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檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究及應(yīng)用的制作方法

文檔序號:5880097閱讀:408來源:國知局
專利名稱:檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及腫瘤標(biāo)志物檢測技術(shù)領(lǐng)域,更具體地說是一種檢測腫瘤標(biāo)志物的電致 化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備,本發(fā)明還涉及采用所述的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器進(jìn)行診斷 腫瘤標(biāo)志物的方法。
背景技術(shù)
腫瘤是人類健康的殺手。惡性腫瘤也稱癌癥,是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類健康和生命的 一類疾病,它是機(jī)體受各種內(nèi)在或外在致癌因素作用下,局部組織的細(xì)胞在基因水平上失 掉了對其自身生長的正常調(diào)控,導(dǎo)致不正常增生而形成的新生物。腫瘤的發(fā)生是一個長期 的、多階段的、多基因改變累積過程,具有多因素調(diào)節(jié)和多基因控制的復(fù)雜性。腫瘤發(fā)病率 和死亡率的上升趨勢直接威脅著人類健康,它的早期診斷和治療是腫瘤防治研究的重要前 言領(lǐng)域之一。惡性腫瘤在生長過程中變得越來越具有侵襲力的現(xiàn)象稱為腫瘤的演進(jìn),其演變過 程涉及腫瘤細(xì)胞之間及腫瘤與宿主之間一系列復(fù)雜的相互作用,包括腫瘤細(xì)胞的增值與凋 亡,胞外基質(zhì)的降解,腫瘤細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)粘附力的改變,細(xì)胞的游走、移動,腫瘤血 管生成,逃避宿主的免疫監(jiān)視等,這些相互作用主要表現(xiàn)在細(xì)胞的無限增值、侵襲性和轉(zhuǎn)移 等特性。在腫瘤的生長過程中,由于附加基因的突變及其編碼產(chǎn)物的異常會使腫瘤的亞克 隆獲得不同的特性,因而機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的選擇會使得腫瘤在生長過程中保留了應(yīng)存活、生 長、浸潤轉(zhuǎn)移的亞克隆并會導(dǎo)致腫瘤異質(zhì)化的產(chǎn)生。因此,加強(qiáng)對腫瘤演進(jìn)各個環(huán)節(jié)的分子 基礎(chǔ)和多基因作用的認(rèn)識和研究勢必為腫瘤疾病的治療帶來廣闊的前景。免疫分析法是利用抗體與抗原特異性結(jié)合而建立的高選擇性生物化學(xué)方法。用免 疫細(xì)胞化學(xué)方法來檢測和定位腫瘤細(xì)胞所特有的腫瘤標(biāo)記,已經(jīng)越來越引起廣大腫瘤病理 學(xué)研究工作者的興趣?,F(xiàn)在有許多免疫組織化學(xué)方法可用于組織細(xì)胞的定性和定量分析以 及成分檢測。目前,主要的免疫分析方法有電化學(xué)免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、流動注射 化學(xué)發(fā)光免疫分析、高效液相色譜化學(xué)發(fā)光免疫分析、毛細(xì)管電泳化學(xué)發(fā)光免疫分析、微流 控芯片化學(xué)發(fā)光免疫分析等。但將其應(yīng)用于免疫診斷中的主要有化學(xué)發(fā)光免疫分析法,電 化學(xué)免疫分析法等,但是這些檢測方法存在不足1.化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有測定速度快、靈敏度高的特點(diǎn),但選擇性相對差一些。 同一種腫瘤由于組織類型不同,也可有一種或幾種腫瘤標(biāo)志物,因此由檢測出的某一特定 腫瘤標(biāo)志物來確定是哪種腫瘤疾病比較困難。2.電化學(xué)免疫分析法具有方便快速的特點(diǎn),并且由于電位可控,提高了選擇性,可 以對不同的腫瘤標(biāo)志物做出診斷,并應(yīng)用于腫瘤的治療,但靈敏度相對低一些?;谏鲜鰴z測方法的缺點(diǎn),本發(fā)明建立了一種高靈敏度、高選擇性、方便、快捷的 電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種檢測速度快、靈敏度高、選擇性高,試劑用 量少,檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備及檢測方法。為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種檢測腫瘤標(biāo)志物 的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法,其特征是包括以下步驟(1)選擇臨床發(fā)病率較高的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定;(2)制備出量子點(diǎn)納米材料溶液;(3)利用組裝表面修飾技術(shù)等,將抗體修飾電極表面上,制作電致化學(xué)發(fā)光免疫傳 感器。本發(fā)明所述抗體修飾到免疫傳感器表面并對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定包括以下步驟(1)將所用電極分別用去離子水、丙酮和乙醇超聲波清洗,之后用高純N2吹干;(2)將步驟(1)得到的電極浸入4% NaOH溶液中10-30min,然后用去離子水沖洗, 在120°C下干燥l-2h ;(3)將特異性抗體(Ab)吸附到處理好的電極表面,4°C溫育12_24h后洗滌除去未 吸附的抗體,洗滌2-5次;(4)將步驟(3)中的電極加入待測抗原(Ag)的樣品中,37°C溫育l_2h,洗滌2_5 次;(5)將步驟(4)中的電極浸泡在發(fā)光試劑標(biāo)記的特異性抗體(Ab ·Ε)中,37°C溫育 10-15min,洗滌 2-5 次;(6)將修飾好的電極結(jié)合電致化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定。本發(fā)明所述使用工作電極可以為玻璃碳電極、ITO電極、金電極、鉬電極。