專利名稱：流式粒子圖像分析方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對流動池中的粒子圖像進(jìn)行拍攝，對粒子的靜止圖像進(jìn)行分析的流式粒子圖像分析方法和裝置。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有的粒子圖像分析中，為了在形態(tài)學(xué)上檢查血液中的細(xì)胞、尿中的粒子，通過以下的方法進(jìn)行檢查，即由檢查技師在玻璃載片上做成標(biāo)本，直接進(jìn)行顯微鏡觀察。顯微鏡檢查存在結(jié)果受到技師的熟練程度的影響，檢查需要時間等問題，所以要求提高效率。近年來，隨著檢查的自動化的發(fā)展，例如在專利文獻(xiàn)1、2中，公開了以下的流式粒子圖像分析裝置，使試樣通過特別形狀的流動池，使試樣中的粒子在寬闊的攝影區(qū)域中流動，點亮閃光燈，作為靜止圖像拍攝試樣中的粒子的放大圖像，從各靜止圖像中對粒子進(jìn)行分類。流式粒子圖像分析裝置通過外側(cè)的鞘液的流動將試樣液體包圍來流到特殊形狀的流動池，由此形成扁平的流動。但是，由于鞘液沒有流過預(yù)定量，在鞘液的流動中存在不均勻等理由，有時樣本液體的流動的形狀比設(shè)定值厚。如果樣本液的流動變厚，則有時粒子位置從聚焦點位置偏離，無法得到正確的圖像。為了在流式粒子圖像分析裝置中維持粒子的分類精度，需要始終在聚焦點位置拍攝粒子的靜止圖像。為了始終得到焦點聚焦的圖像，例如需要進(jìn)行以下的處理。(1)在裝置啟動時，正確地調(diào)整聚焦點位置。(2)在(1)后，還定期地檢查聚焦點位置和樣本液的流動的厚度。例如在專利文獻(xiàn)3 5中記載了(1)的調(diào)焦方法。在專利文獻(xiàn)3中，記載了以下的方法在調(diào)焦時，一邊使流動池或物鏡移動，一邊在多個不同的位置，得到由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的相同大小的標(biāo)準(zhǔn)粒子(以下稱為標(biāo)準(zhǔn)粒子)的靜止圖像，計算各位置處的標(biāo)準(zhǔn)粒子的平均面積值，進(jìn)行流動池或物鏡的位置調(diào)整，使該值成為最小。在專利文獻(xiàn)4中，表示了使用了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)焦方法。在該方法中，預(yù)先使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)在多個焦點位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像的特征量(濃度分散、濃度對比度、濃度微分等)，將結(jié)果載入裝置中，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行調(diào)焦。在專利文獻(xiàn)5中，表示了以下的方法替代專利文獻(xiàn)3的面積，使用標(biāo)準(zhǔn)粒子的R圖像中的等級分散值。這表示了以下的方法，根據(jù)在明亮的狀態(tài)和昏暗的狀態(tài)的中間狀態(tài)下能夠看到在聚焦點位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子的性質(zhì)，進(jìn)行流動池或物鏡的位置調(diào)整，以使?jié)舛确稚?(等級分散)成為最大值與最小值的大致中央值。例如在專利文獻(xiàn)5中記載了( 的聚焦點位置的檢查和檢查樣本液的流動的厚度的方法。在專利文獻(xiàn)5中，公開了以下的方法，根據(jù)上述等級分散值和樣本寬度(靜止圖像的橫向)的關(guān)系圖，利用等級分散值的分布，檢查從聚焦點的偏離和樣本液的流動的厚度。 表示了在等級分散值從聚焦點位置的值偏離的情況下，判斷為焦點沒有聚焦，在等級分散值的波動(等級分散值的分散)大時，判斷為樣本液的流動變厚的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
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專利文獻(xiàn)1 日本特開平5496915號公報專利文獻(xiàn)2 日本特開昭63-94156號公報專利文獻(xiàn)3 日本特開2007-304059號公報專利文獻(xiàn)4 日本特開平9-311102號公報專利文獻(xiàn)5 日本特開2002-62251號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題關(guān)于上述(1)的粒子圖像的聚焦點調(diào)整，專利文獻(xiàn)3的方法對調(diào)焦的參數(shù)使用了面積值。我們通過實驗確認(rèn)可知，如圖1所示，在調(diào)焦中使用的標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑小到 1 μ m的情況下，聚焦點位置的面積最小，但顆粒直徑越大，成為面積最小值的位置越是從聚焦點位置偏離。專利文獻(xiàn)4的方法對調(diào)焦使用了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。為了使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，需要預(yù)先通過從所有位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像得到的特征量進(jìn)行學(xué)習(xí)。另外，因為需要通過考慮了每日的差異、 裝置之間的差異的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像得到的特征量進(jìn)行學(xué)習(xí)，所以數(shù)據(jù)取得需要時間。