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雜交瘤細(xì)胞株wxr分泌的抗大鼠atf3單克隆抗體的制作方法

文檔序號(hào):5877736閱讀:232來源:國(guó)知局
專利名稱:雜交瘤細(xì)胞株wxr分泌的抗大鼠atf3單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及單克隆抗體,特別涉及一種雜交瘤細(xì)胞株MR分泌的抗大鼠ATF3的單 克隆抗體。
背景技術(shù)
激活轉(zhuǎn)錄因子3 (activating transcription factor 3,ATF3)是 1989 年 Hai 等 人發(fā)現(xiàn)的一種cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)家族的核轉(zhuǎn)錄因子(其DNA全長(zhǎng)為32229bp, 有4個(gè)外顯子),其mRNA序列見kq NO. 1,具有廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效應(yīng)。Okamoto等人發(fā)現(xiàn), ATF3可與其它轉(zhuǎn)錄因子,如C-Jim,Jim B, Jun D,等結(jié)合形成異二聚體,其功能多為轉(zhuǎn)錄激 活的調(diào)節(jié)子。生理狀態(tài)下的ATF3水平較低,而有絲裂原刺激或應(yīng)激信號(hào)時(shí),ATF3表達(dá)即刻 上調(diào),作為細(xì)胞應(yīng)激的核轉(zhuǎn)錄因子,參與多種組織的增生反應(yīng)。已知ATF3屬于一種刺激誘 生且早期表達(dá)的反應(yīng)基因,其功能是否作為轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)子取決于刺激原的種類、細(xì)胞類 型、細(xì)胞背景及結(jié)合配體等。就ATF3與疾病之間的關(guān)系而言,目前在糖尿病、腫瘤、炎癥、神 經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)育(主要是先天性尿道下裂)和疼痛等研究領(lǐng)域,有關(guān)ATF3的報(bào)道較為多 見。1.腫瘤在受四環(huán)素調(diào)控的可誘導(dǎo)表達(dá)ATF3的Hela細(xì)胞系,通過"Tet-off/tet-on基因表 達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)ATF3表達(dá),發(fā)現(xiàn)ATF3蛋白可減緩細(xì)胞從Gl期進(jìn)展至S期,ATF3蛋白的過度表 達(dá)能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。ATF3在前列腺癌組織中高表達(dá),用siRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn),沉默Kruppel樣因 子6(KLF6)可以抑制ATF3的表達(dá),從而抑制了由疊氮鈉誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。在人上 皮鱗狀細(xì)胞癌中,過表達(dá)ATF3可以增強(qiáng)Caspase活性,促進(jìn)表鬼白毒和喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞 凋亡。綠茶素可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞凋亡,這與其上調(diào)ATF3介導(dǎo)促凋亡基因非類固醇 抗炎藥物激活基因(non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene,NAG_l)表 達(dá)有關(guān)。在人結(jié)腸癌細(xì)胞中,用抗腫瘤藥物可以誘導(dǎo)ATF3表達(dá)增高,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。 用siRNA技術(shù)沉默ATF3基因則可以抑制LY^4002誘導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞凋亡。LY^4002在 結(jié)腸癌中的抗癌作用是通過上調(diào)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子I(Egr-I)表達(dá),而Egr-I又作用于ATF3 啟動(dòng)子,引起基因轉(zhuǎn)錄激活,最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在人結(jié)腸癌細(xì)胞中,小蘗堿能誘導(dǎo)ATF3 表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而這種上調(diào)是以P53基因依賴的方式進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之,ATF3蛋白對(duì) 細(xì)胞生長(zhǎng)有負(fù)性調(diào)控作用,當(dāng)ATF3蛋白過表述時(shí),對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,且可促進(jìn)腫 瘤細(xì)胞的凋亡。2.糖尿病胰島素受體底物2 (insulin receptor substrate 2,IRS2)基因是維持細(xì)胞存活 的基因。通過轉(zhuǎn)基因小鼠及基因敲除鼠研究發(fā)現(xiàn),一方面,ATF3轉(zhuǎn)基因小鼠胰島發(fā)育缺陷, 胰島組織結(jié)構(gòu)異常,致使胰島β細(xì)胞數(shù)量減少,另一方面,ATF3基因敲除小鼠抗應(yīng)激誘 導(dǎo)的凋亡能力增強(qiáng)。脂聯(lián)素顯著下調(diào)是肥胖癥及糖尿病動(dòng)物模型的一個(gè)顯著特征。