專利名稱：一種熒光顯微成像系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于光學(xué)成像應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種熒光顯微成像方法及成像系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
熒光顯微鏡是利用特定波長(zhǎng)的光照射被檢物，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置的一種顯微光學(xué)檢測(cè)技術(shù)，迄今已有100多年的歷史。近年來，由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH (Fluorescence Situ Hybridization，熒光原位雜交)、GFP (Green Fluorescent Protein，綠色熒光蛋白)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，以及顯微照相、數(shù)字CXD (Charge Coupled Device,電荷耦合器件)成像等技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng)，賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。近代熒光顯微鏡多是在復(fù)式顯微鏡的架構(gòu)上安裝熒光裝置集合而成，熒光裝置包括照明系統(tǒng)、濾光片系統(tǒng)和顯微鏡三部分。在熒光顯微成像中，激發(fā)光照射到樣品后，一部分激發(fā)光被樣品吸收，用于激發(fā)樣品分子內(nèi)的電子躍遷到較高能級(jí)軌道使分子進(jìn)入激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子通過釋放出相應(yīng)較低能量的熒光回到基態(tài)；另一部分激發(fā)光對(duì)產(chǎn)生熒光信號(hào)沒有貢獻(xiàn)，只在樣品上發(fā)生反射或透射，結(jié)果導(dǎo)致熒光信號(hào)淹沒在較強(qiáng)的激發(fā)光當(dāng)中。因此熒光顯微鏡的成像質(zhì)量在一定程度上也取決于對(duì)激發(fā)光的濾波效果。根據(jù)熒光與激發(fā)光波長(zhǎng)的差異，可采用頻率濾波方法來濾除激發(fā)光，提取熒光信號(hào)，目前熒光顯微鏡均采用此方法。但這種方法對(duì)熒光和激發(fā)光的波長(zhǎng)有嚴(yán)重的依賴性，導(dǎo)致熒光顯微鏡的使用受到激發(fā)光與熒光的波長(zhǎng)限制，當(dāng)激發(fā)光或熒光波長(zhǎng)變化時(shí)，需要更換相適應(yīng)的濾波片；當(dāng)激發(fā)光為白光或?qū)拵Ч庠磿r(shí)，若激發(fā)光與熒光在波長(zhǎng)上有重疊，采用傳統(tǒng)的頻率濾波法無能為力。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型目的在于提供一種熒光顯微成像方法，旨在解決現(xiàn)有的熒光顯微成像方法對(duì)激發(fā)光與熒光的波長(zhǎng)具有嚴(yán)重依賴性的缺陷。本實(shí)用新型采用了一種新型的熒光濾波方案，基于激發(fā)光與熒光偏振態(tài)的差異來濾除激發(fā)光，提取熒光信號(hào)。本實(shí)用新型是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種熒光顯微成像系統(tǒng)，包括線偏振光產(chǎn)生單元、分光鏡、物鏡、偏振方向與所述線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光的偏振態(tài)正交的第一偏振片以及CCD攝相機(jī)；所述線偏振光產(chǎn)生單元位于所述分光鏡的入射面的一側(cè)，所述物鏡位于所述分光鏡的反射光出光側(cè)，所述第一偏振片以及所述CCD攝相機(jī)依次位于所述分光鏡的透射光出光側(cè)。進(jìn)一步地，所述線偏振光產(chǎn)生單元進(jìn)一步包括