另外，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)也需要時間。專利文獻(xiàn)5的方法對調(diào)焦的參數(shù)使用了等級分散值。等級分散值與焦點位置的關(guān)系如圖2那樣，不是單調(diào)減少，所以例如在調(diào)焦開始時刻的狀態(tài)位于圖中的箭頭A的情況下，難以判斷使流動池或物鏡向哪個方向移動才好。關(guān)于上述O)的聚焦點位置的檢查和檢查樣本液的流動的厚度的方法，專利文獻(xiàn) 5的方法使用了等級分散值。根據(jù)本方法，在判定樣本液的流動的厚度的情況下，例如如圖 3所示，在樣本的厚度是dl的情況下，等級分散值分布在Δ1的范圍內(nèi)。但是，在聚焦點位置偏離，流到與dl相同的寬度d2的位置時，分布的波動成為與Δ1不同的Δ2。因此，可知難以通過使用等級分散值來正確了解流動的厚度。根據(jù)以上說明，在本發(fā)明中，其目的在于提供一種高精度、高效率地調(diào)整聚焦點位置，并且在調(diào)整聚焦點位置后，高精度地進(jìn)行聚焦點位置的偏離檢查和樣本液的流動的厚度檢查的方法和裝置。解決課題的手段為了解決上述課題，本發(fā)明的流式粒子圖像分析方法包括使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在流動池中流動，通過包含物鏡的拍攝部對標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的步驟；根據(jù)靜止圖像，作為粒子圖像特征參數(shù)值，計算粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值的步驟；以及根據(jù)該參數(shù)值，進(jìn)行拍攝部的調(diào)焦的步驟。通過該結(jié)構(gòu)，能夠使用各種顆粒直徑的標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行調(diào)焦，另外能夠掌握裝置啟動時(調(diào)焦開始時)的狀態(tài)，能夠高效地進(jìn)行調(diào)焦。并且，本發(fā)明的流式粒子圖像分析方法包括使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在流動池中流動，在拍攝部對標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的步驟； 從靜止圖像中抽出表示拍攝部的焦點位置的粒子圖像特征參數(shù)值的步驟；將上述參數(shù)值換算為焦點位置的步驟；以及根據(jù)換算后的焦點位置的波動，取得樣本液的厚度信息的步驟。作為粒子圖像特征參數(shù)值，可以使用粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值。根據(jù)該結(jié)構(gòu)，能夠根據(jù)焦點位置的值和波動檢查聚焦點位置的偏離、檢查樣本液的流動的厚度。另外，本發(fā)明的流式粒子圖像分析裝置包括通過鞘液包住樣本液使樣本液流動的流動池；對流動池進(jìn)行照射的脈沖光源；具有物鏡的拍攝部；使流動池和物鏡之間的距離可變的驅(qū)動單元；使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在流動池中流動，在拍攝部中對標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的單元；根據(jù)靜止圖像，作為粒子圖像特征參數(shù)值，計算粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值的單元。還具有根據(jù)該參數(shù)值，通過驅(qū)動單元使流動池與物鏡之間的距離可變，來進(jìn)行拍攝部的調(diào)焦的單元?；蛘?，具有將參數(shù)值換算為拍攝部的焦點位置的單元；以及根據(jù)換算后的焦點位置，得到聚焦點位置的信息的單元。或者，還可以具有將參數(shù)值換算為焦點位置的單元； 以及根據(jù)換算后的焦點位置的波動，得到樣本液的厚度信息的單元。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的聚焦點調(diào)整方法，能夠高精度并且高效地使用各種顆粒直徑的標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行聚焦點調(diào)整。另外，根據(jù)使用了本發(fā)明的參數(shù)的檢查方法，能夠高精度地檢查聚焦點位置和樣本液的流動的厚度。


圖1是表示顆粒直徑和在各顆粒直徑下表示面積最小值的位置與聚焦點位置的差的分布圖。圖2是表示等級分散值與各焦點位置的關(guān)系的一個例子的圖。圖3是表示等級分散值與各焦點位置的分布的一個例子的圖。圖4是說明流式粒子圖像分析裝置的結(jié)構(gòu)例子的圖。圖5是說明流式粒子圖像分析裝置的圖像輸入裝置的結(jié)構(gòu)例子的圖。圖6是說明流式粒子圖像分析裝置的聚焦點調(diào)整時的圖像處理方法的圖。圖7是說明在代表性的焦點位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像例子和通過了標(biāo)準(zhǔn)粒子的中心的X方向的濃度曲線的示意圖例的圖。圖8是說明求出調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度比)的詳細(xì)步驟的圖。圖9是說明調(diào)焦用參數(shù)的圖。圖10是說明求出調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度差)的詳細(xì)步驟的圖。圖11是說明求出調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度)的詳細(xì)步驟的圖。圖12是表示調(diào)焦用參數(shù)與各焦點位置的關(guān)系的一個例子的圖。圖13是說明調(diào)焦方法的詳細(xì)步驟的圖。圖14是說明使用了近似式的調(diào)焦方法的詳細(xì)步驟的圖。圖15是說明檢查聚焦點位置的偏離和樣本液的流動的厚度的方法的詳細(xì)步驟的圖。圖16是表示聚焦點偏離時的焦點位置直方圖的一個例子的圖。
