專利名稱：一種艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。具體涉及一種艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法。
背景技術(shù)：
艾滋病是嚴(yán)重危害人類健康的超級(jí)瘟疫，它是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的。 目前艾滋病的檢測(cè)使用最廣泛的方法是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)。但是，ELISA法在實(shí)際 中受很多因素影響，易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差，為了提高每次實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在HIV檢測(cè) 過(guò)程中需要設(shè)立質(zhì)控對(duì)照，通過(guò)對(duì)質(zhì)控血清的檢測(cè)值的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而判斷每次實(shí)驗(yàn) 的可靠性和重復(fù)性。因此，質(zhì)控血清的質(zhì)量和準(zhǔn)確性是保證艾滋病檢測(cè)可靠性的關(guān)鍵技術(shù) 環(huán)節(jié)。目前HIV檢測(cè)中使用的質(zhì)控對(duì)照通常為臨界值質(zhì)控血清，這種血清很難從臨床直 接獲得，因此，一般采用HIV強(qiáng)陽(yáng)性血清進(jìn)行稀釋配制。配制的方法一般為通過(guò)反復(fù)稀釋， 并進(jìn)行檢測(cè)其S/C0值(檢測(cè)吸光度S與檢測(cè)限cutoff的比值)，直到其S/C0值達(dá)到預(yù)定 值左右。由于ELISA方法在S/C0值達(dá)到預(yù)定值時(shí)具有極高的敏感性，因此這種方法的弊端 就是需要反復(fù)進(jìn)行摸索稀釋倍數(shù)和進(jìn)行檢測(cè)，直到其檢測(cè)值恰巧可以落在想要的范圍內(nèi)。 需要耗費(fèi)很多的時(shí)間、人力和檢測(cè)費(fèi)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法。該方法 簡(jiǎn)單易行，減少步驟和各種損耗，并且減少反復(fù)摸索稀釋的盲目性和不可控性。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
通過(guò)大量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和數(shù)學(xué)模型分析，本發(fā)明人得出了以下結(jié)論(1)臨床獲得的 HIV強(qiáng)陽(yáng)性血清的檢測(cè)信號(hào)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了現(xiàn)有常規(guī)ELISA定性檢測(cè)方法和儀器的上限， 需要進(jìn)行千倍以上的稀釋才能進(jìn)入檢測(cè)信號(hào)有效區(qū)間。(2)當(dāng)取反應(yīng)OD值(樣本檢測(cè)OD 值-陰性對(duì)照OD值)作為反應(yīng)信號(hào)代替S/C0值時(shí)，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)OD值與血清待檢靶 物質(zhì)的濃度具有良好的線性回歸關(guān)系，其回歸曲線是一條截距近似為0的直線，可以統(tǒng)一 表示為“Y=aX”其中Y代表反應(yīng)OD值，X代表待檢物濃度?；谏鲜稣摾?，本發(fā)明提供了一種艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法該方法包括 以下步驟
(1)選擇陽(yáng)性血清
所選用HIV陽(yáng)性血清樣本需經(jīng)ELISA檢測(cè)為強(qiáng)陽(yáng)性，并經(jīng)蛋白質(zhì)印跡(以后簡(jiǎn)稱 Western Blot)確證；
(2)選擇和處理陰性血清
選用正常人血清，該血清為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性，并且無(wú)肉眼可見(jiàn) 的溶血、黃疸、乳糜顆粒、絮狀沉淀物； 將上述陰性血清滅活補(bǔ)體，除菌備用；(3)最終稀釋倍數(shù)的確定
a.第一步稀釋
用處理后的陰性血清對(duì)HIV陽(yáng)性血清進(jìn)行10，100，1000……IOX梯度稀釋，并對(duì)各稀 釋樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)得各樣本的OD值，找出樣本OD值相對(duì)于原陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯下 降的稀釋倍數(shù)，即該稀釋倍數(shù)為第一步稀釋倍數(shù)，該樣本作為下步稀釋的母液；
b.第二步稀釋
對(duì)上步獲得的母液再進(jìn)行2，4，8……2X系列稀釋，并對(duì)各稀釋樣本進(jìn)行ELISA檢 測(cè)，測(cè)得各樣本的OD值，計(jì)算出S/C0值和反應(yīng)OD值，確定第二步稀釋倍數(shù)，具體方法為