3[0010]產(chǎn)生激發(fā)光的光源和配合所述光源獲得線偏振激發(fā)光的第二偏振片。進(jìn)一步地，所述成像系統(tǒng)還包括一透鏡組件，樣品與所述C⑶相機(jī)相對(duì)于所述透鏡組件與物鏡組成的透鏡組的位置滿足物像關(guān)系。進(jìn)一步地，所述分光鏡為偏振分光鏡。進(jìn)一步地，所述分光鏡替換為雙色鏡，所述雙色鏡鍍有激發(fā)光高反射膜和熒光增透膜。進(jìn)一步地，所述系統(tǒng)還包括一旋光器件，所述旋光器件位于所述線偏振光產(chǎn)生單元與所述第一偏振片之間，所述線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光，經(jīng)過旋光器件作用后，激發(fā)光的偏振方向垂直于所述第一偏振片的偏振方向。在本實(shí)用新型中，有別于傳統(tǒng)技術(shù)中，根據(jù)激發(fā)光與熒光在波長(zhǎng)上的差異濾除激發(fā)光，而是基于激發(fā)光與熒光在偏振態(tài)上的差異，利用偏振器件過濾激發(fā)光，提取熒光，不受激發(fā)光與熒光波長(zhǎng)的限制，適合于不同波長(zhǎng)的激發(fā)光與熒光。

圖1是本實(shí)用新型實(shí)施例提供的熒光顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)原理圖；圖2是圖1所示成像系統(tǒng)的提取熒光信號(hào)原理的簡(jiǎn)化示意圖；圖3是本實(shí)用新型實(shí)施例提供的熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其對(duì)比圖。
具體實(shí)施方式
為了使本實(shí)用新型的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，
以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本實(shí)用新型，并不用于限定本實(shí)用新型。在本實(shí)用新型實(shí)施例中，從激發(fā)光與熒光在偏振態(tài)上的存在差異這一特性出發(fā)， 利用偏振器件過濾激發(fā)光、提取熒光，不受激發(fā)光與熒光波長(zhǎng)的限制。圖1示出了本實(shí)用新型實(shí)施例提供的熒光顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖，為了便于說明，圖中僅給出了與本實(shí)用新型實(shí)施例相關(guān)的部分。參照?qǐng)D1，本實(shí)用新型實(shí)施例提供的熒光顯微成像系統(tǒng)至少需包括線偏振光產(chǎn)生單元、分光鏡BS、物鏡0、第一偏振片Pl以及CCD相機(jī)，線偏振光產(chǎn)生單元位于分光鏡BS的入射面的一側(cè)，物鏡0位于分光鏡BS的反射光出光側(cè)，第一偏振片Pl以及CCD攝相機(jī)依次位于分光鏡BS的透射光出光側(cè)。其中線偏振光產(chǎn)生單元用于產(chǎn)生線偏振激發(fā)光(圖1中以虛線表示)，第一偏振片Pl的偏振態(tài)與所述線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光的偏振態(tài)為正交關(guān)系，因此線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光無法通過第一偏振片P1。分光鏡BS用于反射經(jīng)過它的線偏振激發(fā)光，被反射后的激發(fā)光經(jīng)過物鏡0后照射到樣品S上。樣品S中的分子由于被激發(fā)光激勵(lì)，電子躍遷到較高能級(jí)軌道使分子進(jìn)入激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的分子重新回到基態(tài)時(shí)釋放出熒光。熒光為自然光，不再保持著原來激發(fā)光的偏振態(tài)。由于激發(fā)光沒有完全被樣品吸收，其中一部分照射到樣品S后，被反射回去，對(duì)產(chǎn)生熒光信號(hào)沒有貢獻(xiàn)。這部分激發(fā)光經(jīng)過樣品S處發(fā)生反射后，其偏振態(tài)幾乎保持不變，仍為線偏振光，它將被偏振分光鏡、第一偏振片Pl雙層過濾，無法到達(dá)CCD相機(jī)。樣品S上產(chǎn)生的熒光，由于其偏振態(tài)為自然偏振或接近于自然偏振，偏振態(tài)與激發(fā)光相垂直的熒光能