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圖17是表示樣本液的流動的厚度變厚時的焦點位置直方圖的一個例子的圖。圖18是說明本發(fā)明的流式粒子圖像分析裝置的結(jié)構(gòu)例子的圖。
具體實施例方式下面，說明本發(fā)明的實施方式。圖4是說明應(yīng)用本發(fā)明的流式粒子圖像分析裝置的結(jié)構(gòu)例子的圖。在測量裝置本體401中，通過染色液添加裝置402向試樣添加染色液，一定時間后，通過圖像輸入裝置403 拍攝試樣中的粒子的放大靜止圖像。把拍攝到的圖像轉(zhuǎn)送到圖像處理裝置406，通過圖像模式識別進(jìn)行試樣中的粒子的分類，對1個檢體中包含的試樣中的粒子的種類及其出現(xiàn)頻度進(jìn)行計數(shù)。作為圖像處理裝置406，例如使用具備顯示器404、鍵盤405的通用的個人計算機。計數(shù)的結(jié)果通過顯示器404報告給操作者。將通過圖像輸入裝置403拍攝的圖像、圖像處理裝置406的測量結(jié)果、各對象區(qū)域的分類結(jié)果和在圖像模式識別過程中得到的圖像特征量等數(shù)據(jù)保存在圖像處理裝置406內(nèi)的存儲裝置中。另外，圖像處理裝置406還兼有預(yù)覽功能。在預(yù)覽功能中，操作者能夠顯示任意的圖像，執(zhí)行自動分類的修正、基于目視的細(xì)分類。圖5是構(gòu)成測量裝置本體401的圖像輸入裝置403的結(jié)構(gòu)圖。在圖像輸入裝置403 中，使用流動池501，在物鏡503與脈沖燈502之間，作成寬度廣厚度薄的扁平的試樣505的流動。試樣505以被外側(cè)的鞘液流包圍橫穿光軸的方式流動。向通過流動池501形成的試樣505的流動瞬間照射脈沖燈502的光，通過物鏡503放大后的試樣505中的粒子圖像作為靜止圖像被照相機504拍攝。作為照相機504，例如可以使用CCD彩色照相機、CMOS彩色照相機等。把得到的圖像轉(zhuǎn)送到圖像處理裝置406。通過焦點機構(gòu)506，物鏡503能夠移動。通過焦點機構(gòu)506的電動機509的旋轉(zhuǎn)， 稍微移動進(jìn)給螺釘508，由此，與臂507聯(lián)動的物鏡503沿前后方向在光軸上移動。通過調(diào)整流動池501與物鏡503之間的距離(焦點位置)，能夠進(jìn)行聚焦點調(diào)整。另外，通過焦點機構(gòu)506可動的不限于物鏡503，也可以是流動池501。在進(jìn)行聚焦點調(diào)整時，作為試樣505，使用包含很多由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的同一尺寸的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液。作為標(biāo)準(zhǔn)粒子，例如使用聚乙烯、聚苯乙烯等市場銷售的透明球狀粒子。通過焦點機構(gòu)506使物鏡503移動來改變拍攝系統(tǒng)的焦點位置，在設(shè)置在流動池的流動中的多個不同的焦點位置上，拍攝多張標(biāo)準(zhǔn)粒子的靜止圖像。把得到的圖像轉(zhuǎn)送到圖像處理裝置406。圖6是說明聚焦點調(diào)整時的圖像處理裝置406中的圖像處理方法的詳細(xì)的圖。照相機504拍攝的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像作為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)被轉(zhuǎn)送到圖像處理裝置406。在著色修正處理步驟S601中，除去由于光學(xué)系統(tǒng)的特性造成的圖像上的濃度不均。在平滑化處理步驟S602中，進(jìn)行噪聲除去。作為手段，例如可以使用移動平均法、 介質(zhì)濾波處理等已知的技術(shù)。另外，也可以不進(jìn)行平滑化處理。在區(qū)域分割處理步驟S603中，將拍攝了標(biāo)準(zhǔn)粒子的圖像分割為背景區(qū)域和對象區(qū)域，作成將背景區(qū)域設(shè)為0，將對象區(qū)域設(shè)為1的2值圖像。在區(qū)域分割修正處理步驟S604中，進(jìn)行對象區(qū)域的填坑、背景區(qū)域的噪聲除去等2值圖像的修正、整形。作為手段，例如可以使用包含加粗處理、減細(xì)處理等濾波處理在內(nèi)的已知技術(shù)。在標(biāo)記處理步驟S605中，對2值圖像的每個連接成分進(jìn)行標(biāo)記處理，附加用于唯一確定圖像中的多個對象的編號。在特征量計算處理步驟S606中，針對附加了編號的各個對象區(qū)域，計算面積、后述的調(diào)焦用參數(shù)等特征量。在步驟S607中，判斷得到的對象區(qū)域是否是單一的標(biāo)準(zhǔn)粒子。在滿足(對象區(qū)域的面積)SM的情況下，看作是單一的標(biāo)準(zhǔn)粒子，作為調(diào)焦用圖像前進(jìn)到下一步驟。在不滿足的情況下，看作是多個連接標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像、或者標(biāo)準(zhǔn)粒子以外的成分而廢棄。在此， m、M預(yù)先通過試驗而求出最優(yōu)值。另外，也可以通過硬件進(jìn)行圖6所示的處理的全部或一部分。圖7是在代表性的焦點位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子的圖像例子和通過了標(biāo)準(zhǔn)粒子的中心的χ 方向的濃度曲線的示意圖。