專利名稱：多重樣品中的甾族化合物的質(zhì)譜法的制作方法
同位素變體較正常PTAD重6個質(zhì)量單位并可用于一些實施方式。通過Cookson型試劑進行的留族化合物——包括維生素D和維生素D相關(guān)化合物——的衍生可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行。參見，例如，Holmquist，et al.，2007年12月28日提交的美國專利申請系列號 11/946765 ；Yeung B, et al.，J Chromatogr. 1993，645(1):115-23 ；Higashi T, et al. , Steroids. 2000, 65(5):281-94 ；Higashi T, et al.,Biol PharmBull. 2001，24(7) :738-43 ；Higashi Τ, et al.，J Pharm Biomed Anal. 2002，29(5) :947-55 ；Higashi Τ, et al. , Anal. Biochanal Chem, 2008，391:229-38 和 Aronov,et al. , AnalBioanal Chem, 2008，391:1917-30。 在本文公開的方法的某些優(yōu)選實施方式中，質(zhì)譜法以陽離子方式進行。可選地，質(zhì)譜法以陰離子方式進行。各種電離源，包括例如大氣壓化學(xué)電離(APCI)或電霧化電離(ESI)，可用于本發(fā)明的實施方式。在某些實施方式中，以陽離子方式利用APCI測量包括維生素D和維生素D相關(guān)化合物在內(nèi)的留族化合物。 在優(yōu)選實施方式中，樣品中提供了一個或多個單獨可檢測的內(nèi)標，還在樣品中測定了該內(nèi)標的量。在這些實施方式中，將樣品中存在的所有或部分感興趣的分析物(一 種或多種)和內(nèi)標(一種或多種)離子化以產(chǎn)生多種在質(zhì)譜儀中可檢測的離子，并通過質(zhì)譜法檢測從每種產(chǎn)生的一種或多種離子。示例性的內(nèi)標(一種或多種)包括維生素D2-[6，19，19]-2H3、維生素 D2-[24，24，24，25，25，25]-2H6、維生素 D3-[6，19，19]-2H3、維生素D3-[24，24，24，25，25，25]」H6、250HD2-[6, 19，19]」H3、250HD2-[24, 24，24，25，25，25]-2H6'250HD3-[6, 19，19]」H3、250HD3-[24, 24，24，25，25，25]-2H6U α，250HD2-[6, 19，19]-2H3,
Iα，2 50HD2- [24，24, 24, 25, 25, 25] -2H6, I α，2 50HD3- [6，19，19] -2H3, I α，250HD3-[24, 24，24，25，25，25]-2H6。在用Cookson型衍生試劑處理樣品之前可在樣品中提供一種或多種單獨可檢測的內(nèi)標。在這些實施方式中，一種或多種內(nèi)標可連同內(nèi)源性留族化合物一起經(jīng)歷衍生，在該情況下，衍生的內(nèi)標的離子通過質(zhì)譜法來檢測。在這些實施方式中，從感興趣的分析物產(chǎn)生的離子的存在或量可與樣品中感興趣分析物的量的存在相關(guān)。在一些實施方式中，內(nèi)標可以是在研究下留族化合物的同位素標記的形式。例如，在維生素D代謝物是感興趣的分析物的測定中，250HD2- [6，19，19] -2H3或250HD3- [6，19，19] -2H3可用作內(nèi)標。在250HD2-[6，19，19] -2H3用作內(nèi)標的實施方式中，在質(zhì)譜儀中可檢測的PTAD-250HD2-[6, 19，19]-2H3 離子選自具有 573. 30±0· 50 和 301. 10±0· 50 的質(zhì)荷比(m/z)的陽離子。在相關(guān)實施方式中，PTAD-250HD2-[6，19，19]-2H3先驅(qū)離子具有573. 30±0. 50的m/z，碎片離子具有301. 10±0. 50的m/z。在250HD3-[6，19，19]-2 用作內(nèi)標的實施方式中，質(zhì)譜儀中可檢測的PTAD-250HD3-[6, 19，19]離子選自具有561. 30±0· 50和301. 10±0· 50的質(zhì)荷比(m/z)的陽離子。在相關(guān)實施方式中，PTAD-250HD3-[6, 19, 19]先驅(qū)離子具有561·30±0· 50 的 m/z，碎片離子具有 301. 10±0· 50 的 m/z。如本文所用，當(dāng)用質(zhì)譜技術(shù)分析時，相對于未標記的分子，“同位素標記”在標記的分子中產(chǎn)生質(zhì)量漂移。適合的標記的例子包括氘(2H)、13C和15N。例如，250HD2-[6，19，19]和250HD3-[6，19，19]具有較250HD2和250HD3高約3個質(zhì)量單位的質(zhì)量。同位素標記可在分子中的一個或多個位置處摻入，并且一種或多種同位素標記可用于相同同位素標記的分子。
在其它實施方式中，維生素D代謝物離子的量可通過與一種或多種外參考標準比較而測定。示例性的外參考標準包括摻入250HD2、250HD2- [6，19，19]、250HD3和250HD3-[6, 19，19]中的一種或多種的空白血漿或血清。外標通常將經(jīng)歷與將被分析的任何其它樣品相同的處理和分析，包括在質(zhì)譜法之前用一種或多種Cookson型試劑的處理。在某些優(yōu)選實施方式中，250HD2的定量限值(LOQ)在I. 9ng/mL至10ng/mL范圍內(nèi)，包括端值；優(yōu)選在I. 9ng/mL至5ng/mL范圍內(nèi)，包括端值；優(yōu)選約I. 9ng/mL。在某些優(yōu)選實施方式中，250HD3的定量限值(LOQ)在3. 3ng/mL至10ng/mL范圍內(nèi)，包括端值；優(yōu)選在
3.3ng/mL至5ng/mL范圍內(nèi)，包括端值；優(yōu)選約3. 3ng/mL。如本文所用，除非另外說明，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括復(fù)數(shù)參考。因此，例如，提及“一蛋白(apiOtein)”包括多個蛋白分子。如本文所用，術(shù)語“純化(purification)”或“純化(purifying)”不是指從樣品中 去除除了感興趣的分析物(一種或多種)外的所有物質(zhì)。相反，純化指相對于樣品中可能干擾感興趣的分析物檢測的其它組分，富集一種或多種感興趣的分析物的量的過程。通過各種手段的樣品純化可允許一種或多種干擾物質(zhì)——例如，可能或可能不干擾通過質(zhì)譜法的選擇的母離子或子離子檢測的一種或多種物質(zhì)一的相對減少。當(dāng)該術(shù)語使用時，相對減少不要求將被純化的材料中與感興趣的分析物一起存在的任何物質(zhì)通過純化被完全去除。如本文所用，術(shù)語“固相萃取法”或“SPE”指由于溶解或懸浮于溶液(即，流動相)中的組分對溶液通過或流經(jīng)的固體(即，固相)的親和力而將化學(xué)混合物分成各組分的過程。在一些實例中，當(dāng)流動相通過或流經(jīng)固相時，流動相的不期望的組分可保留在固相中，導(dǎo)致流動相中分析物的純化。在其它實例中，分析物可保留在固相中，允許流動相的不期望的組分通過或流經(jīng)固相。在這些實例中，然后將第二流動相用于將保留的分析物從固相洗脫下來用于進一步的處理或分析。SPE—包括TFLC—可通過單一模式或混合模式機制運行。混合模式機制在同一柱中利用離子交換和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可顯示強陰離子交換和疏水保留；或可顯示強陽離子交換和疏水保留。如本文所用，術(shù)語“色譜法”指由于流過固定的液相或固相時化學(xué)實體的差別分布而將液體或氣體攜帶的化學(xué)混合物分成各組分的過程。如本文所用，術(shù)語“液相色譜”或“LC”指當(dāng)流體通過精細分開的物質(zhì)的柱或通過毛細管通道均勻地濾過時流體溶液的一種或多種組分的選擇性阻滯的過程。阻滯由當(dāng)流體相對于固定相(或多個)運動時，一個或多個固定相和大量流體(即，流動相)之間的混合物的各組分分布產(chǎn)生?！耙合嗌V”的實例包括反相液相色譜法(RPLC)、高效液相色譜法(HPLC)和湍流液相色譜(TFLC)(有時被稱作高湍流液相色譜(HTLC)或高通量液相色譜)。如本文所用，術(shù)語“高效液相色譜法”或“HPLC” (有時被稱作“高壓液相色譜”)指這樣的液相色譜，其中通過在壓力下迫使流動相通過固定相，通常是緊密填充的柱，而增加分離的程度。如本文所用，術(shù)語“湍流液相色譜”或“TFLC”(有時被稱作高湍流液相色譜或高通量液相色譜)指一種形式的色譜，其利用通過柱填充而正被測定的物質(zhì)的湍流作為進行分離的基礎(chǔ)。在通過質(zhì)譜法分析之前，TFLC已應(yīng)用于制備包含兩種未命名的藥物的樣品。參見，例如，Zimmer et al. , J Chromatogr A 854:23-35(1999);還參見，美國專利號5，968，367,5, 919，368,5, 795，469 和 5，772，874，其進一步解釋 TFLC0 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解“湍流”。當(dāng)流體慢慢地并流暢地流動時，該流動被稱作“層流”。例如，以低流速通過HPLC柱的流體是層狀的。在層流中流體的顆粒運動是有秩序的，具有通常以直線運動的顆粒。在較快的速度下，水的慣性克服流體摩擦力并產(chǎn)生湍流。不與不規(guī)則邊界接觸的流體“超過”被摩擦減慢或被粗糙表面偏離的流體。當(dāng)流體以湍流流動時，它以漩渦和渦動(或旋渦)流動，較流動是層狀時具有更多的“阻力(drag)”。可獲得許多參考資料用于輔助確定什么時候流體流動是層狀的或瑞流(例如，Turbulent Flow Analysis !Measurementand Prediction, P. S. Bernard & J. M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc. , (2000) ; AnIntroduction to Turbulent F low, Tean Mathieu & Julian Scott, Cambridge UniversityPress(2001))。如本文所用，術(shù)語“氣相色譜”或“GC”指這樣的色譜，其中將樣品混合物蒸發(fā)并注射進通過包含固定相——由液體或顆粒固體組成——的柱運動的載氣(如氮氣或氦)流，并根據(jù)化合物對固定相的親合力分成其各組成化合物。如本文所用，術(shù)語“大顆粒柱”或“萃取柱”指包含大于約50 μ m的平均粒徑的色譜柱。如本文所用，術(shù)語“分析柱”指具有足夠色譜板以引起樣品中物質(zhì)分離的色譜柱，該物質(zhì)從柱洗脫足以允許測定分析物的存在或量。在優(yōu)選實施方式中，分析柱含有直徑約5μπι的顆粒。這樣的柱常常區(qū)別于“萃取柱”，萃取柱具有從非保留的物質(zhì)中分離或萃取保留的物質(zhì)以獲得純化的樣品用于進一步分析的目的。