專利名稱：腫瘤的分子譜分析的制作方法
腫瘤的分子譜分析交叉引用本申請要求2009年2月11日提交的美國臨時專利申請61/151，758、2009年4月 17日提交的美國臨時專利申請61/170，565和2009年7月四日提交的美國臨時專利申請 61/2 ，686的優(yōu)先權(quán)，所有這些申請均通過引用全文并入本文。背景患者的疾病狀態(tài)一般用根據(jù)基于臨床的標(biāo)準(zhǔn)選擇的治療方案或療法來治療；即， 根據(jù)患者已經(jīng)被診斷為特定疾病的決定因素(已經(jīng)從傳統(tǒng)診斷試驗(yàn)作出診斷)為患者選擇治療或方案。盡管各種疾病狀態(tài)的分子機(jī)制是多年來研究的主題，但是患病個體的分子譜在確定用于該個體的治療方案和療法中的特定應(yīng)用是疾病特異性的，并且沒有廣泛使用。已經(jīng)使用分子譜分析結(jié)合患者的臨床表征確定了一些治療方案，該臨床表征例如是醫(yī)生的觀察(如國際疾病分類編碼，例如，確定該編碼的日期)、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果、X-射線、活檢結(jié)果、患者主訴和醫(yī)生一般依據(jù)其作出特定疾病的診斷的任何其它醫(yī)療信息。但是，使用基于分子譜分析的選擇材料和臨床表征(例如特定癌癥類型的診斷)的組合確定治療方案或療法存在對特定個體的有效治療方案可能被忽略的危險，因?yàn)槟承┲委煼桨缚赡軐Σ煌膊顟B(tài)有效，即使它們與治療特定類型的疾病狀態(tài)有關(guān)?；加须y治的和轉(zhuǎn)移的癌癥的患者是經(jīng)治醫(yī)生特別關(guān)注的。大多數(shù)轉(zhuǎn)移癌患者最終用盡對于其腫瘤的治療選擇。這些患者在腫瘤進(jìn)展后使用標(biāo)準(zhǔn)前線和二線(有時三線和以上)治療具有極其有限的選擇。盡管這些患者可以加入新抗癌藥的I期和II期臨床試驗(yàn)， 但是他們通常必須滿足非常嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，當(dāng)患者加入這些類型的試驗(yàn)時，新抗癌藥在I期研究中可以產(chǎn)生平均5% -10%的應(yīng)答率，在II期研究中可以產(chǎn)生5% -12% 的應(yīng)答率。這些患者也具有接受最佳支持性療法以治療其癥狀的選擇。最近對開發(fā)更加針對細(xì)胞表面受體或上調(diào)的或擴(kuò)增的基因產(chǎn)物的新抗癌藥具有強(qiáng)烈的興趣。該方法滿足某些成功(例如抗乳腺癌細(xì)胞中的HER2/neU的曲妥珠單抗、抗淋巴瘤細(xì)胞中的CD20的利妥昔單抗、抗VEGF的貝伐珠單抗和抗EGFR的西妥昔單抗)。然而， 盡管有這些治療，患者的腫瘤最后仍然進(jìn)展。如果在患者的腫瘤中檢測了大量的靶標(biāo)或分子發(fā)現(xiàn)如分子機(jī)制、基因、基因表達(dá)的蛋白質(zhì)和/或它們的組合，可以發(fā)現(xiàn)額外的可以使用特定治療劑針對研究的靶標(biāo)或分子發(fā)現(xiàn)。確定多種能夠治療多種靶標(biāo)或基礎(chǔ)機(jī)制的藥物將為癌癥患者提供可替代現(xiàn)有治療方案的可行的治療選擇。分子譜分析分析確定一種或多種個別譜，該譜推動更具信息的和有效的個性化治療選擇，它可導(dǎo)致改善的患者醫(yī)護(hù)和提高的治療結(jié)果。本發(fā)明提供通過對來自個體的樣品進(jìn)行分子譜分析確定用于這些個體的治療的方法和系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供用于分子譜分析的方法和系統(tǒng)，使用來自分子譜分析的結(jié)果確定對個體的治療。在一些實(shí)施方案中，所述治療在開始時未被確定為對于該疾病的治療。在一方面，本發(fā)明提供了一種確定用于需要的受試者的候選治療的方法，包括對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定至少五種蛋白質(zhì)的IHC表達(dá)譜；對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定至少10種基因的微陣列表達(dá)譜；對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交 (FISH)分析以確定至少一種基因的FISH突變譜；對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定至少一種基因的測序突變譜；和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜。該規(guī)則數(shù)據(jù)庫包含其對癌細(xì)胞的生物活性已知的治療圖譜，該癌細(xì)胞i)過表達(dá)或欠表達(dá)IHC表達(dá)譜中包括的一種或多種蛋白質(zhì)；ii)過表達(dá)或欠表達(dá)微陣列表達(dá)譜中包括的一種或多種基因；iii)在FISH突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變；和/或iv)在測序突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變。如果i)比較步驟表明該治療應(yīng)當(dāng)對癌癥具有生物活性；和ii)比較步驟沒有表明該治療不能用于治療癌癥，則確定為候選治療。在一些實(shí)施方案中，IHC表達(dá)譜分析包括測定SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、 c-kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMl、BCRP, TOPOl、PTEN、MGMT 和 MRPl 中的一種
或多種。在一些實(shí)施方案中，微陣列表達(dá)譜分析包括測定ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS, BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DWT1、DWT3A、DWT3B、ECGF1、 EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESR1、FLTl、F0LR2、FYN、GART、GNRHl、GSTPl、HCK,HDACl、 HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT, MLH1、MS4A1、MSH2、NFKBl、 NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、RRM2、 RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、TNF、TOPI、T0P2A、 T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGFA, VHL, YESl 和 ZAP70 中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ISH突變譜分析包括測定EGFR和/或HER2。在一些實(shí)施方案中，測序突變譜分析包括測定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中的一種或多種。在另一方面，本發(fā)明提供一種為需要的受試者確定候選治療的方法，包括對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析，以確定以下至少5種的IHC表達(dá)譜SPARC、PGP、 Her2/neu、ER、PR、c-kit, AR, CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMl、BCRP, TOPOl、PTEN、MGMT 和MRPl ；對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定以下至少5種的微陣列表達(dá)譜ABCC1、ABCG2、 ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B、ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLTl、F0LR2、FYN、GART、GNRHl、 GSTPl、HCK, HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT, MLHl、 MS4A1、MSH2、NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、PTEN、PTGS2、RAFl、 RARA, RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、 TNF、T0P1、T0P2A、T0P2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1 和 ZAP70 ；對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定EGFR和/或HER2的FISH突變譜；對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中至少一個的測序突變譜；和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜。該規(guī)則數(shù)據(jù)庫包含其對癌細(xì)胞的生物活性已知的治療圖譜，該癌細(xì)胞i)過表達(dá)或欠表達(dá)IHC表達(dá)譜中包括的一種或多種蛋白質(zhì)； ii)過表達(dá)或欠表達(dá)微陣列表達(dá)譜中包括的一種或多種基因；iii)在FISH突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變；和/或iv)在測序突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變。如果i)比較步驟表明該治療應(yīng)當(dāng)對癌癥具有生物活性；和ii)比較步驟沒有表明該治療不能用于治療癌癥，則確定為候選治療。 在一些實(shí)施方案中，對列出的生物標(biāo)志物的至少50 %、60 %、70 %、80 %或90 %進(jìn)行IHC表達(dá)譜分析。在一些實(shí)施方案中，對列出的生物標(biāo)志物的至少50%、60%、70%、80%或90% 進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。在第三方面，本發(fā)明提供一種確定用于需要的受試者的癌癥的候選治療的方法， 包括對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定至少下組蛋白質(zhì)的IHC表達(dá)譜SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c_kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMU BCRP, TOPOU PTEN、MGMT和MRPl ；對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定至少下組基因的微陣列表達(dá)譜ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS, BCL2、BIRC5、BRCAl、BRCA2、CD33、CD52、CDA, CES2、DCK, DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLT1、F0LR2、 FYN、GART、GNRH1、GSTP1、HCK、HDAC1、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、 MGMT, MLHl、MS4A1、MSH2、NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、PTEN、 PTGS2、RAFl、RARA、RRMl、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、 SSTR5、TKl、TNF, TOPI、T0P2A、T0P2B、TXNRDU TYMS, VDR、VEGFA, VHL, YESl 禾P ZAP70 ；對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定至少下組基因的FISH突變譜EGFR和HER2 ；對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定至少下組基因的測序突變譜KRAS、BRAF, c-KIT和EGFR ；和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜。該規(guī)則數(shù)據(jù)庫包含其對癌細(xì)胞的生物活性已知的治療圖譜，該癌細(xì)胞i)過表達(dá)或欠表達(dá)IHC表達(dá)譜中包括的一種或多種蛋白質(zhì)；ii)過表達(dá)或欠表達(dá)微陣列表達(dá)譜中包括的一種或多種基因； iii)在FISH突變譜中包括的一種或多種基因中具有0個或更多個突變；和/或iv)在測序突變譜中包括的一種或多種基因中具有0個或更多個突變。如果i)比較步驟表明該治療應(yīng)當(dāng)對癌癥具有生物活性；和ii)比較步驟沒有表明該治療不能用于治療癌癥，則確定為候選治療。在本發(fā)明的方法的一些實(shí)施方案中，樣品包括福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE) 組織、新鮮冷凍(FF)組織，或保存核酸或蛋白質(zhì)分子的溶液中包含的組織。在一些實(shí)施方案中，不進(jìn)行微陣列分析、FISH突變分析或測序突變分析中的任一種。例如，可以不進(jìn)行一種方法，除非樣品通過質(zhì)量控制測試。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)量控制測試包括A260/A^0比或RPL 13a mRNA的RT-PCR的Ct值。例如，質(zhì)量控制測試可能需要A260/A280比< 1. 5或 RPL 13a Ct 值> 30。在一些實(shí)施方案中，使用低密度微陣列、表達(dá)微陣列、比較基因組雜交(CGH)微陣列、單核苷酸多態(tài)性(SNP)微陣列、蛋白質(zhì)組陣列或抗體陣列進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。本發(fā)明的方法可能需要測定某些標(biāo)志物，包括額外的標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中， 至少對SPARC、T0P2A和/或PTEN進(jìn)行IHC表達(dá)譜分析?？梢灾辽賹Β?2進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。IHC表達(dá)譜分析進(jìn)一步包括測定DCK、EGFR、BRCAl、CK 14, CK 17, CK 5/6、E_鈣粘著蛋白、p95、PARP-I、SPARC和TLE3中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，IHC表達(dá)譜分析進(jìn)一步包括測定Cox-2和/或Ki-67。在一些實(shí)施方案中，微陣列表達(dá)譜分析進(jìn)一步包括測定HSPCA。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ISH突變譜分析進(jìn)一步包括測定c-Myc和/或T0P2A。測序突變譜分析可以包括測定pii。
大量基因和基因產(chǎn)物可以根據(jù)本發(fā)明的方法測定。例如，用于IHC表達(dá)譜分析的、 微陣列表達(dá)譜分析、FISH突變譜分析和測序突變譜分析的基因獨(dú)立地包括以下一種或多種ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受體、AR、AREG, ASNS, BCL2、BCRP, BDCAl、BIRC5、B-RAF, BRCAl、BRCA2、CA2、小窩蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、 CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c_KIT、c_Myc、C0X-2、細(xì)胞周期蛋白 DU DCK, DHFR、 DNMTl、DNMT3A、DNMT3B.E-鈣粘著蛋白、ECGFl、EGFR、EPHA2、表皮調(diào)節(jié)素、ER、ERBR2、ERCCl、 ERCC3、EREG, ESRl、FLTl、葉酸受體、FOLRl、F0LR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRHl、 GNRHRl、GSTPl、HCK、HDACl、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIGl、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IL13RA1、 IL2RA、KDR、KIT、K-RAS, LCK, LTB、淋巴毒素 β 受體、LYN、MGMT, MLHl、MRPl、MS4A1、MSH2、 Myc, NFKBl、NFKB2、NFKBIA、ODCU OGFR, p53、p95、PARP-U PDGFC, PDGFR, PDGFRA, PDGFRB, PGP、PGR、ΡΙ3Κ、POLA, POLAl、PPARG, PPARGCU PR、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、RRM2、 RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SPARC MC、SPARC PC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、T0P1、T0P2A、T0P2B、T0P01、T0P02B、拓?fù)洚悩?gòu)酶 II、TS、TXN、TXNRD1、 TYMS, VDR、VEGF, VEGFA, VEGFC, VHL, YESl 和 ZAP70。在一些實(shí)施方案中，微陣列表達(dá)分析包括確定一種基因相對于參照是以統(tǒng)計學(xué)顯著性上調(diào)還是下調(diào)。該統(tǒng)計學(xué)顯著性可以在小于或等于0. 05,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005 或0.0001的ρ值確定。ρ值也可以對多次比較進(jìn)行校正。對多次比較的校正可以包括 Bonferroni校正或其改變形式。在一些實(shí)施方案中，IHC分析包括確定是否所述樣品的30%或更多的染色強(qiáng)度為 +2或更高。本發(fā)明的方法使用的規(guī)則數(shù)據(jù)庫內(nèi)包含的標(biāo)準(zhǔn)可以基于各種治療的有效性，特別是對于靶基因或基因產(chǎn)物。規(guī)則數(shù)據(jù)庫可以包括表1和/或表2中列出的標(biāo)準(zhǔn)。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，確定候選治療的優(yōu)先級列表。優(yōu)先化可包括將治療從較高優(yōu)先級到較低優(yōu)先級排序，按照基于微陣列分析和IHC或FISH分析的治療； 基于IHC分析而不基于微陣列分析的治療；和基于微陣列分析但不基于IHC分析的治療。在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，候選治療包括施用一種或多種候選治療劑。 該一種或多種候選治療劑可以是5-氟尿嘧啶，阿巴瑞克，阿侖珠單抗，氨魯米特，阿那曲唑(Anastrazole)，芳香酶抑制劑(阿那曲唑，來曲唑)，天冬酰胺酶，阿司匹林，ATRA，阿扎胞苷，貝伐單抗，貝沙羅汀，比卡魯胺，硼替佐米，骨化三醇，卡培他濱，卡鉬，塞來考昔，西妥昔單抗，化學(xué)內(nèi)內(nèi)分泌治療，膽骨化醇，順鉬，卡鉬，環(huán)磷酰胺，環(huán)磷酰胺/長春新堿，阿糖胞苷，達(dá)沙替尼，地西他濱，多柔比星，表柔比星，表阿霉素，厄洛替尼，依托泊苷，依西美坦， 氟嘧啶，氟他胺，氟維司群，吉非替尼，吉非替尼和曲妥珠單抗，吉西他濱，戈那瑞林，戈舍瑞林，羥基脲，伊馬替尼，伊立替康，伊沙匹隆，拉帕替尼，來曲唑，亮丙瑞林，脂質(zhì)體多柔比星， 甲羥孕酮，甲地孕酮，氨甲喋呤，絲裂霉素，nab-紫杉醇，奧曲肽，奧沙利鉬，紫杉醇，帕尼單抗，培門冬酶，培美曲塞，噴司他丁，索拉非尼，舒尼替尼，他莫昔芬，基于他莫昔芬的治療、 替莫唑胺，托泊替康，托瑞米芬，曲妥珠單抗，VBMCP/環(huán)磷酰胺，長春新堿，或其任意組合。一種或多種候選治療藥物也可以是5FU，貝伐珠單抗，卡培他濱，西妥昔單抗，西妥昔單抗+吉西他濱，西妥昔單抗+伊立替康，環(huán)磷酰胺，己烯雌酚(diethylstibesterol)，多柔比星，厄洛替尼，依托泊苷，依西美坦，氟嘧啶，吉西他濱，吉西他濱+依托泊苷，吉西他濱+培美曲塞，伊立替康，伊立替康+索拉非尼，拉帕替尼，拉帕替尼+他莫昔芬，來曲唑，來曲唑+卡培他濱，絲裂霉素，nab-紫杉醇，nab-紫杉醇+吉西他濱，nab-紫杉醇+曲妥珠單抗，奧沙利鉬，奧沙利鉬+5FU+曲妥珠單抗，帕尼單抗，培美曲塞，索拉非尼，舒尼替尼，舒尼替尼，舒尼替尼+絲裂霉素，他莫昔芬，替莫唑胺，替莫唑胺+貝伐珠單抗，替莫唑胺+索拉非尼，曲妥珠單抗，長春新堿，或其任意組合。在本發(fā)明的方法的實(shí)施方案中，樣品包括癌細(xì)胞。癌癥可以是轉(zhuǎn)移癌。癌癥可以是現(xiàn)有治療難治的?，F(xiàn)有治療可以是癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療。有時，患者以前已經(jīng)用一種或多種治療劑治療癌癥。有時，患者以前未用一種或多種確定的候選治療劑治療。在一些實(shí)施方案中，癌癥包括前列腺癌、肺癌、黑素瘤、小細(xì)胞(食道/腹膜后) 癌、膽管上皮癌、間皮瘤、頭頸癌(SCC)、胰腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌、小細(xì)胞、胃癌、腹膜假黏液瘤、肛管癌(SCC)、陰道癌(SCC)、宮頸癌、腎癌、小汗腺腺瘤、唾液腺腺瘤、子宮軟組織肉瘤(子宮)、GIST(胃)或甲狀腺退行發(fā)育性癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥包括附件，鼻竇，中耳和內(nèi)耳，腎上腺，目尾，造血系統(tǒng)，骨骼和關(guān)節(jié)，脊髓，乳腺，小腦，子宮頸，結(jié)締組織和軟組織，子宮體，食管，眼，鼻，眼球，輸卵管，肝外膽管，口，肝內(nèi)膽管，腎，闌尾-結(jié)腸，喉，唇，肝， 肺和支氣管，淋巴結(jié)，腦，脊柱，鼻軟骨，視網(wǎng)膜，眼，口咽部，內(nèi)分泌腺體，女性生殖器，卵巢， 胰腺，陰莖和陰囊，垂體，胸膜，前列腺，直腸腎盂，輸尿管，腹膜，唾液腺，皮膚，小腸，胃，睪丸，胸腺，甲狀腺，舌，未知的，膀胱，子宮，陰道，陰唇，和陰戶的癌癥。在一些實(shí)施方案中，樣品包括選自下組的細(xì)胞脂肪，腎上腺皮質(zhì)，腎上腺髓質(zhì)，闌尾，膀胱，血液，血管，骨，軟骨， 腦，乳房，軟骨，子宮頸，結(jié)腸，乙狀結(jié)腸，樹突細(xì)胞，骨骼肌，子宮內(nèi)膜，食道，輸卵管，成纖維細(xì)胞，膽囊，腎，喉，肝，肺，淋巴結(jié)，黑色素細(xì)胞，間皮襯里，肌上皮細(xì)胞，成骨細(xì)胞，卵巢，胰腺，腮腺，前列腺，唾液腺，鼻竇組織，骨骼肌，皮膚，小腸、平滑肌，胃，滑膜，關(guān)節(jié)內(nèi)襯組織， 肌腱，睪丸，胸腺，甲狀腺，子宮和子宮體。在一些實(shí)施方案中，癌癥包括乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，卵巢癌，肺癌，非小細(xì)胞肺癌，膽管上皮癌，間皮瘤，汗腺癌，或GIST癌。利用本發(fā)明的方法可以延長患者的無進(jìn)展存活期(Pre)或無病存活期(DFS)。例如，與現(xiàn)有治療相比，PFS或DFS可以延長至少大約10 %、大約15 %、大約20 %、大約30 %、 大約40 %、大約50 %、大約60 %、大約70 %、大約80 %、大約90 %或至少大約100 %。另外， 利用本發(fā)明的方法選擇候選治療可以延長患者的壽命。例如，患者的壽命可以延長至少1 周、2周、3周、4周、1個月、5周、6周、7周、8周、2個月、9周、10周、11周、12周、3個月、4 個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15 個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、24個月、2年、 2 %年、3年、4年或至少5年。參考引入本說明書中提到的所有出版物和專利申請都通過引用并入本文，如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埦唧w且分別地通過弓I用并入本文。


通過以下說明應(yīng)用本發(fā)明原理的示例實(shí)施方案的詳細(xì)描述和附圖能夠更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，附圖中圖1顯示一個系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案的方塊圖，該系統(tǒng)用于確定對特定疾病狀態(tài)的個性化醫(yī)療干預(yù)，它利用對非疾病特異性的患者生物標(biāo)本的分子譜分析。圖2是一種方法的示例性實(shí)施方案的流程圖，該方法用于確定對特定疾病狀態(tài)的個性化醫(yī)療干預(yù)，它利用對非疾病特異性的患者生物標(biāo)本的分子譜分析。圖3A至3D顯示按照圖2的步驟80的示例性的患者特征報告。圖4是用于確定能夠與靶標(biāo)相互作用的藥物治療/藥劑的方法的示例性實(shí)施方案的流程圖。圖5-14是流程圖和圖示，說明根據(jù)本發(fā)明的基于信息的個性化醫(yī)療藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)和方法的各個部分。圖15-25是計算機(jī)屏幕打印輸出，與圖5-14所示的基于信息的個性化醫(yī)療藥物發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)和方法的各個部分相關(guān)。圖^^力6!1為表格，按照腫瘤類型顯示基因表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)的顯著性變化頻率。圖27A-27H是表格，按照腫瘤類型顯示某些基因表達(dá)的顯著性變化頻率。圖^A_280是表格，按照腫瘤類型顯示某些基因表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)的顯著性變化頻率。圖四是表格，顯示基于圖28以頻率順序標(biāo)記為靶標(biāo)的生物標(biāo)志物(基因表達(dá)的蛋白質(zhì))。圖30A-300是表格，按照腫瘤類型顯示某些基因的表達(dá)的顯著性變化頻率。圖31是表格，顯示基于圖30按照頻率標(biāo)記為靶標(biāo)的基因。圖32顯示使用根據(jù)分子譜分析選擇的治療的無進(jìn)展存活期(PFS)(階段B)，以及患者最近接受的治療的PFS (階段A)。如果PFS (B)/PFS (A)比> 1. 3，則分子譜分析選擇的治療被定義為對患者具有益處。圖33是如果靶標(biāo)已被確定，通過分子譜分析確定治療的方法的圖示。圖34顯示實(shí)施例1進(jìn)行的研究中的患者分布。圖35顯示使用PFS比彡1. 3的患者的研究結(jié)果，為18/66(27% )。圖36是所有患者的目標(biāo)病變直徑總和相對于基線直徑的最大％變化的瀑布圖。圖37顯示醫(yī)生在知道分子譜分析結(jié)果的建議之前用來治療患者的選擇之間的關(guān)系。18名PFS比彡1. 3的患者沒有匹配。圖38是18名PFS比彡1. 3的患者相對于全部66名患者的總存活期的圖示。圖39顯示微陣列譜分析結(jié)果的輸出和使用截斷值進(jìn)行的調(diào)用的實(shí)例。圖40A-40J顯示基于分子譜分析的示例性的患者報告。發(fā)明詳述本發(fā)明提供通過利用分子譜分析確定治療靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)。分子譜分析方法提供一種為個體選擇候選治療的方法，該治療可有利地改變患有病癥或疾病如癌癥的個體的臨床過程。當(dāng)使用分子譜分析方法治療時，比使用選擇治療方案的常規(guī)方法，分子譜分析方法可以為個體提供臨床益處，例如提供更長的無進(jìn)展存活期(pre)、更長的無病存活期 (DFS)、更長的總存活期(OS)或延長的壽命。當(dāng)疾病用當(dāng)前的療法難以治療時，例如在癌癥已發(fā)展了對標(biāo)準(zhǔn)治療的抗性后，分子譜分析能夠建議候選治療。分子譜分析能夠通過任何已知的檢測生物樣品中的分子的手段進(jìn)行。可以對任何適用的生物樣品進(jìn)行譜分析。樣品一般來自于懷疑患有或已知患有疾病或障礙的個體， 例如但不限于來自癌癥患者的活檢樣品。樣品的分子譜分析也可以通過任何數(shù)量的評估生物因子如DNA序列、mRNA序列或蛋白質(zhì)的量或狀態(tài)的技術(shù)進(jìn)行。這樣的技術(shù)包括但不限于免疫組化(IHC)、原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、各種類型的微陣列(mRNA表達(dá)陣列、蛋白質(zhì)陣列等)、各種類型的測序(Sanger，焦磷酸測序等)、比較基因組雜交(CGH)、 NextGen測序、Northern印跡法、Southern印跡法、免疫測定、和正在開發(fā)的任何其他合適的測定感興趣的生物分子的存在或量的技術(shù)。這些方法中的任一種或多種可以同時使用或相繼使用。分子譜分析用來為患者的疾病選擇候選治療。例如，候選治療可以是通過分子譜分析技術(shù)確定的、已知對差異表達(dá)基因的細(xì)胞具有效果的治療。差異表達(dá)可以包括生物產(chǎn)物例如基因、mRNA或蛋白質(zhì)相比對照的過表達(dá)和欠表達(dá)。對照可以包括與樣品類似但沒有疾病的細(xì)胞。對照可以來自于同一患者，例如，與病變細(xì)胞相同的器官的正常相鄰部分，或者對照可以來自于其他患者的健康組織。對照可以是在同一樣品中發(fā)現(xiàn)的對照，例如管家基因或其產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))。例如，對照核酸可以是已知根據(jù)細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)沒有不同的核酸。對照核酸的表達(dá)水平可以用來標(biāo)準(zhǔn)化測試和參考群體中的信號水平。 示例性的對照基因包括但不限于，例如，β-肌動蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白 Ρ1?？梢允褂枚鄠€對照或多個類型的對照。差異表達(dá)的來源可以變化。例如，細(xì)胞中的基因拷貝數(shù)可能提高，從而導(dǎo)致基因的表達(dá)提高。