圖7(a)表示包含圖5的物鏡503和照相機504的拍攝系統(tǒng)的焦點位置遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)粒子時的情況，圖7(b)表示拍攝系統(tǒng)的焦點位置與標(biāo)準(zhǔn)粒子一致，焦點與標(biāo)準(zhǔn)粒子相符時的情況，圖7(c)表示拍攝系統(tǒng)的焦點位置位于標(biāo)準(zhǔn)粒子前側(cè)的情況。拍攝系統(tǒng)的焦點位置位于遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)粒子一側(cè)時的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像701如圖7(a)所示那樣，標(biāo)準(zhǔn)粒子的中心部分比背景區(qū)域亮。關(guān)于此時的濃度曲線704，粒子中心附近的濃度值最大，粒子的輪廓部分的濃度值最小，但在背景部分中，表示出比輪廓部分大但比粒子中心小的濃度值。相反，拍攝系統(tǒng)的焦點位置位于標(biāo)準(zhǔn)粒子前側(cè)時的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像703如圖7(c)所示那樣，中心部分沒有注目的特征。此時的濃度曲線706如圖示那樣，整個粒子部分表示出小的濃度值，在粒子中心附近的濃度值和輪廓部分的濃度值中看不到變化。另一方面，在聚焦點位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像702如圖7(b)所示，粒子的中心部分具有亮的背景和暗的輪廓部分的中間的亮度。這時的濃度曲線705在中心附近的濃度值中可以看出特征。即，通過了標(biāo)準(zhǔn)粒子的中心的濃度曲線705在粒子中心部分取得中等程度的濃度值，在粒子輪廓部分顯示出更小的濃度值，在背景區(qū)域中顯示出比粒子中心部分的濃度值大的濃度值。圖8是表示求出在特征量計算處理步驟S602中計算的調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度比) 的詳細(xì)步驟的圖。另外，圖9表示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)粒子的圖像求出的通過標(biāo)準(zhǔn)粒子的中心的典型的濃度曲線。在圖8的步驟S801中，求出圖9所示的濃度值Pd。濃度值Pd相當(dāng)于各圖像中的背景等級。在各圖像中作成了濃度直方圖時，作為具有最頻值的濃度值來求出背景等級。在步驟S802中，求出圖9所示的濃度值bla。濃度值bla是表示標(biāo)準(zhǔn)粒子的對象區(qū)域的輪廓附近的濃度值，表示在對象區(qū)域中濃度值最小(暗)的值。作為整個對象區(qū)域中的最小濃度值，求出濃度值bla。在步驟S803中，求出圖9所示的濃度值cen。濃度值cen是對象區(qū)域的中心附近的濃度值，表示在對象區(qū)域中心部分濃度值最大(亮)的值。作為包含對象區(qū)域的中心像素的1或多個像素的最大濃度值來求出濃度值cen。另外，關(guān)于中心部分的像素數(shù)，根據(jù)使用的標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑通過實驗求出最優(yōu)的像素數(shù)。另外，濃度值cen并不限于最大濃度值，也可以使用包含中心像素的1個或多個像素的平均濃度值。
在步驟S804中，根據(jù)濃度值pd、cen、bla，求出圖9所示的值a (各圖像中的背景等級與對象區(qū)域的輪廓附近的濃度值的差)和值b (各圖像中的背景等級與對象區(qū)域的中心附近的濃度值的差)。具體地說，根據(jù)下式(1)、(2)計算出各值。a = Pd-bla ......(1)b = Pd-cen ......(2)在步驟S805中，根據(jù)值a和b，根據(jù)下式( 計算出調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度比)。調(diào)焦用參數(shù)=b/a ……(3)調(diào)焦用參數(shù)可以使用上述中心濃度比以外的值。在此，作為中心濃度比以外的調(diào)焦用參數(shù)的例子，說明中心濃度差和中心濃度值。圖10是表示使用中心濃度差作為在特征量計算處理步驟S606中計算出的調(diào)焦用參數(shù)時的詳細(xì)步驟的圖。在步驟S1001中，求出對象區(qū)域的輪廓附近的濃度值bla。求出的方法可以使用圖 8的步驟S802所示的方法。在步驟S1002中，求出對象區(qū)域的中心附近的濃度值cen。求出的方法可以使用圖 8的步驟S803所示的方法。在步驟S1003中，根據(jù)在步驟S1001中求出的濃度值bla和在步驟S1002中求出的濃度值cen，根據(jù)下式(4)計算調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度差)。調(diào)焦用參數(shù)=cen-bla ……圖11是表示使用中心濃度值作為在特征量計算處理步驟S606中計算出的調(diào)焦用參時的詳細(xì)步驟的圖。在步驟Sl 101中，求出各圖像中的背景等級。求出的方法可以使用圖8的步驟S801 所示的方法。在步驟S1102中，求出對象區(qū)域的中心附近的濃度值cen。求出的方法可以使用圖 8的步驟S803所示的方法。在步驟Sl 103中，根據(jù)在步驟SllOl中求出的濃度值Pd和在步驟Sl 102中求出的濃度值cen，根據(jù)下式( 計算出調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度值)。調(diào)焦用參數(shù)=Pd-cen ……(5)另外，中心濃度值并不限于(Pd-cen)，也可以使用cen的值本身。