如本文所用，術(shù)語“聯(lián)機(on-1 ine ) ”和“在線(ini ine ) ”，例如如“聯(lián)機自動方式”或“聯(lián)機萃取”中所用，指不需要操作員干預(yù)而進行的程序。相比之下，如本文所用，術(shù)語“脫機(off-line)”指需要操作員的人工干預(yù)的程序。因此，如果將樣品進行沉淀，然后將上清液手動裝載到自動進樣器中，沉淀和裝載步驟與隨后的步驟是脫機的。在方法的各種實施方式中，一個或多個步驟可以以聯(lián)機自動方式進行。如本文所用，術(shù)語“質(zhì)譜法”或“MS”指通過化合物的質(zhì)量鑒定化合物的分析技術(shù)。MS指基于離子的質(zhì)荷比或“m/z”，過濾、檢測和測量離子的方法。MS技術(shù)通常包括⑴電離化合物以形成帶電荷的化合物；和(2)檢測帶電荷的化合物的分子量和計算質(zhì)荷比?；衔锟杀浑婋x和通過任何適合的方法檢測。“質(zhì)譜儀”通常包括電離源和離子檢測器。一般而言，將一種或多種感興趣的分子電離，并隨后將離子引入質(zhì)譜儀器，在質(zhì)譜儀器中由于磁場和電場的聯(lián)合，離子順著空間中取決于質(zhì)量(“m”)和電荷(“z”)的路徑走。參見，例如，名稱為“Mass Spectrometry From Surfaces” 的美國專利號 6，204，500 ;名稱為“Methodsand Apparatus for Tandem Mass Spectrometry，，的6，107, 623 ;名稱為“DNA DiagnosticsBased On Mass Spectrometry” 的 6，268，144 ;名稱為 “Surface-Enhanced PhotolabileAttachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes，，的 6，124，137 ；Wright et al. , Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999，2:264-76 ;和Merchantand Weinberger, Electrophoresis 2000,21:1164-67。如本文所用，術(shù)語“以陰離子方式運轉(zhuǎn)”指產(chǎn)生和檢測陰離子的那些質(zhì)譜法方法。如本文所用，術(shù)語“以陽離子方式運轉(zhuǎn)”指產(chǎn)生和檢測陽離子的那些質(zhì)譜法方法。如本文所用，術(shù)語“電離(ionization)”或“電離(ionizing)”指產(chǎn)生具有等于一個或多個電子單位的凈電荷的分析物離子的過程。陰離子是具有一個或多個電子單位的凈負電荷的那些離子，而陽離子是具有一個或多個電子單位的凈正電荷的那些離子。如本文所用，術(shù)語“電子電離”或“EI ”指這樣的方法，其中氣相或汽相的感興趣的分析物與電子流相互作用。電子與分析物的撞擊產(chǎn)生分析物尚子，然后可將該分析物尚子經(jīng)歷質(zhì)譜法技術(shù)。 如本文所用，術(shù)語“化學(xué)電離”或“Cl ”指這樣的方法，其中將試劑氣體(例如銨)進行電子碰撞，通過試劑氣體離子和分析物分子的相互作用形成分析物離子。如本文所用，術(shù)語“快速原子轟擊”或“FAB”指這樣的方法，其中高能原子束(通常Xe或Ar)撞擊不揮發(fā)的樣品，解吸和電離樣品中包含的分子。將試驗樣品溶解于粘稠的液體基體如甘油、硫甘油、間位硝基芐醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、環(huán)丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺?；衔锘驑悠返暮线m基體的選擇是經(jīng)驗過程。如本文所用，術(shù)語“基體輔助激光解吸電離”或“MALDI”指這樣的方法，其中將不揮發(fā)的樣品暴露于激光輻射，其通過各種電離途徑——包括光電離、質(zhì)子化作用、脫質(zhì)子化
作用和簇衰變(cluster decay)-解吸和電離樣品中的分析物。為了 MALDI,將樣品與
吸收能量的基體混合，該基體促進分析物分子的解吸。如本文所用，術(shù)語“表面增強激光解吸電離”或“SELDI ”指另一種方法，其中將不揮發(fā)的樣品暴露于激光輻射，其通過各種電離途徑——包括光電離、質(zhì)子化作用、脫質(zhì)子化作用和簇衰變(cluster decay)——解吸和電離樣品中的分析物。為了 SELDI，通常將樣品結(jié)合到優(yōu)先保留一種或多種感興趣的分析物的表面。如在MALDI中，該過程還可利用吸收能量的物質(zhì)以促進電離。如本文所用，術(shù)語“電霧化電離”或“ESI ”指這樣的方法，其中將溶液沿著小段毛細管傳送，將高的正或負的電勢施加到毛細管末端。使到達管末端的溶液汽化(霧化)成溶劑蒸汽中溶液的非常小滴的射流或噴霧。該滴的霧流過蒸發(fā)室，其被輕微加熱以防止凝結(jié)和使溶劑蒸發(fā)。隨著滴變小，電表面電荷密度增加直到這樣的時間——同樣的電荷之間的天然排斥引起離子以及中性分子釋放。如本文所用，術(shù)語“大氣壓化學(xué)電離”或“APCI”指與ESI相似的質(zhì)譜法方法；然而，通過在大氣壓發(fā)生在等離子體內(nèi)的離子-分子相互作用，APCI產(chǎn)生離子。等離子體通過噴霧毛細管和對電極之間的放電來保持。然后通常利用一組差示泵出的撇乳器階段(skimmerstages)將離子通常提取到質(zhì)量分析器。干燥和預(yù)熱的隊氣的逆流可用于提高溶劑的去除。APCI中的氣相電離可較ESI更有效地用于分析極性較低的種類。如本文所用，術(shù)語“大氣壓光電離”或“APPI”指一種形式的質(zhì)譜法，其中分子M的光電離的機制是光子吸收和電子噴射以形成分子離子M+。因為光子能量通常剛好高于電離電勢，所以分子離子比較不易離解。在許多情況下，可能分析樣品而無需色譜，因此節(jié)省大量時間和花費。在存在水蒸汽或質(zhì)子溶劑的情況下，分子離子可吸取H以形成MH+。如果M具有高的質(zhì)子親合力，這趨于發(fā)生。這不影響定量準確度，因為M+和MH+之和是恒定的。通常將質(zhì)子溶劑中的藥物化合物觀察為MH+，而非極性化合物如萘或睪酮通常形成M+。參見，例如，Robb et al.，Anal. Chem. 2000，72 (15) : 3653-3659。如本文所用，術(shù)語“電感耦合等離子體”或“ICP”指這樣的方法，其中樣品與部分電離的氣體在充分高的溫度相互作用以便使大部分元素原子化和電離。如本文所用，術(shù)語“場致解吸”指這樣的方法，其中將不揮發(fā)的試驗樣品放到電離表面上，強電場用于以產(chǎn)生分析物離子。如本文所用，術(shù)語“解吸”指從表面去除分析物和/或分析物進入氣相。激光二極管熱解吸(LDTD)是這樣的技術(shù)，其中包含分析物的樣品通過激光脈沖熱解吸到氣相。激光撞擊用金屬基托特別制備的96孔板的背面。激光脈沖加熱基托，熱使樣品轉(zhuǎn)換成氣相。然后將氣相樣品吸進電離源，在那里將氣相樣品在制備中電離，用于在質(zhì)譜儀中分析。當(dāng)利用LDTD時，氣相樣品的電離可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)完成，如通過用電暈放電的電離(例如通過APCI)。如本文所用，術(shù)語“選擇性離子監(jiān)測”是質(zhì)譜儀器的檢測方式，其中只有相對窄的質(zhì)量范圍的離子——通常約一個質(zhì)量單位——被檢測到。如本文所用，“多反應(yīng)方式”有時被稱作“選擇的反應(yīng)監(jiān)測”，是質(zhì)譜儀器的檢測方式，其中先驅(qū)離子和一種或多種碎片離子被選擇性地檢測。如本文所用，術(shù)語“定量的下限(lower limit of quantification)”、“定量的下 限(lower limit of quantitation)”或“LLOQ”指測量變得在數(shù)量上有意義的點。在該LOQ的分析物響應(yīng)是可識別的、離散的和可再現(xiàn)的，具有小于20%的相對標準偏差(RSD%)和80%至120%的準確度。如本文所用，術(shù)語“檢測限值”或“L0D”是這樣的點，在該點測量值較與其相關(guān)的不確定度大。LOD是這樣的點，在該點，值超過與其測量相關(guān)的不確定度并被定義為在零濃度平均值的RSD的三倍。如本文所用，體液樣品中分析物的“量”通常指反映樣品體積中可檢測的分析物質(zhì)量的絕對值。然而，量還考慮與另一個分析物量相比的相對量。例如，樣品中分析物的量可以是大于通常存在于樣品中的分析物的對照或正常水平的量。如本文所用，提到不包括離子質(zhì)量測量的定量測量，術(shù)語“約”指加或減10%的指示值。質(zhì)譜法儀器在測定給定分析物的質(zhì)量時可輕微變化。術(shù)語“約”在離子的質(zhì)量或離子的質(zhì)荷比的上下文中指+/-0. 50原子質(zhì)量單位。上面描述的發(fā)明概述是非限制的，根據(jù)以下本發(fā)明的詳細描述和根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將是明顯的。附圖簡述圖 IA-D 分別顯示 PTAD-250HD3、PTAD-250HD3-[6, 19，19]」H3(內(nèi)標)、PTAD_250HD2和PTAD-250HD2-[6，19，19]-2H3(內(nèi)標)的示例性色譜圖。詳情在實施例3中討論。圖2A和2B顯示通過實施例3中描述的方法測定的血清樣品中的250冊2和250HD3的示例性校正曲線。圖3A顯示變異系數(shù)對250HD2和250HD3濃度的圖。圖3B顯示在LLOQ附近放大的相同的圖。詳情在實施例4中描述。圖4A-B顯示用于比較具有和沒有PTAD衍生的250HD2的質(zhì)譜測定的線性回歸和Deming回歸分析。詳情在實施例10中描述。圖5A-B顯示用于比較具有和沒有PTAD衍生的250HD3的質(zhì)譜測定的線性回歸和Deming回歸分析。詳情在實施例10中描述。圖6A-D顯示比較多重樣品和未混合的樣品(具有相同的衍生劑)的分析結(jié)果的圖。詳情在實施例14中描述。
圖7A-D是比較用不同的衍生劑處理的相同樣本的分析結(jié)果的圖(但比較混合的對混合的，或未混合的對未混合的樣品)。詳情在實施例14中描述。圖8A-D是比較用不同的衍生劑處理的相同樣本的分析結(jié)果的圖，一個分析來自混合的樣品，一個來自未混合的樣品。詳情在實施例14中描述。圖9A顯示25-羥基維生素D2先驅(qū)離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約350至450的m/z范圍)。圖9B顯示具有約395. 2的m/z的25-羥基維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至396的m/z范圍)。詳情在實施例15中描述。圖IOA顯示25-羥基維生素D3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約350至450的m/z范圍)。圖IOB顯示具有約383. 2的m/z的25-羥基維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至396的m/z范圍)。詳情在實施例15中描述。圖IlA顯示PTAD-25-羥基維生素D2離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約520至620的m/z范圍)。圖IlB顯示具有約570. 3的m/z的PTAD-25-羥基維生素D2先驅(qū)離子碎裂 的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約200至400的m/z范圍)。詳情在實施例15中描述。

