專利名稱：表達(dá)盒、其轉(zhuǎn)基因魚及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因魚及其特別是在檢測雌激素和抗雌激素化合物，監(jiān)測環(huán)境中的雌激素樣活性以及研究肝臟的再生中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)發(fā)現(xiàn)曾被視為安全的很多化學(xué)物質(zhì)具有擾亂內(nèi)分泌系統(tǒng)的活性，并且在生物體內(nèi)導(dǎo)致不良反應(yīng)。這些種類的化學(xué)品在環(huán)境中的廣泛存在已近引起了全世界的關(guān)注。因為有關(guān)這些物質(zhì)對雄性生物的雌激素效應(yīng)的報道越來越多，所以大部分研究工作集中于雌激素樣內(nèi)分泌干擾物。重要的是獲得用于鑒定能夠模擬雌激素或干擾雌激素內(nèi)分泌系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)的快速、敏感、經(jīng)濟(jì)且可定量的方法，此方法能夠有助于評估這些化學(xué)物質(zhì)對生物體的生物效應(yīng)。在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，已研究了體外細(xì)胞系分析和體內(nèi)轉(zhuǎn)基因魚分析。細(xì)胞系分析能夠快速且敏感，但不能提供關(guān)于測試物質(zhì)對生物體的毒理動力學(xué)和毒理代謝動力學(xué)作用的信息。目前，轉(zhuǎn)基因魚分析能夠克服細(xì)胞系分析的一些缺陷。然而，現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因魚的局限性在于它們都是淡水物種，不能在海洋環(huán)境中使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面涉及表達(dá)盒，其包含(i)編碼報告蛋白的報告核苷酸序列；(ii)從青鏘魚(medaka fish)分離的雌激素反應(yīng)5'-調(diào)控核苷酸序列，其中所述調(diào)控核苷酸序列可操作地連接到所述報告核苷酸序列的5'端，以在雌激素或雌激素樣化合物存在下誘導(dǎo)報告蛋白表達(dá)；和(iii)可操作地連接到所述報告核苷酸序列3'端的3'-調(diào)控區(qū)。本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化載體。本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)有本發(fā)明表達(dá)盒的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面涉及水生動物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包含至少一個本發(fā)明的表達(dá)盒。本發(fā)明的另一方面涉及包含至少一個本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因魚。在接觸到包含雌激素或雌激素樣化合物的液體介質(zhì)時，所述轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出可觀測的標(biāo)記。所述可觀測的標(biāo)記包括由所述至少一個表達(dá)盒表達(dá)的報告蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測液體介質(zhì)中存在雌激素或雌激素樣化合物的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法。此方法包括使用本發(fā)明的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化非轉(zhuǎn)基因魚，從而獲得包含至少一個所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因魚。本發(fā)明的另一方面涉及篩選液體介質(zhì)中雌激素物質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一方面涉及篩選液體介質(zhì)中雌激素物質(zhì)的方法。此方法包括使本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因魚接觸待測(即用于檢測雌激素物質(zhì)的存在)的液體介質(zhì)。在此接觸步驟后，此方法包括檢測所述轉(zhuǎn)基因魚是否表現(xiàn)出通過誘導(dǎo)(包含在所述轉(zhuǎn)基因魚體中的)報告基因的表達(dá)產(chǎn)生的可觀測的標(biāo)記。存在可觀測的標(biāo)記表明所述液體介質(zhì)包含雌激素物質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面涉及篩選具有抗雌激素活性的化合物的方法。