專利名稱：便潛血快速診斷的層析試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及免疫膠體金法和化學法相結合，且兩種方法通過一點上樣，兩種 路徑分別實現免疫膠體金法和化學法的檢測，通過兩層上樣墊和中間的一層隔離帶而使得 兩種方法互不影響的一步法快速診斷層析試紙及其制備方法。
背景技術：
糞便的潛血檢查，是指消化道出血量很少，肉眼不見血色，而且少量紅細胞又被消 化分解以致顯微鏡下也無從發(fā)現的出血狀況。隱血便消化道少量出血可不引起大便顏色改 變，只有靠大便隱血試驗才能確定。凡是消化道疾病引起少量出血的，均可有隱血便，因此 潛血檢查對于診斷多種消化道出血性疾病都有重要價值，是普查篩選消化道疾病的有效手 段，潛血實驗已經成為人們不斷深入研究的熱點。大便潛血的主要檢測方法有化學法和免疫學方法化學法種類繁多，常用的有鄰甲苯胺法、還原酚酞法、聯苯胺法、匹拉米洞法、愈創(chuàng) 木脂法。其實驗設計原理都是基于人血紅蛋白中的含鐵血黃素部分有催化過氧化物分解的 作用，能催化試劑中的過氧化物，分解釋放新生態(tài)的氧，氧化上述色原物質而呈色，呈色的 深淺反映血紅蛋白的多少。但是化學法缺乏準確性和特異性。外源性食物食品中如含有血 紅蛋白、肌紅蛋白，其血紅素的作用均可以使實驗呈陽性，大量生食蔬菜中含有活性的植物 過氧化物也可催化過氧化物分解，出現假陽性反應。血液在腸道中停留過久，血紅蛋白變 性，則會出現與病情不符的陰性結果。此外，如果病人服用大量的維生素C或其他具有還原 性的藥物，在實驗中可將過氧化物還原，從而不能氧化色原物質，也可使實驗出現假陰性。免疫學方法主要包括免疫單抗法、免疫斑點法、膠乳免疫化學凝聚法、放射免疫擴 散法、反向間接血凝法、膠體金標記夾心免疫檢驗法等。此類試驗所用抗體分為兩大類，即 抗人血紅蛋白抗體和抗人紅細胞基質抗體，目前一般都采用抗人血紅蛋白抗體。近年來研 發(fā)的膠體金免疫層析法，將單克隆技術與膠體金技術結合，利用抗人血紅蛋白的單克隆抗 體與人血紅蛋白可以高度特異性結合的特點來檢測糞便隱血。此法不受動物的血、肉、含過 氧化物酶的新鮮蔬菜、鐵劑、維生素C的影響，靈敏度高，反應快速，在臨床各類疾病導致出 血的診斷中起到了較好的效果。用單克隆雙抗體夾心膠體金顯色技術，以試紙條一步法檢 測便隱血，方法簡單、快速，具有很好的靈敏度和特異性。膠體金免疫層析試紙條因具有體 積小、攜帶方便、不需要儀器設備、操作簡單、可現場檢測、3 lOmin出結果及結果可由肉 眼根據T線顏色深淺判斷等諸多優(yōu)點而被廣泛應用。膠體金免疫層析法融合了免疫層析技 術和膠體金顯色的原理，為特異快速的檢測糞便潛血建立了一種新的免疫學方法。該法是 利用纖維膜的毛細作用，使待測物抗原沿表面向前運動，與待測區(qū)標記的捕獲物特異結合 而聚集顯色。免疫層析一步法目前一般是用抗人血紅蛋白抗體來特異性結合人血紅蛋白抗 原，此法簡便、快速，只特異地針對人血紅蛋白抗原表位，基本排除了飲食及藥物等因素的 干擾，被世界衛(wèi)生組織胃腸鏡檢查協會推薦作為糞便潛血試驗的一種較為確認的方法。免 疫膠體金法隱血試驗有一定的靈敏度，高于或低于此范圍均可出現假陰性。單克隆抗體膠
3體金法在檢測消化道出血有時候會漏診，其原因主要有①血紅蛋白經過消化酶降解而變性，已不具有原來的免疫原性；②過量的大出血而致使反應體系中抗原過剩，出現后帶現象；③病人的血紅蛋白抗原與單克隆抗體不匹配。到目前為止，單一的大便潛血FOB診斷方法的靈敏度和特異性都有待進一步提 高。臨床上往往需要兩種或以上的方法聯合檢測。目前市場上已有相關的聯全檢測試劑出 現。然而本專利涉及的采用膠體金免疫法和化學法結合檢測糞便潛血方法和其它聯測方法 不同，能提高消化道出血的檢出率，并且為一步法，操作簡便。
