專利名稱：利用透明葉片觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用透明葉片觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法。
背景技術(shù)：
形態(tài)解剖學(xué)研究是植物學(xué)研究中的基礎(chǔ)研究，特別是葉表皮和葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的研究 對于植物分類，植物生態(tài)學(xué)，植物生理學(xué)研究以及對葉類藥材的鑒定有重要的價(jià)值，是其它 方法不可替代的。然而，綜觀國內(nèi)外利用光學(xué)顯微鏡對葉表皮和葉內(nèi)部的多種觀察方法，都 存在一定的缺陷，沒有一種普遍適用的方法。特別是對于幼嫩葉表皮和紙質(zhì)葉的觀察中表 皮難以分離；對于具有復(fù)雜毛被的表皮的觀察，即使是掃描電鏡也難以看清楚分層次的毛 被和氣孔，而對于葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，利用切片來觀察實(shí)驗(yàn)煩瑣，無法對其中的一些結(jié)構(gòu) 如晶體，異細(xì)胞進(jìn)行定位觀察，而對于葉脈的研究以往的方法，透明葉的制作中用染色的方 法產(chǎn)生光線難以穿透葉片，會導(dǎo)致看不到最細(xì)小的葉脈，產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)論，從而影響葉類藥 材植物的鑒定、分類，因此如何有效解決成本低、準(zhǔn)確地觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)是 本領(lǐng)域技術(shù)人員所一直希望解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種利用透明葉 觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法，可有效解決成本低、準(zhǔn)確地觀察葉片表皮和葉內(nèi) 部的顯微結(jié)構(gòu)問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是首先，對葉片處理，清洗，再將葉片用乙醇浸泡，除去葉 綠素，然后，用堿溶液浸泡，破外葉肉細(xì)胞，放入次氯酸鈉中脫色，再用流水漂洗后，放入水 合氯酸中，取出后，再流水漂洗，用梯度酒精脫水，脫水后，置入二甲苯中，使葉片變透明，最 后，用中性樹膠或水封片，然后，用光學(xué)顯微鏡觀察并攝像，實(shí)現(xiàn)對葉片不同層次的內(nèi)部和 外部結(jié)構(gòu)觀察。本發(fā)明具有取材少，成本低，工作量小，成功率高，效果好，適用于對各類葉片的觀察。
具體實(shí)施例方式根據(jù)以上技術(shù)方案，本發(fā)明在具體實(shí)施時(shí)，是由以下步驟實(shí)現(xiàn)1.葉片處理新鮮的葉片(即剛從植物上摘下的葉片)或干燥的葉片，用清水洗 干凈表面的灰塵，對于肥厚的葉片內(nèi)部的觀察，新鮮葉片清洗后可以事先徒手將葉片平切 兩片，干燥的葉片則可以用水浸泡后切開，然后再進(jìn)行處理，對于大的葉片可以切成小的 塊，如1-3平方厘米，目的在于去除中脈，防止葉片過厚，以便于放入高倍鏡下觀察微形態(tài)。 而對于葉脈的觀察可以是直接對整片整片葉子進(jìn)行處理；2.乙醇(酒精)浸泡，用體積濃度為95%的乙醇浸泡46-50小時(shí)，最好48小時(shí)為 宜，使葉片呈淺黃綠色，目的是去除葉綠素；
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3.堿溶液浸泡，將除去葉綠素的葉片或切片放置在質(zhì)量濃度為10%的NaOH溶 液中浸泡，46-50小時(shí)，最好48小時(shí)為宜，使葉片完全變黑或是變褐；目的在于破外葉肉細(xì) 胞；4.用次氯酸鈉脫色，將破壞葉肉細(xì)胞的葉片或切片放入質(zhì)量濃度為20%的次氯 酸鈉中脫色36-48小時(shí)，最好可采用37小時(shí)，次氯酸鈉起到漂白作用，得漂白的葉片或切 片；5.流水漂洗，將漂白后的葉片或切片放入清水中，流水漂洗3-5分鐘，最好為4分 鐘，在放于質(zhì)量濃度為250%的水合氯醛中36-48小時(shí)，最好為37小時(shí)，而后進(jìn)行清水流水 漂洗；6.梯度乙醇脫水，流水漂洗后，再依次分別由體積濃度為30^^50^^70%,80%、 95%、100%的乙醇(酒精)進(jìn)行脫水；7. 二甲苯中透明封片，脫水后的葉片或切片放入二甲苯中透明5-10分鐘，葉片變 透明，用中性樹膠封片成為為永久封片，涼干后觀察；當(dāng)只做臨時(shí)觀察，可在步驟( 后，用 水直接封片觀察；8.顯微鏡觀察并攝像，用水或者中性樹膠封片后的葉片或切片，用光學(xué)顯微鏡觀 察并攝像，通過調(diào)節(jié)焦距觀察不同層次的內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)，觀察下表皮時(shí)，下表皮朝上，觀 察上表皮時(shí)候，上表皮朝上，同時(shí)根據(jù)情況調(diào)節(jié)光線。所述的用水和中性樹膠封片，當(dāng)永久封片時(shí)，對透明的葉片或切片，采用中性樹膠 封片。使用1毫米厚的載玻片或更大的玻璃片，但是觀察微形態(tài)時(shí)候要用0.1毫米厚的蓋 玻片，觀察葉脈時(shí)候可以用大的1毫米厚的玻璃封片，當(dāng)不需要永久封片，而只臨時(shí)觀察， 可以在水合氯醛透明后直接用水封片觀察。