當(dāng)2X系列稀釋的樣本中某一稀釋倍數(shù)樣本獲得的S/C0值恰巧為所需配制的數(shù)值，直 接采用該稀釋倍數(shù)為第二步稀釋倍數(shù)；
當(dāng)2X系列稀釋的樣本中沒(méi)有S/C0值沒(méi)有出現(xiàn)所需配制的數(shù)值，則進(jìn)行以下計(jì)算 (i )選一個(gè)OD值在2.0以下，S/C0值最接近所需配制數(shù)值的稀釋倍數(shù)，上下均可； ( )計(jì)算所選稀釋倍數(shù)的反應(yīng)OD值，所述反應(yīng)OD值=該稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的樣本OD 值-陰性對(duì)照OD值；
(iii )計(jì)算所需配制S/C0值的質(zhì)控血清的反應(yīng)OD值，所述反應(yīng)OD值=所需配制的S/ CO值X cutoff值-陰性對(duì)照OD ；
(iv )根據(jù)以下公式計(jì)算第二步稀釋倍數(shù) X2=X1*Y1/Y2
其中，Χ2:第二步稀釋倍數(shù)
Xl 步驟(i )中所選的S/C0值最接近所需配制值的稀釋倍數(shù) Yl 步驟( )所得的反應(yīng)OD值 Y2:步驟(iii)所得的反應(yīng)OD值
c.最終稀釋倍數(shù)=第一步稀釋倍數(shù)X第二步稀釋倍數(shù)；
(4)稀釋分裝
將選定的陽(yáng)性血清和陰性血清，按照步驟(3)確定的最終稀釋倍數(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 稀釋，稀釋后攪拌過(guò)夜，充分混勻，分裝于凍存管中備用。上述方法中，所述陽(yáng)性血清優(yōu)選為Western Blot全條帶的樣本，并且是將幾份 HIV強(qiáng)陽(yáng)性血清混合物。上述方法中，步驟(2 )中，所述滅活補(bǔ)體是將所述陰性血清在56 °C條件下，處理30 分鐘；所述除菌采用0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾。上述方法中，所述步驟(4)中，確認(rèn)最終稀釋倍數(shù)后，進(jìn)行稀釋時(shí)采用逐步稀釋法， 一次稀釋倍數(shù)不超過(guò)10倍。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提出了 HIV臨界值質(zhì)控血清配制方法與現(xiàn)有方法相 比具有以下顯著優(yōu)勢(shì)(1)大大簡(jiǎn)化了配制過(guò)程的核心環(huán)節(jié)，將確定稀釋倍數(shù)的這一需要 反復(fù)摸索的流程簡(jiǎn)化為只需要兩步稀釋(先10倍系列稀釋，再2倍系列稀釋)，然后根據(jù)特 定信號(hào)值的換算可以直接得出最終稀釋倍數(shù)，這樣節(jié)省了該過(guò)程所需時(shí)間和人力和檢測(cè)成 本。(2)配制過(guò)程目標(biāo)性和可控性更強(qiáng)。由于ELISA方法的S/C0值具有極高的敏感性，現(xiàn) 有的一般方法只有經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，才能找到檢測(cè)值接近于目標(biāo)的稀釋倍數(shù)。這樣就使配制 過(guò)程具有較大的盲目性和隨機(jī)性。本發(fā)明只有按照上述步驟進(jìn)行稀釋，就能準(zhǔn)確得出所需特定檢測(cè)值的質(zhì)控血清，流程步驟完全可控。這樣就更適用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的配制生產(chǎn)。 (3)配制更準(zhǔn)確。因?yàn)镠IV強(qiáng)陽(yáng)性血清需要上萬(wàn)倍稀釋才能達(dá)到要求，而人工摸索稀釋倍 數(shù)在后期階段一般只能得出整數(shù)倍，這樣的稀釋倍數(shù)經(jīng)過(guò)上百、上千倍以上的放大，其誤差 范圍也往往達(dá)到上百上千倍，這樣往往造成摸索出來(lái)的試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際配制的結(jié)果差別很 大。而我們經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)模型擬合的反應(yīng)曲線具有非常好的回歸系數(shù)，根據(jù)已知的測(cè)量點(diǎn)進(jìn)行 換算得出的稀釋倍數(shù)可以準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)以后三位甚至更多，這樣就極大的縮小了預(yù)試和實(shí) 際配制兩者之間的誤差。具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以配制S/C0=2的質(zhì)控血清為例
1材料HIV陽(yáng)性血清北京出入境檢疫局從出入境人員中檢出的HIV陽(yáng)性。HIV陰性 血清本實(shí)驗(yàn)室從日常檢測(cè)樣品中或通過(guò)血液中心收集到的正常人血清，收集的血清要求 必須為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性。同時(shí)要求無(wú)肉眼可見(jiàn)的溶血、黃疸、乳糜 顆粒、絮狀沉淀物。上述血清經(jīng)56°C 30分鐘滅活補(bǔ)體，并經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾除菌備用。HIV ELISA試劑生物梅里埃公司Vironostika第四代試劑批號(hào)A57BA)； 儀器SEAC Alisei全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)系統(tǒng)