發(fā)明內容本實用新型目的是提供一種簡便、準確、快捷、靈敏度和特異性高、適合于臨床診 斷或篩查用的便潛血快速診斷試紙及其制備方法。本實用新型免疫法運用雙抗體夾心免疫層析技術實現對被檢樣品中人血紅蛋白 抗原的檢測，提供一種便潛血快速診斷的層析試紙，其特征在于在塑料支撐板7上緊密連 接硝酸纖維素NC膜4，硝酸纖維素NC膜4包被有相互分離的檢測T線9和質控C線10，所 述T線為包被在NC膜上的人血紅蛋白單抗，所述C線為包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗體； 在硝酸纖維素NC膜4的一端搭接吸樣墊5，硝酸纖維素NC膜4的另一端搭接含有標記人血 紅蛋白單抗的膠體金墊8，膠體金墊8的另一端搭接上樣墊26，上樣墊26及膠體金墊8上 搭接隔離帶3，隔離帶3連接上樣墊11，上樣墊11 一端緊密搭接化學法便潛血檢測試紙2 構成試紙。所述的便潛血快速診斷的層析試紙，其特征在于所述的上樣墊11、上樣墊26為無 紡布，吸樣墊5由吸水濾紙構成。本實用新型化學法設計原理是基于人血紅蛋白中的含鐵血黃素部分有催化過氧 化物分解的作用，能催化試劑中的過氧化物，分解釋放新生態(tài)的氧，氧化上述色原物質而呈 色，呈色的深淺反映血紅蛋白的多少。對于化學法的檢測，化學法便潛血檢測試紙與上樣墊 11粘貼在一起，兩層上樣墊之間還粘有隔離帶防止液體滲透以免兩種方法相互影響。試紙 的上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成?？贵w的包被方法為以0. 01M pH 7. 2磷酸鹽緩沖液PBS將人血紅蛋白單抗配制成 2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以1. Oul/cm的參數進行劃線，包被T線，同時在NC膜 上部包被羊抗鼠IgG作為C線。劃線后將NC膜在干燥間溫度20-25°C，濕度小于30%干燥 8-10小時，備用。人血紅蛋白單抗標記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直 徑為30-50nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金液放在燒杯內，用0. 2M K2C03調 至pH7. 6，按100ml膠體金溶液加入1. Omg人血紅蛋白單抗，室溫攪拌1小時，加入封閉劑， 封閉20min，10000r/m離心20分鐘，棄上清，用膠體金工作液復溶至66. 7ml，按1ml溶液鋪 22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間溫度20-25°C，濕度小于30% 干燥2-4小時，制成膠體金墊，備用?；瘜W法便潛血檢測試紙條中含有6. 6% w/w過氧化羥基異丙苯，4. 0w/w四甲基聯 苯胺；89. 4w/w緩沖液和非反應物質。[0017]試紙條的裝配方法為在干燥室內溫度20_25°C，濕度小于30%，取塑料支撐板， 將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接膠體金墊搭膠體金 墊的三分之一粘貼，在膠體金墊另一側搭接上樣墊11和上樣墊26搭上樣墊的十分之一；在 膠體金墊上粘貼一層隔離帶壓NC膜1mm ；在NC膜C線一側搭接吸樣墊搭吸樣墊的十分之 一；于隔離帶上化學法便潛血檢測試紙1/2緊壓上樣墊11 ；最上面貼一層標志膜，最后用裁 剪機將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。檢測方法為將混勻后的樣本平衡至室溫，將試紙條插入盛有待檢樣本的小試管 中，樣本向上滲透，對于化學法的檢測結果，1分鐘內根據便潛血診斷試紙的顏色變化判讀 結果；對于免疫膠體金法，在3-10分鐘內用肉眼直接觀察C、T線的出現情況，并判定檢測結 果。最后結合兩種檢測方法的結果判定最終檢測結果。本實用新型的有益效果是采用免疫膠體金法和化學法結合制備便潛血快速診斷 層析試紙，兩種方法通過一點上樣，兩種路徑分別實現免疫膠體金法和化學法的檢測。兩層 上樣墊，且中間粘有一層隔離帶使得兩種方法互不影響，且采用一步上樣，方便、快捷。采用 雙聯法使試紙的性能比單純的膠體金法或化學法提高一個等級，使快速診斷試劑的靈敏度 和準確度達到一個新的水平；該試紙用于消化道類疾病的篩查或臨床診斷，具有敏感性高、 特異性強、操作簡便、反應快速、適合現場檢測和經濟實用等優(yōu)點。