4順利透射過分光鏡BS與第一偏振片Pl后，被CCD相機(jī)接收。進(jìn)一步地，線偏振光產(chǎn)生單元包括光源和第二偏振片P2，光源用于產(chǎn)生激發(fā)光，第二偏振片P2配合所述光源獲得線偏振激發(fā)光。應(yīng)當(dāng)理解，若光源可以直接發(fā)出線偏振光， 可以將第二偏振片P2省略。將圖1中的光路展開，得到如圖2所示的光路原理簡(jiǎn)化示意圖，其中，參考面1上的帶箭頭的虛線和參考面2帶箭頭的實(shí)線表示光的偏振方向，而偏振片P1、偏振片P2上的帶箭頭的實(shí)線表示偏振片P1、偏振片P2的偏振方向，樣品S上的帶箭頭的虛線表示線偏振光的偏振方向，實(shí)線為熒光方向。具體地，參考面1位置為激發(fā)光(帶箭頭的虛線表示激發(fā)光，箭頭表示偏振方向)入射第二偏振片P2前的任意一位置，激發(fā)光的偏振態(tài)為自然偏振， 經(jīng)過第二偏振片P2 (若如圖中垂直偏振放置)后，入射到樣品S上的激發(fā)光為線偏振光。樣品S被激發(fā)光激發(fā)后，輻射出熒光信號(hào)(帶箭頭實(shí)線表示熒光，箭頭表示偏振方向)，熒光為自然光或接近自然光。由于第一偏振片Pl與第二偏振片P2正交，激發(fā)光經(jīng)過第一偏振片Pl時(shí)由于其偏振方向與偏振片偏振方向垂直而被過濾掉。樣品S被激發(fā)所產(chǎn)生的熒光為自然光，其中偏振態(tài)平行與第一偏振片Pl的那部分熒光，能順利得通過第一偏振片P1， 入射到CXD相機(jī)上。進(jìn)一步地，上述系統(tǒng)還可以進(jìn)一步包括一透鏡組件L，透鏡組件L可以位于第一偏振片P2的前方(如圖1所示)，也可以位于第一偏振片P2的后方，但需保證樣品S與CCD 相機(jī)相對(duì)于透鏡組件L與物鏡0構(gòu)成的組合透鏡組的位置滿足物像關(guān)系。進(jìn)一步，上述分光鏡具體選用普通的分光鏡和偏振分光鏡均可。當(dāng)選用普通的分光鏡時(shí)，經(jīng)樣品S反射的激發(fā)光和產(chǎn)生的熒光經(jīng)過分光鏡時(shí)，將有部分激發(fā)光和部分熒光被反射，它們中的另一部分透射過分光鏡。透射過的激發(fā)光經(jīng)過后續(xù)的第一偏振片Pl時(shí)， 由于其偏振態(tài)垂直于Pl而被過濾掉；而透射過分光鏡的熒光，偏其振態(tài)為自然(或接近自然)偏振，能通過后續(xù)的第一偏振片P1，入射到CCD相機(jī)上。當(dāng)選用偏振分光鏡時(shí)，激發(fā)光經(jīng)過BS時(shí)基本上會(huì)全部被反射，熒光中偏振態(tài)平行于激發(fā)光的那部分也被反射，而垂直于激發(fā)光的那部分熒光發(fā)生透射，透射過BS的熒光順利通過第一偏振片Pl。一般考慮到偏振分光鏡的消光比不太高(如1000 1)，因此，沒有完全被偏振分光鏡過濾掉的激發(fā)光經(jīng)過第一偏振片Pl時(shí)，再次被濾除，從而增強(qiáng)了圖像成像質(zhì)量。進(jìn)一步地，上述分光鏡BS還可以替換為鍍有激發(fā)光高反射膜和熒光增透膜的雙色鏡，雙色鏡上的高反射膜對(duì)激發(fā)光高反，增透膜則會(huì)對(duì)熒光高透，不過高反射膜對(duì)激發(fā)光的反射不夠徹底，增透膜透射出的光中也會(huì)夾雜少許激發(fā)光，因此，需要后續(xù)的偏振濾波法進(jìn)行進(jìn)一步濾除激發(fā)光，提取熒光信號(hào)。當(dāng)然，如果使用雙色鏡分光時(shí)，會(huì)對(duì)光的波長(zhǎng)有一定的依賴作用。進(jìn)一步地，具體實(shí)施時(shí)還可以在第二偏振片P2前增加其它光學(xué)元器件，第二偏振片P2后增加其它非偏振光學(xué)元器件；或者在第一偏振片Pl前增加其它非偏振光學(xué)元器件， 第一偏振片Pl后增加其它光學(xué)元器件，都不影響熒光信號(hào)的提取。也可以在第二偏振片P2 與第一偏振片Pl之間增加一些能使光偏振態(tài)產(chǎn)生θ角度旋轉(zhuǎn)的旋光器件，同時(shí)，將第一偏振片Pl同樣旋轉(zhuǎn)角度θ，或使第二偏振片Ρ2旋轉(zhuǎn)-θ角度；于是，線偏振激發(fā)光經(jīng)過第一偏振片Pl時(shí)，由于其偏振態(tài)仍垂直與第二偏振片Ρ2而截止，熒光仍能通過第一偏振片Ρ1， 最終成像于C⑶相機(jī)上。[0030]圖3A為采用偏振濾波之前實(shí)驗(yàn)所采集到的圖像，圖:3B為使用了偏振濾波后實(shí)驗(yàn)得到的圖像。從圖3A、圖;3B可知，本專利所實(shí)用新型的偏振濾波方案能夠消除激發(fā)光，提取熒光信號(hào)，提高圖像質(zhì)量。為了和傳統(tǒng)的頻率濾波法進(jìn)行比較，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也采集了使用頻率濾波法進(jìn)行濾波后的圖像，為圖3C。比較圖;3B、3C比較可知，由本實(shí)用新型的偏振濾波法獲得的圖像質(zhì)量并不差于傳統(tǒng)濾波法。需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)中偏振濾波法所采用的起偏器和檢偏器為國產(chǎn)吸收型偏振片(大恒新紀(jì)元科技股份有限公司，型號(hào)GCL-050003)， 其消光比為500 1 ；進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)的頻率濾波法采用的是美國進(jìn)口濾波片(Chroma Technology Corp，型號(hào)HQ5101p)。