專利名稱：一種檢測乳品中黃曲霉毒素m1的試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測乳品中的黃曲霉毒素Ml的試劑板，特別是一種檢測乳品中黃曲霉毒素Ml的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)屬真菌毒素(Mycotoxin)，它主要是由黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的，其他曲霉如片霉、青霉、鐮孢霉、根霉等也可產(chǎn)生AFT，AFT常見于花生及其制品、玉米、棉籽，以及一些堅果類食品和飼料中。1993年AFT被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定一類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒素物質(zhì)。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，霉菌影響世界上 40%的食品作物，并在代謝過程中產(chǎn)生毒素。聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計全世界谷物供應(yīng)的25% 受霉菌毒素污染。據(jù)報道全世界每年至少有2%的農(nóng)作物因污染黃曲霉毒素而報廢。動物牲畜食用被黃曲霉毒素污染的飼料后，在其泌乳中發(fā)現(xiàn)有黃曲霉毒素Ml殘留。黃曲霉毒素危害性大，存在范圍廣，醫(yī)學(xué)專家指出黃曲霉毒素的最短致癌時間僅為M周。為了預(yù)防黃曲霉毒素中毒事件的發(fā)生，維護(hù)人類健康，世界上已有70多個國家和地區(qū)對食品中黃曲霉毒素的含量作了嚴(yán)格限量要求。美國聯(lián)邦政府有關(guān)法律規(guī)定，人類消費的牛奶中Ml的含量不能超過0. 5μ g/kg， 其他動物飼料中的含量不能超過300 μ g/kg。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》的規(guī)定，鮮乳和乳制品中黃曲霉毒素Ml不得超過0. 5 μ g/kg。目前檢測乳品中黃曲霉毒素的方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法 (HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。薄層色譜法是檢測黃曲霉毒素的傳統(tǒng)常用方法，是應(yīng)用最早、最廣的分析技術(shù)，曾是我國測定黃曲霉毒素的國家標(biāo)準(zhǔn)方法之一。該方法的優(yōu)點在于所用的試劑、設(shè)備簡單，費用低廉，容易掌握，適用大量樣品的分離、篩選，一般的實驗室均可開展。但是薄層色譜法檢測黃曲霉毒素靈敏度低、重現(xiàn)差、操作煩瑣、時間長且安全性差等缺點，已越來越不適用現(xiàn)代分析的要求。高效液相色譜法是目前國內(nèi)測定黃曲霉毒素使用最多、也是比較權(quán)威的方法，目前有國家標(biāo)準(zhǔn)出臺，靈敏度高、精度高、能同時分析多種黃曲霉毒素類型。但該法的樣品前處理相對復(fù)雜，檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多、操作時需要專門的技術(shù)人員，難以滿足現(xiàn)代檢測快速、簡捷、現(xiàn)場化的要求。酶聯(lián)免疫吸附法是應(yīng)用抗原抗體特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用來測定黃曲霉毒素含量的免疫分析方法，具有特異性高、靈敏度高、快速、簡便等優(yōu)點。但是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，由此易造成測定結(jié)果重復(fù)性較差。此外ELISA試劑壽命短，因此需要低溫保藏，而且該法在配制標(biāo)準(zhǔn)曲線時需要接觸到黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，操作不安全。

實用新型內(nèi)容本實用新型針對乳制品中的黃曲霉毒素Ml殘留開展研究，提供一種用于現(xiàn)場快速篩選黃曲霉毒素陽性樣本的免疫膠體金快速檢測試劑板。本實用新型具有簡單、快速、靈敏度高等特點，無須儀器設(shè)備配合測定，檢測既可在實驗室中進(jìn)行，也可在進(jìn)行實地測定， 5 IOmin完成對樣品中黃曲霉毒素Ml的定性和半定量測定。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。其中樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進(jìn)行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應(yīng)時間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體順利發(fā)生反應(yīng)。膠體金結(jié)合墊上包被有抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有黃曲霉毒素Ml-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠 IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯(lián)黃曲霉毒素Ml的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、 卵清蛋白(OVA)、血藍(lán)蛋白(KLH)。本實用新型試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測乳制品中的黃曲霉毒素Ml殘留。如果樣品溶液含有黃曲霉毒素Ml殘留，黃曲霉毒素Ml先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的黃曲霉毒素Ml占據(jù)而無法與檢測線上黃曲霉毒素Ml特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的黃曲霉毒素Ml含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中黃曲霉毒素Ml 含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。本實用新型試劑板的各部分組成成分與功能如下塑料模板，起固定試紙條及標(biāo)示功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液PH值的作用。膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，其上標(biāo)記有抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，是樣品溶液中的有效成分與金標(biāo)抗體發(fā)生反應(yīng)的場所。硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本實用新型試劑板的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體對黃曲霉毒素Ml 的交叉反應(yīng)率均為100%，與其他種類的抗生素包括玉米赤霉烯酮、伏馬霉素、赭曲霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等藥物沒有交叉反應(yīng)。(2)靈敏度高。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2005《食品中真菌毒素限量》的規(guī)定， 我國食品中黃曲霉毒素Ml允許量標(biāo)準(zhǔn)為鮮乳及乳制品中黃曲霉毒素Ml限量不得超過 0. 5 μ g/kg。本實用新型試劑板的靈敏度可達(dá)到0. 5 μ g/kg，完全可以滿足市場的檢測需求。(3)操作簡便快速。本實用新型試劑板將免疫層析反應(yīng)所需的大部分原料已整合到試劑條中，滴樣后抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短了檢樣時間，滴樣后5
410分鐘內(nèi)即可讀取結(jié)果。本實用新型試劑板的操作不需任何專業(yè)培訓(xùn)，普通人員均可操作， 只需按說明滴樣后用肉眼判讀即可。(4)不依賴于實驗設(shè)備。本實用新型試劑板在直接滴樣跑板后，通過肉眼判斷硝酸纖維素膜上檢測線和控制線的顏色深淺對比來判讀結(jié)果，整個檢測過程無需用到任何實驗設(shè)備，真正做到了對實驗設(shè)備零要求，尤其適合于野外及現(xiàn)場操作，易于推廣。(5)成本低，效益好。本實用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡單，可實現(xiàn)單個樣本檢測，生產(chǎn)成本低，大大降低了檢測費用。