[0020]圖1便潛血快速診斷層析試紙結構示意圖。[0021]附圖符號說明[0022]1 上樣墊1 ；2 化學法便潛血檢測試紙[0023]3:隔離帶；4:硝酸纖維素NC膜；[0024]5 吸樣墊；6:上樣墊2;[0025]7 塑料支撐板；8 膠體金墊；[0026]9 檢測線；10 質控線；
具體實施方式
實施例制備便潛血快速診斷層析試紙1主要材料1. 1人血紅蛋白單抗為上海至亨生物科技有限公司提供，用于標記膠體金顆粒； 另一人血紅蛋白單抗上海至亨生物科技有限公司提供，用于NC膜包被；氯金酸Sigma公 司產品，用于空白金制備；檸檬酸三鈉Sigma公司出品，用于空白金制備；硝酸纖維素NC 膜Millip0re公司產品；牛血清白蛋白BSA，聚乙二醇PEG20000，Sigma公司產品，用于膠 體金封閉；其它常用試劑均為分析純試劑。1. 2氰化高鐵血紅蛋白標準液中國藥品生物制品檢定所產品。2 方法2. 1人血紅蛋白單抗的膠體金標記氯金酸_檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40nm 的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2M K2C03將溶液調到pH6. 0、pH7. 6和 PH9. 0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100ml溶液0. 5mg、l. OmgU. 5mg人血
5紅蛋白單抗緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌1小時，再加入2%體積20% m/V牛血清白 蛋白BSA，體積20% m/V聚乙二醇PEG20000進行封閉20min。標記結束后10000r/m離 心20min，棄上清，沉淀按原體積復溶至不同配比的膠體金稀釋液tris-HCl緩沖液，pH7. 3， 含酪蛋白，蔗糖和表面活性劑中。然后將標記膠體金溶液按1ml溶液鋪22cm2的比例加樣 于無紡布上，在溫度20-25°C，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-4小時，制成膠體金墊，干 燥備用o2. 2人血紅蛋白單抗的包被用0.01M pH7. 2PBS將人血紅蛋白單抗分別稀釋成 1. 5mg/ml、2. 0mg/ml、2. 5mg/ml，然后用噴膜儀將人血紅蛋白單抗在NC膜上按1. Oul/cm進 行劃線包被，同時在NC膜上包被抗羊抗鼠IgG抗體，用于產品的質控，包被完成后將NC膜 在干燥間干燥8-10小時，備用。2. 3化學法便潛血檢測試紙中含有6. 6% w/w過氧化羥基 異丙苯，4. 0% w/w四甲基聯苯胺；89. 4% w/w緩沖液和非反應物質，制備完成后切成5mm寬 試紙條備用。2. 4便潛血快速診斷試紙條的組裝在干燥室內溫度20_25°C，濕度小于30%，取塑 料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接膠體金墊 搭膠體金墊的三分之一粘貼，在膠體金墊另一側搭接上樣墊11和上樣墊26搭上樣墊的十 分之一；在膠體金墊上粘貼一層隔離帶壓NC膜1mm ；在NC膜C線一側搭接吸樣墊搭吸樣墊 的十分之一；于隔離帶上化學法便潛血檢測試紙1/2緊壓上樣墊11 ；最上面貼一層標志膜， 最后用裁剪機將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。2. 