圖12A顯示PTAD-25-羥基維生素D3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約520至620的m/z范圍)。圖12B顯示具有約558. 3的m/z的PTAD-25-羥基維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約200至400的m/z范圍)。詳情在實施例15中描述。圖13A顯示PTAD-I α，25- 二羥基維生素D2離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約520至620的m/z范圍)。圖13B顯示具有約550. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羥基維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。圖13C顯示具有約568. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羥基維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。圖13D顯示具有約586. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羥基維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實施例16中描述。圖14A顯示PTAD-I α，25- 二羥基維生素D3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約520至620的m/z范圍)。圖14B顯示具有約538. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羥基維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。14C顯示具有約556. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羥基維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。圖14D顯示具有約574. 4的m/z的PTAD-I α，25- 二羥基維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實施例16中描述。圖15A顯示PTAD-維生素D2離子的示例性的Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖15B顯示具有約572. 2的m/z的PTAD-維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實施例17中描述。圖16A顯示PTAD-維生素D3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖16B顯示具有約560. 2的m/z的PTAD-維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實施例17中描述。發(fā)明詳述描述測量樣品中留族化合物，如維生素D和維生素D相關(guān)化合物的方法。更具體地，描述在單個質(zhì)譜測定中檢測和定量多個試驗樣品中的留族化合物的方法。結(jié)合質(zhì)譜法(MS)方法，該方法可利用Cookson型試劑，如PTAD，產(chǎn)生衍生的留族化合物，由此提供檢測和定量多個試驗樣品中的留族化合物的高通量測定系統(tǒng)。優(yōu)選實施方式特別適合自動化甾族化合物定量的大的臨床實驗室中的應(yīng)用。用于本發(fā)明方法的合適的試驗樣品包括可含有感興趣的分析物的任何試驗樣品。在一些優(yōu)選實施方式中，樣品是生物樣品；即，從任何生物來源，如動物、細胞培養(yǎng)物、器官培養(yǎng)物等獲得的樣品。在某些優(yōu)選實施方式中，樣品從哺乳動物，如狗、貓、馬等獲得。特別優(yōu)選的哺乳動物是靈長類，最優(yōu)選男性或女性人類。優(yōu)選的樣品包括體液如血液、血漿、血清、唾液、腦脊液或組織樣品；優(yōu)選血漿(包括EDTA和肝素血漿)和血清；最優(yōu)選血清。這樣的樣品可，例如，從患者；即，活人，男性或女性獲得，在臨床環(huán)境中呈現(xiàn)自身用于疾病或狀況的診斷、預(yù)后或治療。本發(fā)明還考慮一種或多種留族化合物的定量試劑盒。留族化合物定量測定的試劑盒可包括包含本文提供的組合物的試劑盒。例如，試劑盒可包括包裝材料和測量過的量的同位素標記的內(nèi)標——以足夠至少一個測定的量。通常，試劑盒還將包括 以有形形式記錄的說明書(例如，包含在紙或電子媒介上)用于使用留族化合物定量測定中使用的包裝的試劑。用于本發(fā)明的實施方式的校準和QC庫優(yōu)選利用與期望的樣品基體相似的基體來制備。用于質(zhì)譜分析的樣品制備在用于質(zhì)譜分析的制備中，一種或多種留族化合物可通過本領(lǐng)域已知的任何方法，包括例如，液相色譜、過濾、離心、薄層色譜(TLC)、包括毛細管電泳在內(nèi)的電泳、包括免疫親和分離在內(nèi)的親和分離、包括乙酸乙酯或甲醇提取在內(nèi)的提取法，和利用離液劑或以上或類似方法的任何組合相對于樣品中的一種或多種其它組分(例如蛋白質(zhì))進行富集。這些富集步驟可在處理之前應(yīng)用于個體試驗樣品，在衍生之后應(yīng)用于個體處理的樣品，或在處理的樣品已被組合之后應(yīng)用于多重樣品。蛋白質(zhì)沉淀是一種制備樣品，特別是生物樣品，如血清或血漿的方法。蛋白質(zhì)純化方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，Poison et al. , Journal of ChromatographyB2003, 785:263-275，描述了適合用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)。蛋白質(zhì)沉淀可用于從樣品中去除大部分蛋白質(zhì)，留下一種或多種留族化合物在上清液中。可將樣品離心以從沉淀的蛋白質(zhì)中分離液體上清液；可選地可將樣品過濾以去除沉淀的蛋白質(zhì)。然后可將得到的上清液或濾液直接應(yīng)用于質(zhì)譜法分析；或可選地應(yīng)用于液相色譜和隨后的質(zhì)譜法分析。在某些實施方式中，個體試驗樣品，如血漿或血清，可通過雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取法而被純化。在這些實施方式中，將未處理的試驗樣品與甲醇、乙酸乙酯和水混合，并將產(chǎn)生的混合物渦旋和離心。將產(chǎn)生的上清液——包含一種或多種純化的留族化合物——移去、完全干燥和在乙腈中重構(gòu)(reconstituted)。然后可將乙腈溶液中的一種或多種純化的甾族化合物用任何Cookson型試劑，優(yōu)選PTAD或其同位素標記的變體衍生?？稍谫|(zhì)譜法之前使用的樣品純化的另一個方法是液相色譜(LC)。包括HPLC在內(nèi)的液相色譜的某些方法依賴相對慢的層流技術(shù)。傳統(tǒng)的HPLC分析依賴柱填充，其中通過柱的樣品的層流是從樣品中分離感興趣的分析物的基礎(chǔ)。熟練的技術(shù)人員將理解，這樣的柱中的分離是擴散過程并可選擇適合衍生的留族化合物使用的包括HPLC在內(nèi)的LC、儀器和柱。色譜柱通常包括介質(zhì)(即，填充材料)以促進化學(xué)部分的分離(即，分級)。介質(zhì)可包括微小的顆粒，或可包括具有孔道的整體材料。介質(zhì)的表面通常包括鍵合表面，其與各種化學(xué)部分相互作用以促進化學(xué)部分的分離。一個合適的鍵合表面是疏水鍵合表面如烷基鍵合、氰基鍵合表面或高純的二氧化硅表面。烷基鍵合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18鍵合的燒基。在優(yōu)選實施方式中，柱是高純的二氧化娃柱(如Thermo Hypersil Gold Aq柱)。色譜柱包括用于接收樣品的入口和用于排出包括分級的樣品的流出液的出口?？蓪悠分苯犹峁┑饺肟?，或從萃取柱，如聯(lián)機SPE柱體或TFLC萃取柱。在優(yōu)選實施方式中，多重樣品可在質(zhì)譜法之前通過液相色譜純化。在一個實施方式中，可將多重樣品在入口施加到LC柱，用溶劑或溶劑混合物洗脫，并在出口排出?？蛇x擇不同的溶劑方式用于洗脫感興趣的分析物(或多個)。例如，液相色譜可利用梯度方式、等度方式或多變(即混合)方式進行。在色譜期間，物質(zhì)的分離通過變量如洗脫液(也被稱作“流動相”)、洗脫方式、梯度條件、溫度等的選擇來完成。在某些實施方式中，通過將多重樣品在感興趣的分析物被柱填充材料可逆地保留，而一種或多種其它物質(zhì)不被保留的條件下施加到柱可將分析物純化。在這些實施方式 中，感興趣的分析物被柱保留時可利用第一流動相條件，一旦非保留的物質(zhì)被洗過，隨后可利用第二流動相條件以從柱去除保留的物質(zhì)?？蛇x地，通過在感興趣的分析物相比一種或多種其它物質(zhì)以有差別的速度洗脫的流動相條件下將多重樣品施加到柱可純化分析物。這樣的操作可相對于樣品的一種或多種其它組分在特定時間(即，特有的保留時間)富集洗脫液中感興趣的分析物的量。在一個優(yōu)選實施方式中，用烷基鍵合的分析柱色譜系統(tǒng)進行HPLC。在某些優(yōu)選實施方式中，使用高純二氧化娃柱(如Thermo Hypersil Gold Aq柱)。在某些優(yōu)選實施方式中，利用HPLC級水作為流動相A和HPLC級乙醇作為流動相B進行HPLC和/或TFLC。通過仔細地選擇閥和連接管道，需要時可將兩個或多個色譜柱連接以便物質(zhì)從一個通過到下一個無需任何手動步驟。在優(yōu)選實施方式中，閥和管道的選擇由預(yù)編程序的計算機控制以進行必需的步驟。最優(yōu)選，色譜系統(tǒng)還以這樣的聯(lián)機方式連接到檢測器系統(tǒng)，例如，MS系統(tǒng)。因此，操作員可將樣品的托盤放到自動進樣器中，剩余的操作在計算機控制下進行，導(dǎo)致所有選擇的樣品得到純化和分析。在一些實施方式中，在質(zhì)譜法之前萃取柱可用于留族化合物的純化。在這樣的實施方式中，在電離之前利用捕獲分析物的萃取柱，樣品可被提取，然后在第二萃取柱上或在分析HPLC柱上洗脫和層析。例如，用TFLC萃取柱的樣品提取可用大粒度(50μπι)的填充柱實現(xiàn)。然后可將該柱的洗脫出的樣品轉(zhuǎn)移到HPLC分析柱用于質(zhì)譜法之前的進一步純化。因為這些色譜程序中包括的步驟可以以自動化方式連接，所以可將分析物純化過程中操作員參與的需要減到最小。