或者，基因的轉(zhuǎn)錄可能被改變，例如，通過染色質(zhì)重構(gòu)、差異甲基化、差異表達(dá)或轉(zhuǎn)錄因子的活性等。轉(zhuǎn)錄也可以被改變，例如，通過降解 mRNA、翻譯mRNA或沉默化翻譯的因子(例如，microRNA或siRNA)的差異表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，差異表達(dá)包括差異活性。例如，蛋白質(zhì)可攜帶提高蛋白質(zhì)活性的突變，如組成型激活，從而導(dǎo)致患病狀態(tài)。顯示活性變化的分子譜分析可以用來指導(dǎo)治療選擇。當(dāng)分子譜分析顯示多個藥物靶標(biāo)差異表達(dá)時，可以準(zhǔn)備決定規(guī)則，以優(yōu)先化 (prioritize)特定治療的選擇?？梢允褂萌魏芜@樣的幫助優(yōu)先化治療的規(guī)則，可以用來優(yōu)先化治療，例如，分子譜分析的直接結(jié)果、預(yù)期效果、以前的相同或其它治療史、預(yù)計的副作用、可用性、成本、藥物-藥物相互作用，和經(jīng)治醫(yī)生考慮的其它因素。醫(yī)生最終可以決定療程。因此，分子譜分析可以基于病變細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞的個體特征和需要治療的個體的其它個性化因素選擇候選治療，而不是依賴于傳統(tǒng)的針對特定指征的目標(biāo)治療所采用的通用的方法。在一些情況中，推薦的治療是一般用來治療影響該患者的疾病或障礙的治療。在一些情況中，在標(biāo)準(zhǔn)治療不再提供足夠的效果后使用推薦的治療。核酸包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及其互補(bǔ)體。核酸可以含有已知的核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵，它們是合成的、天然存在的和非天然存在的，它們具有與參照核酸相似的結(jié)合性質(zhì)，并且以類似于參照核苷酸的方式代謝。這樣的類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA).核酸序列可包括其保守修飾的變體(例如， 簡并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確說明的序列。特別是，簡并密碼子置換可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生其中一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三個位點(diǎn)被置換為混合堿基和/或脫氧肌苷殘基的序列(Batzer等人，核酸Res. 19 :5081 (1991) ；Ohtsuka等人， J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell 探針 8 :91-98 (1994))。術(shù)語核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。特定的核酸序列可以隱含包括編碼截短形式的特定序列和"剪接變體"和核酸序列。同樣，由核酸編碼的特定蛋白質(zhì)可包括由該核酸的剪接變體或截短形式編碼的任何蛋白質(zhì)?！凹艚幼凅w1Π同其字面含義那樣，是基因的可變剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，初始核酸轉(zhuǎn)錄物可以被剪接，使得不同的(可變)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。剪接變體的產(chǎn)生機(jī)制不同，但是包括外顯子的可變剪接。由相同核酸通過通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的可選多肽也包括在該定義中。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括剪接產(chǎn)物的重組形式，包括在該定義中。核酸可以在 5'端或3'端截短。多肽可以在N-末端或C-末端截短。核酸或多肽序列的截短形式可以天然存在或重組產(chǎn)生。術(shù)語“遺傳變體”和“核苷酸變體”在本文中可以互換使用，是指在特定基因座處相對于參照人基因或cDNA序列的改變或變化，包括但不限于編碼和非編碼區(qū)的核苷酸堿基缺失、插入、倒置和置換。缺失可以是單核苷酸堿基缺失、基因的核苷酸序列的一部分或一個區(qū)域的缺失，或整個基因序列的缺失。插入可以是一個或多個核苷酸堿基的插入。遺傳變體或核苷酸變體可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、mRNA的非翻譯區(qū)、外顯子、內(nèi)含子、外顯子/內(nèi)含子連接等。遺傳變體或核苷酸變體可能潛在地導(dǎo)致終止密碼子、移碼、氨基酸缺失、改變的基因轉(zhuǎn)錄物剪接形式或改變的氨基酸序列。等位基因或等位基因通常包括天然存在的具有參照序列的基因或含有特定核苷酸變體的基因。單體型是指個體中發(fā)現(xiàn)的染色體上的mRNA或基因組DNA區(qū)域的遺傳(核苷酸) 變體的組合。因此，單體型包括大量一般作為一個單元一起遺傳的遺傳連接的多態(tài)性變體。本文使用的術(shù)語“氨基酸變體”用來指相對于編碼參照蛋白質(zhì)的參照人基因的遺傳變體或核苷酸變體導(dǎo)致的相對于參照人蛋白質(zhì)序列的氨基酸改變。術(shù)語“氨基酸變體”旨在不僅包括單氨基酸置換而且包括氨基酸缺失、插入和參照蛋白質(zhì)中氨基酸序列的其它顯著改變。術(shù)語“基因型”在本文中是指基因的一個等位基因或兩個等位基因中特定核苷酸變體標(biāo)志物(或基因座)處的核苷酸特征。關(guān)于感興趣的基因的特定核苷酸位點(diǎn)，該基因座處的核苷酸或其在一個或兩個等位基因中的等同物形成該基因在該基因座處的基因型。 基因型可以是純合的或雜合的。因此，“基因型分型”是指確定基因型，即特定基因座處的核苷酸?；蛐头中鸵部梢酝ㄟ^確定可用來推斷相應(yīng)核苷酸變體的蛋白質(zhì)特定位置處的氨基酸變體來進(jìn)行。術(shù)語“基因座”是指基因序列或蛋白質(zhì)中的特定位置或位點(diǎn)。因此，在特定基因座中可能存在一個或多個連續(xù)核苷酸，或者在多肽中的特定基因座處存在一個或多個氨基酸。而且，基因座可以指基因中的特定位置，在此位置一個或多個核苷酸已經(jīng)缺失、插入或倒置。本文使用的術(shù)語“多肽”、“蛋白質(zhì)”和“肽”可以互換使用，是指氨基酸鏈，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。氨基酸鏈可以是至少兩個氨基酸的任意長度，包括全長蛋白質(zhì)。除非另外說明，多肽、蛋白質(zhì)和肽也包括其各種修改形式，包括但不限于糖基化形式、磷酸化形式等。多肽、蛋白質(zhì)或肽也可以指基因產(chǎn)物。本文提供了可以通過分子譜分析技術(shù)測定的基因和基因產(chǎn)物的列表。基因列表在檢測基因產(chǎn)物(例如，mRNA或蛋白質(zhì))的分子譜分析技術(shù)的上下文中給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這意味著所列出的基因的基因產(chǎn)物的檢測。類似地，基因產(chǎn)物列表在檢測基因序列或拷貝數(shù)的分子譜分析技術(shù)的上下文中給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這意味著對應(yīng)于基因產(chǎn)物的基因的檢測，作為一個實(shí)例，包括編碼基因產(chǎn)物的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，“生物標(biāo)志物”或“標(biāo)志物”包括取決于該內(nèi)容的基因和/或基因產(chǎn)物。術(shù)語“標(biāo)記”和“可檢測標(biāo)記”是指可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)、化學(xué)或類似的方法檢測的任何組合物。這樣的標(biāo)記包括用于用標(biāo)記的鏈霉親和素偶聯(lián)物染色的生物素、磁珠(例如，DYNABEADS )、熒光染料(例如，螢光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性標(biāo)記(例如，饑’，化，叱或邛)、酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它常用于ELISA的酶)和量熱標(biāo)記如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。教導(dǎo)了這樣的標(biāo)記的應(yīng)用的專利包括美國專利 3，817，837 ；3，850，752 ；3，939，350 ；3，996，345 ；4，277，437 ；4，275，149 ；和 4，366，241。檢測這些標(biāo)記的手段則本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，例如，放射性標(biāo)記可以用光學(xué)膠片或閃爍計數(shù)器檢測，熒光標(biāo)記可以用光學(xué)檢測器檢測發(fā)出的光來檢測。酶標(biāo)記一般通過向酶提供底物并檢測酶作用于底物產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測，量熱標(biāo)記通過簡單地顯示有色標(biāo)記來檢測。標(biāo)記可以包括，例如，結(jié)合標(biāo)記抗體的配體、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、酶和可作為標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對成員的抗體。關(guān)于標(biāo)記、標(biāo)記過程和標(biāo)記檢測的介紹可見Polak和Van Noorden Introduction to Immunocytochemistry,2nd ed.，Springer Verlag，NY(1997)； 禾口 Haugland Handbook of Fluorescent Probe and Research Chemicals，a combined handbook and catalogue Published by Molecular Probe,Inc. (1996)?？蓹z測的標(biāo)記包括但不限于核苷酸(標(biāo)記的或未標(biāo)記的)、復(fù)合體、糖、肽、蛋白質(zhì)、抗體、化學(xué)化合物、傳導(dǎo)聚合物、結(jié)合部分如生物素、質(zhì)量標(biāo)簽、量熱劑、發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光劑、光散射劑、熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、負(fù)荷標(biāo)記(電或磁荷)、揮發(fā)性標(biāo)記和疏水性標(biāo)記、 生物分子(例如，結(jié)合對抗體/抗原、抗體/抗體、抗體/抗體片段、抗體/抗體受體、抗體/ 蛋白A或蛋白G、半抗原/抗半抗原、生物素/親和素、生物素/鏈霉親和素、葉酸/葉酸鹽結(jié)合蛋白、維生素B12/內(nèi)因子、化學(xué)反應(yīng)基/互補(bǔ)化學(xué)反應(yīng)基(例如，巰基/馬來酰亞胺、 巰基/鹵代乙?；苌?、胺/異硫氰酸酯、胺/琥伯酰亞胺基酯和胺/磺?；u化物的成員)等等。本文使用的術(shù)語“抗體”包括天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括，例如， 單鏈抗體、嵌合、雙功能和人源化抗體，及其抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab' , F(ab' )2, Fab, Fv 禾口 rlgG) ο 參見 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.)。也參見，例如，Kuby, J. , Immunology, 3. sup. rd Ed. , W. H. Freeman & Co. , New York(1998) 這樣的非天然存在的抗體可以使用固相肽合成法構(gòu)建，可以重組產(chǎn)生，或者可以例如通過篩查由可變重鏈和可變輕鏈組成的組合文庫獲得，如Huse等人， Science 246 :1275-1281(1989)所述，其通過引用并入本文。制備例如嵌合、人源化、CDR移植的、單鏈和雙功能抗體的這些和其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見，例如，Winter 和 Harris，Immunol. Today 14:243-246(1993) ；Ward 等人，Nature 341:544-546(1989)； Harlow 禾口 Lane, Antibodies,511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988 ;Hilyard 等人，Protein Engineering :A practical approach(IRL Press1992) ；Borrebaeck,Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995)；以上文獻(xiàn)通過引用并入本文。除非另外指出，抗體可以包括多克隆和單克隆抗體?？贵w也包括遺傳工程形式，如嵌合抗體(例如，人源化鼠抗體)和異偶聯(lián)抗體(例如，雙特異性抗體)。該術(shù)語也指重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語抗體也包括二價或雙特異性分子、雙體、三體和四體。二價和雙特異性分子描述于，例如，Kostelny 等人(1992) J Immunol 148 1547，Pack和Pluckthun(1992) Biochemistry 31 1579，Holliger 等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA. 90 :6444,Gruber 等人(1994) J Immunol :5368，Zhu 等人(1997)Protein Sci 6:781，Hu 等人(1997)Cancer Res. 56 :3055, Adams 等人(1993) Cancer Res. 53 :4026,禾口 McCartney,等人(1995) Protein Eng. 8 :301。一般來說，抗體具有重鏈和輕鏈。每個重鏈和輕鏈含有恒定區(qū)和可變區(qū)，(這些區(qū)域也被稱為“域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有被三個高變區(qū)打斷的四個框架區(qū)，也被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？蚣軈^(qū)和CDR的程度已經(jīng)確定。不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種內(nèi)相對保守。抗體的框架區(qū)，即作為組分的輕鏈和重鏈的組合框架區(qū)，用來在三維空間定位和排列。⑶R主要負(fù)責(zé)與抗原表位的結(jié)合。每條鏈的⑶R —般被稱為⑶R1、⑶R2和⑶R3， 從N末端開始連續(xù)編號，一般也用特定⑶R所定位的鏈來確定。因此，Vh⑶R3位于它所存在的抗體重鏈的可變域，而\ CDRl是來自它所存在的抗體輕鏈可變域的CDRl。提到乂11是指抗體的免疫球蛋白重鏈(包括Fv、scFv或Fab的重鏈)的可變區(qū)。提到\是指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈)的可變區(qū)。短語“單鏈Fv”或“scFv”是指一種抗體，其中傳統(tǒng)雙鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變域已經(jīng)連接形成一條鏈。一般來說，連接肽插入兩條鏈之間，以允許活性結(jié)合位點(diǎn)的適當(dāng)折疊和產(chǎn)生?！扒逗峡贵w”是一種免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分被改變、替換或交換，使得抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接到不同或改變的類別、效應(yīng)功能和/或牿或完全不同的分子的恒定區(qū)，它給嵌合抗體提供了新的性質(zhì)，例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或者(b)可變區(qū)或其一部分被改變、替換或交換為具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)?！叭嗽椿贵w”是一種免疫球蛋白分子，它含有來源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受抗體)，其中來自接受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被替換為來自非人種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基，它們具有希望的特異性、親和力和能力。在一些情況中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。人源化抗體也可以包括在接受抗體或在輸入的CDR或框架序列中均未發(fā)現(xiàn)的殘基。 通常，人源化抗體包括至少一種、一般兩種可變域的基本上全部，其中所有或基本上所有 CDR區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的區(qū)域，所有或基本上所有框架(FR)區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。人源化抗體最好也包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的(Jones 等人，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332 323-327(1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)) 人源化基本上可以按照 Winter 和同事(Jones 等人，Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann 等人，Nature 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等人，Science 239:1534-1536(1988))的方法進(jìn)行，即通過用嚙齒動物CDRs或CDR序列替換人抗體的相應(yīng)的序列。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中大大少于完整的人可變區(qū)已經(jīng)被來自非人物種的相應(yīng)的序列取代。術(shù)語“表位”和“抗原決定簇”是指抗原上被抗體所結(jié)合的位點(diǎn)。表位可以由連續(xù)氨基酸構(gòu)成，或由通過蛋白質(zhì)三級折疊鄰近的不連續(xù)氨基酸構(gòu)成。由連續(xù)氨基酸形成的表位一般保持暴露于變性溶劑，而通過三級折疊形成的表位一般在用變性溶劑處理后丟失。 表位一般在獨(dú)特的空間構(gòu)象中包括至少3個、更通常至少5或8-10個氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括，例如，χ-射線結(jié)晶法和二維核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E.Morris, Ed(1996)。術(shù)語“引物”、“探針”和“寡核苷酸”在本文中可以互換使用，是指相對較短的核酸片段或序列。它們可以包括DNA、RNA或其雜合體，或化學(xué)修飾的類似物或其衍生物。一般來說，它們是單鏈的。但是，它們也可以是具有兩條互補(bǔ)鏈的雙鏈，這兩條鏈可以通過變性分離。正常情況下，引物、探針和寡核苷酸的長度為大約8個核苷酸至大約200個核苷酸， 優(yōu)選為大約12個核苷酸至大約100個核苷酸，更優(yōu)選為大約18個至大約50個核苷酸。它們可以用可檢測標(biāo)志物標(biāo)記，或者使用用于各種分子生物學(xué)應(yīng)用的常規(guī)方法修飾。術(shù)語“分離的”當(dāng)用于核酸(例如，基因組DNA、cDNA、mRNA或其片段)時是指核酸分子以基本上與其它天然存在的核酸分離的形式存在，該其它天然存在的核酸在正常情況下與該分子締合。因?yàn)樘烊淮嬖诘娜旧w(或其病毒等同物)包括長核酸序列，分離的核酸可以是在染色體中只有該核酸序列的一部分而在同一染色體上不存在一個或多個其它部分的核酸分子。更具體地，分離的核酸可包括天然存在的核酸序列，該核酸序列在天然存在的染色體(或其病毒等同物)中位于該核酸的側(cè)翼。分離的核酸可以基本上與同一生物的不同染色體上的其它天然存在的核酸分離。分離的核酸也可以是其中核酸分子顯著富集以構(gòu)成組合物中總核酸的至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^； 至少99%的組合物。分離的核酸可以是雜合核酸，其中特定核酸分子共價連接至一個或多個在自然中不位于特定核酸側(cè)翼的核酸分子。例如，分離的核酸可以在載體中。另外，特定核酸的核苷酸序列可以與天然存在的核酸或修飾形式或具有一個或多個突變?nèi)绾塑账嶂脫Q、缺失/插入、倒置等的突變蛋白相同。分離的核酸可以由重組宿主細(xì)胞(其中核酸已經(jīng)重組擴(kuò)增和/或表達(dá))制備，或者可以是具有天然存在的核苷酸序列或其人工修飾形式的化學(xué)合成的核酸。本文使用的術(shù)語“分離的多肽”被定義為以自然中發(fā)現(xiàn)的形式以外的形式存在的多肽分子。因此，分離的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，分離的多肽可以是“雜合多肽”。分離的多肽也可以是通過氨基酸的添加或缺失或置換由天然存在的多肽衍生的多肽。 分離的多肽也可以是“純化的多肽”，后者在本文中用來指特定多肽分子顯著富集從而構(gòu)成組合物中總蛋白質(zhì)含量的至少10%的組合物或制品?！凹兓亩嚯摹笨梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)或通過化學(xué)合成從天然或重組宿主細(xì)胞獲得，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的。術(shù)語“雜合蛋白質(zhì)”、“雜合多肽”、“雜合肽”、“融合蛋白”、“融合多肽”和“融合肽” 在本文中可以互換使用，是指非天然存在的多肽或分離的多肽，其中特定多肽分子共價連接至一個或多個在自然中不連接至特定多肽的其它多肽分子。因此，“雜合蛋白質(zhì)”可以是通過共價鍵連接在一起的兩個天然存在的蛋白質(zhì)或其片段?！半s合蛋白質(zhì)”也可以是通過將兩個人工多肽共價連接在一起形成的蛋白質(zhì)。一般來說，但不是必然的，兩個或多個多肽分子通過肽鍵連接或“融合”在一起，形成一條不分支的多肽鏈。術(shù)語“高嚴(yán)格性雜交條件”當(dāng)用于核酸雜交時包括在含有50%甲酰胺、 5 X SSC (750mM NaCl，75mM 檸檬酸鈉)、50mM 磷酸鈉，pH 7. 6，5 X Denhardt，s 溶液、10 %硫酸葡聚糖和20 μ g/ml變性剪切鮭精DNA的溶液中42°C進(jìn)行雜交過夜，雜交濾器在0. 1 X SSC 中在大約65°C下洗滌。術(shù)語“中嚴(yán)格性雜交條件”當(dāng)用于核酸雜交時包括在含有50%甲酰胺、5XSSC(750mM NaCl，75mM 檸檬酸鈉)、50mM 磷酸鈉，pH 7. 6，5XDenhardt，s 溶液、 10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml變性剪切鮭精DNA的溶液中37°C進(jìn)行雜交過夜，雜交濾器在 IXSSC中在大約50°C下洗滌。需要注意本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚可以使用許多其它雜交方法、 溶液和溫度來實(shí)現(xiàn)相當(dāng)?shù)膰?yán)格雜交條件。為了比較兩個不同的核酸或多肽序列，一個序列(測試序列)可以被描述為與另一序列(比較序列)有一定的百分比相同。相同性百分比可以通過并入各種BLAST程序中的 Karlin 和 Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :5873-5877 (1993)的算法來確定。 相同性百分比可以通過〃 BLAST 2 Sequences"工具確定，該工具可以從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上獲得。參見 Tatusova 和 Madden，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. , 174(2) 247-250 (1999) ο對于DNA-DNA逐對比較，BLASTN程序以缺省參數(shù)使用(例如，匹配1 ；錯配-2 ；開放空位5個罰分；延伸空位2個罰分；空位χ dropoff :50 ；期望值10 ；字長 11，使用濾器)。對于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)序列逐對比較，BLASTP程序可以使用缺省參數(shù)(例如，矩陣:BL0SUM62 ；空位開放11 ；空位延伸1 ；χ dropoff :15 ；期望值:10.0 ；字長:3，使用濾器)。兩條序列的相同性百分比如下計算使用BLAST將測試序列與比較序列進(jìn)行比對，確定對齊的測試序列中與比較序列相同位點(diǎn)的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的數(shù)目，和將相同氨基酸或核苷酸的數(shù)目除以比較序列中氨基酸或核苷酸的數(shù)目。當(dāng)使用 BLAST比較兩條序列時，比對該序列，產(chǎn)生定義的對齊區(qū)上的相同性百分比。如果兩條序列在其全長上比對，通過BLAST產(chǎn)生的相同性百分比是兩條序列的相同性百分比。如果BLAST 不在其全長上比對兩條序列，則測試序列和比較序列的未對齊區(qū)中相同的氨基酸或核苷酸的數(shù)目被認(rèn)為是0，并通過將對齊區(qū)中相同氨基酸或核苷酸的數(shù)目相加并將該數(shù)字除以比較序列的長度來確定相同性百分比。可以使用BLAST程序的各種版本來比較序列，例如 BLAST 2. 1. 2 或 BLAST+2. 2. 22。受試者可以是任何可能受益于本發(fā)明的方法的動物，包括，例如，人和非人哺乳動物，如靈長類動物、嚙齒動物、馬、狗和貓。受試者包括但不限于真核生物，最優(yōu)選哺乳動物如靈長類動物，例如，黑猩猩或人、牛；狗；貓；嚙齒動物，例如，豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鳥； 爬行動物；或魚。特別使用本文所述的方法治療的受試者包括人。受試者可以被稱為個體或患者。根據(jù)本發(fā)明對疾病或個體的治療是獲得有益的或希望的醫(yī)療結(jié)果的方法，包括臨床結(jié)果，但不一定治愈。對于本發(fā)明，有益的或希望的臨床結(jié)果包括但不限于一個或多個癥狀的緩解或改善、疾病程度的減輕、穩(wěn)定的(即沒有惡化)疾病狀態(tài)、防止疾病擴(kuò)散、疾病進(jìn)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的改善或減輕、和緩解(無論是部分的還是整體的)，無論是可檢測的還是不可檢測的。治療也包括與未接受治療或接受不同的治療預(yù)計的存活期相比延長存活期。治療可包括施用治療劑，該治療劑可以是對病變細(xì)胞例如癌細(xì)胞或其它可能促進(jìn)疾病狀態(tài)的細(xì)胞如活化的免疫細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性、細(xì)胞抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的藥劑。通過本發(fā)明的方法選擇的治療劑沒有限制?？梢赃x擇任何治療劑，只要在分子譜分析和該治療劑的潛在效力之間建立聯(lián)系。治療劑包括但不限于小分子、蛋白質(zhì)治療、抗體治療、病毒治療、基因治療等。癌癥治療或療法包括細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的和非細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的癌癥療法，包括但不限于化學(xué)療法、激素療法、放射療法、免疫療法及其組合。化學(xué)治療劑包括治療劑和治療例如殺死癌細(xì)胞的治療劑的組合。不同類型的化療藥物的例子包括但不限于烷化劑 (例如，氮芥衍生物、乙烯亞胺、烷基磺酸酯類、胼類和三嗪類、亞硝基脲類和金屬鹽類)、植物生物堿類(例如，長春花生物堿類、紫杉烷類、鬼白毒素和喜樹堿類似物)、抗腫瘤抗生素類(例如，蒽環(huán)類、色霉素類等)，抗代謝物(例如，葉酸拮抗劑，嘧啶拮抗劑，嘌呤拮抗劑， 和腺苷脫氨酶抑制劑)，拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，和各種抗腫瘤藥(例如，核糖核苷酸還原酶抑制劑，腎上腺皮質(zhì)類固醇抑制劑，酶，抗微管劑和維生素A酸類)。此處使用的樣品包括任何可用于分子譜分析的相關(guān)樣品，例如，組織如活檢或在外科或其它操作過程中切除的組織的切片、尸檢樣品和為了組織分析目的采集的冷凍切片。這樣的樣品包括血液和血液部分或產(chǎn)物(例如，血清、棕黃層、血漿、血小板、紅細(xì)胞等)、痰、頰細(xì)胞組織、培養(yǎng)的細(xì)胞(例如，原代培養(yǎng)物、外植體和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)、糞便、尿、其它生物液體或體液(例如，前列腺液、胃液、腸液、腎液、肺液、腦脊液等)，等等。樣品可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)處理。樣品可以是但不限于新鮮的、冷凍的或固定的。在一些實(shí)施方案中，樣品包括福爾馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE)組織或新鮮冷凍的(FF)組織。樣品可以包括培養(yǎng)的細(xì)胞，包括來源于受試樣品的原代或永生化細(xì)胞系。樣品也可以指來自受試者樣品的提取物。例如，樣品可以包括從組織或體液提取的DNA、RNA或蛋白質(zhì)。 可以獲得許多用于此目的的技術(shù)和商品試劑盒。來自個體的新鮮樣品可以用試劑處理以在諸如細(xì)胞裂解和提取的進(jìn)一步加工之前保持RNA。樣品可以包括為了其它目的收集的冷凍的樣品。樣品可以與相關(guān)的信息相結(jié)合，如受試者的年齡、性別和臨床癥狀；樣品的來源； 和樣品的收集和貯存方法。樣品一般從受試者獲得?；顧z包括為了診斷或預(yù)后評價切除組織樣品的過程，以及組織標(biāo)本本身。