Kim等 用毒胡蘿卜素刺激3T3-L1小鼠脂肪細(xì)胞、人胚腎293細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,通過熒光素酶報(bào)告基因及電泳遷移率試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),體內(nèi)外ATF3和T細(xì)胞活化核因子4 (nuclear factor of activated T-cellscalcineurin-d印endent 4,NFATc 4)均可共同結(jié)合到脂聯(lián)素啟動(dòng)子 區(qū),起轉(zhuǎn)錄抑制的作用,下調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)。因此,ATF3能通過直接抑制頂52基因的表達(dá), 促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡。糖尿病病人胰島β細(xì)胞ATF3基因表達(dá)異常增高,故下調(diào)ATF3基 因表達(dá)對(duì)糖尿病治療有現(xiàn)實(shí)意義。3.神經(jīng)系統(tǒng)疾病外周神經(jīng)損傷與中樞神經(jīng)損傷不同,外周神經(jīng)損傷后可以激活神經(jīng)元再生。 Seijffers等人發(fā)現(xiàn),外周神經(jīng)損傷后ATF3表達(dá)增高,而中樞神經(jīng)損傷后則未發(fā)現(xiàn)其升高。 另有文獻(xiàn)報(bào)道,背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷后,組成型表達(dá)ATF3的轉(zhuǎn)基因小鼠,其神經(jīng)元再生 能力明顯較野生型增強(qiáng)。然而,也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用吲哚酮GW-5074可以保護(hù)低鉀誘導(dǎo)的小腦 顆粒神經(jīng)元凋亡。進(jìn)一步研究表明,GW-5074不是通過MEK-ERK通路發(fā)揮作用。因低鉀可以 誘導(dǎo)ATF3表達(dá)增高,促進(jìn)凋亡,而GW-5074則可抑制ATF3的表達(dá)。業(yè)已發(fā)現(xiàn),Gff-5074能 夠激活B-Raf,活化的B-Raf作用于其下游靶基因ATF3,抑制其轉(zhuǎn)錄,從而抑制低鉀誘導(dǎo)的 神經(jīng)元凋亡。此外,還有學(xué)者證實(shí),低鉀是通過JNK/c-Jim介導(dǎo)ATF3表達(dá)增高,進(jìn)而促進(jìn)小 腦顆粒神經(jīng)元凋亡。提示ATF3在神經(jīng)損傷模型中起到保護(hù)性的作用,它能促進(jìn)神經(jīng)纖維的 再生。4.炎癥最近,ATF3在機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中的作用已得到了許多研究者的高度重視。ATF3 基因敲除的小鼠患有明顯的哮喘癥狀,表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性、炎癥、氣道重構(gòu)等。ATF3可明 顯抑制過敏性氣道炎癥。染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析發(fā)現(xiàn),ATF3能直接結(jié)合到IL-4、IL-5 和IL-13啟動(dòng)子上,抑制組蛋白乙?;?,進(jìn)而抑制Th2細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。最近,系統(tǒng)生物學(xué) 數(shù)學(xué)建模并實(shí)驗(yàn)證實(shí),ATF3、NF-kB和C/EBP互相作用,形成基因調(diào)節(jié)性網(wǎng)絡(luò),控制炎癥反 應(yīng)。在這個(gè)調(diào)節(jié)回路中,NF-kB為啟動(dòng)者,C/EBP為增強(qiáng)器,而ATF3則起到了衰減器的作 用。另有研究發(fā)現(xiàn),ATF3在Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR-4)誘導(dǎo)的炎癥中 起保護(hù)作用。表明ATF3在炎癥反應(yīng)中起到保護(hù)作用,為負(fù)性調(diào)節(jié)因子。5.ATF3在腎臟病中的研究ATF3參與了應(yīng)激相關(guān)腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。例如,利用基因芯片技術(shù),Yoshida 等人發(fā)現(xiàn),用H2A刺激人近端小管細(xì)胞可以迅速誘導(dǎo)ATF3表達(dá)增高。ATF3可能起到保護(hù)細(xì) 胞的作用。在小鼠急性腎損傷模型中,用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)ATF3可以降低肌酐,改善 腎功能,病理檢查發(fā)現(xiàn),腎小管缺血再灌注損傷明顯減輕。另外,用蛋白印跡的方法,Zhou等 人發(fā)現(xiàn),在急性腎損傷模型及病人、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥病人的尿液中,可檢測(cè)到ATF3 的含量升高。提示,ATF3可作為檢測(cè)早期急性腎損傷的一種生物標(biāo)記。鑒于ATF3核轉(zhuǎn)錄因子的重要性,為進(jìn)一步研究和應(yīng)用ATF3,本發(fā)明采用人工方法 先合成大鼠ATF3多肽,然后制備了抗大鼠ATF3的單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)目的本發(fā)明提供一種雜交瘤細(xì)胞株WXR ;本發(fā)明提供一種雜交瘤細(xì)胞株MR分泌的抗大鼠ATF3的單克隆抗體;
本發(fā)明提供一種抗大鼠ATF3免疫組化染色試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
一種雜交瘤細(xì)胞株MR于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏號(hào)為CCTCC NO C201034,