該特點可導(dǎo)致節(jié)省時間和成本，并消除操作員錯誤的可能。在一些實施方式中，蛋白質(zhì)沉淀通過雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取法一包括從血清試驗樣品的甲醇蛋白質(zhì)沉淀和乙酸乙酯/水萃取一實現(xiàn)。在經(jīng)歷萃取柱之前產(chǎn)生的甾族化合物可被衍生。優(yōu)選，雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取法和萃取柱以聯(lián)機方式連接。在甾族化合物選自維生素D和維生素D相關(guān)化合物的優(yōu)選實施方式中，萃取柱優(yōu)選是C-8萃取柱，如Cohesive Technologies C8XL聯(lián)機萃取柱(50 μ m粒度，O. 5 X 50mm)或同等物。然后在質(zhì)譜分析之前可將來自萃取柱的洗脫液施加到分析型LC柱，如以聯(lián)機方式的HPLC柱。因為這些色譜程序中包括的步驟可以以自動化方式連接，所以可將分析物純化過程中對操作員參與的需要減到最小。該特點可導(dǎo)致節(jié)省時間和成本，并消除操作員錯誤的可能。通過質(zhì)譜法的檢測和定暈在各種實施方式中，衍生的留族化合物可通過熟練的技術(shù)人員已知的任何方法而被電離。利用質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜法，質(zhì)譜儀包括用于電離分級的樣品和產(chǎn)生用于進一步分析的帶電荷分子的離子源。例如樣品的電離可通過電子電離、化學(xué)電離、電霧化電離(ESI)、光電離、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、光電離、大氣壓光電離(APPI)、快原子轟擊(FAB)、液體二次電離(LSI)、基體輔助激光解吸電離(MALDI)、場致電離、場致解吸、熱噴射/等離子體噴射電離、表面增強激光解吸電離(SELDI)、電感耦合等離子體(ICP)、顆粒束電離和LDTD進行。熟練的技術(shù)人員將理解，可基于將被測量的分析物、樣品類型、檢測器類型、陽性對陰性方式的選擇等確定電離方法的選擇。衍生的留族化合物可以以陽性或陰性方式電離。在優(yōu)選實施方式中，衍生的甾族 化合物以陽性方式通過APCI而被電離。在相關(guān)的優(yōu)選實施方式中，衍生的甾族化合物離子處于氣態(tài)，惰性碰撞氣體是IS或氮；優(yōu)選気。在質(zhì)譜法技術(shù)中，通常在樣品已被電離之后，可分析由此產(chǎn)生的帶正電荷或帶負電荷的離子以測定質(zhì)荷比。測定質(zhì)荷比的合適的分析器包括四極分析器、離子阱分析器和飛行時間分析器。示例性的離子講方法在Bartolucci, et al. , Rapid Commun. MassSpectrom. 2000，14:967-73 中被描述。可利用幾種檢測方式來檢測離子。例如，選擇的離子可被檢測，即利用選擇性離子監(jiān)測方式(SIM)，或可選地，由碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的質(zhì)量變遷或中性喪失可被監(jiān)測，例如，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)或選擇性反應(yīng)監(jiān)測(SRM)。優(yōu)選，利用四極分析器測定質(zhì)荷比。例如，在“四極”或“四極離子阱”儀器中，振蕩射頻場中的離子經(jīng)歷與在電極之間施加的DC電勢、RF信號的振幅和質(zhì)荷比成比例的力?？蛇x擇電壓和振幅以便只有具有特定質(zhì)荷比的離子經(jīng)歷四極的長度，而所有其它離子偏離。因此，四極儀器可充當(dāng)注射進儀器的離子的“質(zhì)量過濾器”和“質(zhì)量檢測器”。人們可通過利用“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“MS/MS”提高MS技術(shù)的分辨率。在該技術(shù)中，可將從感興趣的分子產(chǎn)生的先驅(qū)離子(也稱作母離子)在MS儀器中過濾，隨后破碎先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種碎片離子(也稱作子離子或產(chǎn)物離子)，然后將其在第二 MS程序中分析。通過仔細地選擇先驅(qū)離子，只將某些分析物產(chǎn)生的離子送到碎裂室，在那里與惰性氣體的原子碰撞產(chǎn)生碎片離子。因為先驅(qū)離子和碎片離子都在給定的電離/碎裂條件下以可再現(xiàn)的方式產(chǎn)生，所以MS/MS技術(shù)可提供非常強大的分析工具。例如，過濾/碎裂的組合可用于消除干擾物質(zhì)，并可在復(fù)雜樣品，如生物樣品中特別有用。操作串聯(lián)質(zhì)譜儀器的替換方式包括產(chǎn)物離子掃描和先驅(qū)離子掃描。對于這些操作方式的描述，參見，例如，E. Michael Thurman, et al. , Chromatographic-MassSpectrometric Food Analysis for Trace Determination of Pesticide Residues,第 8 章(AmadeoR.Fernandez-Alba編,Elsevier 2005) (387)。可通過本領(lǐng)域已知的為數(shù)眾多的方法將分析物測定的結(jié)果與最初樣品中分析物的量關(guān)聯(lián)。例如，假定仔細控制采樣和分析參數(shù)，可將給定離子的相對豐度與將該相對豐度轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對量的表比較?？蛇x地，外標可與樣品一起進行，基于從那些標準產(chǎn)生的離子作標準曲線。利用這樣的標準曲線，可將給定離子的相對豐度轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對量。在某些優(yōu)選實施方式中，內(nèi)標用于產(chǎn)生計算留族化合物的量的標準曲線。產(chǎn)生和利用這樣的標準曲線的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，普通技術(shù)人員能選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標。例如，在一些實施方式中，一種或多種同位素標記的維生素D代謝物(例如,250HD2-[6, 19, 19]-2H3和250HD3-[6，19，19]-2H3)可用作內(nèi)標。將離子的量與原始分子的量相關(guān)聯(lián)的為數(shù)眾多的其它方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說將是熟知的。方法的一個或多個步驟可利用自動化機器進行。在某些實施方式中，一個或多個純化步驟聯(lián)機進行，更優(yōu)選所有的純化和質(zhì)譜法步驟可以以聯(lián)機方式進行。在某些質(zhì)譜法技術(shù)中，如MS/MS，通過碰撞活化解離(CAD)將先驅(qū)離子分離用于進一步碎裂。在CAD中，先驅(qū)離子通過與惰性氣體碰撞而獲得能量，并隨后通過稱作“單分子分解”的過程被破碎。足夠的能量必須沉積在先驅(qū)離子中以便由于增加的振動能，離子內(nèi)的某些鍵可被斷裂。
如下利用MS/MS，樣品中的甾族化合物可被檢測和/或定量。樣品可首先通過蛋白質(zhì)沉淀或雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取來純化。然后，將純化的樣品中的一種或多種甾族化合物用Cookson型試劑，如PTAD或其同位素變體衍生。然后可將純化的樣品經(jīng)歷液相色譜，優(yōu)選在萃取柱(如TFLC柱)上，該萃取柱之后是分析柱(如HPLC柱)；來自色譜柱的液體溶劑流進入MS/MS分析器的霧化器接口 ；溶劑/分析物混合物在接口的加熱的帶電荷的管道中被轉(zhuǎn)化成蒸汽。通過將大的電壓施加到溶劑/分析物混合物而將溶劑中含有的分析物(一種或多種)(例如，衍生的留族化合物如衍生的維生素D代謝物)電離。當(dāng)分析物退出接口的帶電荷的管道時，溶劑/分析物混合物霧化，溶劑蒸發(fā)，留下分析物離子。可選地，在電離之前，純化的樣品中的衍生的留族化合物可不經(jīng)歷液相色譜。相反，可將樣品點樣于96孔板中并通過LDTD使之揮發(fā)和電離。離子，例如先驅(qū)離子，通過串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)儀器的孔口并進入第一四極。在串聯(lián)質(zhì)譜儀器中，四極I和3(Q1和Q3)是質(zhì)量過濾器，允許基于它們的質(zhì)荷比(m/z)選擇離子(即，分別選擇Ql和Q3中的“先驅(qū)”離子和“碎片”離子)。四極2(Q2)是碰撞小室，離子在那里被破碎。質(zhì)譜儀的第一四極(Ql)選擇具有感興趣的衍生的留族化合物質(zhì)荷(m/z)比的分子。允許具有正確質(zhì)/荷比的先驅(qū)離子進入碰撞室(Q2)，而具有任何其它質(zhì)荷比的不需要的離子與四極的側(cè)面撞擊并被消除。進入Q2的先驅(qū)離子與中性氬氣分子撞擊并破碎。產(chǎn)生的碎片離子進入四極3 (Q3)，在那里感興趣的衍生的留族化合物的碎片離子被選擇，而其它離子被排除。方法可包括以陽離子方式或陰離子方式，優(yōu)選陽離子方式進行的MS/MS。利用本領(lǐng)域熟知的標準方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能鑒定可用于四極3(Q3)中選擇的衍生的留族化合物的特定先驅(qū)離子的一種或多種碎片離子。當(dāng)離子與檢測器碰撞時，它們產(chǎn)生電子脈沖，其被轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號。將獲得的數(shù)據(jù)傳遞給計算機，計算機繪制收集的離子計數(shù)對時間的圖。產(chǎn)生的質(zhì)譜圖與傳統(tǒng)的HPLC-MS方法產(chǎn)生的色譜圖相似?？蓽y量對應(yīng)于特定離子的峰下面積或這樣的峰的振幅并使之與感興趣的分析物的量相關(guān)聯(lián)。在某些實施方式中，測量碎片離子(一種或多種)和/或先驅(qū)離子的曲線下面積或峰的振幅，以測定特定留族化合物的量。如上所述，基于內(nèi)部分子標準的一種或多種離子的峰，可利用校正標準曲線將給定離子的相對豐度轉(zhuǎn)換成原始分析物的絕對量。處理患者樣品用于多重患者樣品的分析接著上面描述的程序，如果每個患者樣品被不同地處理，那么多個患者樣品可以是多重(即，一起混合和測定)。短語“不同地處理”指即將被包括在多重樣品中的每個患者樣品以這樣的方式被處理最初通過質(zhì)譜法不能區(qū)別的兩個或多個患者樣品中的留族化合物在處理之后變得可區(qū)別。這可通過用衍生留族化合物的不同的劑處理每個患者樣品來實現(xiàn)。選擇使用的衍生劑必須產(chǎn)生通過質(zhì)譜法可區(qū)別的衍生的留族化合物。通過質(zhì)譜法區(qū)分衍生的留族化合物的基礎(chǔ)將是來自衍生的留族化合物的離子的質(zhì)量差異。質(zhì)量差異可由使用兩種或多種不同的衍生劑，如PTAD和DMEQTAD的而引起。質(zhì)量差異還可由使用相同衍生劑的兩種或多種同位素變體，如PTAD和13C6-PTAD而引起。這兩個方法不互相排斥，并且不同的衍生劑和相同劑的同位素變體的任何組合可用于獨特地標記將被分析的多個患者樣品中每個患者樣品中的留族化合物。任選地，可處理來自多個患者樣品的一個樣品，而不用衍生劑。處理多個患者樣品之后，來自一個患者樣品的特定留族化合物將具有與其它患者 樣品中的相同甾族化合物不同的質(zhì)譜曲線。當(dāng)將處理的患者樣品混合以形成多重樣品——其然后被分析以測定處理的留族化合物的水平——時，檢測的處理的留族化合物的質(zhì)譜曲線的差異允許將每個處理的留族化合物歸因于起始的患者樣品。因此，兩個或多個患者樣品中的留族化合物的量通過多重樣品的單個質(zhì)譜分析來測定。如上面所指出的，不同的Cookson型試劑可用作不同的患者樣品的衍生劑；例如，可用PTAD衍生一個患者樣品，并且用DMEQTAD衍生第二患者樣品。利用不同的Cookson型試劑通常導(dǎo)致衍生的分析物之間大的質(zhì)量差異。例如，用PTAD衍生的留族化合物和用DMEQTAD衍生的相同化合物之間的質(zhì)量差異是約200個質(zhì)量單位(TAD和DMEQTAD之間的質(zhì)