2方法
第一步稀釋首先用陰性血清對(duì)HIV陽(yáng)性血清進(jìn)行10，100，1000……IOX梯度稀釋并 用生物梅里埃第四代ELISA試劑檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如下 表1陽(yáng)性血清IOX系列稀釋ELISA檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)選擇陽(yáng)性血清所選用Hiv陽(yáng)性血清樣本需經(jīng)ELISA檢測(cè)為強(qiáng)陽(yáng)性，并經(jīng)Wfestern Blot確證；(2)選擇和處理陰性血清選用正常人血清，該血清為HIV抗體陰性、HBsAg陰性、HCV抗體陰性，并且無(wú)肉眼可見(jiàn) 的溶血、黃疸、乳糜顆粒、絮狀沉淀物； 將上述陰性血清滅活補(bǔ)體，除菌備用；(3)最終稀釋倍數(shù)的確定a.第一步稀釋用處理后陰性血清對(duì)HIV陽(yáng)性血清進(jìn)行10，100，1000……IOX梯度稀釋，并對(duì)各稀釋 樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)得各樣本的OD值，找出樣本OD值相對(duì)于原陽(yáng)性血清出現(xiàn)明顯下降 的稀釋倍數(shù)，即該稀釋倍數(shù)為第一步稀釋倍數(shù)，該樣本作為下步稀釋的母液；b.第二步稀釋對(duì)上步獲得的母液再進(jìn)行2，4，8……2X系列稀釋，并對(duì)各稀釋樣本進(jìn)行ELISA檢 測(cè)，測(cè)得各樣本的OD值，計(jì)算出S/C0值和反應(yīng)OD值，確定第二步稀釋倍數(shù)，具體方法為當(dāng)2X系列稀釋的樣本中某一稀釋倍數(shù)樣本獲得的S/C0值恰巧為所需配制的數(shù)值，直 接采用該稀釋倍數(shù)為第二步稀釋倍數(shù)；當(dāng)2X系列稀釋的樣本中S/C0值沒(méi)有出現(xiàn)所需配制的數(shù)值，則進(jìn)行以下計(jì)算 (i )選一個(gè)OD值在2.0以下，S/C0值最接近所需配制數(shù)值的稀釋倍數(shù)，上下均可； ( )計(jì)算所選稀釋倍數(shù)的反應(yīng)OD值，所述反應(yīng)OD值=該稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的樣本OD 值-陰性對(duì)照OD值；(iii )計(jì)算所需配制S/C0值的質(zhì)控血清的反應(yīng)OD值，所述反應(yīng)OD值=所需配制的S/ CO值X cutoff值-陰性對(duì)照OD ；(iv )根據(jù)以下公式計(jì)算第二步稀釋倍數(shù) X2=X1*Y1/Y2其中，Χ2:第二步稀釋倍數(shù)Xl 步驟(i )中所選的S/C0值最接近所需配制數(shù)值的稀釋倍數(shù) Yl 步驟( )所得的反應(yīng)OD值 Y2:步驟(iii)所得的反應(yīng)OD值c.最終稀釋倍數(shù)=第一步稀釋倍數(shù)X第二步稀釋倍數(shù)；(4)稀釋分裝將選定的陽(yáng)性血清和陰性血清，按照步驟(3)確定的最終稀釋倍數(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行 稀釋，稀釋后攪拌過(guò)夜，充分混勻，分裝于凍存管中備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法，其特征在于，所述陽(yáng)性血 清為Western Blot全條帶的樣本，并且是幾份HIV強(qiáng)陽(yáng)性血清的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法，其特征在于，步驟(2)中， 所述滅活補(bǔ)體是將所述陰性血清在56°C條件下，處理30分鐘；所述除菌采用0. 45 μ m微孔 濾膜過(guò)濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法，其特征在于，所述步驟(4)中，確認(rèn)最終稀釋倍數(shù)后，進(jìn)行稀釋時(shí)采用逐步稀釋法，一次稀釋倍數(shù)不超過(guò)10倍。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種艾滋病檢測(cè)質(zhì)控血清的配制方法，該方法是一種通過(guò)兩步稀釋法確定稀釋倍數(shù)的臨界值質(zhì)控血清的配制新方法，該方法簡(jiǎn)單易行，減少步驟和各種損耗，并且減少反復(fù)摸索稀釋的盲目性和不可控性。
文檔編號(hào)G01N33/571GK102128927SQ20101061131
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者劉建禮, 張紹福, 朱紅 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局