5檢測原理和方法將混勻后的樣本平衡至室溫，將制備好的試紙條插入盛有待 檢樣本的小試管中，若樣品中含人血紅蛋白，則和膠體金墊上標記人血紅蛋白單抗的膠體 金結合，形成復合物，并擴散到NC膜上進一步層析，當遇到包被在NC膜上T線處的另一人 血紅蛋白單抗時，復合物則又和包被人血紅蛋白的單抗結合，被捕獲在包被處，當被捕獲的 膠體金復合物達到一定數量時，則形成一條肉眼可見的T線；若樣本中不含人血紅蛋白，則 不能形成免疫復合物，亦不能形成T線，C線作為試劑的質控標準，陽性和陰性樣品檢測時 均會出現。用肉眼直接觀察在1、5、10和15分鐘內C、T線的出現情況，并判定檢測結果。對 于化學法，若樣品中含有一定量的人血紅蛋白，人血紅蛋白中的含鐵血黃素部分可以催化 過氧化物分解釋放新生態(tài)的氧，氧化四甲基聯苯胺而呈色，呈色的深淺反映人血紅蛋白的 多少，用肉眼直接觀察在30秒、1分鐘和5分鐘內試紙的顏色變化情況，并判定檢測結果。最后結合兩種檢測方法的結果判定最終檢測結果。2. 6反應體系工藝評價方法研制產品制備小樣后，以氰化高鐵血紅蛋白標準液為 質控品，進行檢測，確定最佳的產品反應體系和工藝路線。3 結果3. 1根據小樣的檢測結果，確定了試紙的最佳標記pH值為7.6 ；人血紅蛋白單抗的 最佳標記量為lmg每100ml膠體金溶液；最佳的膠體金稀釋液為Tris-HCl緩沖液，pH7. 3， 含0. 5%的酪蛋白，5%蔗糖，l^Tween 20 ；最佳的人血紅蛋白單抗包被濃度為2mg/ml。檢 測結果的最佳判定時間免疫法為在5分鐘內判定，化學法為在1分鐘內判定。3. 2臨床樣本檢測，以已商品化的試劑為對照，50份FOB陽性樣本中，本試劑檢測 出陽性49份，靈敏度為98%，50份FOB陰性樣本中，本試劑檢測均為陰性，特異性為100%。
權利要求一種便潛血快速診斷的層析試紙，其特征在于在塑料支撐板(7)上緊密連接硝酸纖維素(NC)膜(4)，硝酸纖維素(NC)膜(4)包被有相互分離的檢測(T)線(9)和質控(C)線(10)，所述T線為包被在NC膜上的人血紅蛋白單抗，所述C線為包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗體；在硝酸纖維素(NC)膜(4)的一端搭接吸樣墊(5)，硝酸纖維素(NC)膜(4)的另一端搭接含有標記人血紅蛋白單抗的膠體金墊(8)，膠體金墊(8)的另一端搭接上樣墊2(6)，上樣墊2(6)及膠體金墊(8)上搭接隔離帶(3)，隔離帶(3)連接上樣墊1(1)，上樣墊1(1)一端緊密搭接化學法便潛血檢測試紙(2)構成試紙。
2.根據權利要求1所述的便潛血快速診斷的層析試紙，其特征在于所述的上樣墊 1(1)、上樣墊2 (6)為無紡布，吸樣墊(5)由吸水濾紙構成。
專利摘要本實用新型公開了一種便潛血快速診斷的層析試紙，其在在塑料支撐板上緊密連接硝酸纖維素NC膜，硝酸纖維素NC膜包被有相互分離的檢測T線和質控C線，所述T線為包被在NC膜上的人血紅蛋白單抗，所述C線為包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗體；在硝酸纖維素NC膜的一端搭接吸樣墊，硝酸纖維素NC膜的另一端搭接含有標記人血紅蛋白單抗的膠體金墊，膠體金墊的另一端搭接上樣墊2，上樣墊2及膠體金墊上搭接隔離帶，隔離帶連接上樣墊1，上樣墊1一端緊密搭接化學法便潛血檢測試紙構成，用于消化道類疾病的篩查或臨床診斷，具有敏感性高、特異性強、準確度高、操作簡便、反應快速、適合現場檢測和經濟實用等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/72GK201607444SQ20102915102
公開日2010年10月13日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權日2010年2月8日
發(fā)明者劉圍, 李洲, 楊發(fā)青 申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司