量差異)。相同的Cookson型試劑同位素變體還可用于在許多患者樣品中產(chǎn)生可區(qū)別的衍生物。例如，可用PTAD衍生一個患者樣品，并且可用13C6-PTAD衍生第二患者樣品。在該實例中，PTAD和13C6-PTAD之間的質(zhì)量差異是約6個質(zhì)量單位。以下實施例通過用PTAD的同位素變體處理許多患者樣品而用于舉例說明本發(fā)明。這些實施例決不是想要限制方法的范圍。特別地，以下實施例顯示利用250HD2-[6, 19，19]-屯3或250冊3-[6，19，19]-2H3作為內(nèi)標通過質(zhì)譜法定量維生素D代謝物。當(dāng)應(yīng)用于維生素D代謝物時，本發(fā)明方法的顯示不將該方法的適用性限制為只是維生素D和維生素D相關(guān)化合物。相似地，250HD2-[6，19，19]-2 或250HD3-[6，19，19]」比用作內(nèi)標不意味以任何方式受到限制。任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物種——容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員測定——可被用作甾族化合物定量的內(nèi)標。實施例實施例I :雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提耳又和Cookson型衍生對患者血清樣品進行以下自動化的雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取技術(shù)。已將凝膠屏障血清(Gel Barrier Serum)(即，在血清分離管中采集的血清)以及EDTA血衆(zhòng)和肝素血漿建立為該測定所接受的。Perkin-Elmer Janus機器人和TomTec Quadra Tower機器人用于使以下程序自動化。對于每個樣品，將50 μ L血清加到96孔板的孔中。然后向每個孔中加入25 μ L內(nèi)標混合物(包含同位素標記的250HD2-[6, 19，19]-2H3和25OHD3-[6, 19，19]-2H3)，并將板渦旋。然后加入75 μ L甲醇,之后進行另外的渦旋。然后加入300 μ L乙酸乙酯和75 μ L水，之后進行另外的渦旋、離心，并將得到的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板。將來自實施例I的第二 96孔板中的轉(zhuǎn)移的液體在流動的氮氣歧管下干燥完全。通過向每個孔加入100 μ L的乙腈中的Cookson型衍生劑PTAD的O. lmg/mL溶液來實現(xiàn)衍生。允許衍生反應(yīng)進行大約一個小時，并通過向反應(yīng)混合物中加入100 μ L水而使之淬滅。實施例2 :用液相色譜提取維生素P代謝物利用Aria OS V I. 5. I 或更新的軟件用 Cohesive Technologies Aria TX-4 TFLC系統(tǒng)進行樣品注射。TFLC系統(tǒng)自動化地將上述制備的樣品的等分試樣注射進填充有大顆粒的 Cohesive Technologies C8XL 聯(lián)機萃取柱(50 μ m 粒度，005 X 50mm,來自 CohesiveTechnologies, Inc.)。在高流速下裝載樣品以在萃取柱內(nèi)部產(chǎn)生瑞流。該瑞流確保柱中衍生的維生素D代謝物與大顆粒優(yōu)化的結(jié)合，和過量衍生試劑和碎片到廢物的通道。裝載之后,用水/乙醇洗脫梯度將樣品洗脫到分析柱-Thermo Hypersil Gold
Aq分析柱(5 μ m粒度，50 X 2. Imm)。將HPLC梯度施加到分析柱以將維生素D代謝物與樣品中含有的其它分析物分離。流動相A是水，流動相B是乙醇。HPLC梯度從35%有機梯度開始，其在大約65秒中上升到99%。實施例3 :通過MS/MS檢測和定暈衍生的維生素D代謝物利用Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS系統(tǒng)(Thermo Electron Corporation)進行MS/MS。以下軟件程序——所有都來自Thermo Electron——在本文描述的實施例中使用Quantum Tune Master V I. 5 或更新的、Xcalibur V 2. 07 或更新的、LCQuan V2. 56 (Thermo Finnigan)或更新的和ARIA OS vl. 5. I (Cohesive Technologies)或更新的。退出分析柱的液體溶劑/分析物流到MS/MS分析器的霧化器接口。在接口的管道中溶劑/分析物混合物被轉(zhuǎn)化成蒸氣。霧化的溶劑中的分析物通過ESI被電離。離子經(jīng)過第一四極(Ql)，其為衍生的維生素D代謝物選擇離子。為PTAD_250HD2選擇具有 570. 32 ±0. 50m/z 的離子；為 PTAD_250HD3 選擇具有 558. 32 ±0. 50m/z 的離子。進入四極2(Q2)的離子與氬氣碰撞，產(chǎn)生離子碎片，其被送到四極3(Q3)用于進一步選擇。質(zhì)譜儀設(shè)置顯示在表I。同時，用內(nèi)標，？1八0-250!102-[6，19，19]-2!13和PTAD-250HD3-[6, 19，19]-2H3進行利用同位素稀釋質(zhì)譜法的相同的過程。以下質(zhì)量變遷用于驗證過程中正極性的檢測和定量。指示的質(zhì)量變遷不意味著以任何方式受到限制。如接下來的實施例所見，可為每個分析物選擇其它質(zhì)量變遷以產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)。表I.用于PTAD_250HD2和PTAD_250HD3檢測的質(zhì)譜儀設(shè)置。
權(quán)利要求
1.用單個質(zhì)譜測定來測定多個試驗樣品的每個試驗樣品中的留族化合物的量的方法，其中在處理之前所述留族化合物在每個試驗樣品中是相同的，所述方法包括 不同地處理每個試驗樣品以形成多個處理的樣品，其中由于所述處理，每個處理的樣品中的所述留族化合物通過質(zhì)譜法可區(qū)別于其它處理的樣品中的所述留族化合物； 合并所述處理的樣品以形成多重樣品； 使所述多重樣品在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測的離子的條件下經(jīng)歷電離源，其中一種或多種從來自每個處理的樣品的所述留族化合物產(chǎn)生的離子不同于一種或多種從來自其它處理的樣品的所述留族化合物產(chǎn)生的離子； 通過質(zhì)譜法檢測一種或多種來自每個處理的樣品的所述留族化合物的離子的量；和 使一種或多種來自每個處理的樣品的所述留族化合物的離子的量與每個試驗樣品中所述留族化合物的量相關(guān)聯(lián)。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述多個處理的樣品包括一個具有未衍生的留族化合物的處理的樣品。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述處理包括在適合產(chǎn)生衍生的留族化合物的條件下將每個試驗樣品經(jīng)歷不同的衍生劑。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述不同的衍生劑是各自的同位素變體。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述不同的衍生劑是Cookson型衍生劑。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述Cookson型衍生劑選自4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4-甲基-I, 2，4-三唑啉-3，5_ 二酮(MTAD)、4_[2_(6，7- 二甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- 二氫喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD)、4-(4-硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)、4_ 二茂鐵基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(FMTAD)和其同位素變體。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述Cookson型衍生劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的同位素變體。
8.權(quán)利要求3-7中任一項所述的方法，其中所述多個樣品包括兩個樣品，第一衍生試劑是4-苯基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，第二衍生試劑是13C6+苯基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述留族化合物是維生素D或維生素D相關(guān)化合物。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述留族化合物選自維生素D2、維生素D3、25-羥基維生素D2 (250HD2)、25_羥基維生素D3 (250HD3)、I a，25- 二羥基維生素D2 (I a，250HD2)和 I a，25- 二羥基維生素 D3 (I a，250HD3)。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述留族化合物是25-羥基維生素D2(250HD2)或25-羥基維生素D3(250HD3)。