本領(lǐng)域已知的任何活檢技術(shù)可用于本發(fā)明的分子譜分析方法。應(yīng)用的活檢技術(shù)可取決于將要評價的組織類型(例如，結(jié)腸、前列腺、腎、膀胱、淋巴結(jié)、肝、骨髓、血細(xì)胞、肺、乳腺等)、腫瘤的大小和類型(例如，固體的或懸浮的，血液或腹水)，以及其它因素。代表性的活檢技術(shù)包括但不限于切除活檢、切開活檢、針刺活檢、手術(shù)活檢和骨髓活檢。“切除活檢”是指切除整個腫瘤塊，圍繞著它有少量的正常組織?！扒虚_活檢”是指切除楔形組織，包括腫瘤的橫截面直徑。分子譜分析可以采用腫瘤塊的“芯針活檢”，或“細(xì)針吸活檢”，后者通常從腫瘤塊內(nèi)獲得細(xì)胞懸浮液?；顧z技術(shù)例如在 Harrison' s Principles of Internal Medicine,Kasper, 等人，eds.，16th ed.，2005，第70章和整個第V部分討論。本領(lǐng)域已知的并且沒有具體描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)通常按照Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press， New York (1989)禾口 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular BiologyjJohn Wiley 禾口 Sons，Baltimore, Md. (1989)禾口 Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning， John Wiley & Sons，New York(1988)禾口 Watson 等人，Recombinant DNA, Scientific American Books, New York 禾口 Birren 等人(eds) Genome Analysis :A Laboratory ManualSeries, Vols. l_4Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)禾口美國專利 4，666，828 ；4，683，202 ；4，801，531 ；5，192，659 和 5，272，057 中所述的方法，這些文獻(xiàn)通過引用并入本文。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通常可以如PCR Protocols =A Guide to Methods和 Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)所述進(jìn)行?；虮磉_(dá)譜分析在本發(fā)明的某些方面，生物標(biāo)志物通過基因表達(dá)譜分析進(jìn)行評估?；虮磉_(dá)譜分析方法包括基于多核苷酸的雜交分析的方法，和基于多核苷酸測序的方法。本領(lǐng)域已知用于定量樣品中的mRNA表達(dá)的常用方法包括northern印跡法和原位雜交(Parker & Barnes (1999)Methods in Molecular Biology 106:247-283) ；RNAse 保護(hù)試驗(yàn)(Hod (1992) Biotechniques 13 :852-854)；和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) (Weis 等人(199 Trends in Genetics 8:263-264)。此外，可以使用能夠識別特定雙鏈體(包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體)的抗體。代表性的基于測序的基因表達(dá)分析方法包括基因表達(dá)系列分析(SAGE)和通過大規(guī)模平行簽名測序(MPSQ的基因表達(dá)分析。逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR (RT-PCR)RT-PCR可以用來確定本發(fā)明生物標(biāo)志物的RNA水平，例如，mRNA或miRNA水平。 RT-PCR可以用來比較不同樣品群體中、正常和腫瘤組織中、進(jìn)行藥物治療或不進(jìn)行藥物治療的本發(fā)明生物標(biāo)志物的這些RNA水平，以表征基因表達(dá)的模式，區(qū)別密切相關(guān)的RNA，以及分析RNA結(jié)構(gòu)。第一步是從樣品中分離RNA，例如，mRNA。起始材料可以是分別從人腫瘤或腫瘤細(xì)胞系以及相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系中分離的總RNA。因此，RNA可以從諸如腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系的樣品中分離，并與來自健康供體的合并的DNA進(jìn)行比較。如果mRNA的來源是原發(fā)性腫瘤，則mRNA可以提取自例如冷凍的或保存的石蠟包埋的和固定的(例如福爾馬林固定的)組織樣品。提取mRNA的常用方法是本領(lǐng)域公知的，并且在分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書中公開，包括Ausubel等人(1997)Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons。 從石蠟包埋的組織中提取RNA的方法例如在Rupp & Locker (1987) Lab hvest. 56 :A67和 De Andres等人，BioiTechniques 18 :42044(1995)中公開。特別是，RNA分離可以使用來自如Qiagen等廠商的純化試劑盒、緩沖液組和蛋白酶按照使用說明進(jìn)行OiIAGEN Inc., Valencia, CA) 0例如，來自培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA可以使用Qiagen RNeasy微型柱分離。大量 RNA分離試劑盒可以購得，并且可以用于本發(fā)明的方法。在替代方案中，第一步是從目標(biāo)樣品中分離miRNA。起始材料一般是分別從人腫瘤或腫瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系中分離的總RNA。因此RNA可以從多種原發(fā)性腫瘤或腫瘤細(xì)胞系中分離，具有來自健康供體的合并的DNA。如果miRNA的來源是原發(fā)性腫瘤，則miRNA可以提取自例如冷凍的或保存的石蠟包埋的和固定的(例如福爾馬林固定的)組織樣品。提取miRNA的常用方法是本領(lǐng)域公知的，并且在分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)教科書中公開， 包括 Ausubel 等人(1997) Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons。從石蠟包埋的組織中提取RNA的方法例如在Rupp & Locker (1987)Lab Invest. 56 A67 和 De Andres 等人，BioiTechniques 18:42044(1995)中公開。特別是,RNA 分離可以使用來自如Qiagen等廠商的純化試劑盒、緩沖液組和蛋白酶按照使用說明進(jìn)行。例如，來自培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA可以使用Qiagen RNeasy微型柱分離。大量RNA分離試劑盒可以購得， 并且可以用于本發(fā)明的方法。無論RNA包括mRNA、miRNA還是其它類型的RNA，通過RT-PCR的基因表達(dá)譜分析可以包括RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶包括但不限于禽類成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)。逆轉(zhuǎn)錄步驟根據(jù)表達(dá)譜分析的情況和目的一般用特異性引物、隨機(jī)六聚體或寡聚-dT引物引發(fā)。例如，提取的RNA可以使用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer, Calif.，USA)按照使用說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。衍生的cDNA然后可以用作后續(xù)PCR反應(yīng)中的模板。盡管PCR步驟可以使用多種熱穩(wěn)定的DNA依賴的DNA聚合酶，但是一般使用Taq DNA聚合酶，該酶具有5' -3'活性但是缺乏3' -5'校正內(nèi)切核酸酶活性。TaqMan PCR 一般使用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性水解與目標(biāo)擴(kuò)增子結(jié)合的雜交探針，但是也可以使用任何具有等同的5'核酸酶活性的酶。使用兩種寡核苷酸產(chǎn)生PCR反應(yīng)典型的擴(kuò)增子。第三寡核苷酸或探針設(shè)計為檢測位于兩個PCR引物之間的核苷酸序列。探針不能用 Taq DNA聚合酶延伸，并且用報道熒光染料和猝滅熒光染料標(biāo)記。當(dāng)兩種染料在探針上靠近在一起時，來自報道染料的任何激光誘導(dǎo)的發(fā)射被猝滅染料猝滅。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，Taq DNA聚合酶以模板依賴的方式切割探針。得到的探針片段在溶液中解離，來自釋放的報道染料的信號沒有第二熒光團(tuán)的猝滅效果。對于合成的每個新分子釋放一個報道染料分子，對未猝滅的報道染料的檢測為數(shù)據(jù)的定量解釋提供了基礎(chǔ)。TaqMan RT-PCR可以使用商業(yè)上可以獲得的設(shè)備進(jìn)行，例如，使用ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems,Foster City, Calif. , USA)或 Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)。在一個特定實(shí)施方案中，5'核酸酶過程在實(shí)時定量PCR裝置如ABI PRISM 7700 Sequence Detection System 上運(yùn)行。該系統(tǒng)由熱循環(huán)儀、激光器、電荷耦合器件(CCD)、照相機(jī)和計算機(jī)組成。該系統(tǒng)在熱循環(huán)儀上以96孔形式擴(kuò)增樣品。在擴(kuò)增過程中，通過光纖維纜對全部96個孔實(shí)時采集激光誘導(dǎo)的熒光信號，并用CCD檢測。該系統(tǒng)包括用于運(yùn)行該儀器和用于分析數(shù)據(jù)的軟件。TaqMan數(shù)據(jù)最初表示為Ct或閾值循環(huán)。如上所述，在每個循環(huán)過程中記錄熒光值，代表擴(kuò)增反應(yīng)中到該點(diǎn)擴(kuò)增的產(chǎn)物量。熒光信號第一次被記錄為統(tǒng)計學(xué)顯著性的點(diǎn)是閾值循環(huán)(Ct)。為了使樣品間差異的錯誤和影響最小化，通常使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行RT-PCR。理想的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)在不同組織之間以恒定水平表示，并且不受實(shí)驗(yàn)治療的影響。最常用來標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)模式的RNA是管家基因甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAPDH)和β-肌動蛋白的mRNA。實(shí)時定量PCR(也稱為定量實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)，QRT-PCR或Q-PCR)是RT-PCR技術(shù)的一種較新的變化形式。Q-PCR可以通過雙標(biāo)記的熒光生成探針(即TaqMan 探針)測定 PCR產(chǎn)物積累。實(shí)時PCR與其中使用每個目標(biāo)序列的內(nèi)部競爭劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的定量競爭PCR 匹配，并且與使用樣品中所含標(biāo)準(zhǔn)化基因或管家基因進(jìn)行RT-PCR的定量比較PCR匹配。參見，例如 Held 等人(1996) Genome Research 6:986-994。
免疫組化(IHC)IHC是用特異性結(jié)合組織中抗原的結(jié)合抗體定位組織細(xì)胞中的抗原(例如，蛋白質(zhì))的過程?？乖Y(jié)合抗體可以偶聯(lián)或融合到允許其檢測(例如通過顯示)的標(biāo)記上。在一些實(shí)施方案中，該標(biāo)記是能夠催化產(chǎn)色反應(yīng)的酶，如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。酶可以融合到抗體上或使用非共價結(jié)合，例如使用生物素-親和素系統(tǒng)。或者，抗體可以用諸如熒光素、羅丹明、DyLight Fluor或Alexa Fluor的熒光團(tuán)標(biāo)記?？乖Y(jié)合抗體可以直接標(biāo)記，或者它本身可以被攜帶標(biāo)記的檢測抗體識別。使用IHC，可以檢測一種或多種蛋白質(zhì)。 基因產(chǎn)物的表達(dá)可能與其與對照水平相比的染色強(qiáng)度有關(guān)。在一些實(shí)施方案中，如果基因產(chǎn)物的染色在樣品中相對于對照至少變化1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2. 0、2. 2、 2. 5,2. 7,3. 0、4、5、6、7、8、9或10倍，則它被認(rèn)為差異表達(dá)。微陣列本發(fā)明的生物標(biāo)志物也可以利用微陣列技術(shù)鑒定、證實(shí)和/或測量。因此，表達(dá)譜生物標(biāo)志物可以利用微陣列技術(shù)在新鮮的或石蠟包埋的腫瘤組織中測量。在該方法中，將目標(biāo)多核苷酸序列置于或排列于微芯片基底上。排列的序列然后與來自目標(biāo)細(xì)胞或組織的特異性DNA探針雜交。mRNA的來源可以是從樣品(例如，人腫瘤或腫瘤細(xì)胞系和相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系)分離的總RNA。因此RNA可以從多種原發(fā)性腫瘤或腫瘤細(xì)胞系中分離。如果mRNA的來源是原發(fā)性腫瘤，則可以從例如冷凍的或保存的石蠟包埋的并固定的(例如福爾馬林固定的)組織樣品中提取mRNA，這些樣品是在每日臨床實(shí)踐中常規(guī)制備和保存的。生物標(biāo)志物的表達(dá)譜可以利用微陣列技術(shù)在新鮮的或石蠟包埋的腫瘤組織或體液中測量。在該方法中，將目標(biāo)多核苷酸序列置于或排列于微芯片基底上。排列的序列然后與來自目標(biāo)細(xì)胞或組織的特異性DNA探針雜交。與RT-PCR方法一樣，miRNA的來源一般是從人腫瘤或腫瘤細(xì)胞系(包括體液)如血清、尿、淚和外來體和相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系分離的總RNA。因此RNA可以從多種來源分離。如果miRNA的來源是原發(fā)性腫瘤，則可以從例如冷凍的組織樣品中提取miRNA，這些樣品是在每日臨床實(shí)踐中常規(guī)制備和保存的。在微陣列技術(shù)的特定實(shí)施方案中，將PCR擴(kuò)增的cDNA克隆插入片段加到密集陣列中的基底上。在一個方面，將至少 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 500、 2，000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10，000,15,000,20,000,25,000,30,000、 35，000,40, 000,45, 000或至少50，000個核苷酸序列加到基底上。每個序列可以對應(yīng)于不同的基因，或者每個基因可以陣列排列多個序列。固定在微芯片上的微陣列排列的基因適合在嚴(yán)格條件下雜交。熒光標(biāo)記的cDNA探針可以通過經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄從目標(biāo)組織提取的RNA摻入熒光核苷酸來產(chǎn)生。加到芯片上的標(biāo)記的cDNA探針與陣列上的每個DNA點(diǎn)特異性雜交。 嚴(yán)格洗滌以除去非特異性結(jié)合的探針后，通過共聚焦激光顯微術(shù)或通過另一種檢測方法如 CCD照相機(jī)掃描芯片。每個陣列排列的成分的雜交的定量允許評估相應(yīng)的mRNA豐度。使用雙色熒光，從兩個RNA來源產(chǎn)生的分別標(biāo)記的cDNA探針與陣列逐對雜交。同時測定來自對應(yīng)于每個指定基因的兩個來源的轉(zhuǎn)錄物的相對豐度。雜交的小型化允許方便和快速地評價大量基因的表達(dá)模式。已經(jīng)證明這些方法具有檢測每個細(xì)胞以較少拷貝數(shù)表達(dá)的罕見轉(zhuǎn)錄物以及可重復(fù)地檢測表達(dá)水平的至少大約兩倍差異所需的靈敏度(khena等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2) :106-149)。微陣列分析可以使用商購的設(shè)備按照使用手冊進(jìn)行，包括但不限于 Affymetrix GeneChip technology (Affymetrix, Santa Clara，CA)、Agilent(Agilent Technologies,Inc. , Santa Clara, CA)或Illumina (Illumina,Inc. ,San Diego, CA)微陣列技術(shù)。用于基因表達(dá)大規(guī)模分析的微陣列方法的發(fā)展使得能夠系統(tǒng)地探索癌癥分類的分子標(biāo)志物和多種腫瘤類型中的結(jié)果預(yù)測。在一些實(shí)施方案中，使用Agilent全人類基因組微陣列試劑盒(Agilent Technologies, Inc. , Santa Clara, CA)。該系統(tǒng)可以分析超過41，000種獨(dú)特的人類基因和代表的轉(zhuǎn)錄物，全部具有公共的注釋。該系統(tǒng)按照使用說明使用。在一些實(shí)施方案中，使用Illumina全基因組DASL試驗(yàn)(Illumina Inc. , San Diego, CA) 0該系統(tǒng)提供以高通量方式同時對來自最小RNA輸入量的超過M，000個轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行譜分析的方法，它們來自新鮮冷凍的(FF)和福爾馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE)組織來源。微陣列表達(dá)分析包括確定基因或基因產(chǎn)物相對于參照是上調(diào)還是下調(diào)。這種確定可以使用統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)來進(jìn)行，以確定觀察到的任何差異表達(dá)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。在一些實(shí)施方案中，使用參數(shù)統(tǒng)計檢驗(yàn)確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。參數(shù)統(tǒng)計檢驗(yàn)可以包括，例如，部分析因設(shè)計、方差分析(ANOVA)、t-檢驗(yàn)、部分析因設(shè)計、Pearson相關(guān)、簡單線性回歸、非線性回歸、 多元線性回歸、或多元非線性回歸。此外，參數(shù)統(tǒng)計檢驗(yàn)也可以包括單因素方差分析、兩因素方差分析或方差的重復(fù)測量分析。在其它實(shí)施方案中，使用非參數(shù)統(tǒng)計檢驗(yàn)確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。例子包括但不限于Wilcoxon符號秩檢驗(yàn)、Mann-Whitney檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)、Friedman檢驗(yàn)、Spearman秩次序相關(guān)系數(shù)、Kendall Tau分析和非參數(shù)回歸檢驗(yàn)。 在一些實(shí)施方案中，以小于大約0. 05,0. 01,0. 005,0. 001,0. 0005或0. 0001的ρ-值確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。盡管本發(fā)明的方法中使用的微陣列系統(tǒng)可以測定上千種轉(zhuǎn)錄物，但是數(shù)據(jù)分析只需要對感興趣的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行，從而減少了進(jìn)行多種統(tǒng)計檢驗(yàn)中固有的多重比較的問題。P-值也可以對多重比較進(jìn)行校正，例如，使用Bonferroni校正、其改良方法或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，例如，Hochberg校正、Holm-Bonferroni校正、§iddk校正或
Dunnett' s校正。也可以考慮差異表達(dá)的程度。例如，當(dāng)與對照相比的表達(dá)變化總數(shù)為樣品相對于對照相差至少 1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9,2. 0,2. 2,2. 5,2. 7,3. 0、4、5、 6、7、8、9或10倍時，可以認(rèn)為基因差異表達(dá)。差異表達(dá)考慮過表達(dá)和欠表達(dá)。如果差異表達(dá)滿足統(tǒng)計閾值、倍數(shù)變化閾值或兩者，可以認(rèn)為基因或基因產(chǎn)物上調(diào)或下調(diào)。例如，確定差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)可以包括P-值為0.001和倍數(shù)變化至少為1.5倍(上或下)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些統(tǒng)計和閾值測量可以適合通過本文公開的任何分子譜分析技術(shù)確定差異表達(dá)。本發(fā)明的各種方法利用多種微陣列，檢測樣品中生物實(shí)體的存在和可能的量。陣列一般含有可定位的部分，該部分可檢測樣品中實(shí)體的存在，例如，通過結(jié)合事件。微陣列包括但不限于DNA微陣列，如cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列和SNP微陣列、microRNA陣列、 蛋白質(zhì)微陣列、抗體微陣列、組織微陣列、細(xì)胞微陣列(也稱為轉(zhuǎn)染微陣列)、化學(xué)化合物微陣列和碳水化合物陣列(糖陣列)。DNA陣列一般包括可定位的能夠結(jié)合樣品中存在的序列的核苷酸序列。MicroRNA陣列，例如，來自University of Louisville的MMChips陣列，或來自Agilent的商業(yè)系統(tǒng)，可用來檢測microRNA。蛋白質(zhì)微陣列可以用來確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，包括但不限于確定蛋白質(zhì)激酶的底物、轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)-激活，或確定生物活性小分子的靶標(biāo)。蛋白質(zhì)陣列可包括不同蛋白質(zhì)分子(通常為抗體)或結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)的核苷酸序列的陣列?？贵w微陣列包括點(diǎn)樣至蛋白質(zhì)芯片上的抗體，該抗體用作捕獲分子， 檢測來自諸如細(xì)胞或組織裂解溶液的樣品的蛋白質(zhì)或其它生物材料。例如，抗體陣列可用來檢測來自例如血清或尿的體液的生物標(biāo)志物，用于診斷應(yīng)用。組織微陣列包括以陣列形式裝配的單獨(dú)的組織核心，以允許多重組織學(xué)分析。細(xì)胞微陣列也被稱為轉(zhuǎn)染微陣列，包括各種捕獲劑，如抗體、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)，它們可以與細(xì)胞相互作用，以利于它們被捕獲在可尋址的位置上?；瘜W(xué)化合物微陣列包括化學(xué)化合物的陣列，并可用來檢測蛋白質(zhì)或其它結(jié)合化合物的生物材料。碳水化合物陣列(糖陣列)包括碳水化合物的陣列，可以檢測，例如， 結(jié)合糖部分的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的方法可以使用類似的方法或改進(jìn)。通過大規(guī)模平行簽名測序(MPSS)的基因表達(dá)分析該方法由 Brenner 等人 Q000) Nature Biotechnology 18 :630-634 描述，是一種組合了非基于凝膠的簽名測序以及在單獨(dú)的微珠上體外克隆上百萬個模板的測序方法。首先，DNA模板的微珠文庫通過體外克隆構(gòu)建。然后以高密度在流動池中裝配含模板微珠的平面陣列。每個微珠上克隆的模板的自由端使用基于熒光的簽名測序方法同時分析，該方法不需要DNA片段分離。已經(jīng)證明該方法在一次操作中同時和精確地提供成百上千個來自 cDNA文庫的基因簽名序列。MPSS數(shù)據(jù)具有許多用途。幾乎全部轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平都可以測定；簽名的豐度代表分析的組織中的基因的表達(dá)水平。用于分析標(biāo)簽頻率和檢測文庫間差異的定量方法已經(jīng)發(fā)表，并且并入SAGE 數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫中，適用于MPSS數(shù)據(jù)。全基因組序列的可用性允許直接比較簽名與基因組序列，并進(jìn)一步擴(kuò)展了 MPSS數(shù)據(jù)的應(yīng)用。因?yàn)镸PSS分析的目標(biāo)沒有預(yù)先選擇(如在微陣列上)，MPSS數(shù)據(jù)可以表征轉(zhuǎn)錄組的完全復(fù)雜性。這類似于一次對上百萬個EST測序，可以使用基因組序列數(shù)據(jù)，使得可以通過計算手段容易地鑒別MPSS 簽名的來源?；虮磉_(dá)系列分析(SAGE)基因表達(dá)系列分析(SAGE)是一種允許同時定量分析大量基因轉(zhuǎn)錄物的方法，不需要為每個轉(zhuǎn)錄物提供單獨(dú)的雜交探針。首先，產(chǎn)生短序列標(biāo)簽(例如，大約10_14bp)，其含有足夠的唯一確定轉(zhuǎn)錄物的信息，條件是該標(biāo)簽從每種轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的獨(dú)特位置獲得。然后， 將許多轉(zhuǎn)錄物連接在一起，形成長系列分子，該分子可以測序，同時揭示多個標(biāo)簽的身份。 可以通過確定各個標(biāo)簽的豐度，并確定對應(yīng)于每個標(biāo)簽的基因，來定量評估任何轉(zhuǎn)錄物群體的表達(dá)模式。參見，例如 Velculescu 等人(1995) Science 270 :484-487 ；和 Velculescu 等人(1997)Cell 88 :243_51。DNA拷貝數(shù)譜分析任何能夠確定特定樣品的DNA拷貝數(shù)譜的方法可以用于本發(fā)明的分子譜分析，只要分辨率足以確定本發(fā)明的生物標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道并且能夠利用大量不同的平臺以足以確定一種或多種本發(fā)明生物標(biāo)志物的拷貝數(shù)的分辨率評估全基因組拷貝數(shù)變化。 一些平臺和技術(shù)在下面的實(shí)施方案中描述。在一些實(shí)施方案中，拷貝數(shù)譜分析包括通過全基因組擴(kuò)增方法擴(kuò)增全基因組DNA。 全基因組擴(kuò)增方法可以使用標(biāo)準(zhǔn)置換聚合酶和隨機(jī)引物。
在這些實(shí)施方案的某些方面，拷貝數(shù)譜分析包括全基因組擴(kuò)增的DNA與高密度陣列雜交。在更具體的方面，高密度陣列具有5，000個或更多的不同的探針。在另一個具體方面，高密度陣列具有 5，000,10, 000,20, 000,50, 000,100, 000,200, 000,300, 000,400, 000、 500，000,600, 000,700, 000,800, 000,900, 000 或 1，000，000 個或更多的探針。在另一個具體方面，陣列上的每個不同的探針是長度為大約15-200個堿基的寡核苷酸。在另一個具體方面，陣列上的每個不同的探針是長度為大約15-200、15-150、15-100、15-75、15-60或 20-55個堿基的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，微陣列用來幫助確定樣品(例如來自腫瘤的細(xì)胞)的拷貝數(shù)譜型。微陣列一般包括多種寡聚體(例如，DNA或RNA多核苷酸或寡核苷酸，或其它聚合物)，它們是合成的或以陣列模式沉積在基底(例如，玻璃支持體)上。與支持體結(jié)合的寡聚體是“探針”，它們用來在雜交實(shí)驗(yàn)中雜交或結(jié)合樣品材料(例如，從腫瘤樣品制備或獲得的核酸)。相反的情況也可適用樣品可以結(jié)合到微陣列基底上，寡聚體探針在溶液中用于雜交。在使用中，陣列表面與一個或多個目標(biāo)在有利于靶標(biāo)與一個或多個探針特異性、高親和力結(jié)合的條件下接觸。在一些設(shè)置中，樣品核酸用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記， 使得用掃描設(shè)備可以檢測雜交的樣品和探針。DNA陣列技術(shù)具有使用多種(例如，成百上千)不同寡核苷酸分析DNA拷貝數(shù)譜型的潛力。在一些實(shí)施方案中，用于陣列的基底是表面衍生化的玻璃或硅石，或聚合物膜表面(參見，例如，Z.Guo，等人，Nucleic Acids Res, 22,5456-65(1994) ；U. Maskos，Ε. Μ. Southern，Nucleic Acids Res,20，1679-84 (1992)，和 Ε. Μ. Southern，等人，Nucleic Acids Res，22，1368-73 (1994)，均通過引用并入本文)。陣列基底表面的改性可以通過多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，含硅或金屬氧化物表面可以用雙官能硅烷衍生化，即具有能夠與表面共價結(jié)合的第一官能團(tuán)(例如，Si-鹵素或Si-烷氧基，如分別在一SiCl3或一Si (OCH3)3中)和能夠使表面具有希望的化學(xué)和/或物理修飾的第二官能團(tuán)的硅烷，以共價或非共價連接配體和/或聚合物或單體用于生物探針陣列。甲硅烷基化衍生和本領(lǐng)域已知的其它表面衍生(參見例如Sundberg的美國專利5，624，711,Willis 的美國專利5，266，222，和Farnsworth的美國專利5，137，765，均通過引用并入本文)。其它制備陣列的方法在轉(zhuǎn)讓給Agilent Corp.的Bass等人的美國專利6，649，348中描述，其中公開了通過原位合成方法產(chǎn)生的DNA陣列。聚合物陣列合成也在包括以下的文獻(xiàn)中廣泛描述W0 00/58516，美國專