若采用高消光比的檢偏器件，如格蘭泰勒偏振片消光比小于5X10_6，利用本專利實(shí)用新型的熒光顯微成像方法所獲得的圖像質(zhì)量也將有進(jìn)一步地提尚。本實(shí)用新型實(shí)施例基于激發(fā)光與熒光在偏振態(tài)上的差異的特性，利用偏振器件過濾激發(fā)光，提取熒光信號(hào)，提取過程不受激發(fā)光與熒光波長(zhǎng)的限制，能增強(qiáng)熒光成像質(zhì)量， 適合于不同波長(zhǎng)的激發(fā)光與熒光；本實(shí)用新型實(shí)施例也適合于用波長(zhǎng)可調(diào)諧的激光激勵(lì)樣品，產(chǎn)生多色的熒光的多光譜成像熒光顯微鏡。以上所述僅為本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本實(shí)用新型，凡在本實(shí)用新型的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求1.一種熒光顯微成像系統(tǒng)，其特征在于，包括線偏振光產(chǎn)生單元、分光鏡、物鏡、偏振方向與所述線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光的偏振態(tài)正交的第一偏振片以及CCD 攝相機(jī)；所述線偏振光產(chǎn)生單元位于所述分光鏡的入射面的一側(cè)，所述物鏡位于所述分光鏡的反射光出光側(cè)，所述第一偏振片以及所述CCD攝相機(jī)依次位于所述分光鏡的透射光出光側(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，所述線偏振光產(chǎn)生單元進(jìn)一步包括產(chǎn)生激發(fā)光的光源和配合所述光源獲得線偏振激發(fā)光的第二偏振片。
3.如權(quán)利要求1所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，所述成像系統(tǒng)還包括一透鏡組件，樣品與所述CCD相機(jī)相對(duì)于所述透鏡組件與物鏡組成的透鏡組的位置滿足物像關(guān)系。
4.如權(quán)利要求1所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，所述分光鏡為偏振分光鏡。
5.如權(quán)利要求1所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，所述分光鏡替換為雙色鏡，所述雙色鏡鍍有激發(fā)光高反射膜和熒光增透膜。
6.如權(quán)利要求1所述的成像系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包括一旋光器件，所述旋光器件位于所述線偏振光產(chǎn)生單元與所述第一偏振片之間，所述線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光，經(jīng)過旋光器件作用后，激發(fā)光的偏振方向垂直于所述第一偏振片的偏振方向。
專利摘要本實(shí)用新型適用于光學(xué)成像應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種熒光顯微成像系統(tǒng)，包括線偏振光產(chǎn)生單元、分光鏡、物鏡、偏振方向與所述線偏振光產(chǎn)生單元產(chǎn)生的線偏振激發(fā)光的偏振態(tài)正交的第一偏振片以及CCD攝相機(jī)；所述線偏振光產(chǎn)生單元位于所述分光鏡的入射面的一側(cè)，所述物鏡位于所述分光鏡的反射光出光側(cè)，所述第一偏振片以及所述CCD攝相機(jī)依次位于所述分光鏡的透射光出光側(cè)。本實(shí)用新型有別于傳統(tǒng)技術(shù)中，根據(jù)激發(fā)光與熒光在波長(zhǎng)上的差異濾除激發(fā)光，而是基于激發(fā)光與熒光在偏振態(tài)上的差異，利用偏振器件過濾激發(fā)光，提取熒光，不受激發(fā)光與熒光波長(zhǎng)的限制，適合于不同波長(zhǎng)的激發(fā)光與熒光。
文檔編號(hào)G01N21/64GK202057597SQ20102069060
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者屈軍樂, 文僑, 牛憨笨, 王凱歌, 邵永紅 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)