12.權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，進一步包括在經(jīng)歷電離源之前將所述多重樣品經(jīng)歷萃取柱和分析柱。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。
15.權(quán)利要求12-14中任一項所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
16.權(quán)利要求1-15中任一項所述的方法，其中質(zhì)譜法是串聯(lián)質(zhì)譜法。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法作為多重反應(yīng)監(jiān)測、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描而進行。
18.權(quán)利要求12-17中任一項所述的方法，其中所述萃取柱、分析柱和所述電離源以聯(lián)機方式連接。
19.權(quán)利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述電離源包括激光二極管熱解吸(LDTD)。
20.權(quán)利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述電離源包括電霧化電離源(ESI)或大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。
21.權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法，其中所述試驗樣品包括生物樣品。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述試驗樣品包括血漿或血清。
23.用單個質(zhì)譜測定來測定多個試驗樣品的每個試驗樣品中的兩種或多種留族化合物的量的方法，所述方法包括 不同地處理每個試驗樣品以形成多個處理的樣品，其中由于所述處理，每個處理的樣品中的兩種或多種留族化合物通過質(zhì)譜法可區(qū)別于其它處理的樣品中的兩種或多種甾族化合物； 合并所述處理的樣品以形成多重樣品； 使所述多重樣品在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測的離子的條件下經(jīng)歷電離源，其中一種或多種從來自每個處理的樣品的每種所述留族化合物產(chǎn)生的離子不同于一種或多種從來自其它處理的樣品的甾族化合物產(chǎn)生的離子； 通過質(zhì)譜法檢測一種或多種來自每個處理的樣品的所述兩種或多種留族化合物中每種甾族化合物的離子的量；和 使一種或多種來自每個處理的樣品的所述兩種或多種留族化合物中每種留族化合物的離子的量與每個試驗樣品中所述留族化合物中每種留族化合物的量相關(guān)聯(lián)。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述多個處理的樣品包括一個具有未衍生的留族化合物的處理的樣品。
25.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述處理包括在適合產(chǎn)生衍生的留族化合物的條件下將每個試驗樣品經(jīng)歷不同的衍生劑。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述不同的衍生劑是各自的同位素變體。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述不同的衍生劑是Cookson型衍生劑。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述Cookson型衍生劑選自4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)、4_ 甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(MTAD)、4_[2_(6，7-二甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- 二氫喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD)、4-(4-硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)、4_ 二茂鐵基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(FMTAD)和其同位素變體。
29.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述Cookson型衍生劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的同位素變體。
30.權(quán)利要求23-29中任一項所述的方法，其中所述多個樣品包括兩個樣品，第一衍生試劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，第二衍生試劑是13C6_4_苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
31.權(quán)利要求23-30中任一項所述的方法，其中每個試驗樣品中的所述兩種或多種甾族化合物是維生素D或維生素D相關(guān)化合物。
32.權(quán)利要求23-31中任一項所述的方法，其中每個試驗樣品中的所述兩種或多種甾族化合物選自維生素D2、維生素D3、25-羥基維生素D2 (250HD2)、25_羥基維生素D3 (250HD3)、I a，25- 二羥基維生素 D2 (I a，250HD2)和 I a，25- 二羥基維生素 D3 (I a，250HD3)。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中每個試驗樣品中的所述兩種或多種留族化合物包括至少一個選自25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3(250HD3)的留族化合物。
34.權(quán)利要求32所述的方法，其中每個試驗樣品中的所述兩種或多種留族化合物是25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3 (250HD3)。
35.權(quán)利要求23-34中任一項所述的方法，進一步包括在經(jīng)歷電離源之前將所述多重樣品經(jīng)歷萃取柱和分析柱。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
37.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。
38.權(quán)利要求35-37中任一項所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
39.權(quán)利要求23-38中任一項所述的方法，其中質(zhì)譜法是串聯(lián)質(zhì)譜法。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法作為多重反應(yīng)監(jiān)測、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描而進行。
41.權(quán)利要求23-40中任一項所述的方法，其中所述萃取柱、分析柱和所述電離源以聯(lián)機方式連接。
42.權(quán)利要求23-41中任一項所述的方法，其中所述電離源包括激光二極管熱解吸(LDTD)。
43.權(quán)利要求23-42中任一項所述的方法，其中所述電離源包括電霧化電離源(ESI)或大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。
44.權(quán)利要求23-44中任一項所述的方法，其中所述試驗樣品包括生物樣品。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述試驗樣品包括血漿或血清。
46.用單個質(zhì)譜測定來測定兩個試驗樣品的每個試驗樣品中的維生素D或維生素D相關(guān)化合物的量的方法，其中在處理之前維生素D或維生素D相關(guān)化合物在每個試驗樣品中是相同的，所述方法包括 在適合產(chǎn)生維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的條件下，通過將第一試驗樣品經(jīng)歷4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的第一同位素變體而產(chǎn)生第一處理的樣品； 在適合產(chǎn)生維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的條件下，通過將第二試驗樣品經(jīng)歷4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的第二同位素變體而產(chǎn)生第二處理的樣品，其中所述PTAD的第一和第二同位素變體通過質(zhì)譜法是可區(qū)分的； 混合所述第一處理的樣品和所述第二處理的樣品以形成多重樣品； 使來自所述多重樣品中每個處理的樣品的維生素D或維生素D相關(guān)衍生物在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測的離子的條件下經(jīng)歷電離源，其中一種或多種來自所述第一處理的樣品的所述維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的離子不同于一種或多種來自所述第二處理的樣品的所述維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的離子；通過質(zhì)譜法檢測一種或多種來自每個處理的樣品的所述維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的離子的量；和 使所述測定的離子的量與所述第一和第二試驗樣品中的所述維生素D或維生素D相關(guān)化合物的量相關(guān)聯(lián)。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的所述第一同位素變體是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的所述第二同位素變體是13C6-4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
48.權(quán)利要求46-47中任一項所述的方法，其中所述維生素D或維生素D相關(guān)化合物選自25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3(250HD3)。
49.權(quán)利要求46-48中任一項所述的方法，其中所述試驗樣品進一步包括兩種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物，并且每個試驗樣品中所述兩種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物的所述量通過所述方法來測定。