利 5，143，854，5，242，974，5，252，743，5，324，633，5，384，261,5，405，783，5:,424,186，5，451，683, 5，482，867, 5，491，074,5，527，681,5，550，215,5,571，639,5，578，832，5，593，839,5，599，695,5，624，711,5,631，734, 5，795，716，5，831，070，5，837，832，5，856，101，5，858，659，5，936，324,5，968，740,5，974，164，5，981，185，5，981，956，
6，025，601,6, 033，860,6, 040，193,6, 090，555,6, 136，269,6, 269，846 和 6，428，752， 5，412，087，6，147，205，6，262，216，6，310，189，5，889，165，和 5，959，098，PCT 申請 Nos. PCT/US99/00730 (國際公布 No. WO 99/36760)和 PCT/US01/04285 (國際公布 No. WO 01/58593)，均為了所有目的通過引用全部并入本文。 可用于本發(fā)明的核酸陣列包括但不限于可從Affymetrix (Santa Clara, Calif.) 以商品名GeneChip 購買到的陣列。陣列實(shí)例在affymetrix. com網(wǎng)站顯示。另一個微陣列供應(yīng)商是Illumina，Inc.，San Diego, Calif.，其陣列實(shí)例在其網(wǎng)站illumina. com上顯不。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供樣品制備。根據(jù)微陣列和將要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)， 樣品核酸可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法以大量方式制備。在本發(fā)明的某些方面，在基因分型(拷貝數(shù)譜分析)之前或同時，可以通過任何數(shù)目的機(jī)制擴(kuò)增樣品。最常用的擴(kuò)增方法包括 PCR。參見，例如，PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification(Ed. H. A. Erlich,Freeman Press,NY,N. Y. ,1992) ；PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis,等人，Academic Press, San Diego, Calif., 1990) ；Mattila 等人，Nucleic Acids Res. 19,4967(1991) ；Eckert 等人，PCR Methods and Applications 1,17(1991) ；PCR (Eds. McPherson 等人，IRL Press, Oxford)；和美國專利 4，683，202，4，683，195，4，800，1594，965，188 和 5，333，675，均為了所有目的全文并入本文作為參考。在一些實(shí)施方案中，可以在陣列上擴(kuò)增樣品(例如，美國專利6，300，070，通過引用并入本文)。其它合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(例如，Wu和Wallace， Genomics 4，560 (1989)，Landegren 等人，Science 241,1077(1988)和 Barringer 等人 Gene 89 117 (1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh 等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 86,1173(1989) 和 W088/10315)、自我持續(xù)序列復(fù)制(Guatelli 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874(1990)和W090/06995)、靶多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增(美國專利6，410，276)、共有序列引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)(美國專利4，437，975)、任意引發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng) (AP-PCR)(美國專利5，413，909，5，861，245)和基于核酸的序列擴(kuò)增(NABSA)。(參見，美國專利5，409，818，5，554，517，和6，063，603，均通過引用并入本文)。其它可以使用的擴(kuò)增方法在美國專利 5，242，794,5, 494，810,4, 988，617 和 U. S. Ser. No. 09/854，317 中描述，均通過引用并入本文。其它樣品制備方法和減少核酸樣品復(fù)雜性的技術(shù)在Dong等人，Genome Research 11，1418 (2001)、美國專利 6，361，947,6, 391，592 和 U. S. Ser. Nos. 09/916，135， 09/920, 491 (美國專利申請公布2003009623 ,09/910,四2 (美國專利申請公布 20030082543)和 10/013，598 中描述。進(jìn)行多核苷酸雜交試驗(yàn)的方法在本領(lǐng)域中已經(jīng)開發(fā)。本發(fā)明的方法中使用的雜交試驗(yàn)程序和條件將根據(jù)應(yīng)用而不同，并且按照已知的普通結(jié)合方法進(jìn)行選擇，包括以下提至丨J 的:Maniatis 等人 Molecular Cloning :A Laboratory Manual(2. sup.nd Ed. Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) ；Berger 禾口 Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. ,1987)； ^ung和Davism，P. N. A. S,80 :1194(1983)。用于進(jìn)行重復(fù)和受控雜交反應(yīng)的方法和裝置已經(jīng)在美國專利 5，871，928,5, 874，219,6, 045，996 和 6，386，749,6, 391，623 中描述，均通過引用并入本文。本發(fā)明的方法也可以包括雜交之后(和/或期間)配體之間雜交的信號檢測。 參見美國專利 5，143，854，5，578，832 ；5，631，734 ；5，834，758 ；5，936，324 ；5，981，956 ； 6，025，601 ；6，141，096 ；6，185，030 ；6，201，639 ；6，218，803 ；和 6，225，625，U. S. Ser. No. 10/389，194和PCT申請PCT/US99/06097 (公布為W099/47964)，均為了所有目的全文并
入本文作為參考。
用于信號檢測和強(qiáng)度數(shù)據(jù)加工的方法和裝置例如在美國專利5，143，854， 5，547，839,5，578，832,5，631，734,5，800，992,5，834，758 ；5，856，092,5，902，723, 5，936，324,5，981，956,6，025，601,6，090，555,6，141，096,6，185，030,6，201，639 ； 6，218，803 ；和 6，225，625，in U. S. Ser. Nos. 10/389，194,60/493, 495 和 PCT 申請 PCT/ US99/06097(公布為W099/47964)中公開，均為了所有目的全文并入本文作為參考。序列分析本發(fā)明的分子譜分析包括通過確定個體在一種或多種基因或基因產(chǎn)物中是否具有一個或多個核苷酸變體(或氨基酸變體)而對一種或多種生物標(biāo)志物進(jìn)行基因分型的方法。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法對一種或多種基因基因分型可以為選擇治療提供更多證據(jù)。本發(fā)明的生物標(biāo)志物可以通過通過任何可用于確定核酸或其編碼的蛋白質(zhì)中的變化的方法分析。根據(jù)一個實(shí)施方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠分析一種或多種基因的突變，包括缺失突變、插入突變、移碼突變、無義突變、錯義突變和剪接突變。用于分析一種或多種基因的核酸可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法從樣品中的細(xì)胞分離 (Sambrook等人，1989)。例如，核酸可以是基因組DNA或分級分離的或全細(xì)胞RNA，或從外來體或細(xì)胞表面獲得的miRNA。使用RNA時，可以希望將RNA轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA。在一個實(shí)施方案中，RNA是全細(xì)胞RNA;在另一個實(shí)施方案中，是聚-A RNA ；在另一個實(shí)施方案中，是外來體RNA。通常，擴(kuò)增核酸。根據(jù)分析一個或多個基因的試驗(yàn)的形式，具體的目標(biāo)核酸直接使用擴(kuò)增在樣品中檢測，或者在擴(kuò)增后使用第二已知的核酸。然后，檢測確定的產(chǎn)物。在某些應(yīng)用中，檢測可以通過可視手段進(jìn)行(例如，凝膠的溴化乙錠染色)。此外，檢測可涉及產(chǎn)物的間接鑒定，通過化學(xué)發(fā)光、放射標(biāo)記或熒光標(biāo)記的放射閃爍顯像，或者甚至通過采用電或熱脈沖信號的系統(tǒng)(Affymax Technology ；Bellus，1994)。已知本發(fā)明的生物標(biāo)志物存在各種類型的缺陷。變異包括但不限于缺失、插入、點(diǎn)突變和復(fù)制。點(diǎn)突變可以是沉默的，或者可以導(dǎo)致終止密碼子、移碼突變或氨基酸置換。一個或多個基因的編碼區(qū)之內(nèi)和之外的突變可以發(fā)生，并且可以根據(jù)本發(fā)明的方法分析。目標(biāo)核酸的靶位點(diǎn)可以包括其中序列變化的區(qū)域。例子包括但不限于以多種形式存在的多態(tài)性，如單核苷酸變異、核苷酸重復(fù)、多堿基缺失(共有序列缺失超過一個核苷酸)、多堿基插入(從共有序列插入超過一個核苷酸)、微衛(wèi)星重復(fù)(少量核苷酸重復(fù)，具有典型的5-1000 個重復(fù)單元)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、序列重排(包括易位和復(fù)制)、嵌合序列(來自不同基因來源的兩個序列融合在一起)，等等。在序列多態(tài)性中，人基因組中最頻繁的多態(tài)性是單堿基變異，也稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。SNP富含、穩(wěn)定并廣泛分布在基因組中。分子譜分析包括對一個或多個基因進(jìn)行單體型分析的方法。單體型是位于一個染色體上的一組遺傳決定簇，它一般在染色體區(qū)域中含有特定組合的等位基因(基因的所有備選序列)。換句話說，單體型是個體染色體上的位相序列信息。通常，染色體上的位相 SNP定義了單體型。染色體上的單體型組合可以確定細(xì)胞的遺傳譜。單體型確定特定遺傳標(biāo)志物和疾病突變之間的連鎖。單體型分析可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行。常用的SNP評分方法包括雜交微陣列或直接凝膠測序，在Landgren等人，Genome Research, 8 769-776,1998中概述。例如，可以只從個體中分離一個或多個基因的一個拷貝，并確定每個變異位點(diǎn)處的核苷酸?；蛘?，可以利用等位基因特異性PCR或類似的方法擴(kuò)增個體中的一個或多個基因的僅一個拷貝，并且確定本發(fā)明的變異位點(diǎn)處的SNP。本領(lǐng)域已知的Clark 方法也可以用于單體型分析。高通量分子單體型分析方法也在Tost等人，Nucleic Acids Res. ,30(19) :e96(2002)中公開，其通過引用并入本文。因此，與本發(fā)明的變體和/或單體型連鎖不平衡的其它變體可以通過本領(lǐng)域已知的單體型分析方法確定，這是遺傳學(xué)和單體型分析領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚的。與本發(fā)明的變體和/或單體型連鎖不平衡的其它變體也可用于如下所述的各種應(yīng)用中。為了基因分型和單體型分析，基因組DNA和mRNA/cDNA都可使用，在本文中通稱為 “基因”。大量檢測核苷酸變體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且均可用于本發(fā)明的方法。該技術(shù)可以是基于蛋白質(zhì)的或基于核酸的。在任一種情況中，使用的技術(shù)必須足夠靈敏，以精確地檢測小核苷酸或氨基酸變異。通常，使用以可檢測標(biāo)記物標(biāo)記的探針。除非在以下所述的特定技術(shù)中另外說明，可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的標(biāo)記物，包括但不限于放射性同位素、熒光化合物、可使用鏈霉親和素檢測的生物素、酶(例如，堿性磷酸酶)、酶底物、配體和抗體等。參見 Jablonski 等人，Nucleic Acids Res.，14 :6115-6128(1986) ；Nguyen 等人，Biotechniques，13 :116-123(1992) ；Rigby 等人，J. Mol. Biol.，113 :237-251 (1977)。在基于核酸的檢測方法中，目標(biāo)DNA樣品，即含有對應(yīng)于一個或多個基因的基因組DNA、cDNA、mRNA和/或miRNA的樣品，必須從待測個體中獲得?？梢允褂煤袑?yīng)于一個或多個基因的基因組DNA、miRNA、mRNA和/或cDNA (或其部分)的任何組織或細(xì)胞樣品。 為此目的，可以從個體獲得含有細(xì)胞核因此含有基因組DNA的組織樣品。血樣也是有用的， 除了僅白細(xì)胞和其它淋巴細(xì)胞具有細(xì)胞核，而紅細(xì)胞不含細(xì)胞核，只含有mRNA或miRNA。然而，miRNA和mRNA也是有用的，可以分析其序列中是否存在核苷酸變體，或用作cDNA合成的模板。組織或細(xì)胞樣品可以不經(jīng)進(jìn)一步加工直接分析。或者，包括靶序列的核酸在進(jìn)行下述各種檢測方法之前可以提取、純化和/或擴(kuò)增的。除了組織或細(xì)胞樣品，cDNA或來自 cDNA的基因組DNA或使用從待測個體獲得的組織或細(xì)胞構(gòu)建的基因組DNA文庫也是有用的。序列分析為了確定特定核苷酸變體的存在或不存在，靶基因組DNA或cDNA的測序，特別是包含待測核苷酸變體基因座的區(qū)域。各種測序技術(shù)通常是本領(lǐng)域中公知的和廣泛，包括 Sanger法和Gilbert化學(xué)法。焦磷酸測序法使用發(fā)光計量檢測系統(tǒng)實(shí)時監(jiān)測DNA合成。已經(jīng)證明焦磷酸測序可有效分析遺傳多態(tài)性，如單核苷酸多態(tài)性，并且也可以用于本發(fā)明中。 參見 Nordstrom等人，Biotechnol. Appl. Biochem. ,31 (2) :107-112(2000) ；Ahmadian 等人， Anal. Biochem.，280 103—11(^2000)。核酸變體可以通過合適的檢測方法檢測。檢測、定量等方法的非限制性實(shí)例包括 質(zhì)量改變的擴(kuò)增子的質(zhì)量檢測(例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)質(zhì)譜法和電噴射 (ES)質(zhì)譜法)、引物延伸法(例如，iPLEX ；Sequenom, Inc.)、微量測序法(例如，引物延伸法的變型)、連接酶測序確定法(例如，美國專利5，679，5 和5，952，174和WO 01/27326)、 錯配序列確定法(例如，美國專利5，851，770 ；5, 958，692 ；6, 110，684 ；和6，183，958)、直接DNA測序、限制片段長度多態(tài)性(RFLP分析)、等位基因特異性寡核苷酸(ASO)分析、甲基化特異性PCR(MSPCR)、焦磷酸測序分析、acycloprime分析、反向斑點(diǎn)印跡法、GeneChip微陣列、動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)、肽核酸(PNA)和鎖定核酸(LNA)探針、TaqMan, 分子信標(biāo)、嵌入染料、FRET引物、Alphakreen、SNPstream、遺傳位分析(GBA)、多重微測序、 SNaPshot,GOOD分析、微陣列miniseq、陣列引物延伸(APEX)、微陣列引物延伸(例如，微陣列序列確定方法)、標(biāo)簽陣列、編碼微球體、模板指導(dǎo)的摻入(TDI)、熒光偏振、比色寡核苷酸連接試驗(yàn)(OLA)、序列編碼0LA、微陣列連接、連接酶鏈反應(yīng)、加鎖探針、侵入試驗(yàn)、雜交方法(例如，使用至少一種探針的雜交，使用至少一種熒光標(biāo)記的探針的雜交，等等)、常規(guī)斑點(diǎn)印跡分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP，例如，美國專利5，891，625和6，013，499 ；Orita 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 86 :27776-2770 (1989))、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、 異常源雙鏈體分析、錯配切割檢測，和Sheffield等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 49 699-706 (1991)，White 等人，Genomics 12 :301-306 (1992)，Grompe 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :5855-5892(1989)，和 Grompe，Nature Genetics 5:111—117(1993)所述的技術(shù)，克隆和測序，電泳，使用雜交探針和定量實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)OiRT-PCR)，數(shù)字PCR，納米孔測序，芯片，以及它們的組合。等位基因或橫向同源物的檢測和定量可以使用2007年12 月4日申請的美國專利申請kr. No. 11/950，395所述的“閉管”法進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，核酸物質(zhì)的量通過質(zhì)譜法、引物延伸、測序(例如，任何合適的方法，例如納米孔或焦磷酸測序)、定量PCIUQ-PCR或QRT-PCR)、數(shù)字PCR、它們的組合等等來確定。本文使用的術(shù)語“序列分析”是指確定核苷酸序列，例如，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列。 可以確定多核苷酸例如DNA或mRNA的完整序列或部分序列，確定的核苷酸序列可以被稱為 “讀數(shù)”或“序列讀數(shù)”。例如，在一些實(shí)施方案中，線性擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接分析而無需進(jìn)一步擴(kuò)增(例如，通過使用單分子測序方法)。在某些實(shí)施方案中，線性擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)一步擴(kuò)增，然后分析(例如，使用通過連接或焦磷酸測序方法測序)。讀數(shù)可以進(jìn)行不同類型的序列分析。任何合適的測序方法可以用來檢測和確定核苷酸物質(zhì)、擴(kuò)增的核酸物質(zhì)或由上述產(chǎn)生的可檢測產(chǎn)物的量。某些測序方法的例子在下面描述。序列分析裝置或序列分析部件包括裝置，和與該裝置結(jié)合使用的一個或多個部件，它們可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用來確定此處所述方法產(chǎn)生的核苷酸序列(例如，線性和/或指數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物)。測序平臺的例子包括但不限于妨4平臺(Roche) (Margulies, Μ.等人 2005 Nature 437，376-380)、Illumina 基因組分析儀(或 Solexa platform)或 SOLID 系統(tǒng)(Applied Biosystems)或 Helicos True 單分子 DNA 測序技術(shù)(Harris TD 等 A 2008Science, 320,106-109), Pacific Biosciences 的單分子實(shí)時(SMRT )技術(shù)，和納米孔測序(Soni G V和Meller A. 2007 Clin Chem 53:1996—2001)。這些平臺允許以平行方式以高級多路技術(shù)對從標(biāo)本分離的許多核酸分子進(jìn)行測序(Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003;1:397-416)。這些平臺中的每一個允許對核酸片段的克隆擴(kuò)增的或非擴(kuò)增的單分子進(jìn)行測序。某些平臺涉及，例如，通過染料修飾的探針的連接(包括周期連接和切割)進(jìn)行測序、焦磷酸測序和單分子測序。核苷酸序列物質(zhì)、擴(kuò)增核酸物質(zhì)和由其產(chǎn)生的可檢測產(chǎn)物可以通過這些序列分析平臺進(jìn)行分析。通過連接的測序是依賴于DNA連接酶對堿基配對錯配的靈敏度的核酸測序方法。 DNA連接酶將正確堿基配對的DNA的末端連接在一起。DNA連接酶只將正確堿基配對的DNA 末端連接在一起的能力與熒光標(biāo)記的寡核苷酸或引物的混合池結(jié)合起來，能夠通過熒光檢測進(jìn)行序列測定。通過包括包含可切割連接的引物可以獲得更長的序列讀數(shù)，該可切割連接可以在標(biāo)志物鑒定后切割。連接體處的切割切除標(biāo)志物，并且在連接的引物的末端再生 5'磷酸，準(zhǔn)備引物用于另一輪連接。在一些實(shí)施方案中，引物可以用一種以上的熒光標(biāo)志物(例如，至少1、2、3、4或5種熒光標(biāo)記物)標(biāo)記。通過連接的測序一般包括以下步驟?？寺≈槿后w可以在乳液微反應(yīng)器中制備，其中含有靶核酸模板序列、擴(kuò)增反應(yīng)成分、珠和引物。擴(kuò)增后，使模板變性，進(jìn)行珠富集，以使具有延伸模板的珠與不希望的珠(例如，不含延伸的模板的珠)分離。選擇的珠上的模板經(jīng)歷3'修飾，以允許與載玻片共價鍵合，修飾的珠可以沉積到載玻片上。沉積室提供在珠加載過程中將載玻片分隔為一個、四個或八個區(qū)室的能力。為了序列分析，引物與銜接子序列雜交。一組四色染料標(biāo)記的探針競爭與測序引物的連接。探針連接的特異性通過在連接系列過程中每第4個和第5個堿基進(jìn)行查詢來實(shí)現(xiàn)。5至7輪連接、檢測和切割在每5個位置記錄顏色，輪數(shù)取決于使用的文庫的類型。每輪連接后，在5'方向補(bǔ)償一個堿基的新的互補(bǔ)引物用于另一系列連接。引物重設(shè)和連接輪(每輪5-7個連接循環(huán))連續(xù)重復(fù)5次， 以對于單個標(biāo)簽產(chǎn)生25-35個堿基對的序列。對于配對測序，對第二標(biāo)簽重復(fù)該過程。焦磷酸測序是基于合成測序的核酸測序方法，它依賴于核苷酸摻入時釋放的焦磷酸的檢測。通常，合成測序包括一次一個核苷酸地合成與正試圖測序的鏈互補(bǔ)的DNA鏈。靶核酸可以固定在固體支持體上，與測序雜交雜交，與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶、 腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷5'磷酸硫酸和螢光素孵育。連續(xù)添加和除去核苷酸溶液。核苷酸的正確摻入釋放焦磷酸鹽，焦磷酸鹽與ATP硫酸化酶相互作用，在腺苷5'磷酸硫酸的存在下產(chǎn)生ATP，供給螢光素反應(yīng)，產(chǎn)生允許確定序列的化學(xué)發(fā)光信號。產(chǎn)生的光的量與添加的堿基數(shù)成比例。因此，可以確定測序引物下游的序列。一個示例性的焦磷酸測序系統(tǒng)包括以下步驟將銜接子核酸連接到所研究的核酸，將得到的核酸與珠雜交；擴(kuò)增乳液中的核苷酸序列；使用皮升多孔固體支持體分選珠；和通過焦磷酸測序法對擴(kuò)增的核苷酸序列進(jìn)行測序(例如，Nakano 等人，“單分子 PCR using water-in-oil emulsion ； “ Journal of Biotechnology 102 :117-124(2003)) 某些單分子測序?qū)嵤┓桨富诤铣蓽y序原理，并且利用單分子對熒光共振通量轉(zhuǎn)移(單分子對FRET)作為由于成功核苷酸摻入而發(fā)射光子的機(jī)制。發(fā)射的光子通常使用強(qiáng)化的或高靈敏度冷卻的電荷耦合裝置結(jié)合全內(nèi)反射顯微鏡檢查(TIRM)來檢測。光子只在引入的反應(yīng)溶液含有將摻入由測序過程合成的正在延長的核酸鏈內(nèi)的正確核苷酸時才發(fā)射。在基于FRET的單分子測序中，通過長程偶極相互作用，能量在兩個熒光染料(有時為聚甲炔花青染料Cy3和C0)之間轉(zhuǎn)移。供體在其特定激發(fā)波長激發(fā)，激發(fā)態(tài)能量非輻射地轉(zhuǎn)移到接受染料，接受染料隨后變?yōu)榧ぐl(fā)。接受染料最后通過光子的輻射發(fā)射返回基態(tài)。能量轉(zhuǎn)移過程中使用的兩種染料代表單分子對FRET中的“單分子對”。Cy3通常用作供體熒光團(tuán)，并且通常作為第一標(biāo)記核苷酸摻入。Cy5通常用作接受熒光團(tuán)，并且作為核苷酸標(biāo)記用于摻入第一 Cy3標(biāo)記核苷酸后的連續(xù)核苷酸添加。為了成功發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，熒光團(tuán)通常在彼此10納米內(nèi)。可以基于單分子測序使用的系統(tǒng)的一個例子通常包括使引物與靶核酸序列雜交以產(chǎn)生復(fù)合物；使復(fù)合物與固相締合；反復(fù)使引物延伸用熒光分子標(biāo)記的核苷酸；和在每個反復(fù)后捕獲熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號圖像(例如，美國專利7，169，314 ；Braslavsky等人， PNAS 100(7) :3960-3964 000 )。這種系統(tǒng)可以用來直接對通過此處所述的方法產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物(線性或指數(shù)擴(kuò)增的產(chǎn)物)進(jìn)行測序。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物可以與含有與固體支持體(例如珠或載玻片)上存在的固定捕獲序列互補(bǔ)的序列的引物雜交。引物-擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物與固定捕獲序列的雜交將擴(kuò)增產(chǎn)物固定在用于基于單分子對FRET的合成測序的固體支持體上。引物通常是熒光引物，因此可以產(chǎn)生具有固定核酸的載玻片表面的初始參考圖像。初始參考圖像可用于確定發(fā)生真正核苷酸摻入的位置。在開始時在“僅有引物”參考圖像中沒有識別到的陣列位置檢測到的熒光信號作為非特異性熒光排除。固定引物-擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物后，結(jié)合的核酸通常通過以下重復(fù)步驟平行測序a)在一種熒光標(biāo)記的核苷酸的存在下聚合酶延伸，b)使用合適的顯微鏡檢查例如TIRM檢測熒光，c)除去熒光核苷酸，和d)返回步驟a，使用不同熒光標(biāo)記的核苷酸。在一些實(shí)施方案中，核苷酸測序可以通過固相單核苷酸測序法和過程。固相單核苷酸測序法包括在單分子樣品核酸與單分子固體支持體雜交的條件下接觸靶核酸和固體支持體。這樣的條件可以包括在“微反應(yīng)器”中提供固體支持體分子和單分子靶核酸。這樣的條件也可以包括提供混合物，在該混合物中靶核酸分子可以與固體支持體上的固相核酸雜交。在此處所述的實(shí)施方案中有用的單核苷酸測序法在2008年1月17日提交的美國臨時專利申請No. 61/021,871中描述。在某些實(shí)施方案中，納米孔測序檢測方法包括(a)在檢測劑與基礎(chǔ)核酸的基本互補(bǔ)亞序列特異性雜交的條件下，將用于測序的靶核酸(“基礎(chǔ)核酸”，例如，連接的探針分子)與序列特異性檢測劑接觸；(b)檢測來自檢測劑的信號；和(c)根據(jù)檢測到的信號確定基礎(chǔ)核酸的序列。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)檢測劑在基礎(chǔ)核酸通過孔時干擾納米孔結(jié)構(gòu)時，與基礎(chǔ)核酸雜交的檢測劑與基礎(chǔ)核酸分離(例如，連續(xù)分離)，并檢測從基礎(chǔ)序列分離的檢測劑。在一些實(shí)施方案中，從基礎(chǔ)核酸分離的檢測劑發(fā)出可檢測的信號，與基礎(chǔ)核酸雜交的檢測劑發(fā)出不同的可檢測信號或沒有可檢測信號。在某些實(shí)施方案中，核酸(例如，連接的探針分子)中的核苷酸被對應(yīng)于特定核苷酸("核苷酸代表")的特定核苷酸序列取代，從而產(chǎn)生擴(kuò)展的核酸(例如，美國專利6，723，513)，并且檢測劑與用作基礎(chǔ)核酸的擴(kuò)展的核酸中的核苷酸代表雜交。在這些實(shí)施方案中，核苷酸代表可以排列為二元或更高級排列(例如，Soni 和 Meller，Clinical Chemistry 53(11) :1996-2001 (2007))。在一些實(shí)施方案中， 核酸不擴(kuò)展，不產(chǎn)生擴(kuò)展的核酸，并且直接用作基礎(chǔ)核酸(例如，連接的探針分子用作非擴(kuò)展的基礎(chǔ)核酸)，并且檢測劑直接接觸基礎(chǔ)核酸。例如，第一檢測劑可以與第一亞序列雜交， 第二檢測劑可以與第二亞序列雜交，其中第一檢測劑和第二檢測劑各自具有能夠?qū)⑵浔舜藚^(qū)別的可檢測標(biāo)記；并且其中當(dāng)檢測劑與基礎(chǔ)核酸解離時，來自第一檢測劑和第二檢測劑的信號可以彼此區(qū)分。