本發(fā)明所述發(fā)光試劑為三氯聯(lián)吡啶釕及其衍生物、魯米諾及其衍生物、吖啶酯類、 光澤精及量子點(diǎn)納米材料。本發(fā)明所述腫瘤標(biāo)志物為甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細(xì) 胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA19-9、SCC、CA15-3, CA12-5, HCG、F-PSA, PAP、TMA、人 絨毛膜促性腺激素(hCG)、兒茶酚胺類物質(zhì)。一種快速檢測腫瘤標(biāo)志物的方法,其特征是包括如下步驟將按上述任意一種方 法制得的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器配合電致化學(xué)發(fā)光儀,對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測。本發(fā)明的有益效果1.腫瘤標(biāo)志物電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備方法,,將抗體修飾到電極表面制 備電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器,采用三氯聯(lián)吡啶釕、魯米諾、吖啶酯、光澤精及量子點(diǎn)納米材 料作為發(fā)光試劑,使得所制備的腫瘤標(biāo)志物電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有更高的靈敏性和 選擇性。2.將表面修飾技術(shù)應(yīng)用到電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備當(dāng)中,使得發(fā)光試劑增 效的腫瘤標(biāo)志物電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備具有可控性,提高了電致化學(xué)發(fā)光免疫傳 感器的靈敏度和準(zhǔn)確性。3.本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的特異性強(qiáng),由于將抗體修飾到電極上,并 對抗原進(jìn)行特異性識別,樣品中其它非特異性分子對檢測結(jié)果無影響;靈敏度高,可以達(dá)到
4ng級;試劑用量少,檢測一個樣品只需要幾十微升試劑;成本低。4.電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器檢測腫瘤標(biāo)志物的方法,靈敏度高、重現(xiàn)性好、電極壽 命長、抗干擾能力強(qiáng),操作快速簡單,反應(yīng)及結(jié)果均由儀器自動完成和記錄,避免了主觀因 素的影響,并保證有很好的重復(fù)性,便于現(xiàn)場檢測。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。附圖為抗體修飾到電極表面制備電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器并對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行 檢測的過程示意圖。
具體實(shí)施例方式一種檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器制備方法,其特征是包括以下步 驟(1)選擇臨床發(fā)病率較高的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定;(2)制備出量子點(diǎn)納米材料溶液;(3)利用組裝表面修飾技術(shù)等,將抗體修飾電極表面上,制作電致化學(xué)發(fā)光免疫傳 感器。本發(fā)明所述抗體修飾到免疫傳感器表面并對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定包括以下步 驟(1)將所用電極分別用去離子水、丙酮和乙醇超聲波清洗,之后用高純N2吹干;(2)將步驟⑴得到的電極浸入4% NaOH溶液中10-30min,然后用去離子水沖洗, 在120°C下干燥l-2h ;(3)將特異性抗體(Ab)吸附到處理好的電極表面,4°C溫育12_24h后洗滌除去未 吸附的抗體,洗滌2-5次;(4)將步驟(3)中的電極加入待測抗原(Ag)的樣品中,37°C溫育l_2h,洗滌2_5 次;(5)將步驟(4)中的電極浸泡在發(fā)光試劑標(biāo)記的特異性抗體(Ab ·Ε)中,37°C溫育 10-15min,洗滌 2-5 次;(6)將修飾好的電極結(jié)合電致化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定。本發(fā)明所述使用工作電極可以為玻璃碳電極、ITO電極、金電極、鉬電極。本發(fā)明所述發(fā)光試劑為三氯聯(lián)吡啶釕及其衍生物、魯米諾及其衍生物、吖啶酯類、 光澤精及量子點(diǎn)納米材料。本發(fā)明所述腫瘤標(biāo)志物為甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細(xì) 胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA19-9, SCC、CA15-3, CA12-5, HCG、F-PSA, PAP、TMA、人 絨毛膜促性腺激素(hCG)、兒茶酚胺類物質(zhì)。一種快速檢測腫瘤標(biāo)志物的方法,其特征是包括如下步驟將按上述任意一種方 法制得的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器配合電致化學(xué)發(fā)光儀,對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測。實(shí)施例1(胚胎抗原類,如甲胎蛋白)
一種檢測甲胎蛋白的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器制備方法,包括以下步驟(1)選擇臨床發(fā)病較高的甲胎蛋白進(jìn)行測定;(2)利用組裝技術(shù),將甲胎蛋白抗體修飾到電極表面,制作電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感 器;(3)工作電極選用ITO電極,將電極分別用去離子水、丙酮和乙醇超聲波清洗,之