另外，對于針對調(diào)焦用參數(shù)使用中心濃度比、中心濃度差、中心濃度值中的哪一個，可以根據(jù)安裝在裝置中的光學(xué)系統(tǒng)的特性選擇最適于調(diào)焦的參數(shù)。圖12表示例如在圖5所示的標(biāo)準(zhǔn)粒子試樣505中使用顆粒直徑10 μ m的標(biāo)準(zhǔn)粒子，根據(jù)使物鏡503每次1 μ m地移動30點的情況下在設(shè)置在流動池中的各焦點位置拍攝到的圖像計算出的調(diào)焦用參數(shù)(中心濃度比)值的例子。符號1201是在各焦點位置對根據(jù)得到的大約100張標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像計算出的調(diào)焦用參數(shù)的平均值進(jìn)行描繪得到的。另外， 所使用的標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑可以與在流式粒子圖像分析裝置中成為對象的成分相配合， 選擇最適合的大小。另外，對于物鏡的移動幅度，根據(jù)所使用的標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑，預(yù)先通過實驗確定最適合的幅度。在計算調(diào)焦用參數(shù)時，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)粒子的顏色特性和照相機的分光特性，選擇使用靈敏度最高的顏色濃度值。關(guān)于在各焦點位置的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像的收集張數(shù)，根據(jù)調(diào)焦用參數(shù)的波動、照相機的特性，預(yù)先通過實驗求出最適合的張數(shù)。
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如圖12所示那樣，焦點位置與調(diào)焦用參數(shù)的關(guān)系是廣范圍并且單調(diào)增加，聚焦點位置1202位于調(diào)焦用參數(shù)的最大值和最小值的大致中央的位置。例如在圖12的例子時， 在聚焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)值(中心濃度比)為0.觀。另外，關(guān)于聚焦點位置，根據(jù)所使用的標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑和光學(xué)系統(tǒng)的特性，預(yù)先通過實驗求出最適合的位置。在此，說明了使用中心濃度比作為調(diào)焦用參數(shù)的情況，但在使用中心濃度值、中心濃度值作為調(diào)焦用參數(shù)的情況下也一樣，可以決定聚焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)值。圖13是表示本發(fā)明的聚焦點調(diào)整方法的詳細(xì)步驟的一個例子的圖。在步驟S1301中，使物鏡移動到預(yù)先確定的初始位置。這可以在裝置啟動時自動地移動。在步驟S1302中，計算在初始位置的調(diào)焦用參數(shù)平均值。在步驟S1303中，使物鏡例如移動1 μ m。預(yù)先通過實驗設(shè)定移動幅度和移動方向。 另外，使計數(shù)值η加1。在步驟S1304中，計算移動后的位置的調(diào)焦用參數(shù)平均值。在步驟S1305中，判斷物鏡的移動次數(shù)(η)是否達(dá)到了預(yù)先通過實驗確定的次數(shù)。 在滿足η = N的情況下，物鏡移動了規(guī)定的次數(shù)，前進(jìn)到步驟S1306。在不滿足的情況下，返回到步驟S1303，直到滿足步驟S1305為止，重復(fù)進(jìn)行物鏡的移動、各焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)的平均值的計算。另外，對于N，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑、調(diào)焦用參數(shù)，預(yù)先求出最適合的次數(shù)。在步驟S1306中，使物鏡移動到在求出的各焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)成為最接近P 的值的焦點位置。P是預(yù)先通過實驗確定的值，例如在圖12的例子的情況下，是0.觀。另外，在步驟S1301中，也可以不將預(yù)先確定的初始位置作為初始位置，而是將裝置啟動時的位置作為初始位置。在該情況下，關(guān)于步驟S1303中的物鏡的移動，根據(jù)在步驟 S1302中求出的調(diào)焦用參數(shù)值位于預(yù)先求出的關(guān)系圖例如圖12的哪個邊，來判斷物鏡的移動方向。圖14表示使用了近似式的聚焦點調(diào)整方法的詳細(xì)步驟的一個例子。在步驟S1401中，使物鏡移動到預(yù)先確定的初始位置。也可以在裝置啟動時自動地移動。在步驟S1402中，計算初始位置的調(diào)焦用參數(shù)平均值。在步驟S1403中，使物鏡例如移動3μπι。預(yù)先通過實驗設(shè)定移動幅度和移動方向。 另外，使計數(shù)值η加1。在步驟S1404中，計算移動后的位置的調(diào)焦用參數(shù)平均值。在步驟S1405中，判斷物鏡的移動次數(shù)(η)是否達(dá)到了預(yù)先通過實驗確定的次數(shù)。 在滿足η = N的情況下，物鏡移動了規(guī)定的次數(shù)，前進(jìn)到步驟S1406。在不滿足的情況下，返回到步驟S1403，直到滿足步驟S1405為止，重復(fù)進(jìn)行物鏡的移動、各焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)的平均值的計算。