在某些實(shí)施方案中，檢測劑包括與基礎(chǔ)核酸雜交的區(qū)域(例如，兩個區(qū)域)，它們的長度可以是大約3個至大約100個核苷酸(例如大約4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90 或 95 個核苷酸的長度)。檢測劑也可以包括不與基礎(chǔ)核酸雜交的核苷酸的一個或多個區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，檢測劑是分子信標(biāo)。檢測劑通常包含一個或多個獨(dú)立地選自本文所述的可檢測標(biāo)記。每個可檢測標(biāo)記可以用任何方便的能夠檢測每種標(biāo)記產(chǎn)生的信號(例如，磁、電、化學(xué)、光學(xué)等)的檢測方法檢測。例如，CD照相機(jī)可以用來檢測來自一個或多個與檢測劑連接的可區(qū)別的量子點(diǎn)的信號。在某些序列分析實(shí)施方案中，讀數(shù)可以用來構(gòu)建較大的核苷酸序列，通過確定不同讀數(shù)中的重疊序列以及通過使用讀數(shù)中的鑒別序列有利于這種構(gòu)建。這樣的用于從讀數(shù)構(gòu)建較大序列的序列分析方法和軟件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的(例如，Venter等人， Science 291 :1304-1351(2001)).特定的讀數(shù)、部分核苷酸序列構(gòu)建體和完整核苷酸序列構(gòu)建體可以在樣品核酸內(nèi)的核苷酸序列之間比較(即內(nèi)部比較)，或者在某些序列分析實(shí)施方案中可以與參照序列比較(即參照比較)。在從多種樣品或從含有序列變異的一個樣品來源制備樣品核酸的情況下可以進(jìn)行內(nèi)部比較。當(dāng)參照核苷酸序列已知并且目的在于確定樣品核酸是否含有與參照核苷酸序列基本類似或相同或不同的核苷酸序列時，有時進(jìn)行參照比較。利用上述的序列分析裝置和部件可促進(jìn)序列分析。弓丨物延伸多態(tài)性檢測方法在本文中也被稱為“微測序”法，一般通過將互補(bǔ)寡核苷酸與攜帶多態(tài)性位點(diǎn)的核酸雜交而進(jìn)行。在這些方法中，寡核苷酸一般鄰近多態(tài)性位點(diǎn)雜交。在“微測序”法中使用的術(shù)語“鄰近”是指當(dāng)延伸寡核苷酸與該核酸雜交時，延伸寡核苷酸的3'末端有時與核酸中多態(tài)性位點(diǎn)的5'末端相距1個核苷酸，與多態(tài)性位點(diǎn)的5' 末端相距通常2或3個，有時4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。延伸寡核苷酸于是擴(kuò)展一個或多個核苷酸，通常1、2或3個核苷酸，添加到延伸寡核苷酸的核苷酸的數(shù)目和/或類型確定了存在哪種或哪些多態(tài)性變異。寡核苷酸延伸方法例如公開在美國專利4，656，127 ； 4，851，331 ；5，679，524 ；5，834，189 ；5，876，934 ；5，908，755 ；5，912，118 ；5，976，802 ； 5，981，186 ；6，004，744 ；6，013，431 ；6，017，702 ；6，046，005 ；6，087，095 ；6，210，891 ；和 WO 01Λ0039中。延伸產(chǎn)物可以通過多種方式檢測，如通過熒光法(參見，例如，Chen & Kwok, Nucleic Acids Research 25:347—353(1997)禾口 Chen 等人，Proc. Natl. AcacL Sci. USA 94/20 :10756-10761(1997))或通過質(zhì)譜法(例如，MALDI-T0F質(zhì)譜法)和本文所述的其它方法。利用質(zhì)譜法的寡核苷酸延伸方法例如在美國專利5，547，835 ；5，605，798 ； 5，691，141 ；5，849，542 ；5，869，242 ；5，928，906 ；6，043，031 ；6，194，144 ；和 6，258，538 中描述。微測序檢測方法通常在延伸步驟前加入了擴(kuò)增過程。擴(kuò)增過程一般從核酸樣品擴(kuò)增含有多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域。擴(kuò)增可以利用上述方法進(jìn)行，或者例如在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中使用一對寡核苷酸引物進(jìn)行，其中一個寡核苷酸引物一般互補(bǔ)于位于多態(tài)性3'的區(qū)域，另一個一般互補(bǔ)于位于多態(tài)性5'的區(qū)域。PCR引物對可以用于例如美國專利4，683，195; 4，683，202，4，965，188 ；5，656，493 ；5，998，143 ；6，140，054 ；WO 01/27327 ；和 WO 01/27329 公開的方法中。P C R引物對也可以用于任何商購的進(jìn)行P C R的機(jī)器，例如可從Ap ρ 1 i e d Biosystems獲得的任一種GeneAmp 系統(tǒng)。其它合適的測序方法包括多路聚合酶克隆測序(如aumdure等人，Accurate Multiplex Polony Sequencing of an Evolved Bacterial Genome， Sciencexpress， Aug. 4，2005，pg 1 所述，可見 www. sciencexpress. org/4 Aug. 2005/Pagel/10. 1126/ science. 1117389，通過引用并入本文)，它使用固定的微珠，并且在微制造的皮升反應(yīng)器中測序(如 Margulies 等人，Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors, Nature, August 2005 所述，可見 www. nature, com/nature (在線發(fā)表于2005年7月31日，doi :10. 1038/nature03959，通過引用并入本文)。在一些實(shí)施方案中，全基因組測序也可以用于區(qū)別RNA轉(zhuǎn)錄物的等位基因。全基因組測序方法的例子包括但不限于基于納米孔的測序方法、合成測序和連接測序，如上所述。
原位雜交原位雜交試驗(yàn)是眾所周知的，概括性地描述于Angerer等人，Methods Enzymo 1. 152 :649-660 (1987)。在原位雜交試驗(yàn)中，細(xì)胞，例如來自活檢的細(xì)胞，固定在固體支持物上，一般固定在載玻片上。如果探查DNA，則細(xì)胞用熱或堿變性。細(xì)胞然后在適中的溫度下與雜交溶液接觸，以允許標(biāo)記的特異性探針退火。探針優(yōu)選地用放射性同位素和熒光報道分子標(biāo)記。FISH(熒光原位雜交)使用只結(jié)合顯示高度序列相似性的序列部分的熒光探針。FISH是一種細(xì)胞生成技術(shù)，用來檢測和定位細(xì)胞中的特異性多核苷酸序列。例如， FISH可以用來檢測染色體上的DNA序列。FISH也可以用來檢測和定位組織樣品內(nèi)的特異性RNA，例如，mRNA。FISH使用結(jié)合顯示高度序列相似性的特異性核苷酸序列的熒光探針。 熒光顯微鏡檢查可以用來發(fā)現(xiàn)熒光探針是否結(jié)合以及在何處結(jié)合。除了檢測特異性核苷酸序列例如易位、融合、斷裂、重復(fù)和其它染色體異常外，F(xiàn)ISH可以幫助定義細(xì)胞和組織內(nèi)的特異性基因拷貝數(shù)和/或基因表達(dá)的空間-時間模式。比較基因組雜交(CGH)使用原位雜交動力學(xué)來比較來自樣品的不同DNA或RNA序列的拷貝數(shù)，或?qū)⒁粋€樣品中的不同DNA或RNA的拷貝數(shù)與另一樣品中基本相同的序列的拷貝數(shù)進(jìn)行比較。在CGH的許多有用的應(yīng)用中，從受試細(xì)胞或細(xì)胞群中分離DNA或RNA。比較可以是定性的或定量的。描述了允許確定細(xì)胞或細(xì)胞群整個基因組中的DNA序列絕對拷貝數(shù)的方法，如果對于一個或幾個序列的絕對拷貝數(shù)已知或者是確定的。不同序列彼此的區(qū)別在于當(dāng)與參照基因組雜交時它們的結(jié)合位點(diǎn)的不同位置，通常是中期染色體，但是在有時情況下是間期核?？截悢?shù)信息來自于參照基因組上不同位置之間雜交信號強(qiáng)度的比較。 CGH的方法、技術(shù)和應(yīng)用是已知的，例如在美國專利6，335，167和美國申請No. 60/804, 818 中描述，其中的有關(guān)部分通過引用并入本文。其它序列分析方法核酸變體也可以用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)檢測。盡管有時在檢測步驟之前可以進(jìn)行擴(kuò)增步驟，但是在本文所述的實(shí)施方案中不需要擴(kuò)增。使用電泳技術(shù)檢測和定量核酸的方法的例子在本領(lǐng)域中可見。一個非限制性的例子包括在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中運(yùn)行樣品(例如，從母親血清分離的混合的核酸樣品，或例如擴(kuò)增核酸物質(zhì))。凝膠可以用溴化乙錠標(biāo)記 (例如，染色)(參見，Sambrook 禾口 Russell,Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3d ed.，2001)。存在與標(biāo)準(zhǔn)對照相同大小的條帶表明存在目標(biāo)核酸序列，然后可以基于條帶的強(qiáng)度將其含量與對照進(jìn)行比較，從而檢測和定量目標(biāo)序列。在一些實(shí)施方案中，能夠區(qū)別母親與父親等位基因的限制酶可以用來檢測和定量目標(biāo)核酸物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)序列特異性寡核苷酸探針用來檢測目標(biāo)序列的存在。寡核苷酸也可以用來基于探針導(dǎo)致的信號的強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)對照相比，表明靶核酸分子的量。序列特異性探針雜交可以用來檢測含有其它核酸種類的混合物或混合群體中的特定核酸。在充分嚴(yán)格的雜交條件下，探針只與基本互補(bǔ)的序列特異性雜交。雜交條件的嚴(yán)格性可以放松，以耐受不同程度的序列匹配。許多雜交形式是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于溶液相、固相或混合相雜交試驗(yàn)。下列文章提供了對各種雜交試驗(yàn)形式的概述=Singer 等人，Biotechniques 4 :230，1986 ；Haase 等人，Methods in Virology, pp. 189-226，1984 ； Wilkinson, In situ Hybridization, Wilkinson ed. , IRL Press, Oxford UniversityPress, Oxford ；禾口 Hames 禾口 Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach,IRL Press, 1987。雜交復(fù)合物可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測。能夠與靶核酸(例如，mRNA或DNA) 特異性雜交的核酸探針可以通過任何合適的方法進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的探針用來檢測雜交的核酸的存在。一種常用的檢測方法是放射自顯影，它使用用3h、125I、35S、14C、32P、33P等標(biāo)記的探針。放射性同位素的選擇取決于選擇的同位素的合成容易程度、穩(wěn)定性和半衰期導(dǎo)致的研究選擇。其它標(biāo)志物包括化合物(例如，生物素和地高辛配基)，它結(jié)合抗配體或用熒光團(tuán)、 化學(xué)發(fā)光劑或酶標(biāo)記的抗體。標(biāo)志物的選擇取決于需要的靈敏性、與探針偶聯(lián)的容易程度、 穩(wěn)定性要求和可以利用的儀器。此外，限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和AFLP方法可以用于分子譜分析。如果對應(yīng)于一個或多個基因的靶DNA中的核苷酸變體導(dǎo)致限制酶識別位點(diǎn)的消除或產(chǎn)生，則用該特定限制酶消化靶DNA將產(chǎn)生改變的限制性片段長度圖案。因此，檢測的RFLP或AFLP將表明特定核苷酸變體的存在。另外一種有用的方法是單鏈構(gòu)象多態(tài)性試驗(yàn)(SSCA)，它基于跨越目標(biāo)核苷酸變體的單鏈靶DNA的改變的遷移性。靶序列中的單核苷酸改變可導(dǎo)致不同的分子內(nèi)堿基配對模式，因此導(dǎo)致單鏈DNA的不同的二級結(jié)構(gòu)，它可以在非變性凝膠中檢測。參見Orita 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，86 :2776-2770(1989)?；谧冃阅z的技術(shù)如夾變性凝膠電泳(CDGE)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測突變序列與野生型序列相比在變性凝膠中的遷移率的不同。參見 Miller 等人，Biotechniques, 5 :1016-24(1999) ； Sheffield 等人，Am. J. Hum, Genet. ,49 :699-706(1991) ；Warte 11 等人，Nucleic Acids Res. , 18 2699-2705(1990)；和 Sheffield 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 :232-236 (1989) 另外，雙鏈構(gòu)象分析(DSCA)也可以用于本發(fā)明。參見Arguello等人，Nat. Genet.，18 192-194(1998)。個體的一個或多個基因中的特定基因座處存在或不存在核苷酸變體也可以用難以擴(kuò)增的突變系統(tǒng)(ARMQ技術(shù)進(jìn)行檢測。參見例如，歐洲專利No. 0，332，435; Newton 等人，Nucleic Acids Res. , 17 :2503-2515(1989) ；Fox 等人，Br. J. Cancer, 77 1267-1274(1998) ；Robertson 等人，Eur. Respir. J. , 12 :477-482 (1998)。在 ARMS 方法中，合成引物，除了對應(yīng)于該基因座處的核苷酸的3'-末端核苷酸是預(yù)先確定的核苷酸外，該引物匹配待測基因座直接5'上游的核苷酸序列。例如，3'-末端核苷酸可以與突變基因座處的核苷酸相同。引物可以是任何合適的長度，只要僅當(dāng)其3'-末端核苷酸匹配待測基因座處的核苷酸時，它在嚴(yán)格條件下與靶DNA雜交。優(yōu)選地，引物具有至少12個核苷酸，更優(yōu)選大約18-50個核苷酸。如果待測個體在該基因座處具有突變，并且其中的核苷酸匹配引物的3'-末端核苷酸，則引物在與靶DNA模板雜交時可以進(jìn)一步延伸，并且引物可以與另一合適的PCR引物一起啟動PCR擴(kuò)增反應(yīng)。相反，如果該基因座處的核苷酸是野生型的，則引物延伸不能實(shí)現(xiàn)。可以使用過去幾年發(fā)展的各種形式的ARMS技術(shù)。參見，例如，Gibson 等人，Clin. Chem. 43 :1336-1341 (1997)。類似于ARMS技術(shù)的有微量測序或單核苷酸引物延伸方法，它基于單核苷酸的引入。匹配待測基因座直接5'的核苷酸序列的寡核苷酸引物在標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸的存在下與靶DNA、mRNA或miRNA雜交。僅當(dāng)雙脫氧核糖核苷酸匹配待檢變異基因座處的核苷酸時，標(biāo)記的核苷酸被引入或連接到引物。因此，可以根據(jù)連接到摻入的雙脫氧核糖核苷酸的檢測標(biāo)記揭示變異基因座處的核苷酸的身份。參見Syvanen等人，Genomics, 8 684-692(1990) ；Shumaker 等人，Hum. Mutat.，7 :346-354(1996) ；Chen 等人，Genome Res.， 10 :549-547(2000)。可用于本發(fā)明的另一套技術(shù)是所謂的“寡核苷酸連接試驗(yàn)”(OLA)，其中野生型基因座和突變之間的區(qū)別基于兩個寡核苷酸在靶DNA分子上彼此相鄰地退火的能力，從而允許兩個寡核苷酸通過DNA連接酶連接在一起。參見Landergren等人，Science, 241 1077-1080(1988) ；Chen 等人，Genome Res.，8 :549-556(1998) ；Iannone 等人，Cytometry, 39 :131-14(K2000)。因此，例如，為了檢測一個或多個基因中特定基因座處的單核苷酸突變，可以合成兩個寡核苷酸，一個具有恰在基因座5'上游的序列，其3'末端核苷酸與特定基因的變異基因座的核苷酸相同，另一個具有匹配基因中該基因座直接3’下游的序列的核苷酸序列。寡核苷酸可以為了檢測目的標(biāo)記。在嚴(yán)格條件下與靶基因雜交時，兩個寡核苷酸在合適的連接酶的存在下經(jīng)歷連接。兩個寡核苷酸的連接將表明靶DNA在被檢測的基因座處具有核苷酸突變。小遺傳變異的檢測也可以通過多種基于雜交的方法實(shí)現(xiàn)。等位基因特異性寡核苷酸是最有用的。參見 Conner 等人，Proc. Natl. Acad. ki.USA，80 :278-282(1983) ；Saiki 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 :6230-6234 (1989)。特異性雜交在特定基因座處具有特定基因變異的等位基因、但是不特異性雜交其它等位基因的寡核苷酸探針(等位基因特異性)可以通過本領(lǐng)域已知的方法設(shè)計。探針可以具有例如10個到大約50個核苷酸堿基的長度。靶DNA和寡核苷酸探針可以在足夠嚴(yán)格的條件下彼此接觸，使得核苷酸變體可以根據(jù)雜交的存在或不存在與野生型基因區(qū)分開來?？梢詷?biāo)記探針以提供檢測信號。此外，等位基因特異性寡核苷酸探針可以在“等位基因特異性PCR”中用作PCR擴(kuò)增引物，預(yù)期長度的PCR產(chǎn)物的存在或不存在將指示特定核苷酸變體的存在或不存在。其它有用的基于雜交的技術(shù)允許兩個單鏈核酸一起退火，甚至在由于核苷酸取代、插入或缺失而存在錯配時。然后可以使用各種技術(shù)檢測錯配。例如，退火的雙鏈體可以進(jìn)行電泳。錯配的雙鏈體可以根據(jù)它與完全匹配的雙鏈體不同的電泳遷移率進(jìn)行檢測。 參見Cariello，Human Genetics,42 =726(1988) 此外，在RNase保護(hù)試驗(yàn)中，可以制備跨越待測的核苷酸變異位點(diǎn)并且具有檢測標(biāo)記的RNA探針。參見Giimta等人，Diagn. Mol. Path.，5 :265-270(1996) ；Finkelstein 等人，Genomics, 7 :167-172(1990) ；Kinszler 等人，Science 251:1366-1370(1991)。RNA探針可以與靶DNA或mRNA雜交，形成異源雙鏈體，該異源雙鏈體然后進(jìn)行核糖核酸酶RNase A消化。RNase A只在錯配位點(diǎn)消化異源雙鏈體中的RNA探針。該消化可以在變性電泳凝膠上根據(jù)大小變化來確定。另外，錯配也可以通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)切割方法來檢測。參見，例如，Roberts等人，Nucleic Acids Res., 25 :3377-3378(1997)。在mutS試驗(yàn)中，可以制備探針，該探針匹配將檢測存在或不存在突變的基因座周圍的基因序列，除了在變異基因座處使用預(yù)先確定的核苷酸外。在探針與靶DNA退火形成雙鏈體時，大腸桿菌mutS蛋白質(zhì)與雙鏈體接觸。由于mutS蛋白質(zhì)僅結(jié)合含有核苷酸錯配的異源雙鏈體序列，mutS蛋白質(zhì)的結(jié)合將表示存在突變。參見Modrich等人，Ann. Rev. Genet. ,25 :229-253(1991)。
本領(lǐng)域中已經(jīng)根據(jù)上述基本技術(shù)開發(fā)了多種改進(jìn)和變化，它們可以用于在本發(fā)明中檢測突變或核苷酸變體。例如，“日出探針”或“分子信標(biāo)”使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 性質(zhì)并產(chǎn)生高靈敏度。參見 Wolf 等人，Proc. Nat. Acad. Sci.USA,85 :8790-8794(1988)。 一般來說，跨越待測核苷酸基因座的探針被設(shè)計為發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，并且在一端用猝滅熒光團(tuán)標(biāo)記，在另一端用報道熒光團(tuán)標(biāo)記。在其天然狀態(tài)，來自報道熒光團(tuán)的熒光被猝滅熒光團(tuán)猝滅，因?yàn)橐粋€熒光團(tuán)與另一個靠近。在探針與靶DNA雜交時，5'末端與3'-末端離開， 因此熒光信號再生。參見 Nazarenko 等人，Nucleic Acids Res.，25 :2516-2521 (1997)； Rychlik 等人，Nucleic Acids Res.，17 :8543-8551 (1989) ；Sharkey 等人，Bio/technology 12 :506-509(1994) ；Tyagi 等人，Nat. Biotechnol.，14 :303-308(1996) ；Tyagi 等人，Nat. Biotechnol.，16 :49-53 (1998)。同源尾輔助的非二聚體系統(tǒng)(HANDS)可以與分子信標(biāo)法結(jié)合使用，以抑制引物-二聚體積累。參見Brownie等人，Nucleic Acids Res. ,25 3235-3241 (1997)。染料標(biāo)記的寡核苷酸連接試驗(yàn)是基于FRET的方法，它結(jié)合了 OLA試驗(yàn)和PCR。參見Chen等人，Genome Res. 8 :549-556 (1998)。TaqMan是另一種基于FRET的檢測核苷酸變體的方法。TaqMan探針可以是設(shè)計為具有跨越感興趣的變異基因座的基因核苷酸序列并且與不同等位基因差異雜交的寡核苷酸。探針的兩端分別用猝滅熒光團(tuán)和報道熒光團(tuán)標(biāo)記。 TaqMan探針引入PCR反應(yīng)中，該P(yáng)CR反應(yīng)用于使用Taq聚合酶擴(kuò)增含有感興趣的基因座的靶基因區(qū)。由于Taq聚合酶顯示5' -3'核酸外切酶活性而沒有3' -5'核酸外切酶活性，如果TaqMan探針與靶DNA模板退火，則在PCR反應(yīng)過程中TaqMan探針的5 ‘-末端將被Taq聚合酶降解，從而分離報道熒光團(tuán)與猝滅熒光團(tuán)，并釋放熒光信號。參見Holland等 A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :7276-7280 (1991) ；Kalinina等人，Nucleic Acids Res., 25 :1999-2004(1997) ；Whitcombe 等人，Clin. Chem. ,44 :918-923(1998)。另外，本發(fā)明的檢測也可以利用基于化學(xué)發(fā)光的技術(shù)。例如，寡核苷酸探針可以設(shè)計為與野生型或變異基因座雜交但不與兩者同時雜交。探針用高度化學(xué)發(fā)光吖啶酯標(biāo)記。 吖啶酯的水解破壞了化學(xué)發(fā)光。探針與靶DNA的雜交防止了吖啶酯的水解。因此，通過檢測化學(xué)發(fā)光的變化確定了靶DNA中特定突變的存在或不存在。參見Nelson等人，Nucleic Acids Res. ,24 :4998-5003(1996)。本發(fā)明的基因中遺傳變異的檢測也可以基于“堿基切割序列掃描”(BESS)技術(shù)。 BESS方法是一種基于PCR的突變掃描方法。產(chǎn)生BESS T-掃描和BESS G-追蹤，它們類似于雙脫氧測序的T和G梯級。通過比較正常和突變DNA的序列檢測突變。參見，例如，Hawkins 等人，Electrophoresis, 20 :1171-1176(1999)。質(zhì)譜法可以用于根據(jù)本發(fā)明的分子譜分析。參見Graber等人，Curr. Opin. Biotechnol.，9 14-18 (1998)。例如，在引物寡核苷酸堿基延伸(PROBE )方法中，靶核酸被固定在固相支持物上。引物與靶標(biāo)在待分析的基因座的緊鄰5'上游處退火。在選擇的脫氧核糖核苷酸和雙脫氧核糖核苷酸混合物的存在下進(jìn)行引物延伸。然后通過MALDI-T0F分析得到的新延伸引物的混合物。參見，例如，Monforte等人，Nat. Med.，3 :360-362(1997)。另外，微芯片或微陣列技術(shù)也適用于本發(fā)明的檢測方法?；旧希谖⑿酒?，大量不同的寡核苷酸探針被固定在諸如硅芯片或載玻片的基底或載體上的陣列中。待分析的靶核酸序列可以接觸微芯片上固定的寡核苷酸探針。參見，Lipshutz等人，Biotechniques，19 :442-447(1995) ；Chee 等人，Science, 274 :610-614(1996) ；Kozal 等人，Nat. Med. 2 753-759(1996) ；Hacia 等人，Nat. Genet. , 14 :441-447(1996) ；Saiki 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 :6230-6234 (1989) ；Gingeras 等人，Genome Res.，8 :435-448 (1998)。或者，多個待研究的靶核酸序列被固定在基底上，探針陣列接觸固定的靶序列。參見Drmanac 等人，Nat. Biotechnol.，16 :54-58 (1998)。已經(jīng)開發(fā)了大量微芯片技術(shù)，其中引入了一種或多種上述技術(shù)用于檢測突變。微芯片技術(shù)與計算機(jī)化的分析工具組合允許大規(guī)?？焖俸Y選。微芯片技術(shù)適用于本發(fā)明對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯然的。參見，例如，F(xiàn)odor 等人的美國專利 5，925，525 ；WiIgenbus 等人，J. Mol. Med. ,77 :761-786(1999)； Graber 等人，Curr. Opin. Biotechnol.，9 :14-18(1998) ；Hacia 等人，Nat. Genet. , 14 441-447(1996) ；Shoemaker 等人，Nat. Genet. , 14 :450-456(1996) ；DeRisi 等人，Nat. Genet. , 14 :457-460(1996) ；Chee 等人，Nat. Genet. , 14 :610-614(1996) ；Lockhart 等人， Nat. Genet.，14 :675-680 (1996) ；Drobyshev 等人，Gene, 188 :45-52 (1997)。由以上對合適的檢測技術(shù)的描述可以明白，根據(jù)使用的檢測技術(shù)，可能必須或者可能不必擴(kuò)增靶DNA，即基因、cDNA、mRNA、miRNA或其部分，以提高靶DNA分子的數(shù)目。例如，大多數(shù)基于PCR的技術(shù)結(jié)合了一部分靶標(biāo)的擴(kuò)增和突變的檢測。PCR擴(kuò)增是本領(lǐng)域公知的，在美國專利4，683，195和4，800，159(通過引用并入本文)中公開。對于非基于PCR 的檢測技術(shù)，必要時，擴(kuò)增可以通過例如體內(nèi)質(zhì)粒擴(kuò)增或通過從大量組織或細(xì)胞樣品純化靶 DNA 來實(shí)現(xiàn)。概括地參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989。但是，甚至對于極少的樣品，也已經(jīng)開發(fā)了許多靈敏的技術(shù)，其中可以檢測小遺傳變異如單核苷酸取代，而無需擴(kuò)增樣品中的靶DNA。例如，已經(jīng)開發(fā)了擴(kuò)增與靶DNA相反的信號的技術(shù)，例如， 通過使用能夠雜交靶DNA的分支DNA或樹狀聚合物。分支的或樹狀聚合DNA提供多個供雜交探針連接的雜交位點(diǎn)，從而擴(kuò)增檢測信號。參見Detmer等人，J. Clin. Microbiol., 34 :901-907(1996) ；Collins 等人，Nucleic Acids Res. ,25 :2979-2984(1997) ；Horn 等人，Nucleic Acids Res. ,25 :4835-4841(1997) ；Horn 等人，Nucleic Acids Res. ,25 4842-4849 (1997) ；Nilsen 等人，J. Theor. Biol.，187 :273-284 (1997)。Invader 試驗(yàn)是另一種檢測單核苷酸變異的技術(shù)，可用于本發(fā)明的分子譜分析。Invader 試驗(yàn)使用新型線性信號擴(kuò)增技術(shù)，它改進(jìn)了典型的PCR DNA測序基分析所需的長運(yùn)行時間。參見 Cooksey 等人，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44: 1296-1301 (2000)。該試驗(yàn)基于在兩個重疊寡核苷酸之間形成的獨(dú)特二級結(jié)構(gòu)的切割，該重疊寡核苷酸與感興趣的靶序列雜交形成“瓣”。每個“瓣”然后每小時產(chǎn)生上千個信號。因此，該技術(shù)的結(jié)果可以容易地讀取，并且該方法不需要指數(shù)擴(kuò)增DNA靶標(biāo)。Invader 系統(tǒng)使用兩個短DNA探針，它們與DNA靶標(biāo)雜交。雜交事件形成的結(jié)構(gòu)被特殊的切割酶識別，該酶切割一個探針，釋放短DNA “瓣”。每個釋放的“瓣”然后結(jié)合熒光標(biāo)記的探針，形成另一切割結(jié)構(gòu)。當(dāng)切割酶切割標(biāo)記的探針時，該探針發(fā)出可檢測的熒光信號。參見例如Lyamichev 等人，Nat. Biotechnol.，17 :292-296 (1999)。滾環(huán)法是避免指數(shù)擴(kuò)增的另一方法。Lizardi等人，Nature Genetics, 19 225-232(1998)(通過引用并入本文)。例如，Sniper ，該方法的一個商業(yè)實(shí)施方案，是靈敏的高通量SNP評分系統(tǒng)，設(shè)計用于特定變體的精確的熒光檢測。對于每個核苷酸變體，設(shè)計兩個等位基因特異性線性探針。除了 3'-堿基變化以互補(bǔ)于變異位點(diǎn)以外，兩個等位基因特異性探針相同。在該試驗(yàn)的第一階段，使靶DNA變性，然后與一對單一的、等位基因特異性開環(huán)寡核苷酸探針雜交。當(dāng)3 ‘-堿基完全互補(bǔ)于靶DNA時，將優(yōu)先發(fā)生探針的連接。后續(xù)的環(huán)化寡核苷酸探針的檢測是通過滾環(huán)擴(kuò)增，此時擴(kuò)增的探針產(chǎn)物通過熒光進(jìn)行檢測。參見Clark禾口Pickering，Life Science News 6，2000，Amersham Pharmacia Biotech (2000)。