此方法包括以下步驟(a)提供本發(fā)明的第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚，其中所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚為相同的種，并且處于基本相同的發(fā)育階段；(b)使所述第一轉(zhuǎn)基因魚接觸第一液體介質(zhì)，其中所述第一液體介質(zhì)包含雌激素或雌激素樣化合物；(c)使所述第二轉(zhuǎn)基因魚接觸第二液體介質(zhì)，其中所述第二液體介質(zhì)包含第一液體介質(zhì)和測試化合物；和(d)將所述第一轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的任何可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度與所述第二轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的任何可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度進(jìn)行比較，其中與所述第一轉(zhuǎn)基因魚中可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度相比，所述第二轉(zhuǎn)基因魚中可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度下降表明所述測試化合物具有抗雌激素活性。本發(fā)明的另一方面涉及用于研究雌激素化合物對肝臟再生的影響的方法?？傮w而言，此方法包括對本發(fā)明的成體轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述轉(zhuǎn)基因魚的部分肝臟；使所述轉(zhuǎn)基因魚接觸包含測試雌激素化合物的測試液體介質(zhì)；和分析所述轉(zhuǎn)基因魚的肝臟以檢測肝組織的任何再生。與研究單一的雌激素化合物相反，本發(fā)明的另一方面涉及用于研究不同雌激素化合物對肝臟再生的影響的方法。總體而言，此方法包括以下步驟(a)提供本發(fā)明的第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚，其中所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚為相同種的成體魚；(b) 使所述第一轉(zhuǎn)基因魚接觸包含第一測試雌激素化合物溶液的第一液體介質(zhì)；(c)使所述第二轉(zhuǎn)基因魚接觸包含第二測試雌激素化合物溶液的第二液體介質(zhì)；(d)量化所述第一轉(zhuǎn)基因魚和所述第二轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的任何可觀測的標(biāo)記的強(qiáng)度；(e)對所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚的部分肝臟；(f)重復(fù)此方法的步驟(b)到步驟(d)；和(g)分析所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚的肝臟以比較所述第一液體介質(zhì)和所述第二液體介質(zhì)中包含的雌激素化合物對肝組織任何再生的影響。


本專利或申請文件包含至少一幅彩色的附圖?；谡埱蟛⑹杖”匾馁M(fèi)用，專利局可提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埜北?。圖1顯示通過綠色熒光(GFP)陽性幼體的頻率所代表的不同長度的omChgH5’-上游區(qū)的相對啟動子活性，其中所述GFP陽性幼體源自于注射有核酸序列的胚胎，所述核酸序列包含對17 β -雌二醇反應(yīng)的omChgH啟動子-EGFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)。圖2顯示不同基因的mRNA聚腺苷酸化信號對核酸omChgH啟動子-EGFP的相對啟動子活性的影響，核酸omChgH啟動子-EGFP的相對啟動子活性由GFP陽性幼體的頻率所代表，其中所述GFP陽性幼體源自于注射有核酸的胚胎，所述核酸包含對17 β -雌二醇反應(yīng)的，側(cè)翼為olChgH、SV40或omChgH3’ -側(cè)翼區(qū)的omChgH啟動子-EGFP (增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)。圖3A-3G顯示轉(zhuǎn)基因EGFP在通過引入包含omChgH啟動子-EGFP轉(zhuǎn)基因的核酸序列而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因魚中的天然和誘導(dǎo)表達(dá)。GFP的表達(dá)僅局限于成體雌魚的肝臟(圖3C)， 而不在胚胎(圖3A)、幼體(圖3B)或雄魚(圖3D)中表達(dá)。圖3E-3G顯示通過17 β -雌二醇也可在胚胎、幼體和雄魚的肝臟中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因EGFP的表達(dá)。