另外，對于N，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑、調(diào)焦用參數(shù)，預(yù)先求出最適合的次數(shù)。在步驟S1406中，根據(jù)直到步驟S1405為止得到的多個不同的位置的焦點位置和調(diào)焦用參數(shù)值，計算近似式。例如可以使用sigmoid函數(shù)等公知的函數(shù)，求出近似式。在步驟S1407中，使用在步驟S1406中求出的近似式，預(yù)測表示調(diào)焦用參數(shù)值P的聚焦點位置，移動物鏡。P是預(yù)先通過實驗確定的值，例如在圖12的例子的情況下，是0. 28。另外，在圖13和圖14的例子中，通過使物鏡移動，使拍攝系統(tǒng)的焦點位置在流動池中移動。但是，在將拍攝系統(tǒng)的焦點位置設(shè)定為流動池中的不同的多個位置時，也可以代替物鏡的移動而使流動池移動。圖15是表示在將拍攝系統(tǒng)的焦點位置暫時調(diào)整為聚焦點位置后，檢查聚焦點位置的偏離和樣本液的流動的厚度的方法的詳細(xì)步驟的圖。由于圖5所示的包圍樣本液的鞘液沒有流過預(yù)定量，在鞘液的流動中存在不均等理由，有時樣本的流動形狀變得比設(shè)定值厚，因此希望定期地檢查聚焦點的位置、樣本液的流動的厚度。例如根據(jù)檢測體個數(shù)、時間間隔等來確定檢查間隔。作為步驟，如上所述作為試樣使標(biāo)準(zhǔn)粒子流動，在步驟S1501中，不使物鏡移動而在當(dāng)前的位置，根據(jù)1或多張圖像，計算各標(biāo)準(zhǔn)粒子的調(diào)焦用參數(shù)。所使用的標(biāo)準(zhǔn)粒子的顆粒直徑和調(diào)焦用參數(shù)的計算方法與聚焦點調(diào)整一樣。在步驟S1502中，將調(diào)焦用參數(shù)換算為焦點位置。換算使用在圖14所示的步驟 S1406中求出的近似式。另外，近似式也可以使用預(yù)先通過實驗求出的近似式。在步驟S1503中，作成求出的焦點位置的直方圖。在步驟S1504中，判斷聚焦點位置是否沒有偏離，樣本液的流動的厚度是否正常。 直方圖的表示最頻值的焦點位置=D，在D是將拍攝系統(tǒng)的焦點位置調(diào)整到聚焦點位置時的焦點位置，并且滿足焦點位置的波動的情況下，判斷為聚焦點位置與樣本液的流動的厚度正常，結(jié)束檢查。在不滿足的情況下，在步驟S1505中進(jìn)行警告。在警告中，可以具體地顯示聚焦點的偏離、樣本液的流動的厚度不正常，也可以通過警告器進(jìn)行通知。關(guān)于焦點位置的波動，例如可以使用(a)直方圖的表示最頻值的半值的上側(cè)的位置與下側(cè)的位置的差(幅度)、(b)假設(shè)直方圖依照正態(tài)分布，使用平均值士(χΧ Σ ) (χ例如是1等預(yù)先確定的常數(shù))的位置的上側(cè)與下側(cè)的位置的差(幅度)等。另外，可以預(yù)先使用樣本液的流動的厚度正常時的直方圖，通過實驗求出Kl和Κ2，也可以根據(jù)聚焦點調(diào)整后的聚焦點位置的直方圖求出Kl和Κ2。圖16例如表示樣本液的流動的厚度正常，但聚焦點位置偏離時的直方圖例子。符號1601表示聚焦點位置和樣本液的流動的厚度正常時的直方圖。符號1602表示某裝置狀態(tài)下的直方圖。根據(jù)圖可知，符號1602為表示最頻值的焦點位置從符號1601時的D偏離。 另外，根據(jù)該偏離顯示在+側(cè)，可以判斷出聚焦點位置偏離到+側(cè)。關(guān)于樣本液的流動的厚度，例如表示直方圖的半值的焦點位置的上側(cè)與下側(cè)的差是與正常的符號1601時大致相同的程度，因此可以判斷樣本液的流動的厚度正常。圖17例如表示聚焦點位置正常，但樣本液的流動的厚度變厚時的直方圖例子。符號1701表示聚焦點位置和樣本液的流動的厚度正常時的直方圖。符號1702表示某裝置狀態(tài)下的直方圖。符號1702的表示直方圖的最頻值的焦點位置與符號1701 —樣是D，因此可以判斷聚焦點位置正常。關(guān)于樣本液的流動的厚度，例如表示直方圖的半值的焦點位置的上側(cè)與下側(cè)的差與符號1701相比，符號1702 —方變大，因此可以判斷樣本液的流動的厚度變厚。根據(jù)使用了本發(fā)明的調(diào)焦用參數(shù)的聚焦點調(diào)整方法，能夠使用各種大小的標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行聚焦點調(diào)整。另外，如果使用本發(fā)明的調(diào)焦用參數(shù)，則參數(shù)與焦點位置的關(guān)系為廣范圍并且單調(diào)增加(或減少)，因此，能夠容易地預(yù)測裝置啟動時的焦點狀態(tài)，能夠有效地進(jìn)行調(diào)焦。并且，通過根據(jù)焦點位置與調(diào)焦用參數(shù)的關(guān)系，求出近似函數(shù)，能夠容易地預(yù)測聚焦點位置，因此能夠有效地進(jìn)行調(diào)焦。如果使用本發(fā)明的調(diào)焦用參數(shù)，則能夠?qū)?shù)換算為焦點位置，因此能夠正確地掌握裝置的聚焦點位置。另外，在聚焦點位置偏離的情況下，能夠正確地掌握向哪個方向偏離。并且，如果利用使用本發(fā)明的調(diào)焦用參數(shù)的樣本液的流動的厚度檢查方法，則能夠?qū)?shù)換算為焦點位置，因此能夠高精度地檢查樣本液的流動的厚度。實施例2圖18是說明本發(fā)明的流式粒子圖像分析裝置的聚焦點調(diào)整、以及進(jìn)行聚焦點位置和樣本液的流動的厚度檢查的裝置的結(jié)構(gòu)例子的圖。在進(jìn)行聚焦點調(diào)整的情況下，將在多個焦點位置通過照相機等圖像輸入單元1802 拍攝到的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像轉(zhuǎn)送到存儲器1801。