大量其它避免擴(kuò)增的技術(shù)包括，例如，表面增強(qiáng)的共振拉曼散射(SERRQ、熒光相關(guān)光譜法和單分子電泳。在SERRS中，生色團(tuán)-核酸偶聯(lián)物被吸附到膠體銀上，并且用生色團(tuán)共振頻率的激光照射。參見Graham等人，Anal. Chem. ,69 :4703-4707(1997)。熒光相關(guān)光譜法基于電場中波動光信號和捕獲單分子之間的空間-時間相關(guān)。參見Eigen等人， Proc. Natl. Acad. Sci.USA,91 :5740-5747 (1994)。在單分子電泳中，熒光標(biāo)記的核酸的電泳速度通過測量分子通過兩個激光束之間的預(yù)定距離所需的時間來確定。參見Castro等人， Anal. Chem. ,67 :3181-3186(1995)。另外，等位基因特異性寡核苷酸(ASO)也可用于使用組織或細(xì)胞作為樣品的原位雜交?？梢耘c野生型基因序列或攜帶突變的基因序列差異雜交的寡核苷酸探針可以用放射性同位素、熒光或其它可檢測標(biāo)記物標(biāo)記。原位雜交技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且它們?yōu)榱藱z測特定個體的一個或多個基因中核苷酸突變的存在或不存在而對本發(fā)明的改變應(yīng)當(dāng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本公開內(nèi)容而能夠明白的?；诘鞍踪|(zhì)的檢測技術(shù)也可用于分子譜分析，特別是在核苷酸變體導(dǎo)致影響蛋白質(zhì)一級、二級或三級結(jié)構(gòu)的氨基酸置換或缺失或插入或移碼時。為了檢測氨基酸變異，可以采用蛋白質(zhì)測序技術(shù)。例如，可以使用從待測個體分離的DNA片段，通過重組表達(dá)合成對應(yīng)于一個基因的蛋白質(zhì)或其片段。優(yōu)選地，使用包含待測多態(tài)性基因座的不超過100-150 個堿基對的cDNA片段。肽的氨基酸序列然后可以通過常規(guī)蛋白質(zhì)測序方法確定?；蛘?， HPLC-顯微鏡檢查串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以用于確定氨基酸序列變異。在該技術(shù)中，對蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解消化，得到的肽混合物通過反相色譜法分離。然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法，分析從中采集的數(shù)據(jù)。參見 Gatlin 等人，Anal. Chem. ,72 :757-763(2000)。其它基于蛋白質(zhì)的檢測分子譜分析技術(shù)包括基于對本發(fā)明的突變基因編碼的蛋白質(zhì)具有選擇性免疫反應(yīng)性的抗體的免疫親和試驗(yàn)。生產(chǎn)這些抗體的方法是本領(lǐng)域已知的?？贵w可以用來從溶液樣品中免疫沉淀特定蛋白質(zhì)或者免疫印跡通過例如聚丙烯酰胺凝膠分離的蛋白質(zhì)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法也可以用于檢測組織或細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)多態(tài)性。 也可以使用其它公知的基于抗體的技術(shù)，包括，例如，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶測定(IEMA)，包括使用單克隆抗體或多克隆抗體的夾心法測定。參見，例如，美國專利4，376，110和4，486，530，均通過引用并入本文。因此，可以使用上述任何檢測方法確定個體中存在或不存在一個或多個基因核苷酸變體或氨基酸變體。一般來說，一旦確定了一個或多個基因核苷酸變體或氨基酸變體的存在或不存在，可以將結(jié)果通知給醫(yī)生或遺傳顧問或患者或其它研究人員。特別是，結(jié)果可以形成為可傳送形式，該形式可以通信或傳送給其他研究者或醫(yī)生或遺傳學(xué)顧問或患者。這種形式可能變化，并且可能是有形的或無形的。關(guān)于在檢測個體中存在或不存在本發(fā)明的核苷酸突變的結(jié)果可以體現(xiàn)在描述性聲明、圖形、照片、圖表、圖像或任何其它可視形式。例如，PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖像可以用于解釋結(jié)果。顯示在個體基因中何處發(fā)生變異的圖形也可用于說明檢測結(jié)果。聲明和可視形式可以記錄在有形介質(zhì)如紙、計算機(jī)可讀介質(zhì)如軟磁盤、光盤等或無形介質(zhì)如電子郵件或互聯(lián)網(wǎng)或內(nèi)聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址形式的電子介質(zhì)上。另外，關(guān)于在檢測個體中存在或不存在核苷酸變異或氨基酸變異的結(jié)果也可以以聲音形式記錄，并且通過任何合適的介質(zhì)傳送，例如，通過模擬或數(shù)字電纜、光纖維纜等，通過電話、傳真、無線移動電話、互聯(lián)網(wǎng)電話等。因此，可以在世界上任何地方產(chǎn)生檢測結(jié)果的信息和數(shù)據(jù)，并傳送到不同的地點(diǎn)。 例如，當(dāng)在海外進(jìn)行基因分型試驗(yàn)時，可以產(chǎn)生關(guān)于檢測結(jié)果的信息和數(shù)據(jù)，并且形成如上所述的可傳送形式?？蓚魉托问降臋z測結(jié)果因此可以輸入到美國。因此，本發(fā)明也包括產(chǎn)生關(guān)于來自個體的兩個或多個疑似癌樣品的基因型的可傳送形式的信息的方法。該方法包括以下步驟(1)根據(jù)本發(fā)明的方法確定來自樣品的DNA的基因型；和(2)將該確定步驟的結(jié)果體現(xiàn)為可傳送形式?？蓚魉托问绞巧a(chǎn)方法的產(chǎn)物。數(shù)據(jù)和分析本發(fā)明的實(shí)施也可以使用常規(guī)生物學(xué)方法、軟件和系統(tǒng)。本發(fā)明的計算機(jī)軟件產(chǎn)品一般包括計算機(jī)可讀介質(zhì)，其中具有計算機(jī)可執(zhí)行的指令，用于執(zhí)行本發(fā)明方法的邏輯步驟。合適的計算機(jī)可讀介質(zhì)包括軟盤、⑶-R0M/DVD/DVD-R0M、硬盤驅(qū)動器、閃速存儲器、ROM/RAM、磁帶等。計算機(jī)可執(zhí)行的指令可以以合適的計算機(jī)語言或幾種語言的組合書寫?；居嬎闵飳W(xué)方法描述在例如Setubal和Meidanis等人， Introduction to Computational Biology Methods(PffS Publishing Company, Boston, 1997) ；Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam,1998) ；Rashidi 禾口 Buehler, Bioinformatics Basics Application in Biological Science and Medicine(CRC Press, London,2000)以及 Ouelette and Bzevanis Bioinformatics :A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc.，2. sup. nd ed.，2001)。參見美國專利 6，420，108。本發(fā)明也可以利用各種計算機(jī)程序產(chǎn)品和用于多種目的的軟件，例如探針設(shè)計、 數(shù)據(jù)管理、分析和儀器操作。參見，美國專利5，593，839,5, 795，716,5, 733，729,5, 974，164、 6，066，454,6, 090，555,6, 185，561,6, 188，783,6, 223，127,6, 229，911 和 6，308，170。另外，本發(fā)明涉及包括在網(wǎng)絡(luò)如因特網(wǎng)上提供遺傳信息的方法的實(shí)施方案， 如 U. S. kr. Nos. 10/197，621、10/063，559(美國公布號 20020183936)、10/065，856、 10/065，868、10/328，818、10/328，872、10/423，403 和 60/482，389 所示。例如，一種或多種分子譜分析技術(shù)可以在一個地點(diǎn)(例如，城市、州、國家或大陸)進(jìn)行，并且結(jié)果可以傳送到不同的城市、州、國家或大陸。然后可以在第二地點(diǎn)整體或部分進(jìn)行治療選擇。本發(fā)明的方法包括不同地點(diǎn)之間的信息傳送。用于治療選擇的分子譜分析本發(fā)明的方法為需要的受試者提供候選治療選擇。分子譜分析可以用來為患有疾病的個體確定一種或多種候選治療劑，其中本文公開的生物標(biāo)志物的一個或多個是治療靶標(biāo)。例如，該方法可以確定一種或多種用于癌癥的化學(xué)治療。在一方面，本發(fā)明提供一種方法，包括對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定至少五種蛋白質(zhì)的IHC表達(dá)譜；對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定至少十種基因的微陣列表達(dá)譜；對該樣品進(jìn)行熒光
39原位雜交(FISH)分析以確定至少一種基因的FISH突變譜；對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定至少一種基因的測序突變譜；和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜，其中該規(guī)則數(shù)據(jù)庫包括其對病變細(xì)胞的生物活性已知的治療的圖譜， 該細(xì)胞i)過表達(dá)或欠表達(dá)IHC表達(dá)譜中包括的一個或多個蛋白質(zhì)；ii)過表達(dá)或欠表達(dá)微陣列表達(dá)譜中包括的一個或多個基因；iii)在FISH突變譜中包括的一個或多個基因中沒有突變或具有多個突變；和/或iv)在測序突變譜中包括的一個或多個基因中沒有突變或具有多個突變；和如果相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫的比較表明該治療應(yīng)當(dāng)對病變細(xì)胞具有生物活性，和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫的比較沒有表明該治療不能用于治療病變細(xì)胞，則確定該治療。該疾病可以是癌癥。分子譜分析步驟可以按照任何順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，不是所有分子譜分析步驟都進(jìn)行。作為一個非限制性的例子，如果樣品質(zhì)量不滿足如本文所述的閾值， 則不進(jìn)行微陣列分析。在另一實(shí)例中，只在FISH分析滿足閾值時進(jìn)行測序。任何相關(guān)生物標(biāo)志物可以使用此處所述的或本領(lǐng)域已知的分子譜分析技術(shù)中的一個或多個進(jìn)行評估。標(biāo)志物只需要與有用的治療具有一定的直接或間接相關(guān)。分子譜分析包括用于進(jìn)行的每種測試技術(shù)的至少一個基因(或基因產(chǎn)物)的譜分析。不同數(shù)目的基因可以用不同的技術(shù)測定。此處公開的與靶治療劑直接或間接相關(guān)的任何標(biāo)志物可以根據(jù)基因例如DNA序列和/或基因產(chǎn)物例如mRNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行評估。 這種核酸和/或多肽可以對存在或不存在、水平或量、突變、序列、單體型、重排、拷貝數(shù)等進(jìn)行適用的譜分析。在一些實(shí)施方案中，單基因和/或一個或多個相應(yīng)的基因產(chǎn)物通過一種以上的分子譜分析技術(shù)進(jìn)行測定?；蚧蚧虍a(chǎn)物(在本文中也稱為“標(biāo)志物”或“生物標(biāo)志物”)，例如，mRNA或蛋白質(zhì)，利用適用的技術(shù)進(jìn)行評估(例如，評價DNA、RNA、蛋白質(zhì))，包括但不限于FISH、微陣列、IHC、測序或免疫測定。因此，此處公開的任何標(biāo)志物可以通過一種分子譜分析技術(shù)或通過多種此處公開的方法進(jìn)行測定(例如，一種標(biāo)志物通過 IHC、FISH、測序、微陣列等中的一個或多個進(jìn)行譜分析)。在一些實(shí)施方案中，至少大約1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少大約100種基因或基因產(chǎn)物通過 FISH、微陣列、IHC和測序中的至少一種技術(shù)、多種技術(shù)或每一種進(jìn)行譜分析。在一些實(shí)施方案中，至少大約 100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、 6000、7000、8000、9000、10，000,11,000,12,000,13,000,14,000,15,000,16,000,17,000、 18，000,19,000,20,000,21, 000,22, 000,23, 000,24, 000,25, 000,26, 000,27, 000,28, 000、 29，000,30,000,31,000,32,000,33, 000,34, 000,35, 000,36, 000,37, 000,38, 000,39, 000、 40，000,41, 000,42, 000,43, 000,44, 000,45, 000,46, 000,47, 000,48, 000,49, 000 或至少大約50，000種基因或基因產(chǎn)物通過每種技術(shù)進(jìn)行譜分析。測定的標(biāo)志物的數(shù)目取決于使用的技術(shù)。例如，微陣列和大規(guī)模平行測序適合于高通量分析。在一些實(shí)施方案中，來自需要的受試者的樣品使用包括但不限于以下這些的方法進(jìn)行譜分析=IHC表達(dá)譜分析、微陣列表達(dá)譜分析、FISH突變譜分析，和/或測序突變譜分析 (如PCR、RT-PCR、焦磷酸測序)，該分析是針對以下的一個或多個ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、 ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受體、AR、AREG, ASNS, BCL2、BCRP, BDCAl、BIRC5、B-RAF, BRCAl、 BRCA2、CA2、小窩蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Myc、C0X-2、細(xì)胞周期蛋白 Dl、DCK、DHFR、DWTl、DWT3A、DNMT3B、E-鈣粘著蛋白、ECGFl、EGFR、EPHA2、表皮調(diào)節(jié)素、ER、ERBR2、ERCCl、ERCC3、EREG, ESRl、FLT1、葉酸受體、FOLRl、F0LR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRHl、GNRHRl、GSTPl、HCK,HDACl、Her2/ Neu、HGF、HIF1A、HIGl、HSP90、HSP90AA1、HSPCA,IL13RA1、IL2RA、KDR、KIT、K-RAS、LCK、LTB, 淋巴毒素 Beta 受體、LYN、MGMT、MLHl、MRPl、MS4A1、MSH2、Myc、NFKBl、NFKB2、NFKBIA、ODCl、 OGFR、p53、p95、PARP-I、PDGFC,PDGFR、PDGFRA,PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLAl、PPARG, PPARGCU PR、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SPARC MC、 SPARC PC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、TOPI、T0P2A、 T0P2B、TOPO1、T0P02B、拓?fù)洚悩?gòu)酶 II、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、 YES1、ZAP70。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行額外的分子譜分析方法。這可包括但不限于PCR、RT_PCR、 Q-PCR、SAGE、MPSS、免疫測定和其它技術(shù)，以評估本文所述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生物系統(tǒng)。待測定的基因和基因產(chǎn)物的選擇可以隨時間更新為新的治療，并確定新的藥物靶標(biāo)。 一旦生物標(biāo)志物的表達(dá)或突變與治療選項(xiàng)相關(guān)，則它可以通過分子譜分析評估。技術(shù)人員明白這些分子譜分析不限于本文公開的技術(shù)，而包括任何用于評估核酸或蛋白質(zhì)水平、序列信息或兩者的常規(guī)方法。本發(fā)明的方法也可以利用當(dāng)前方法的任何改良或未來開發(fā)的新的分子譜分析技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，通過單一分子譜分析技術(shù)評估基因或基因產(chǎn)物。在其它實(shí)施方案中，通過多種分子譜分析技術(shù)評估基因和/或基因產(chǎn)物。在非限制性實(shí)例中， 可以通過FISH和焦磷酸測序分析中的一種或多種測定基因序列，可以通過RT-PCR和微陣列中的一種或多種測定mRNA基因產(chǎn)物，并且可以通過IHC和免疫測定中的一種或多種測定蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物。技術(shù)人員明白本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物和有益于疾病治療的分子譜分析技術(shù)的任何組合。已知在癌癥中起作用并且可以通過本發(fā)明的任何分子譜分析技術(shù)測定的基因和基因產(chǎn)物包括但不限于 2AR、A DISINTEGRIN、ACTIVATOR OF THYROID 和 RETINOIC ACID 受體(ACTR)、ADAM 11、ADIP0GENESIS 抑制劑 Y FACTOR (ADIF)、ALPHA 6 INTEGRIN SUBUNIΤ, ALPHA V INTEGRIN SUBUNIT、ALPHA_CATENIN、擴(kuò)增的 IN 乳腺癌 1 (AIBl)、擴(kuò)增的 IN 乳腺癌 3(AIB3)、擴(kuò)增的 IN 乳腺癌 4(AIB4)、AMYLOID PRECURSOR 蛋白質(zhì) SECRETASE (APPS)、AP-2 GAMMA、APPS, ATP-BINDING CASSETTE TRANSPORTER (ABCT)、PLACENTA-SPECIFIC (ABCP)、 ATP-BINDING CASSETTE SUBFAMILY C MEMBER(ABCCl)、BAG_1、BASIGIN(BSG)、BCEI、B_CELL DIFFERENTIATION FACTOR (BCDF)、B-CELL LEUKEMIA 2 (BCL-2)、B-CELL STIMULATORY FACT0R-2 (BSF-2)、BCL-U BCL-2-ASS0CIATED X 蛋白質(zhì)(ΒΑΧ)、BCRP, BETA 1 INTEGRIN SUBUNIT, BETA 3 INTEGRIN SUBUNIT, BETA 5 INTEGRIN SUBUNIT, BETA-2 INTERFERON、 BETA-CATENIN、BETA-CATENIN、BONE SIALO 蛋白質(zhì)(BSP)、乳腺癌 ESTROGEN-INDUCIBLE SEQUENCE(BCEI)、乳腺癌 RESISTANCE 蛋白質(zhì)(BCRP)、乳腺癌 TYPE 1 (BRCAl)、乳腺癌 TYPE 2 (BRCA2) ,BREAST CARCINOMA 擴(kuò)增的 SEQUENCE 2 (BCAS2)、鈣粘著蛋白、EPITHELIAL 鈣粘著蛋白-11、鈣粘著蛋白-ASSOCIATED 蛋白質(zhì)、CALCITONIN 受體(CTR)、CALCIUM PLACENTAL 蛋白質(zhì)(CAPL)、CALCYCLIN、CALLA、CAM5、CAPL、CARCIN0EMBRY0NIC ANTIGEN (CEA)、 CATENIN、ALPHA 1、CATHEPSIN B、CATHEPSIN D、CATHEPSIN K、CATHEPSIN L2、CATHEPSIN 0、CATHEPSIN 01、CATHEPSIN V、CD10、CD146、CD147、CD24、CD29、CD44、CD51、CD54、CD61、 CD66e、CD82、CD87、CD9、CEA, CELLULAR RET INOL-BINDING 蛋白質(zhì) 1 (CRBPl)、c-ERBB-2、CK7、CK8、CK18、CK19、CK20、CLAUDIN-7、c-MET、COLLAGENASE、FIBROBLAST、COLLAGENASE、 INTERSTITIAL、COLLAGENASE-3、COMMON ACUTE LYMPHOCYTIC LEUKEMIA ANTIGEN (CALLA)、 CONNEXIN 26 (Cx26)、CONNEXIN 43 (Cx43)、CORTACTIN、COX-2、CTLA-8、CTR、CTSD、細(xì)胞周期蛋白 D1、CYCL00XYGENASE-2、CYT0KERATIN 18.CYTOKERATIN 19.CYTOKERATIN 8,CYTOTOXIC T-LYMPHOCYTE-ASSOCIATED SERINE ESTERASE 8 (CTLA-8)、DIFFERENTIATION-INHIBITING ACTIVITY(DIA)、DNA 擴(kuò)增的 IN MAMMARY CARCINOMA 1 (DAMl)、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 IIALPHA、 DR-匪23、E-鈣粘著蛋白、EMMPRIN、EMSl、ENDOTHELIAL CELL GROWTH FACTOR(ECGR)、 PLATELET-DERIVED (PD-ECGF)、ENKEPHALINASE、EPIDERMAL GROWTH FACTOR 受體(EGFR)、 EPISIALIN、EPITHELIAL MEMBRANE ANTIGEN(EMA)、ER-ALPHA, ERBB2、ERBB4、ER-BETA, ERF-I、ERYTHROID-POTENTIATING ACTIVITY (EPA)、ESRl、ESTROGEN 受體-ALPHA、ESTROGEN 受體-BETA、ETS-I、EXTRACELLULAR MATRIX METALLO 蛋白質(zhì) ASE INDUCER (EMMPRIN)、 FIBRONECTIN 受體、BETA 多肽(FNRB)、FIBRONECTIN 受體 BETA SUBUNIT (FNRB)、FLK-U GA15. 3、GA733. 2、GALECTIN-3、GAMMA-CATENIN、GAP JUNCTION 蛋白質(zhì)(26kDa)、GAP JUNCTION 蛋白質(zhì)(43kDa)、GAP JUNCTION 蛋白質(zhì) ALPHA-I (GJAl)、GAP JUNCTION 蛋白質(zhì) BETA-2 (GJB2)、GCPl、明膠酶 Α、明膠酶 B、明膠酶(72kDa)、明膠酶(92kDa)、GLIOSTATIN、 糖皮質(zhì)激素受體相互作用蛋白質(zhì)1 (GRIPl)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶p、GM-CSF, GRANULOCYTE CHEMOTACTIC 蛋白質(zhì) 1 (GCPl)、GRANULOCYTE-MACROPHAGE-COLONY STIMULATING FACTOR、 GROWTH FACTOR 受體 BOUND-7 (GRB-7)、GSTp、HAP、HEAT-SHOCK COGNATE 蛋白質(zhì) 70 (HSC70)、 耐熱抗原、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR)、肝細(xì)胞刺激因子 III (HSF III)、HER-2、HER2/NEU、HERMES ANTIGEN、HET, HHM、HUMORAL HYPERCALCEMIA OF MALIGNANCY (HHM)、ICERE-I、INT-I、INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE-1(ICAM-1)、 INTERFERON-GAMMA-INDUCING FACTOR(IGIF)、INTERLEUKIN-1ALPHA(IL-IA)、 INTERLEUKIN-1BETA(IL-IB)、INTERLEUKIN-11(IL-11)、INTERLEUKIN-17(IL-17)、 INTERLEUKIN-18(IL-18)、INTERLEUKIN-6 (IL_6)、INTERLEUKIN-8 (IL_8)、INVERSELY CORRELATED WITH ESTROGEN 受體表達(dá)-1 (ICERE-1)、KAIl、KDR、KERATIN 8、KERATIN 18、 KERATIN 19、KISS-I、LEUKEMIA 抑制劑 Y FACTOR(LIF)、LIF、LOST IN INFLAMMATORY 乳腺癌(LIBC)、LOT ( “ LOST ON TRANSFORMATION “ )、LYMPHOCYTE HOMING 受體、 MACROPHAGE-COLONY STIMULATING FACTOR、MAGE-3、MAMMAGLOBIN、MASPIN、MC56、 M-CSF、MDC、MDNCF, MDR、MELANOMA CELL ADHESION MOLECULE (MCAM)、MEMBRANE METALLOENDOPEPTIDASE (MME)、MEMBRANE-ASSOCIATED NEUTRAL ENDOPEPTIDASE (NEP)、 CYSTEINE-RICH 蛋白質(zhì)(MDC)、METASTASIN(MTS-I)、MLN64、MMPl、MMP2、MMP3、MMP7、 MMP9、MMPl 1、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MOESIN、MONOCYTE ARGININE-SERPIN、 MONOCYTE-DERIVED NEUTROPHIL CHEMOTACTIC FACTOR、MONOCYTE-DERIVED PLASMINOGEN ACTIVATOR 抑制齊[J、MTS-I、MUC-U MUC18、MUCIN LIKE 癌癥 ASSOCIATED ANTIGEN (MCA)、 MUCIN、MUC-I、MULTIDRUG RESISTANCE 蛋白質(zhì) 1 (MDR、MDRl)、MULTIDRUG RESISTANCE RELATED 蛋白質(zhì)-1 (MRP、MRP-1)、N-鈣粘著蛋白、NEP、NEU, NEUTRAL ENDOPEPT IDASE、 NEUTROPHIL-ACTIVATING PEPTIDE 1 (NAPl)、NM23-H1、NM23-H2、NMEl、NME2、NUCLEAR 受體 C0ACTIVAT0R-1 (NCoA-I)、NUCLEAR 受體 COACTIVATOR-2 (NCoA-2)、NUCLEAR 受體 C0ACTIVAT0R-3(NCoA-3)、NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE A (NDPKA)、NUCLEOSIDE
42DIPHOSPHATE KINASE B (NDPKB)、ONCOSTATIN M(OSM)、ORNITHINE DECARBOXYLASE (ODC)、 OSTEOCLAST DIFFERENTIATION FACTOR(ODF)、OSTEOCLAST DIFFERENTIATION FACTOR 受體 ^DFR)、OSTEONECTIN (OSN、ON)、OSTEOPONTIN (OPN)、OXYTOCIN 受體 ^XTR)、p27/ kipl、p300/CBP COINTEGRATOR ASSOCIATE 蛋白質(zhì)(p/CIP)、p53、p9Ka、PAI-1、PAI-2、 PARATHYROID ADENOMATOSIS 1 (PRADl)、PARATHYROID HORMONE-LIKE HORMONE (PTHLH)、 PARATHYROID HORMONE-RELATED PEPTIDE (PTHrP)、P-鈣粘著蛋白、PD-ECGF、 PDGF、PEANUT-REACTIVE URINARY MUCIN (PUM)、P-糖蛋白(P-GP)、PGP-1、PHGS-2、 PHS-2、PIP、PLAKOGLOBIN、PLASMINOGEN ACTIVATOR 抑制劑(TYPE 1)、PLASMINOGEN ACTIVATOR 抑制劑(TYPE 2), PLASMINOGEN ACTIVATOR (TISSUE-TYPE)、PLASMINOGEN ACTIVATOR(UROKINASE-TYPE)、PLATELET 糖蛋白 IIIa(GP3A)、PLAU, PLEOMORPHIC ADENOMA GENE-LIKE 1 (PLAGLl)、POLYMORPHIC EPITHELIAL MUCIN (PEM)、PRADl、PROGESTERONE 受體(PgR)、！PROGESTERONE RESISTANCE, PROSTAGLANDIN ENDOPEROXIDE SYNTHASE-2、 PROSTAGLANDIN G/H SYNTHASE-2, PROSTAGLANDIN HSYNTHASE-2、pS2、PS6K、PSORIASIN、 PTHLH、PTHrP, RAD51、RAD52、RAD54、RAP46,受體-ASSOCIATED COACTIVATOR 3 (RAC3)、 REPRESSOR OF ESTROGEN 受體 ACTIVITY (REA)、S100A4、S100A6、S100A7、S6K、SART-1、 SCAFFOLD ATTACHMENT FACTOR B (SAF-B), SCATTER FACTOR (SF)、SECRETED PHOSPHOgg 質(zhì)-1 (SPP-I)、SECRETED 蛋白質(zhì)、ACIDIC 和 RICH IN CYSTEINE (SPARC)、STANNICALCIN、 STEROID 受體 COACTIVATOR-1 (SRC-I)、STEROID 受體 COACTIVATOR-2 (SRC-2)、STEROID 受體 COACTIVATOR-3 (SRC-3)、STEROID 受體 RNA ACTIVATOR (SRA)、STROMELYSIN-1、 STROMELYSIN-3、TENASCIN-C(TN-C)、TESTES-SPECIFIC PROTEASE 50、THROMBOSPONDIN I、 THROMBOSPONDIN II、THYMIDINE PHOSPHORYLASE(TP)、THYROID HORMONE 受體 ACTIVATOR MOLECULE 1 (TRAM-I)、TIGHT JUNCTION 蛋白質(zhì) 1 (TJPl)、TIMPl、TIMP2、TIMP3、TIMP4,組織-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR、TN-C, TP53、tPA、TRANSCRIPTIONAL INTERMEDIARY FACTOR 2(TIF2)、TREFOIL FACTOR 1 (TFFl)、TSGlOl、TSP-U TSPl、TSP-2、TSP2、TSP50、 TUMOR CELL COLLAGENASE STIMULATING FACTOR (TCSF)、TUMOR-ASSOCIATED EPITHELIAL MUCIN、uPA、uPAR、UROKINASE、UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR、UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR 受體(uPAR)、UVOMORULIN、VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR、VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR 受體-2 (VEGFR2)、VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-A, VASCULAR PERMEABILITY FACTOR、VEGFR2、VERY LATE T-CELL ANTIGEN BETA (VLA-BETA)、VIMENTIN、VITRONECTIN 受體 ALPHA 多肽(VNRA)、VITRONECTIN 受體、VON WILLEBRAND FACTOR、VPF、VWF、WNT-I、ZAC、ZO-I，禾Π ZONULA OCCLUDENS-1。