圖1為黃曲霉毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊，2 為膠體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為 PVC 板。圖2為黃曲霉毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔， C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為黃曲霉毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。
具體實施方式
本實用新型試劑板的制備包括黃曲霉毒素Ml載體蛋白偶聯(lián)物的制備、抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備、膠體金溶液、膠體金標(biāo)記抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備和黃曲霉素毒素免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。1.黃曲霉毒素Ml與載體蛋白的偶聯(lián)采用碳二亞胺法(EDC法)將黃曲霉毒素Ml與載體蛋白(牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA)偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原。稱取2mg黃曲霉毒素Ml和^ig CM0，溶解于400 μ L吡啶中，25°C避光振搖反應(yīng)。 直至反應(yīng)完全。將反應(yīng)產(chǎn)物冷凍干燥，所得殘渣用3mL超純水溶解，用0. lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至8. 0。分3次加入IOmL苯(4mL、3mL、3mL)，振蕩萃取有機(jī)相中未反應(yīng)的黃曲霉毒素Ml。在水相中滴加0. lmol/L稀鹽酸調(diào)pH值至3.0，得沉淀，用乙酸乙酯抽提沉淀物， 真空干燥得中間產(chǎn)物黃曲霉毒素Ml肟。稱取0.ang黃曲霉毒素Ml 肟，溶于 100 μ L DMF_^K (6 9，V/V)中，加入 2mg EDC, 避光混勻。再加入0. 5% C-BSA溶液，25°C避光、100r/min反應(yīng)4h，補(bǔ)加EDC 2mg，繼續(xù)反應(yīng)。將偶聯(lián)產(chǎn)物裝入透析袋，在O.Olmol/L PBS (pH 7.4)中置4°C透析3d，期間換透析液3 次(每24h更換一次)。用OVA替代BSA，采用同樣方法制備黃曲霉毒素Ml-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的黃曲霉毒素Ml-BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫1次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。[0037]融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩選擇10mg/L黃曲霉毒素Ml-BSA包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，0PD顯色。篩選出的陽性孔再用黃曲霉毒素Ml-卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L黃曲霉毒素Ml溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (0. 01mol/L、pH7. 4)替代黃曲霉毒素Ml溶液作對照，其余步驟同上。若黃曲霉毒素Ml阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X IOVmL時停止換液，細(xì)胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個細(xì)胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備取已制備好的膠體金溶液IOOmL,用0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8. 0。邊攪拌邊加入2mg抗黃曲霉毒素Ml單抗，攪拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇 20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min，棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4 的 PBS 緩沖液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用IOmL #2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4) 溶解，用0. 22 μ m無菌過濾器過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.黃曲霉毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝用點膜機(jī)把適當(dāng)濃度的黃曲霉毒素Ml-載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥他。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記黃曲霉毒素Ml單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.黃曲霉毒素Ml免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. 1樣品制備打開溫浴器電源及加熱開關(guān)，預(yù)熱，使加樣槽實際溫度維持在50°C左右，將盛有原奶的的離心管和試劑板放于試管架上預(yù)熱5分鐘，移液器取100 μ L預(yù)熱的原奶加入酶標(biāo)孔中，用滴管將孔中金標(biāo)充分混勻，反應(yīng)1分鐘，靜置待檢。6. 2檢測步驟吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結(jié)果應(yīng)在3 5min 讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結(jié)果判斷讀取結(jié)果時，將試劑板水平置于觀察者正面。陰性㈠T線顯色(檢測線，靠近加樣孔一端)比C線(控制線)深或一樣深，表示樣品中黃曲霉毒素Ml殘留含量低于檢測限或不含黃曲霉毒素Ml殘留。陽性⑴Τ線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中黃曲霉毒素Ml殘留含量
6高于檢測限，T線顯色比C線越淺，表示樣品中黃曲霉毒素Ml含量越高。 無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新
的試劑板重新測試。
權(quán)利要求1.一種檢測乳品中黃曲霉毒素Ml的試劑板，由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其特征在于樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各部分之間有l(wèi)_2mm的重疊，膠體金結(jié)合墊上包被有抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有黃曲霉毒素Ml載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和控制線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于偶聯(lián)黃曲霉毒素Ml的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于背襯為一面涂有不干膠的PVC板，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測乳品中黃曲霉毒素M1的試劑板，可用于檢測乳品中的黃曲霉毒素M1。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需20min，且無需任何昂貴實驗設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門、檢驗檢疫機(jī)構(gòu)、奶站以及乳制品生產(chǎn)加工企業(yè)對原料及產(chǎn)品中的黃曲霉毒素M1進(jìn)行大規(guī)模快速檢測。
文檔編號G01N33/577GK202033368SQ20102069572
公開日2011年11月9日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者周崇盈, 張少恩, 桑麗雅 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司