標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像被轉(zhuǎn)送到圖像處理單元1803，進(jìn)行區(qū)域分割和特征量(面積、調(diào)焦用參數(shù)等)的計算。區(qū)域分割方法、特征量計算方法可以使用實施例1所示的方法。區(qū)域分割后的對象區(qū)域圖像和特征量被轉(zhuǎn)送到存儲器1801。針對每個焦點位置，把根據(jù)作為特征量之一的面積判斷為單一的標(biāo)準(zhǔn)粒子的區(qū)域的調(diào)焦用參數(shù)轉(zhuǎn)送到調(diào)焦用參數(shù)平均值計算單元1804，計算平均值。把計算出的各焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)平均值轉(zhuǎn)送到存儲器1801。作為調(diào)焦用參數(shù)，可以使用實施例1中說明了的中心濃度比、中心濃度差、中心濃度值等。把在各焦點位置計算出的調(diào)焦用參數(shù)的平均值轉(zhuǎn)送到聚焦點判斷單元1805，判斷哪個焦點位置是聚焦點。判斷方法可以使用實施例1所示的方法。把判斷出的聚焦點位置轉(zhuǎn)送到存儲器1801。把各焦點位置的調(diào)焦用參數(shù)的平均值轉(zhuǎn)送到近似式計算單元1806，計算調(diào)焦用參數(shù)與焦點位置的關(guān)系的近似式。計算出的近似式被轉(zhuǎn)送到存儲器1801。近似式的求取方法可以使用實施例1所示的方法。在聚焦點調(diào)整完成的狀態(tài)下，檢查聚焦點位置的偏離和樣本液的流動的厚度時， 把照相機等圖像輸入單元1802拍攝到的標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像轉(zhuǎn)送到存儲器1801。把標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像轉(zhuǎn)送到圖像處理單元1803，計算區(qū)域分割和特征量(面積、調(diào)焦用參數(shù)等)。區(qū)域分割方法、特征量計算方法可以使用實施例1所示的方法。區(qū)域分割后的對象區(qū)域圖像和特征量被轉(zhuǎn)送到存儲器1801。根據(jù)作為特征量之一的面積判斷為單一的標(biāo)準(zhǔn)粒子的區(qū)域的調(diào)焦用參數(shù)被轉(zhuǎn)送到向焦點位置的換算單元1807。換算方法可以使用實施例1所示的方法。換算后的焦點位置被轉(zhuǎn)送到存儲器1801。換算后的焦點位置被轉(zhuǎn)送到聚焦點判斷單元1805、樣本液的流動的厚度判斷單元 1808，判斷聚焦點位置是否正常、樣本液的流動的厚度是否正常。判斷方法可以使用實施例 1所示的方法。判斷結(jié)果被轉(zhuǎn)送到存儲器1801。根據(jù)本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)，能夠高精度、高效率地使用各種顆粒直徑的標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行聚焦點調(diào)整。另外，能夠高精度地檢查聚焦點的偏離和樣本液的流動的厚度。符號說明
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401 測定裝置本體；402 染色液添加裝置；403 圖像輸入裝置；404 顯示器； 405 鍵盤；406 圖像處理裝置；501 流動池；502 脈沖燈；503 物鏡；504 照相機；505 試樣；506 焦點機構(gòu)；507 臂；508 進(jìn)給螺釘；509 電動機
權(quán)利要求
1.一種流式粒子圖像分析方法，其對拍攝被鞘液包圍而流動的樣本液所得到的粒子圖像進(jìn)行分析，其特征在于，具有使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在流動池中流動，通過包含物鏡的拍攝部對上述標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的步驟；根據(jù)上述靜止圖像，作為粒子圖像特征參數(shù)值，計算粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值的步驟；以及根據(jù)上述參數(shù)值，進(jìn)行上述拍攝部的調(diào)焦的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流式粒子圖像分析方法，其特征在于， 還具有通過使上述物鏡或上述流動池移動，在設(shè)定在上述流動池中的多個不同的焦點位置取得多個靜止圖像的步驟；以及對于上述多個不同的焦點位置中的每個焦點位置，根據(jù)在該焦點位置取得的靜止圖像，計算平均參數(shù)值的步驟，根據(jù)上述平均參數(shù)值進(jìn)行上述調(diào)焦。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的流式粒子圖像分析方法，其特征在于，通過函數(shù)對上述多個焦點位置與上述平均參數(shù)值的關(guān)系進(jìn)行近似，使用該函數(shù)進(jìn)行上述調(diào)焦。
4.一種流式粒子圖像分析方法，其對拍攝被鞘液包圍而流動的樣本液所得到的粒子圖像進(jìn)行分析，其特征在于，具有使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在流動池中流動，在拍攝部對上述標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的步驟；根據(jù)上述靜止圖像，作為粒子圖像特征參數(shù)值，計算粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值的步驟；將上述參數(shù)值換算為上述拍攝部的焦點位置的步驟；以及根據(jù)上述焦點位置，取得聚焦點位置的信息的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流式粒子圖像分析方法，其特征在于，根據(jù)對上述焦點位置與上述參數(shù)值的關(guān)系進(jìn)行近似的函數(shù)，取得上述焦點位置信息。