50.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述兩種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物包括25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3(250HD3)。
51.權(quán)利要求49所述的方法，其中所述兩種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物是25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3 (250HD3)。
52.權(quán)利要求46-51中任一項所述的方法，進一步包括在經(jīng)歷電離源之前將所述多重樣品經(jīng)歷萃取柱和分析柱。
53.權(quán)利要求52所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
54.權(quán)利要求52所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。
55.權(quán)利要求52-54中任一項所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
56.權(quán)利要求52-55中任一項所述的方法，其中質(zhì)譜法是串聯(lián)質(zhì)譜法。
57.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法作為多重反應(yīng)監(jiān)測、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描而進行。
58.權(quán)利要求52-57中任一項所述的方法，其中所述萃取柱、分析柱和所述電離源以聯(lián)機方式連接。
59.權(quán)利要求46-58中任一項所述的方法，其中所述電離源包括激光二極管熱解吸(LDTD)。
60.權(quán)利要求46-59中任一項所述的方法，其中所述電離源包括電霧化電離源(ESI)或大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。
61.權(quán)利要求46-60中任一項所述的方法，其中所述試驗樣品包括生物樣品。
62.權(quán)利要求61所述的方法，其中所述試驗樣品包括血漿或血清。多重樣品中的留族化合物的質(zhì)譜法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法的留族化合物的定量測量。在具體方面，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法的多個樣品的留族化合物的定量測量的方法。
發(fā)明背景
留族化合物是任何為數(shù)眾多的天然存在的或合成的脂溶性有機化合物，該化合物具有作為基礎(chǔ)的以四個環(huán)排列的17個碳原子，并包括留醇和膽汁酸、腎上腺和性激素、某些天然藥物如洋地黃化合物以及某些維生素和相關(guān)的化合物(如維生素D、維生素D類似物和維生素D代謝物)。
許多甾族化合物是生物學(xué)上重要的。例如，維生素D是在鈣(Ca2+)穩(wěn)態(tài)的正調(diào)節(jié)中具有重要生理作用的必需營養(yǎng)素。維生素D可通過暴露于日光而在皮膚中從頭形成或它可從飲食吸收。存在兩種形式維生素D :維生素D2 (麥角鈣化醇)和維生素D3 (膽鈣化醇)。維生素D3是由動物從頭合成的形式。它還是加入到在美國生產(chǎn)的乳制品和某些食品中的常見補充物。飲食和內(nèi)在合成的維生素D3必須經(jīng)歷代謝激活以產(chǎn)生生物活性的代謝物。在人類中，維生素D3激活的最初步驟主要發(fā)生在肝中并包括羥基化作用以形成中間體代謝物25-羥基膽鈣化醇(骨化二醇；250HD3)。骨化二醇是循環(huán)中維生素D3的主要形式。然后循環(huán)的250HD3由腎轉(zhuǎn)化，形成1，25-二羥基維生素D3 (骨化三醇；1，25 (OH)2D3),其通常被認為是具有最高生物活性的維生素D3的代謝物。
維生素D2來自真菌和植物來源。許多非處方膳食補充物(dietary supplements)含有麥角鈣化醇(維生素％)而不是膽鈣化醇(維生素隊)。麥角骨化醇(Drisdol)—在美國可獲得的唯一的維生素D的高效處方形式——是用麥角鈣化醇配制的。維生素D2在人類中經(jīng)歷與維生素D3相似的代謝激活途徑，形成代謝物250冊2和1，25 (OH)2D20維生素仏和維生素D3已長期被假定在人類中在生物學(xué)上相等，然而最近的報道提出這兩種形式的維生素D在生物活性和生物利用率上可存在差異(Armas et. al.，(2004) J. Clin. Endocrinol.Metab. 89:5387-5391)。
維生素D—無活性維生素D先驅(qū)體一的測量在臨床情況中不常發(fā)生。相反，25-羥基維生素D3、25-羥基維生素D2和總25-羥基維生素D ( “250HD”)的血清水平是維生素D營養(yǎng)狀況和某些維生素D類似物的效力的有用指示物。250HD的測量通常用于鈣代謝病癥的診斷和處理。在這方面，低水平250HD指示與疾病如低鈣血癥、低磷血癥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進癥、升高的堿性磷酸酶、成人中骨軟化癥和兒童中佝僂病有關(guān)的維生素D缺乏。在疑似維生素D中毒的患者中，升高水平的250HD使該病癥區(qū)別于引起高鈣血癥的其它病癥。
I, 25 (OH)2D的測量還用于臨床情況。某些疾病狀態(tài)可通過循環(huán)水平的1，25 (OH)2D反映，例如腎疾病和腎功能衰竭常常導(dǎo)致低水平的1，25 (OH) 2D。升高水平的1，25 (OH)2D可指示過量的甲狀旁腺素或可指示某些疾病如結(jié)節(jié)病或某些類型的淋巴瘤。
維生素D代謝物的檢測已通過用對250HD2和250HD3共同特異的抗體的放射免疫測定完成。因為目前的基于免疫學(xué)的測定不分別分辨250HD2和250HD3，所以不求助于其它試驗，維生素D的任何營養(yǎng)缺乏的來源不能被確定。已發(fā)表了公開利用質(zhì)譜法檢測特定維生素D代謝物的方法的報道。在一些報道中，維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前被衍生，但是在其它的報道中，它們不是這樣。例如Holmquist，et al. 2007年12月28日提交的美國專利申請系列號 11/946765 ;Yeung B，et al. , J Chromatogr. 1993，645 (I) : 115-23 ;Higashi T, et al. , Steroids. 2000, 65(5) :281-94 ；Higashi T, et al., Biol PharmBull. 2001，24(7) :738-43 ；Higashi T, et al.，J Pharm Biomed Anal. 2002，29(5) :947-55 ；Higashi T, et al. , Anal. Bioanal Chem, 2008, 391:229-38 ；和 Aronov, et al. , AnalBioanal Chem，2008，391:1917_30公開通過在質(zhì)譜法之前衍生代謝物而檢測各種維生素D代謝物的方法。檢測未衍生的維生素D代謝物的方法在Clarke, et al.，2005年4月6日提交的美國專利申請系列號11/101，166和2006年3月21日提交的11/386,215中，和Singh，et al.，2004年10月24日提交的美國專利申請系列號10/977，121中被報道。還已公開了報道，其公開用Cookson型試劑，特別是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)和4-[2-(6，7-二甲氧基-4-甲基_3_氧代-3，4-二氫喹喔啉基(dihydroquinoxalyl))乙基]_1，2，4_三唑啉 _3，5_ 二酮(DMEQ-TAD)進行的維生素 D3 的衍 生。參見 Aberhart, J, et al. , J. Org. Chem. 1976, 41 (12) : 2098-2102 和 Kamao, M, et al. , JChromatogr. B2007, 859:192-200。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供用單個質(zhì)譜測定來測定多個試驗樣品中每個試驗樣品的留族化合物的量的方法。該方法包括不同地處理每個試驗樣品以形成多個處理的樣品，其中由于處理，每個處理的樣品中的留族化合物可通過質(zhì)譜法區(qū)別于其它處理的樣品中的留族化合物；合并處理的樣品以形成多重樣品；使多重樣品在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測的離子的條件下經(jīng)歷電離源，其中一種或多種從來自每個處理的樣品的留族化合物產(chǎn)生的離子不同于一種或多種從來自其它處理的樣品的留族化合物產(chǎn)生的離子；通過質(zhì)譜法檢測一種或多種來自每個處理的樣品的留族化合物的離子的量；和使一種或多種來自每個處理的樣品的留族化合物的離子的量與每個試驗樣品中留族化合物的量相關(guān)聯(lián)。
在一些實施方式中，處理試驗樣品包括使每個試驗樣品在適于產(chǎn)生衍生的留族化合物的條件下經(jīng)歷不同的衍生劑。在一些實施方式中，一個試驗樣品可被處理，無需使該樣品經(jīng)受衍生劑。
在一些實施方式中，在多個試驗樣品的處理中使用的不同的衍生劑是各自的同位素變體。在一些實施方式中，不同的衍生劑是Cookson型衍生劑；如選自4-苯基-1，2, 4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4- [2- (6，7- 二甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- 二氫喹喔啉基)乙基]_1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD)、4_(4_ 硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)、4_ 二茂鐵基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(FMTAD)和其同位素變體的Cookson型衍生劑。在一個相關(guān)的實施方式中，Cookson型衍生劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的同位素變體。在一個具體實施方式
中，多個樣品包括兩個樣品，第一 Cookson型衍生試劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，第二 Cookson型衍生試劑是13C6-4-苯基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