保藏日期為2010年6月9日,中國(guó)武漢武漢大學(xué)。一種雜交瘤細(xì)胞株WXR分泌的抗大鼠ATF3單克隆抗體。所述的抗大鼠ATF3單克隆抗體,針對(duì)大鼠ATF3第168-181位氨基酸多肽 NLFIQQIKEGTLQSC,對(duì)應(yīng)于第502_M3bp堿基序列(見序列表中的kq NO. 1)。一種抗大鼠ATF3免疫組化染色試劑盒,含有所述的抗大鼠ATF3的單克隆抗體。一種抗大鼠ATF3單克隆抗體的制備方法,其特征在于以下步驟1.雜交瘤細(xì)胞的建立免疫動(dòng)物將弗氏完全佐劑與大鼠ATF3多肽抗原1 1比例混勻,每只Balb/c小 鼠腹腔注射0. 3mL(70yg),隔3周重復(fù),劑量相同,佐劑改用不完全佐劑;再過3周每只小 鼠注射純化抗原0. 3mL,3天后融合,融合當(dāng)天,眼眶采血,間接ELISA測(cè)血清抗體效價(jià);免疫 小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞以8 1融合,lOOOr/min離心Smin后,緩慢加入0.5倍體 積的PEG ImL介導(dǎo)融合;間接ELISA法篩選,單抗分泌陽(yáng)性克隆用有限稀釋法克隆。將用大 鼠ATF3多肽免疫的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,共融合4次(16塊96孔培養(yǎng)板),克隆 形成率約為70%,檢測(cè)率在90%以上。經(jīng)反復(fù)克隆及亞克隆后得到一株能穩(wěn)定分泌小鼠抗 大鼠ATF3mAb的雜交瘤細(xì)胞株,命名為WXR。雜交瘤細(xì)胞株MR于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心保藏,保藏號(hào)為CCTCC C201034,保藏日期為2010年6月9日。W)(R經(jīng)染色體核型分析 顯示染色體數(shù)目在80 100條之間(圖幻。這株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培 養(yǎng),液氮凍存后復(fù)蘇,仍生長(zhǎng)良好,能穩(wěn)定分泌抗大鼠ATF3的抗體。上述的大鼠ATF3多肽經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè),即采用哈佛大學(xué)分子免疫基金 會(huì)在線提供的抗原肽預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出ATF3蛋白的抗原決定簇有20個(gè)(表1),然后采用 DNAStar Protean軟件提供的模塊分析ATF3的氨基酸序列的β _轉(zhuǎn)角,α -螺旋,親水性, 抗原性和在蛋白表面可能性的評(píng)分。Garnier-Robson法預(yù)測(cè)ATF3蛋白含有5個(gè)α螺旋 中心、3個(gè)β折疊區(qū)段,Chou-Fasman法預(yù)測(cè)ATF3蛋白含有7個(gè)α螺旋中心、6個(gè)β折 疊區(qū)段,Karplus-Schulz法預(yù)測(cè)ATF3蛋白含有7個(gè)柔性區(qū)域,Kyte-Doolittle法預(yù)測(cè)B細(xì) 胞抗原表位結(jié)果顯示,ATF3蛋白親水性區(qū)域(》0)分布較廣,其中親水性較高區(qū)域主要在 第78-98,100-118和155-172區(qū)段。Plot-Emini法預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,ATF3蛋白的第86-98、 102-112和160-171區(qū)段出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表面可能性比較大(彡1)(見

圖1)。因此,綜合 抗原決定簇的預(yù)測(cè)結(jié)果、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、蛋白質(zhì)表面可能性等因素,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成 了 ATF3第168-181位氨基酸多肽NLFIQQIKEGTLQSC,對(duì)應(yīng)于第502_543bp堿基序列,包含 第18、19、20預(yù)測(cè)的抗原決定簇(如表1中黑體部分所示),并且偶聯(lián)蛋白KLH,分子量是 1722KD。ATF3合成多肽經(jīng)高效液相色譜分析,從HPLC層析圖可見合成肽為單一峰,多肽的 純度約為97. 58%,結(jié)果見圖2。表1軟件預(yù)測(cè)的大鼠ATF3蛋白的抗原決定簇
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株WXR CCTCC C201034。
2.一種雜交瘤細(xì)胞株WXR分泌的抗大鼠ATF3的單克隆抗體。
3.一種抗大鼠ATF3免疫組化染色試劑盒,其特征在于含有權(quán)利要求2所述的抗大鼠 ATF3的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及單克隆抗體,特別涉及一種雜交瘤細(xì)胞株WXR分泌的單克隆抗體;一種雜交瘤細(xì)胞株WXRCCTCC C201034;一種雜交瘤細(xì)胞株WXR分泌的抗大鼠轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)的單克隆抗體及其制成試劑盒;本發(fā)明不僅為進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)角度研究ATF3的生物學(xué)功能及其作用機(jī)理奠定基礎(chǔ),而且為今后研發(fā)抗腫瘤、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、炎癥、腎臟病治療性藥物提供了有價(jià)值的參照材料。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102115732SQ20101027875
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者任琎, 唐奇, 夏梅, 王迎偉, 邱文 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)
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