6.一種流式粒子圖像分析方法，其對拍攝被鞘液包圍而流動的樣本液所得到的粒子圖像進(jìn)行分析，其特征在于，具有使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在流動池中流動，在拍攝部對上述標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的步驟；從上述靜止圖像中抽出表示上述拍攝部的焦點位置的粒子圖像特征參數(shù)值的步驟； 將上述參數(shù)值換算為焦點位置的步驟；以及根據(jù)上述換算后的焦點位置的波動，取得樣本液的厚度信息的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的流式粒子圖像分析方法，其特征在于，作為上述粒子圖像特征參數(shù)值，使用粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的流式粒子圖像分析方法，其特征在于，通過函數(shù)對上述焦點位置與上述參數(shù)值的關(guān)系進(jìn)行近似，根據(jù)上述函數(shù)將上述參數(shù)值換算為上述焦點位置。
9.一種流式粒子圖像分析裝置，其特征在于， 具有通過鞘液包住樣本液使樣本液流動的流動池； 對上述流動池進(jìn)行照射的脈沖光源； 具有物鏡的拍攝部；使上述流動池和上述物鏡之間的距離可變的驅(qū)動單元；使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在上述流動池中流動，在拍攝部中對上述標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的單元；根據(jù)上述靜止圖像，作為粒子圖像特征參數(shù)值，計算粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值的單元；根據(jù)上述參數(shù)值，通過上述驅(qū)動單元使上述流動池與上述物鏡之間的距離可變，來進(jìn)行上述拍攝部的調(diào)焦的單元。
10.一種流式粒子圖像分析裝置，其特征在于， 具有通過鞘液包住樣本液使樣本液流動的流動池； 對上述流動池進(jìn)行照射的脈沖光源； 具有物鏡的拍攝部；使上述流動池和上述物鏡之間的距離可變的驅(qū)動單元；使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在上述流動池中流動，在拍攝部中對上述標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的單元；根據(jù)上述靜止圖像，作為粒子圖像特征參數(shù)值計算粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值的單元；將上述參數(shù)值換算為上述拍攝部的焦點位置的單元；以及根據(jù)上述焦點位置取得聚焦點位置的信息的單元。
11.一種流式粒子圖像分析裝置，其特征在于， 具有通過鞘液包住樣本液使樣本液流動的流動池； 對上述流動池進(jìn)行照射的脈沖光源； 具有物鏡的拍攝部；使上述流動池和上述物鏡之間的距離可變的驅(qū)動單元；使包含由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的球狀的標(biāo)準(zhǔn)粒子的樣本液在上述流動池中流動，在拍攝部中對上述標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行拍攝，取得靜止圖像的單元；從上述靜止圖像中抽出表示上述拍攝部的焦點位置的粒子圖像特征參數(shù)值的單元； 將上述參數(shù)值換算為焦點位置的單元；以及根據(jù)上述焦點位置的波動，取得樣本液的厚度信息的單元。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的流式粒子圖像分析裝置，其特征在于， 作為上述粒子圖像特征參數(shù)值，使用粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比、或者粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的差、或者粒子圖像的中心附近的濃度值。
全文摘要
能夠高精度并且高效地進(jìn)行聚焦點調(diào)整，高精度地檢查聚焦點位置的偏離、樣本液的流動的厚度。在多個不同的焦點位置上，根據(jù)由均勻的物質(zhì)構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)粒子的圖像取得調(diào)焦用參數(shù)值。作為標(biāo)準(zhǔn)粒子圖像的中心附近的濃度值與輪廓附近的濃度值的比或差、或者中心附近的濃度值來求出調(diào)焦用參數(shù)值。根據(jù)得到的調(diào)焦用參數(shù)值與焦點位置的關(guān)系，調(diào)整聚焦點位置。另外，根據(jù)調(diào)焦用參數(shù)值與焦點位置的關(guān)系，將參數(shù)值換算為焦點位置，根據(jù)焦點位置及其波動，檢查聚焦點位置的偏離和樣本液的厚度。
文檔編號G01N15/14GK102460115SQ201080024498
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者萬里千裕, 光山訓(xùn), 大和田伯男 申請人:株式會社日立高新技術(shù)