在一些實施方式中，留族化合物是維生素D或維生素D相關(guān)的化合物。在相關(guān)的實施方式中，留族化合物選自維生素D2、維生素D3、25-羥基維生素D2(250HD2)、25_羥基維生素03(250冊3)、10，25-二羥基維生素02(10，2501102)和la，25_二羥基維生素D3(l a，250HD3)。在具體的實施方式中，留族化合物是25-羥基維生素D2(250HD2)或25-羥基維生素D3(250HD3)。
可進行上面描述的方法，用于分析多個試驗樣品的每個中的兩種或多種留族化合物。在這些實施方式的一些中，每個試驗樣品中的兩種或多種留族化合物可包括選自25-羥基維生素D2(250HD2)和25-羥基維生素D3(250HD3)的至少一種留族化合物。在一些實施方式中，每個試驗樣品中的兩種或多種留族化合物是25-羥基維生素D2(250HD2)和25-羥基維生素D3(250HD3)。
在具體實施方式
中，用單個質(zhì)譜測定兩個試驗樣品的每個中的一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物的量。在該實施方式中，通過在適合產(chǎn)生一種或多種維生素D或維 生素D相關(guān)衍生物的條件下使第一試驗樣品經(jīng)受4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的第一同位素變體而產(chǎn)生第一處理的樣品；通過在適合產(chǎn)生一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的條件下使第二試驗樣品經(jīng)受4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的第二同位素變體而產(chǎn)生第二處理的樣品，其中PTAD的第一和第二同位素變體可通過質(zhì)譜法區(qū)分；將第一處理的樣品和第二處理的樣品混合以形成多重樣品；將來自多重樣品中每個處理的樣品的一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)衍生物在適合產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測的離子的條件下經(jīng)歷電離源，其中來自第一處理的樣品的每種維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的一種或多種離子不同于來自第二處理的樣品的維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的一種或多種離子；來自每個處理的樣品的一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)衍生物的一種或多種離子的量通過質(zhì)譜法來測定；測定的離子的量與第一或第二試驗樣品中的維生素D或維生素D相關(guān)化合物的量相關(guān)。
在一些具體實施方式
中，4-苯基-1,2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的第一同位素變體是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)的第二同位素變體是13C6-4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(13C6-PTAD)。
在一些具體實施方式
中，一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物選自25-羥基維生素02(250冊2)和25-羥基維生素D3(250HD3)。在一些相關(guān)的具體實施方式
中，一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物包括25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3(250HD3)。在一些相關(guān)的具體實施方式
中，一種或多種維生素D或維生素D相關(guān)化合物是25-羥基維生素D2 (250HD2)和25-羥基維生素D3 (250HD3)。
在一些實施方式中，使多重樣品在經(jīng)歷電離源之前經(jīng)歷萃取柱和分析柱。在一些相關(guān)實施方式中，萃取柱是固相萃取(SPE)柱。在其它相關(guān)實施方式中，萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。在一些實施方式中，分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
在利用萃取柱、分析柱和電離源中的兩個或多個的實施方式中，這些組分中的兩種或多種可以以聯(lián)機方式連接以允許自動化的樣品處理和分析。
在本文描述的方法中，質(zhì)譜法可以是串聯(lián)質(zhì)譜法。在利用串聯(lián)質(zhì)譜法的實施方式中，串聯(lián)質(zhì)譜法可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來進行，包括例如，多重反應(yīng)監(jiān)測、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描。
在本文描述的方法中，留族化合物可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的離子化技術(shù)被離子化。在一些實施方式中，電離源是激光二極管熱解吸(LDTD)電離源。
在優(yōu)選實施方式中，試驗樣品包括生物樣品，如血漿或血清。
如本文所用，術(shù)語“多重樣品”指通過如下而制備的樣品混合兩個或多個樣品以形成單個的“多重(multiplex)”樣品，然后將該樣品進行質(zhì)譜分析。在本文描述的方法中，對兩個或多個試驗樣品中的每個不同地處理以產(chǎn)生許多不同處理的樣品。然后將這些許多不同處理的樣品混合以產(chǎn)生單個“多重”樣品，然后將該樣品進行質(zhì)譜分析。
如本文所用，術(shù)語“留族化合物”指為數(shù)眾多的天然存在的或合成的脂溶性有機化合物中的任何一種，其具有作為基礎(chǔ)的在四個環(huán)中排列的17個碳原子并包括留醇和膽汁酸、腎上腺和性激素、某些天然藥物如洋地黃化合物、以及某些維生素和相關(guān)化合物(如維生素D、維生素D類似物和維生素D代謝物)。
如本文所用，術(shù)語“維生素D或維生素D相關(guān)化合物”指任何天然或合成形式的維生素D，或與通過維生素D的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的維生素D有關(guān)的任何化學(xué)物種，如維生素D代謝的中間體和產(chǎn)物。例如，維生素D可指維生素D2和維生素D3中的一種或多種。維生素D還 可被稱作“營養(yǎng)性”維生素D以區(qū)別于通過維生素D的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的化學(xué)物種。維生素D相關(guān)化合物可包括維生素D2或維生素D3的類似物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的化學(xué)物種，或與維生素D2或維生素D3有關(guān)的化學(xué)物種。維生素D相關(guān)化合物，特別是維生素D代謝物，可在動物的循環(huán)中找到和/或可由生物體，如動物產(chǎn)生。維生素D代謝物可以是天然存在的形式的維生素D代謝物或可以是合成的維生素D類似物的代謝物。在某些實施方式中，維生素D相關(guān)化合物可包括一種或多種選自25-羥基維生素D3、25_羥基維生素D2、I a，25- 二羥基維生素D3和I a，25- 二羥基維生素D2的維生素D代謝物。
如本文所用，“衍生”指使兩個分子反應(yīng)以形成新的分子。因此，衍生劑是與另一個物質(zhì)反應(yīng)以衍生物質(zhì)的劑。例如，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)是可與維生素D代謝物反應(yīng)以形成PTAD-衍生的維生素D代謝物的衍生試劑。
如本文所用，“不同的衍生劑”是通過質(zhì)譜法可區(qū)別的衍生劑。作為一個實例，相同衍生劑的兩個同位素變體通過質(zhì)譜法是可區(qū)別的。作為另一個實例，相同衍生劑的鹵代變體通過質(zhì)譜法也是可區(qū)別的。例如，可利用相同的Cookson型劑，如4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)的鹵代和非鹵代形式。另外，可利用相同的Cookson型劑的兩個鹵代形式，但用不同的鹵素或用不同數(shù)目的鹵素鹵代。作為另一個實例，可利用兩種不同的Cookson型劑，如4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4-甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(MTAD)和4- (4-硝基苯基)-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)。以上實例說明通過質(zhì)譜法可區(qū)別的衍生劑的原理。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，其它的實例——包括上面任何的組合一可以是可能的。
如本文所用，甾族化合物的衍生形式的名稱包括關(guān)于衍生的性質(zhì)的表示。例如，25-羥基維生素D2的PTAD衍生物被表示為PTAD-25-羥基維生素D2 (或PTAD_250HD2)。
如本文所用，“Cookson型衍生劑”是4_取代的1，2，4_三唑啉_3，5_ 二酮化合物。示例性的Cookson型衍生劑包括4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)、4_甲基-I, 2，4-三唑啉-3，5- 二酮(MTAD)、4_[2_(6，7- 二甲氧基-4-甲基 _3_ 氧代-3，4- 二氫喹喔啉基)乙基]-1,2，4-三唑啉-3，5-二酮(DMEQTAD)、4_(4-硝基苯基)-1，2，4_三唑啉-3，5- 二酮(NPTAD)和4- 二茂鐵基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(FMTAD)。另夕卜，在一些實施方式中可利用Cookson型衍生劑的同位素標記的變體。例如，13C6-PTAD
全文摘要
本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法對甾族化合物的定量測量。在具體方面，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法對來自多個樣品的甾族化合物的定量測量方法。
文檔編號G01N31/00GK102812356SQ201080063451
公開日2012年12月5日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者B·霍爾奎斯特, N·J·克拉克 申請人:奎斯特診斷投資公司