用于IHC表達(dá)譜分析的基因產(chǎn)物包括但不限于SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、 c-kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMl、BCRP, TOPOl、PTEN、MGMT 禾口 MRPl 中的一種或多種。也可以進(jìn)行EGFR的IHC譜分析。IHC也用來檢測或測試各種基因產(chǎn)物，包括但不限于以下一種或多種EGFR、SPARC、C_kit、ER、PR、雄激素受體、PGP、RRMl、TOPOl、BRCPl、 MRPl、MGMT、PDGFR、DCK、ERCCl、胸苷酸合酶、Her2/neu 或 T0P02A。在一些實(shí)施方案中，IHC 用來檢測以下蛋白質(zhì)中的一種或多種，包括但不限于ADA、AR、ASNA, BCL2、BRCA2、⑶33、 CDW52、CES2、DNMTU EGFR, ERBB2、ERCC3、ESR1、F0LR2、GART, GSTPl、HDACl、HIF1A、HSPCA, IL2RA、KIT、MLH1、MS4A1、MASH2、NFKB2、NFKBIA、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLA,PTEN、PTGS2、RAFl、RARA、RXRB、SPARC、SSTRl、TKl、TNF、TOPl、T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、 VDR、VEGF、VHL 或 ZAP70。微陣列表達(dá)譜分析可以用來同時測定一個或多個基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)，包括但不限于 ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、 DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGF1、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCC1、ERCC3、ESRl、FLT1、F0LR2、 FYN、GART, GNRHl、GSTPl、HCK、HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT、MLHl、MS4A1、MSH2、NFKB1、NFKB2、OGFR、PDGFC、PDGFRA、PDGFRB、PGR、POLAl、PTEN、 PTGS2、RAFl、RARA、RRMl、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、 SSTR5、TK1、TNF、T0P1、T0P2A、T0P2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1 和 ZAP70。在一些實(shí)施方案中，用于微陣列表達(dá)譜分析的基因包括以下一種或多種EGFR、SPARC、C_kit、ER、 PR、雄激素受體、PGP、RRM1、T0P01、BRCP1、MRP1、MGMT、PDGFR、DCK、ERCC1、胸苷酸合酶、Her2/ neu、T0P02A、ADA、AR、ASNA, BCL2、BRCA2、CD33、CDW52、CES2、DNMTl、EGFR、ERBB2、ERCC3、 ESRl、F0LR2、GART, GSTPl、HDACl、HIF1A、HSPCA, IL2RA、KIT、MLHl、MS4A1、MASH2、NFKB2、 NFKBIA、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLA, PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RXRB, SPARC、 SSTRl、TKl、TNF、TOPI、T0P2A、T0P2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VHL 或 ZAP70?？梢允褂玫兔芏任㈥嚵?、表達(dá)微陣列、比較基因組雜交(CGH)微陣列、單核苷酸多態(tài)性(SNP)微陣列、蛋白質(zhì)組陣列、抗體陣列或本文所述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它陣列進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。在一些實(shí)施方案中，使用高通量表達(dá)陣列。這樣的系統(tǒng)包括但不限于可以從Agilent 或Illumina購到的系統(tǒng)，如本文更詳細(xì)所述。FISH突變譜分析可以用來對EGFR和HER2中的一種或多種進(jìn)行譜分析。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ISH用來檢測或測試以下基因中的一種或多種，包括但不限于EGFR、SPARC、 C-kit、ER、PR、雄激素受體、PGP、RRMl、TOPOl、BRCPl、MRPl、MGMT、PDGFR、DCK, ERCCl、胸苷酸合酶、HER2或T0P02A。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ISH用來檢測或測試各種生物標(biāo)志物，包括但不限于以下一種或多種ADA、AR、ASNA, BCL2、BRCA2、CD33、CDW52、CES2、DWTl、EGFR、ERBB2、 ERCC3、ESRl、F0LR2、GART, GSTPl、HDACl、HIF1A、HSPCA, IL2RA、KIT、MLH1、MS4A1、MASH2、 NFKB2、NFKBIA、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLA, PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RXRB, SPARC、SSTRl、TKl、TNF、TOPI、T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGF, VHL 或 ZAP70。在一些實(shí)施方案中，用于測序突變譜分析的基因包括KRAS、BRAF、c_KIT和EGFR中的一種或多種。測序分析也可以包括評估以下一種或多種中的突變ABCC1、ABCG2、ADA、AR、 ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、 ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLTl、F0LR2、FYN、GART、GNRHl、GSTPl、HCK、 HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT、MLH1、MS4A1、MSH2、 NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA、PDGFRB, PGR、P0LA1、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、 RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、TNF、T0P1、 T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGFA, VHL, YESl 禾P ZAP70。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種通過使用幾組已知生物標(biāo)志物的分子譜分析為需要的受試者確定候選治療的方法。例如，該方法可以為癌癥患者確定化療劑。該方法包括 從該受試者獲得樣品；對該樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定以下至少五種的IHC表達(dá)譜SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit, AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMU BCRP,TOPOU PTEN、MGMT和MRPl ；對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定以下至少五種的微陣列表達(dá)譜ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS, BCL2、BIRC5、BRCAl、BRCA2、CD33、CD52、CDA, CES2、DCK, DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLT1、F0LR2、 FYN、GART, GNRHl、GSTPl、HCK, HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT, MLHl、MS4A1、MSH2、NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、 PTEN、PTGS2、RAFl、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、 SSTR4、SSTR5、TK1、TNF、T0P1、T0P2A、T0P2B、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YES1 和 ZAP70 ； 對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定EGFR和HER2中的至少一種的FISH突變譜；對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR中的至少一種的測序突變譜； 和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜，其中所述規(guī)則數(shù)據(jù)庫包括其對病變細(xì)胞的生物活性已知的治療的圖譜，該細(xì)胞i)過表達(dá)或欠表達(dá) IHC表達(dá)譜中包括的一個或多個蛋白質(zhì)；ii)過表達(dá)或欠表達(dá)微陣列表達(dá)譜中包括的一個或多個基因；iii)在FISH突變譜中包括的一個或多個基因中沒有突變或具有多個突變；和 /或iv)在測序突變譜中包括的一個或多個基因中沒有突變或具有多個突變；和如果相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫的比較表明該治療應(yīng)當(dāng)對病變細(xì)胞具有生物活性，和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫的比較沒有表明該治療不能用于治療病變細(xì)胞，則確定該治療。該疾病可以是癌癥。分子譜分析步驟可以按照任何順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，不是所有分子譜分析步驟都進(jìn)行。作為一個非限制性的例子，如果樣品質(zhì)量不滿足如本文所述的閾值，則不進(jìn)行微陣列分析。在一些實(shí)施方案中，對上述基因產(chǎn)物的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或 95 %進(jìn)行IHC表達(dá)譜分析。在一些實(shí)施方案中，對以上所列基因的至少20 %、30 %、40 %、 50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。 在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供一種通過利用對定義的幾組已知生物標(biāo)志物的分子譜分析為需要的受試者確定候選治療的方法。例如，該方法可以為癌癥個體確定化療劑。該方法包括從該受試者獲得樣品，其中該樣品包含福爾馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE)組織或新鮮冷凍的組織，并且其中該樣品包含癌細(xì)胞；對該樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定至少以下的 IHC 表達(dá)譜SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、 TS、ERCC1、RRM1、BCRP、T0P01、PTEN、MGMT和MRPl ；對樣品進(jìn)行微陣列分析以確定至少以下的微陣列表達(dá)譜ABCC1、ABCG2、ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、 CES2、DCK、DHFR、DNMTl、DNMT3A、DNMT3R、ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、 FLTl、F0LR2、FYN、GART、GNRHl、GSTPl、HCK,HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、 KIT、LCK, LYN、MGMT, MLH1、MS4A1、MSH2、NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、 POLAl、PTEN、PTGS2、RAFURARA,RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB,RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、 SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、TNF、TOPl、T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGFA、VHL、YESl 禾口 ZAP70 ；對樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定至少EGFR和HER2的FISH突變譜；對樣品進(jìn)行DNA測序以確定至少KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR的測序突變譜。IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，其中規(guī)則數(shù)據(jù)庫包括其對病變細(xì)胞的生物活性已知的治療的圖譜，該細(xì)胞i)過表達(dá)或欠表達(dá)IHC表達(dá)譜中包括的一個或多個蛋白質(zhì)；ii)過表達(dá)或欠表達(dá)微陣列表達(dá)譜中包括的一個或多個基因；iii) 在FISH突變譜中包括的一個或多個基因中沒有突變或具有多個突變；和/或iv)在測序突變譜中包括的一個或多個基因中沒有突變或具有多個突變；和如果相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫的比較表明該治療應(yīng)當(dāng)對該疾病具有生物活性，和相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫的比較沒有表明該治療不能用于治療該疾病，則確定該治療。疾病可以是癌癥。分子譜分析步驟可以按任何順序進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，不是所有分子譜分析步驟都進(jìn)行。作為一個非限制性的例子，如本文所述，如果樣品的質(zhì)量不滿足閾值，則不進(jìn)行微陣列分析。在一些實(shí)施方案中，生物材料是mRNA，質(zhì)量對照測試包括使用管家基因例如RPL13a的RT-PCR的A260/A^0比和/或Ct 值。在實(shí)施方案中，如果A260/A^0比< 1.5或RPL13a Ct值> 30，則mRNA通不過質(zhì)量控制測試。在該情況中，可以不進(jìn)行微陣列分析?；蛘撸梢詼p弱微陣列結(jié)果，例如，與其它分子譜分析技術(shù)的結(jié)果相比給予較低的優(yōu)先級。在一些實(shí)施方案中，分子譜分析總是對特定基因或基因產(chǎn)物進(jìn)行，而其它基因或基因產(chǎn)物的譜分析是任選的，例如，IHC表達(dá)譜分析可以至少對SPARC、T0P2A和/或PTEN 進(jìn)行。類似地，微陣列表達(dá)譜分析可以至少對⑶52進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，除上述以外的基因用來確定治療。例如，用于IHC表達(dá)譜分析的一組基因可以進(jìn)一步包括DCK、EGFR、 BRCAUCK 14、CK 17、CK 5/6、E-鈣粘著蛋白、p95、PARP-1、SPARC 和 TLE3。在一些實(shí)施方案中，用于IHC表達(dá)譜分析的一組基因進(jìn)一步包括Cox-2和/或Ki-67。在一些實(shí)施方案中，HSPCA通過微陣列分析檢測。在一些實(shí)施方案中，對c-Myc和T0P2A進(jìn)行FISH突變。在一些實(shí)施方案中，對PII進(jìn)行測序。本發(fā)明的方法可以在任何設(shè)置中使用，其中差異表達(dá)或突變分析已經(jīng)與各種治療的效果關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，利用該方法確定用于癌癥患者的候選治療。在這些條件下，用于分子譜分析的樣品優(yōu)選地含有癌細(xì)胞。樣品中癌細(xì)胞的百分比可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法確定，例如使用病理學(xué)技術(shù)。也可以從樣品富集癌細(xì)胞，例如顯微解剖技術(shù)等。樣品在用于分子譜分析之前可能需要具有特定閾值的癌細(xì)胞。閾值可能是至少大約 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%的癌細(xì)胞。閾值取決于分析方法。例如，揭示各細(xì)胞中表達(dá)的技術(shù)可能比使用從不同細(xì)胞的混合物提取的樣品的技術(shù)需要較低的閾值。在一些實(shí)施方案中，疾病樣品與取自同一患者的正常樣品例如相鄰的非癌組織進(jìn)行比較。治療選擇本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可以用來選擇其突出的效力可能與分子譜分析結(jié)果聯(lián)系的任何治療。本發(fā)明包括使用分子譜分析結(jié)果提示與治療反應(yīng)的相關(guān)性。在一個實(shí)施方案中， 根據(jù)患者的腫瘤類型選擇用于分子譜分析的適當(dāng)?shù)纳飿?biāo)志物。這些提出的生物標(biāo)志物可用來改變生物標(biāo)志物的默認(rèn)列表。在其它實(shí)施方案中，分子譜分析獨(dú)立于來源材料。在一些實(shí)施方案中，利用規(guī)則根據(jù)分子譜分析測試結(jié)果提供提示的化學(xué)治療。在一個實(shí)施方案中，從同行評議的臨床腫瘤學(xué)文獻(xiàn)的摘要產(chǎn)生規(guī)則。專家觀點(diǎn)規(guī)則可以使用，但是是任選的。在一個實(shí)施方案中，使用來自United States Preventive Services Taskforce采用的證據(jù)分級系統(tǒng)衍生的層級結(jié)構(gòu)估計臨床引證與本發(fā)明的方法的相關(guān)性?！白罴炎C據(jù)”可以用作規(guī)則的基礎(chǔ)。最簡單的規(guī)則構(gòu)建為“如果生物標(biāo)志物為陽性則治療選項(xiàng)一，否則治療選項(xiàng)二”的形式。治療選項(xiàng)包括沒有特定藥物的治療、使用特定藥物的治療或使用聯(lián)合藥物的治療。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)建更復(fù)雜的規(guī)則，其涉及兩個或多個生物標(biāo)志物的相互作用。在這些情況中，更復(fù)雜的相互作用一般得到臨床研究的支持，該臨床研究分析規(guī)則中包括的生物標(biāo)志物之間的相互作用。最后，可以生成報告，該報告描述化療反應(yīng)和生物標(biāo)志物的相關(guān)性和支持選擇的治療的最佳證據(jù)的大概說明。最終，經(jīng)治醫(yī)生將確定最佳療程。作為一個非限制性實(shí)例，分子譜分析可以揭示EGFR基因是擴(kuò)增的或過表達(dá)的，因而表明可以阻斷EGFR活性的治療的選擇，如單克隆抗體抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗，或?qū)GFR具有活化突變的患者有效的小分子激酶抑制劑，如吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼。臨床開發(fā)的其它抗EGFR單克隆抗體包括扎蘆木單抗、尼妥珠單抗和馬妥珠單抗。選擇的候選治療可以取決于通過分子譜分析顯示的設(shè)置。例如，激酶抑制劑通常與發(fā)現(xiàn)具有活化突變的EGFR — 起開出。繼續(xù)示例性的實(shí)施方案，分子譜分析也可能顯示一些或全部這些治療可能有效性較低。例如，施用吉非替尼或厄洛替尼的患者最終在EGFR中發(fā)展抗藥性突變。因此，存在抗藥性突變將表明不能選擇小分子激酶抑制劑。技術(shù)人員將明白可以擴(kuò)展這個例子以指導(dǎo)作用于分子譜分析顯示其差異表達(dá)的基因或基因產(chǎn)物的其它候選治療的選擇。類似地，如果分子譜分析顯示這些變體，則可以選擇已知對攜帶某些核酸變體的病變細(xì)胞有效的候選藥物。 可以通過本發(fā)明方法確定為候選治療的癌癥治療包括但不限于13-順-視黃酸、 2-CdA、2-氯脫氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、5-FU、6-巰基嘌呤，6_MP，6-TG，6-硫鳥嘌 Πφ, Abraxane> Accutane ( , ^ -D, ΗβΚ , Adrucil , Afinitor <D, Agrylin , ALA-CORT ,阿地白介素，阿侖珠單抗，ALIMTA,阿利維a酸、Alkaban-AQ⑧、Alkeran⑧、 全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤、氨磷汀、氨魯米特、阿那格雷、Anandron 、 阿那曲唑、阿糖胞嘧啶、Ara-C、Aranesp 、Aredia 、Arimidex 、Aromasin L 、 Arranon 、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、Avastin 、阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯達(dá)莫司汀、 貝伐珠單抗、貝沙羅汀、BEXXAR⑧、比卡魯胺、BiCNU, Blenoxane 、博來霉素、硼替佐米、 白消安、Busulfex 、C225、甲酰四氫葉酸鈣、Campath 、Camptosar 、喜樹堿-11、卡培他濱、Carac 、卡鉬、卡莫司汀、卡莫司汀片、Casodex 、CC-5013、CCI-779、CCNU, CDDP, CeeNU, Cerubidine 、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉬、噬橙菌因子、克拉屈濱、可的松、 Cosmegen 、CPT_11、環(huán)磷酰胺、Cytadren 、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質(zhì)體、Cytosar-U 、 Cytoxan⑧、達(dá)卡巴嗪、Dacogen、放線菌素D、達(dá)依泊汀Alfa、達(dá)沙替尼、道諾霉素柔紅霉素、 鹽酸柔紅霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體、DaunoXome 、Decadron、地西他濱、Delta-Cortef 、 Deltasone (g)、Denileukin、Diftitox、DepoCyt 、Dexamethasone、Dexamethasone Acetate Dexamethasone Sodium Phosphate、Dexasone、Dexrazoxane、DHAD> DIC、 Diodex多西他賽、Doxil 、多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體、Droxia 、DTIC、DTIC-Dome 、 Duralone 、Efudex 、Eligard 、Ellence 、Eloxatin 、Elspar 、Emcyt 、表柔比星、Epoetin Alfa、Erbitux、厄洛替尼、Erwinia L-天冬酉先胺Bi、Estramustine、Ethyol Etopophos 、依托泊昔、依托泊昔 Phosphate、Eulexin 、Everolimus、Evista 、依西美坦、Fareston 、Faslodex 、Femara 、Filgrastim、Floxuridine、Fludara 、 Fludarabine、Fluoroplex 、氟尿啼唆、氟尿啼唆(cream)、Fluoxymesterone、氟他胺、 Folinic Acid、FUDR 、氟維司群、G-CSF、吉非替尼、吉西他濱、Gemtuzumab ozogamicin、 Gemzar、Gleevec 、Gliade 1 Wafer、GM-CSF、戈舍瑞林、Granulocyte-CoIony Stimulating Factor、Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor、Halotestin 、 Herceptin 、Hexadrol、Hexalen 、HexamethyImelamine> HMM> Hycamtin 、 Hydrea 、Hydrocort Acetate 、Hydrocortisone、Hydrocortisone SodiumPhosphate、氫化可的松琥珀酸鈉、氫化可的松磷酸鹽、羥基脲、Ibritumomab、Ibritumomab、 Tiuxetan、Idamycin ，伊達(dá)比星、Ifex 、IFN-α、異環(huán)磷酰胺、IL-IU IL-2、伊馬替尼 mesylate、Imidazole Carboxamide> Interferon alfa、Interferon Alfa~2b (PEG Conjugate)、白介素_2、白介素 _ll、Intron A. (interferon alfa-2b)、Iressa 、伊立替康、異維甲酸、伊沙匹隆、IxempraTM、Kidr0lase(t)、LanaC0rt 、拉帕替尼、L-天冬酰胺酶、 LCR> Lenalidomide、來曲唑、Leucovorin、Leukeran> Leukine 、亮丙瑞林、Leurocristine、 Leustatin 、月旨質(zhì)體 Ara-C Liquid Pred 、Lomustine、L-PAM、L_Sarcolysin、Lupron 、 Lupron Depot 、Matulane (R)、Maxidex、Mechlorethamine>Mechlorethamine Hydrochloride、Medralone 、Medrol 、Megace 、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、Mesnex ,氨甲喋呤、氨甲喋呤鈉、甲潑尼龍、Meticorten 、絲裂霉素、絲裂霉素-C、米托蒽醌、M-Prednisol 、MTC、MTX、Mustargen (R)、Mustine、 Mutamycin 、Myleran 、Mylocel 、Mylotarg 、Navelbine <g)、Nelarabine、 Neosar 、Neulasta 、Neumega 、Neupogen 、Nexavar 、Nilandron 、尼魯米特、Nipent 、氮芥、Novaldex 、Novantrone 、奧曲肽、乙酸奧曲肽、Oncospar 、 Oncovin 、Ontak 、Onxa 1 > Oprevelkin、Orapred 、Orasone 、奧沙禾Ij韋白、紫杉醇、 蛋白質(zhì)結(jié)合的紫杉醇、帕米膦酸鹽、帕尼單抗、Panretin 、Paraplatin 、Pediapred⑧、 PEG hterferon、培門冬酶、Pegfilgrastim, PEG-INTRON 、PEG-L-天冬酰胺酶、培美曲塞、