后用高純N2吹干;(4)將處理好的電極浸入4% NaOH溶液中l(wèi)Omin,然后用去離子水沖洗,在120°C 下干燥2h ;(5) CdTe量子點(diǎn)溶液制備在N2保護(hù)下,將現(xiàn)制得NaHTe為Te前驅(qū)體,與CdCl2反 應(yīng),巰基乙酸作為穩(wěn)定劑的條件下,制得水溶性CdTe量子點(diǎn)溶液;(6)取制備好的CdTe溶液20 μ 1,超聲20min,得到均勻分散的CdTe量子點(diǎn)溶液;(7)將甲胎蛋白抗體吸附到處理好的電極表面,4°C溫育24h后洗滌除去未吸附的 甲胎蛋白抗體,洗滌3次;(8)將處理好的電極加入甲胎蛋白抗原樣品中,37°C溫育lh,洗滌3次;(9)將上述處理好的電極浸泡在CdTe量子點(diǎn)標(biāo)記的特異性甲胎蛋白抗體中,37°C 溫育15min,洗滌3次。將制得甲胎蛋白電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器配合電致化學(xué)發(fā)光儀,對人體、動物血 清樣品中的甲胎蛋白進(jìn)行檢測,結(jié)果見表1。利用現(xiàn)有的方法,制備甲胎蛋白電化學(xué)免疫傳 感器,連接電化學(xué)工作站,對人體、動物血清樣品提取液中的甲胎蛋白進(jìn)行實(shí)際檢測,結(jié)果 見表1。表1本發(fā)明甲胎蛋白電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器與甲胎蛋白電化學(xué)免疫傳感器檢 測效果對比
權(quán)利要求
1. 一種檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法,其特征是包括以下步驟1.1選擇臨床發(fā)病率較高的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定;1. 2利用納米材料,按照現(xiàn)有方法制備出納米材料;1.3制備出量子點(diǎn)材料溶液;1.4利用組裝表面修飾技術(shù)等,將抗體修飾電極表面上,制作電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述電極制備方法,其特征是將特異性抗體修飾到免疫傳感器電極 表面并對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定包括以下步驟2. 1將所用電極分別用去離子水、丙酮和乙醇超聲波清洗,之后用高純N2吹干;2. 2將步驟2. 1得到的電極浸入4% NaOH溶液中10-30min,然后用去離子水沖洗,在 120°C下干燥 l-2h ;2. 3將特異性抗體(Ab)吸附到處理好的電極表面,4°C溫育12-24h后洗滌除去未吸附 的抗體,洗滌2-5次;2. 4將步驟2. 3中的電極加入待測抗原(Ag)的樣品中,37°C溫育l_2h,洗滌2_5次;2. 5將步驟2. 4中的電極浸泡在發(fā)光試劑標(biāo)記的特異性抗體(Ab ·Ε)中,37°C溫育 10-15min,洗滌 2-5 次;2.6將修飾好的電極結(jié)合電致化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述電極制備方法,其特征是所述使用工作電極可以為玻璃碳電 極、ITO電極、金電極、鉬電極。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述電極制備方法,所述發(fā)光試劑為三氯聯(lián)吡啶釕及其衍生物、魯 米諾及其衍生物、吖啶酯類、光澤精及量子點(diǎn)納米材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的電極制備方法,所述腫瘤標(biāo)志物為甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗 原、癌胚鐵蛋白、胰癌胚抗原、細(xì)胞角蛋白、鱗癌相關(guān)抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、酸性磷 酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA19-9, SCC、CA15-3, CA12-5、HCG、F-PSA、PAP、TMA、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、兒茶酚胺類物質(zhì)。
6.一種快速檢測腫瘤標(biāo)志物的方法,其特征是包括如下、步驟將按上述任意一種方 法制得的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器配合電致化學(xué)發(fā)光儀,對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測腫瘤標(biāo)志物的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究及應(yīng)用的方法。電極制備方法(示意圖見附圖),包括以下步驟選擇臨床發(fā)病率較高的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行測定;制備出量子點(diǎn)納米材料溶液;利用電極表面修飾技術(shù),將抗體修飾電極表面上,制作電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。一種檢測腫瘤標(biāo)志物的方法,包括如下步驟將修飾好的電極連接到電致化學(xué)發(fā)光儀,對樣品中的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測。本發(fā)明的電極的特異性強(qiáng),靈敏度高,可以達(dá)到ng級;完成一個基本檢測過程所需時間較短;成本低。電極檢測腫瘤標(biāo)志物的方法,操作快速簡單,反應(yīng)及結(jié)果均由儀器自動完成和記錄。
文檔編號G01N21/66GK102072954SQ20101052419
公開日2011年5月25日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者萬夫偉, 于京華, 張萌, 戴平, 葛慎光, 藏德進(jìn), 顏梅, 高偉強(qiáng) 申請人:濟(jì)南大學(xué)
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