本發(fā)明方法經(jīng)多次反復(fù)試用和實(shí)驗(yàn)表明，觀察結(jié)果清晰，葉片內(nèi)外結(jié)構(gòu)都可以看 到，無需染色，與現(xiàn)有方法相比，具有取材少，成本低，可節(jié)約資材和成本50 %以上，工作量 小，工作效率可提高一倍以上，觀察準(zhǔn)確，準(zhǔn)確成功率高達(dá)99.9%，效果之好令人非常滿意 (未曾料到)，可有效用于各類葉片植物，特別是葉片藥用植物的分類、植物生態(tài)學(xué)、植物生 理學(xué)以及對葉類藥材的鑒定，有重要的價(jià)值，是其他方法無可相比的，本發(fā)明的研制成功是 一大創(chuàng)造。
權(quán)利要求
1.一種利用透明葉片觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，由以下步 驟實(shí)現(xiàn)(1).葉片處理新鮮的葉片或干燥的葉片，用清水洗干凈表面的灰塵，對于肥厚的新 鮮葉片清洗后，徒手將葉片平切兩片，干燥的葉片用水浸泡后切開，對于大的葉片切成1-3 平方厘米的小塊，除去中脈，防止葉片過厚，以便能夠放入高倍鏡下觀察微形態(tài)，當(dāng)用于葉 脈的觀察時(shí)，由于不需要在高倍鏡下觀察，處理中，直接采用整個(gè)葉片；(2).乙醇浸泡，用體積濃度為95%的乙醇浸泡46-50小時(shí)，使葉片呈淺黃綠色，目的在 于去除葉綠素；(3).堿溶液浸泡，將除去葉綠素的葉片或切片放置在質(zhì)量濃度為10%的NaOH溶液中 浸泡，46-50小時(shí)，使葉片完全變黑或是變褐，目的在于破外葉肉細(xì)胞；(4).用次氯酸鈉脫色，將破壞葉肉細(xì)胞以后的葉片或切片放入質(zhì)量濃度為20%的次 氯酸鈉中脫色36-48小時(shí)，得到漂白的葉片或切片；(5).流水漂洗，將漂白后的葉片或切片放入清水中，流水漂洗3-5分鐘，在放于質(zhì)量濃 度為250%的水合氯醛中36-48小時(shí)，而后進(jìn)行清水流水漂洗；(6).梯度乙醇脫水，流水漂洗后，再依次分別由體積濃度為30^^50^^70^^80%, 95%、100%的乙醇進(jìn)行脫水；(7).二甲苯中透明后封片，脫水后的葉片或切片放入二甲苯中透明5-10分鐘，葉片變 透明，用中性樹膠封片成為永久封片，涼干后觀察；當(dāng)只做臨時(shí)觀察，在步驟( 后，用水直 接封片觀察；(8).顯微鏡觀察并攝像，用水或者中性樹膠封片后的葉片或切片，用光學(xué)顯微鏡觀察 并攝像，通過調(diào)節(jié)焦距觀察不同層次的內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)，觀察下表皮時(shí)，下表皮朝上，觀察 上表皮時(shí)候，上表皮朝上，同時(shí)根據(jù)情況調(diào)節(jié)光線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用透明葉片觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特 征在于，所述的用水或中性樹膠封片，當(dāng)永久封片時(shí)，對透明的葉片或切片，用1毫米厚的 載玻片或玻璃片，采用中性樹膠封片；觀察微形態(tài)時(shí)，用0. 1毫米厚的蓋玻片，采用中性樹 膠封片，觀察葉脈時(shí)，用1毫米厚的玻璃封片，當(dāng)不需要永久封片時(shí)，只需臨時(shí)觀察，葉片或 切片在水合氯醛透明后直接用水封片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用透明葉片觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法，其特 征在于，所述的乙醇浸泡、堿溶液浸泡，其時(shí)間均為48小時(shí)；所述的用次氯酸鈉脫色，其時(shí) 間為37小時(shí)；所述的流水漂洗，其時(shí)間為4分鐘，所述的水合氯醛溶液浸泡，其時(shí)間為37小 時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用透明葉觀察葉表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)的方法，可有效解決成本低、準(zhǔn)確地觀察葉片表皮和葉內(nèi)部的顯微結(jié)構(gòu)問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是首先，對葉片處理，清洗，再將葉片用乙醇浸泡，除去葉綠素，然后，用堿溶液浸泡，破外葉肉細(xì)胞，放入次氯酸鈉中脫色，再用流水漂洗后，放入水合氯酸中，取出后，再流水漂洗，用梯度酒精脫水，脫水后，置入二甲苯中，使葉片變透明，最后，用中性樹膠或水封片，然后，用光學(xué)顯微鏡觀察并攝像，實(shí)現(xiàn)對葉片不同層次的內(nèi)部和外部結(jié)構(gòu)觀察。本發(fā)明具有取材少，成本低，工作量小，成功率高，效果好，適用于對各類葉片的觀察。
文檔編號G01N21/84GK102095730SQ20101054897
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者劉孟奇, 周靜, 柳繼鋒, 王小巧, 高富 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院