Platinol , Platinol-AQ (R) 、Prednisolone、Prednisone、 Prelone 、Procarbazine、PROCRIT 、Proleukin 、Prolifeprospan 20 with Carmustine Implant、Purinethol 、Raloxifene、Revlimid (R)、Rheumatrex 、 Rituxan 、利妥昔單抗、Roferon-A Qnterferon Alfa_2a)、Rubex 、柔紅霉素鹽酸 ife、 Sandostatin Cg) 、Sandostatin LAR、夕少司 、 Solu-Cortef'(g) 、Solu-Medrol 、 索拉非尼、SPRYCEL 、STI-571、Str印tozocin、SU11248、舒尼替尼、Sutent 、他莫昔芬、 Tarceva、Targretin (S)、Taxol 、Taxotere 、Temodar 、！f 貞P坐月安、Temsirolimus、 替尼泊苷、TESPA、沙利度胺、Hialomid 、TheraCys ,⑧、硫鳥嘌呤、硫鳥嘌呤Tabloid 、 Thiophosphoamide、Thioplex 塞替派、TICE 、Toposar 、托泊替康、托瑞米芬、 Torisel ,酒石酸、曲妥珠單抗、Treanda 、維甲酸、Trexal 1 , Trisenox 、TSPA、 TYKERB 、VCR、Vectibix 、Velban 、Velcade 、VePesid 、Vesanoid . 、Viadur 、 Vidaza 、長春堿、硫酸長春堿、Vincasar Pfs 、長春新堿、長春瑞濱、酒石酸長春瑞濱、 VLB>VM-26、Vorinostat、VP—16、Vumon 、Xeloda 、Zanosar 、Zevalin 、Zinecard 、 hladex 、唑來膦酸、Zolinza, Zometa和其任意組合。 在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生將治療和分子譜分析結(jié)果作圖的數(shù)據(jù)庫。治療信息可以包括治療劑對具有某些屬性的細(xì)胞的突出的效果，該屬性可以通過分子譜分析檢測。分子譜分析可包括感興趣的某些基因、蛋白質(zhì)或其它生物分子的差異表達(dá)或突變。通過作圖，分子譜分析結(jié)果可以與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以選擇治療。數(shù)據(jù)庫可包括治療和分子譜分析結(jié)果之間的陽性和陰性作圖。在一些實(shí)施方案中，通過閱讀關(guān)于生物劑和治療劑之間的關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)進(jìn)行作圖。例如，為了可能的作圖可以閱讀雜志文章、專利出版物或?qū)＠暾埑霭嫖铩⒖茖W(xué)報告等。作圖可以包括體內(nèi)結(jié)果，例如動物研究或臨床試驗(yàn)的結(jié)果，或體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，例如細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。發(fā)現(xiàn)的任何作圖可以輸入數(shù)據(jù)庫，例如，治療劑對表達(dá)基因或蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。以這種方式，數(shù)據(jù)庫可以持續(xù)更新。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法也更新。作圖的規(guī)則可以包括多種補(bǔ)充信息。在一些實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)庫含有優(yōu)先化標(biāo)準(zhǔn)。 例如，在給定設(shè)置具有突出效果的治療可能優(yōu)于具有較低效果的治療。從某些設(shè)置例如臨床實(shí)驗(yàn)衍生的作圖可能優(yōu)于由另一設(shè)置例如細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)衍生的作圖。具有強(qiáng)文獻(xiàn)支持的治療可能比更多初步結(jié)果支持的治療優(yōu)先化。通常應(yīng)用于所述疾病類型的治療，例如某些組織來源的癌癥，可能比用于特定疾病的治療優(yōu)先化。作圖可包括治療和分子譜分析結(jié)果之間的陽性和陰性相關(guān)。在一個非限制性的例子中，一種作圖可以提示使用激酶抑制劑如厄洛替尼對抗在EGFR中具有活化突變的腫瘤，而另一作圖可能提示如果EGFR也具有抗藥性突變，針對該治療。類似地，治療可能顯示在某些基因或蛋白質(zhì)過表達(dá)的細(xì)胞中有效，但是如果基因或蛋白質(zhì)欠表達(dá)則無效。為個體選擇候選治療可基于來自所述方法的任一個或多個的分子譜分析結(jié)果?；蛘?，為個體選擇候選治療可基于來自所述方法中的一種以上的分子譜分析結(jié)果。例如，為個體選擇治療可基于來自單獨(dú)的FISH、單獨(dú)的IHC、或單獨(dú)的微陣列分析的分子譜分析結(jié)果。 在其它實(shí)施方案中，為個體選擇治療可基于來自IHC、FISH和微陣列分析、IHC和FISH、IHC 和微陣列分析、或FISH和微陣列分析的分子譜分析結(jié)果。為個體選擇治療也可基于來自測序或其它突變檢測方法的分子譜分析結(jié)果。分子譜分析結(jié)果可包括突變分析連同一個或多個方法，如IHC、免疫測定和/或微陣列分析?？梢允褂貌煌慕M合或連續(xù)結(jié)果。例如，治療可以根據(jù)通過分子譜分析獲得的結(jié)果進(jìn)行優(yōu)先化。在一個實(shí)施方案中，優(yōu)先化基于以下算法1)IHC/FISH和微陣列指示與第一優(yōu)先級相同的靶標(biāo)；2)單獨(dú)的IHC陽性結(jié)果為下一優(yōu)先級；或幻單獨(dú)的微陣列陽性結(jié)果為最后優(yōu)先級。測序可以用來指導(dǎo)選擇。在一些實(shí)施方案中，測序揭示抗藥性突變，因此不選擇所述藥物，即使包括IHC、微陣列和/或FISH在內(nèi)的技術(shù)顯示靶分子的差異表達(dá)。任何這樣的禁忌，例如，另一基因或基因產(chǎn)物的差異表達(dá)或突變可能放棄治療的選擇。微陣列表達(dá)結(jié)果相對于預(yù)測的治療的一個示例性列表顯示在表1中。進(jìn)行分子譜分析以確定與對照相比樣品中的基因或基因產(chǎn)物是否差異表達(dá)。對照可以是該設(shè)置的任何合適的對照，包括但不限于對照基因如管家基因的表達(dá)水平，相同基因在來自同一或其它個體的健康組織中的表達(dá)、統(tǒng)計學(xué)手段、檢測水平等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，任何適用的分子譜分析技術(shù)(例如，微陣列分析PCR、Q-PCR、RT-PCR、免疫測定、SAGE、IHC、FISH或測序)的結(jié)果可以用來確定表達(dá)狀態(tài)?；蚧蚧虍a(chǎn)物的表達(dá)狀態(tài)用來選擇預(yù)計有效或無效的藥物。例如，表1顯示ADA基因或蛋白質(zhì)的過表達(dá)意味著噴司他丁為可能的治療。另一方面，ADA基因或蛋白質(zhì)的欠表達(dá)涉及對阿糖胞苷的抗性，提示阿糖胞苷不是最佳治療。表1 分子譜分析結(jié)果和預(yù)測的治療
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權(quán)利要求
1. 一種為需要的受試者確定候選治療的方法，包括(a)對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定至少五種蛋白質(zhì)的IHC表達(dá)譜；(b)對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定至少10種基因的微陣列表達(dá)譜；(c)對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定至少一種基因的FISH突變譜；(d)對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定至少一種基因的測序突變譜；和(e)相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較所述IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜，其中所述規(guī)則數(shù)據(jù)庫包含其對癌細(xì)胞的生物活性已知的治療的圖譜，該癌細(xì)胞i.過表達(dá)或欠表達(dá)所述IHC表達(dá)譜中包括的一種或多種蛋白質(zhì)；ii.過表達(dá)或欠表達(dá)所述微陣列表達(dá)譜中包括的一種或多種基因；iii.在所述FISH突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變；和/或iv.在所述測序突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變；和(f)如果滿足以下條件，則確定所述候選治療方法1.步驟(e)中的比較表明該治療應(yīng)當(dāng)對該癌癥具有生物活性；和 .步驟(e)中的比較沒有表明該治療不能用于治療該癌癥。
2.一種為需要的受試者確定候選治療的方法，包括(a)對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析，以確定以下至少5種的IHC表達(dá)譜SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c_kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMl、BCRP、 TOPOl、PTEN、MGMT 禾口 MRPl ；(b)對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定以下至少5種的微陣列表達(dá)譜ABCC1、ABCG2、 ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B、ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLTl、F0LR2、FYN、GART, GNRHl、 GSTPl、HCK, HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT, MLHl、 MS4A1、MSH2、NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、PTEN、PTGS2、RAFl、 RARA, RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、 TNF, TOPI、T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGFA, VHL, YESl 禾P ZAP70 ；(c)對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定EGFR和/或HER2的FISH突變譜；(d)對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定KRAS、BRAF,c-KIT和EGFR中至少一個的測序突變譜；和(e)相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較所述IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜，其中該規(guī)則數(shù)據(jù)庫包含其對癌細(xì)胞的生物活性已知的治療的圖譜，該癌細(xì)胞i.過表達(dá)或欠表達(dá)所述IHC表達(dá)譜中包括的一種或多種蛋白質(zhì)；ii.過表達(dá)或欠表達(dá)所述微陣列表達(dá)譜中包括的一種或多種基因；iii.在所述FISH突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變；和/或iv.在所述測序突變譜中包括的一種或多種基因中沒有突變或具有一個或多個突變；(f)如果滿足以下條件，則確定所述候選治療i.步驟(e)中的比較表明該治療應(yīng)當(dāng)對該癌癥具有生物活性；和 .步驟(e)中的比較沒有表明該治療不能用于治療該癌癥。
3.一種為需要的受試者的癌癥確定候選治療的方法，包括(a)對來自該受試者的樣品進(jìn)行免疫組化(IHC)分析以確定至少下組蛋白質(zhì)的IHC表達(dá)譜SPARC、PGP、Her2/neu、ER、PR、c_kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMl、BCRP、 TOPOl、PTEN、MGMT 禾口 MRPl ；(b)對該樣品進(jìn)行微陣列分析以確定至少下組基因的微陣列表達(dá)譜ABCC1、ABCG2、 ADA、AR、ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、 DNMT3B、ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLTl、F0LR2、FYN、GART, GNRHl、 GSTPl、HCK, HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK, LYN、MGMT, MLHl、 MS4A1、MSH2、NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、PTEN、PTGS2、RAFl、 RARA, RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、 TNF, TOPI、T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGFA, VHL, YESl 禾P ZAP70 ；(c)對該樣品進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析以確定至少下組基因的FISH突變譜 EGFR 禾口 HER2 ；(d)對該樣品進(jìn)行DNA測序以確定至少下組基因的測序突變譜KRAS、BRAF,c_KIT和 EGFR ；禾口(e)相對于規(guī)則數(shù)據(jù)庫比較所述IHC表達(dá)譜、微陣列表達(dá)譜、FISH突變譜和測序突變譜，其中該規(guī)則數(shù)據(jù)庫包含其對癌細(xì)胞的生物活性已知的治療的圖譜，該癌細(xì)胞i.過表達(dá)或欠表達(dá)所述IHC表達(dá)譜中包括的一種或多種蛋白質(zhì)；ii.過表達(dá)或欠表達(dá)所述微陣列表達(dá)譜中包括的一種或多種基因；iii.在所述FISH突變譜中包括的一種或多種基因中具有0個或更多個突變；和/或iv.在所述測序突變譜中包括的一種或多種基因中具有0個或更多個突變；和(f)如果滿足以下條件，則確定所述候選治療i.步驟(e)中的比較表明該治療應(yīng)當(dāng)對該癌癥具有生物活性；和 .步驟(e)中的比較沒有表明該治療不能用于治療該癌癥。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述樣品包括福爾馬林固定的石蠟包埋的(FFPE)組織、新鮮冷凍(FF)組織，或保存核酸或蛋白質(zhì)分子的溶液中包含的組織。
5.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中不進(jìn)行所述微陣列分析、FISH突變分析或測序突變分析中的任一種。
6.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述樣品通過質(zhì)量控制測試。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述質(zhì)量控制測試包括A260/A^0比或RPL13amRNA的 RT-PCR 的 Ct 值。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述質(zhì)量控制測試包括A260/A^0比<1. 5或RPL13a Ct 值> 30。
9.權(quán)利要求2的方法，其中對步驟(a)中所列的生物標(biāo)志物的至少50^^60^^70%, 80%或90%進(jìn)行所述IHC表達(dá)譜分析。
10.權(quán)利要求2的方法，其中對步驟(b)中所列的生物標(biāo)志物的至少50%,60^^70%、80%或90%進(jìn)行所述微陣列表達(dá)譜分析。
11.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中使用低密度微陣列、表達(dá)微陣列、比較基因組雜交 (CGH)微陣列、單核苷酸多態(tài)性(SNP)微陣列、蛋白質(zhì)組陣列或抗體陣列進(jìn)行所述微陣列表達(dá)譜分析。
12.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中至少對SPARC、T0P2A和/或PTEN進(jìn)行所述IHC表達(dá)譜分析。
13.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中至少對⑶52進(jìn)行所述微陣列表達(dá)譜分析。
14.權(quán)利要求2的方法，其中所述IHC表達(dá)譜分析進(jìn)一步包括測定DCK、EGFR、BRCAU CK 14, CK 17, CK 5/6、E-鈣粘著蛋白、p95、PARP-I、SPARC 和 TLE3 中的一種或多種。
15.權(quán)利要求2的方法，其中所述IHC表達(dá)譜分析進(jìn)一步包括測定Cox-2和/或Ki_67。
16.權(quán)利要求2的方法，其中所述微陣列表達(dá)譜分析進(jìn)一步包括測定HSPCA。
17.權(quán)利要求2的方法，其中所述FISH突變譜分析進(jìn)一步包括測定c-Myc和/或 T0P2A。
18.權(quán)利要求2的方法，其中所述測序突變譜分析進(jìn)一步包括測定Pi;3K。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述用于IHC表達(dá)譜分析、微陣列表達(dá)譜分析、FISH突變譜分析和測序突變譜分析的基因獨(dú)立地包括以下一種或多種ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、 ADH1C、ADH4、AGT、雄激素受體、AR、AREG, ASNS, BCL2、BCRP, BDCAl、BIRC5、B-RAF, BRCAl、 BRCA2、CA2、小窩蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Myc、C0X-2、細(xì)胞周期蛋白 Dl、DCK、DHFR、DWTl、DWT3A、DNMT3B、E-鈣粘著蛋白、ECGFl、EGFR、EPHA2、表皮調(diào)節(jié)素、ER、ERBR2、ERCCl、ERCC3、EREG, ESRl、FLT1、葉酸受體、FOLRl、F0LR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRHl、GNRHRl、GSTPl、HCK,HDACl、Her2/ Neu、HGF、HIF1A、HIGl、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IL13RA1、IL2RA、KDR、KIT、K-RAS、LCK、LTB, 淋巴毒素 β 受體、LYN、MGMT, MLHl、MRPl、MS4A1、MSH2、Myc, NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODCU OGFR、p53、p95、PARP-I、PDGFC,PDGFR、PDGFRA,PDGFRB、PGP、PGR、P13K、POLA、POLAl、PPARG, PPARGCU PR、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SPARC MC、 SPARC PC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活蛋白、TK1、TLE3、TNF、TOPI、T0P2A、 T0P2B、TOPO1、T0P02B、拓?fù)洚悩?gòu)酶 II、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、 YESl 禾P ZAP70。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述IHC表達(dá)譜分析包括測定SPARC、PGP、Her2/neu、ER、 PR、c-kit、AR、CD52、PDGFR、T0P2A、TS、ERCCl、RRMl、BCRP、TOPOl、PTEN、MGMT 和 MRPl 中的一種或多種。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述微陣列表達(dá)譜分析包括測定ABCC1、ABCG2、ADA、AR、 ASNS、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、CD33、CD52、CDA、CES2、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、 ECGFl、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERCCl、ERCC3、ESRl、FLTl、F0LR2、FYN、GART、GNRHl、GSTPl、HCK, HDACl、HIF1A、HSP90AA1、IL2RA、HSP90AA1、KDR、KIT、LCK、LYN、MGMT, MLH1、MS4A1、MSH2、 NFKBl、NFKB2、OGFR、PDGFC, PDGFRA, PDGFRB, PGR、POLAl、PTEN、PTGS2、RAFl、RARA, RRMl、 RRM2、RRM2B、RXRB, RXRG, SPARC、SRC、SSTRl、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、TKl、TNF、TOPI、 T0P2A、T0P2B、TXNRDl、TYMS、VDR、VEGFA, VHL, YESl 和 ZAP70 中的一種或多種。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述FISH突變譜分析包括測定EGFR和/或HER2。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述測序突變譜分析包括測定KRAS、BRAF、c-KIT和EGFR 中的一種或多種。
24.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述微陣列表達(dá)分析包括確定一種基因是否相對于參照以統(tǒng)計學(xué)顯著性上調(diào)或下調(diào)。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述統(tǒng)計學(xué)顯著性以小于或等于0.05,0. 01,0. 005、 0. 001,0. 0005 或 0. 0001 的 ρ 值確定。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述ρ值進(jìn)行多重比較校正。
27.權(quán)利要求沈的方法，其中所述多重比較校正包括Bonferroni校正或其改變形式。
28.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述IHC分析包括確定是否所述樣品的30%或更多的染色強(qiáng)度為+2或更高。
29.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述規(guī)則數(shù)據(jù)庫包括表1和/或表2中列出的規(guī)則。
30.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述規(guī)則數(shù)據(jù)庫內(nèi)包含的規(guī)則基于各種治療的有效性，特別是對于靶基因或基因產(chǎn)物的有效性。
31.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中確定候選治療的優(yōu)先化列表。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述優(yōu)先化可包括按照基于微陣列分析和IHC或FISH分析的治療，基于IHC分析而不基于微陣列分析的治療，和基于微陣列分析但不基于IHC分析的治療，將治療從較高優(yōu)先級到較低優(yōu)先級排序。
33.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述治療包括施用一種或多種候選治療劑。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述一種或多種候選治療劑包括5-氟尿嘧啶、阿巴瑞克、阿侖珠單抗、氨魯米特、阿那曲唑、芳香酶抑制劑(阿那曲唑、來曲唑)、天冬酰胺酶、阿司匹林、ATRA、阿扎胞苷、貝伐珠單抗、貝沙羅汀、比卡魯胺、硼替佐米、骨化三醇、卡培他濱、 卡鉬、塞來考昔、西妥昔單抗、化學(xué)內(nèi)分泌治療、膽骨化醇、順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺/ 長春新堿、阿糖胞苷、達(dá)沙替尼、地西他濱、多柔比星、表柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟嘧啶、氟他胺、氟維司群、吉非替尼、吉非替尼和曲妥珠單抗、吉西他濱、 戈那瑞林、戈舍瑞林、羥基脲、伊馬替尼、伊立替康、伊沙匹隆、拉帕替尼、來曲唑、亮丙瑞林、 脂質(zhì)體多柔比星、甲羥孕酮、甲地孕酮、氨甲喋呤、絲裂霉素、nab-紫杉醇、奧曲肽、奧沙利鉬、紫杉醇、帕尼單抗、培門冬酶、培美曲塞、噴司他丁、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、基于他莫昔芬的治療、替莫唑胺、托泊替康、托瑞米芬、曲妥珠單抗、VBMCP/環(huán)磷酰胺、長春新堿， 或其任意組合。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述所述一種或多種候選治療劑包括5FU、貝伐珠單抗、 卡培他濱、西妥昔單抗、西妥昔單抗+吉西他濱、西妥昔單抗+伊立替康、環(huán)磷酰胺、己烯雌酚、多柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟嘧啶、吉西他濱、吉西他濱+依托泊苷、吉西他濱+培美曲塞、伊立替康、伊立替康+索拉非尼、拉帕替尼、拉帕替尼+他莫昔芬、來曲唑、來曲唑+卡培他濱、絲裂霉素、nab-紫杉醇、nab-紫杉醇+吉西他濱、nab-紫杉醇+曲妥珠單抗、奧沙利鉬、奧沙利鉬+5FU+曲妥珠單抗、帕尼單抗、培美曲塞、索拉非尼、舒尼替尼、舒尼替尼、舒尼替尼+絲裂霉素、他莫昔芬、替莫唑胺、替莫唑胺+貝伐珠單抗、替莫唑胺 +索拉非尼、曲妥珠單抗、長春新堿，或其任意組合。
36.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品包含癌細(xì)胞。
37.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述患者以前已經(jīng)用一種或多種治療癌癥的治療劑治療。
38.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述患者以前未用一種或多種步驟(f)中確定的候選治療劑治療。
39.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述癌癥包括轉(zhuǎn)移癌。
40.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述癌癥用原有治療難以治療。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述原有治療包括癌癥的標(biāo)準(zhǔn)治療。
42.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述癌癥包括前列腺癌、肺癌、黑素瘤、小細(xì)胞(食道/腹膜后)癌、膽管上皮癌、間皮瘤、頭頸癌(SCC)、胰腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌、小細(xì)胞、胃癌、腹膜假黏液瘤、肛管癌(SCC)、陰道癌(SCC)、宮頸癌、腎癌、小汗腺腺瘤、唾液腺腺瘤、子宮軟組織肉瘤(子宮)、GIST (胃)或甲狀腺退行發(fā)育性癌。
43.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述癌癥包括以下器官的癌癥附件、鼻竇、中耳和內(nèi)耳、腎上腺、闌尾、造血系統(tǒng)、骨骼和關(guān)節(jié)、脊髓、乳腺、小腦、子宮頸、結(jié)締組織和軟組織、 子宮體、食管、眼、鼻、眼球、輸卵管、肝外膽管、口、肝內(nèi)膽管、腎、闌尾-結(jié)腸、喉、唇、肝、肺和支氣管、淋巴結(jié)、腦、脊柱、鼻軟骨、視網(wǎng)膜、眼、口咽部、內(nèi)分泌腺體、女性生殖器、卵巢、胰腺、陰莖和陰囊、垂體、胸膜、前列腺、直腸腎盂、輸尿管、腹膜、唾液腺、皮膚、小腸、胃、睪丸、 胸腺、甲狀腺、舌、未知的、膀胱、子宮、陰道、陰唇和陰戶的癌癥。
44.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述樣品包含選自下組的細(xì)胞脂肪、腎上腺皮質(zhì)、 腎上腺髓質(zhì)、闌尾、膀胱、血液、血管、骨、軟骨、腦、乳房、軟骨、子宮頸、結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、樹突細(xì)胞、骨骼肌、子宮內(nèi)膜、食道、輸卵管、成纖維細(xì)胞、膽囊、腎、喉、肝、肺、淋巴結(jié)、黑色素細(xì)胞、間皮襯里、肌上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、卵巢、胰腺、腮腺、前列腺、唾液腺、鼻竇組織、骨骼肌、 皮膚、小腸、平滑肌、胃、滑膜、關(guān)節(jié)內(nèi)襯組織、肌腱、睪丸、胸腺、甲狀腺、子宮和子宮體。
45.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述癌癥包括乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、膽管上皮癌、間皮瘤、汗腺癌、或GIST癌。
46.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述患者的無進(jìn)展存活期(Pre)或無病存活期 (DFS)延長。
47.權(quán)利要求46的方法，其中與現(xiàn)有治療相比，PFS或DFS延長至少大約10%、大約 15%、大約20%、大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70%、大約80%、大約 90%或至少大約100%。
48.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中通過候選治療的選擇延長所述患者的壽命。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述患者的壽命延長至少1周、2周、3周、4周、1個月、5 周、6周、7周、8周、2個月、9周、10周、11周、12周、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8 個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、 19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、24個月、2年、2 %年、3年、4年或至少5年。
全文摘要
本申請?zhí)峁┘膊∪绨┌Y的分子譜分析的方法和系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，分子譜分析可以用于確定用于疾病的治療，如最初未被確定為疾病治療或預(yù)期不是特定疾病的治療的治療。
文檔編號G01N33/574GK102439454SQ201080016438
公開日2012年5月2日 申請日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月11日
發(fā)明者A·賴特, A·阿拉康, C·庫斯利施, D·D·范霍夫, D·M·洛伊施, M·J·麥金尼斯, R·J·潘尼, R·P·本德, T·波洛維斯基 申請人:卡里斯Mpi公司