圖4顯示使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因魚幼體分析測試溶液的雌激素樣活性的一個實(shí)施方式的操作流程圖。圖5顯示孵化后不同天數(shù)的轉(zhuǎn)基因魚幼體的雌激素敏感性。圖6是顯示在5 9范圍的pH不影響轉(zhuǎn)基因魚幼體對17 β -雌二醇反應(yīng)的圖。圖7是顯示0 35ppt的鹽度不影響轉(zhuǎn)基因魚幼體對17 β -雌二醇反應(yīng)的圖。圖8顯示對雌激素反應(yīng)轉(zhuǎn)基因幼體中GFP信號強(qiáng)度隨時間推移而增加。圖9顯示轉(zhuǎn)基因魚幼體對17 β -雌二醇的劑量-反應(yīng)。圖10顯示轉(zhuǎn)基因魚幼體對合成激素17 β -乙炔雌二醇的劑量-反應(yīng)。圖11顯示分別由植物雌激素染料木黃酮、染料木苷、大豆苷原、大豆苷以及從豆?jié){提取的它們的組合物誘導(dǎo)的肝GFP信號。圖12顯示由UV過濾劑ΒΡ-3和4-MBC單獨(dú)及組合誘導(dǎo)的肝GFP信號。使本發(fā)明一個實(shí)施方式的轉(zhuǎn)基因魚幼體接觸4-MBC (5 μ M)、HMS (5 μ Μ)和以上述一半濃度O. 5 μ Μ) 混合的這兩種化合物的組合。由其混合物誘導(dǎo)的GFP信號顯著高于由這兩種化合物誘導(dǎo)的 GFP信號。圖13顯示由單獨(dú)的17 β -雌二醇，或者17 β -雌二醇與UV過濾劑B-MDM、OMC或 OD-PABA的組合誘導(dǎo)的肝GFP信號。圖14顯示HMS能夠以劑量依賴的方式提高17 β -雌二醇誘導(dǎo)的肝GFP信號。圖15顯示多環(huán)麝香AHTN能夠降低17 β -雌二醇誘導(dǎo)的肝GFP信號。
具體實(shí)施例方式一方面，本發(fā)明涉及包含表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因魚，所述表達(dá)盒包含從青鏘魚分離的雌激素反應(yīng)5'-調(diào)控核苷酸序列，其中所述雌激素反應(yīng)5'-調(diào)控核苷酸序列可操作地連接到所述報告核苷酸序列的5'端。當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因魚接觸包含雌激素或雌激素樣化合物的液體介質(zhì)時，所述報告核苷酸序列表達(dá)能夠在體內(nèi)或體外檢測的相應(yīng)報告蛋白。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因魚可用于各種應(yīng)用，包括但不限于，用于檢測雌激素化合物和抗雌激素化合物，監(jiān)測環(huán)境中的雌激素樣活性，以及研究肝臟的再生。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因魚可以是各種淡水、半咸水或咸水(海水)魚類，包括但不限于青鏘種(Oryzias species)和鯉種(Danio species)的魚。青鏘屬的魚屬于異鏘(Adrianichthyidae)科，包括例如，黑點(diǎn)青鏘(Oryzias melastigma,別名恒河青鏘(Oryzias dancena)(海水或半咸水青鏘)、日本青鏘(Oryzias latipes)、西里伯其i 青鏘(Oryzias celebensis)、花斑青鏘(Oryzias marmoratus)、印尼青鏘(Oryzias matanensis)(Oryziasnigrimas, H#t )(Oryzias orthognathus buntingi)和深青鏘(Oryzias profundicola)。鯉屬的魚屬于鯉(Cyprinidae)科，包括例如斑馬魚(Danio rerio)、閃電斑馬魚(Danio albolineatus)、珍珠斑馬魚(Danio abolineatus) >ΦΙ ! 3 ^H. (Danio choprae) ^^!!. (Danio dangila) ^ : ! !!. (Danio erythromicron)、1面甸斑馬魚(Danio feegradei)、克氏斑馬魚(Danio kerri) > Danio kyathit>IiIMSE^iI. (Danio margaritatus) > Danio meghalayensis> 11 ] !!. (Danio nigrofasciatus)禾口3 馬H (Danio roseus)。關(guān)于黑點(diǎn)青鏘魚(0. melastigma)，此種是經(jīng)鑒定屬于青鏘屬的很多青鏘種之一(上文列出了某些種)。黑點(diǎn)青鏘魚產(chǎn)于巴基斯坦、印度、緬甸和泰國的近海和淡水水域 (K. Naruse，F(xiàn)ish Biol. L. Medaka 8 1_9 (1996))，并且生長在鹽度在千分之 0 35 (0 35ppt)的水域中。此外，該黑點(diǎn)青鏘魚對于轉(zhuǎn)基因開發(fā)具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括(1)體型小(成體魚為2-3厘米)；( 傳代時間相對短個月)；C3)性別二態(tài)性(例如，雌魚具有扁平的臀鰭遠(yuǎn)極面，而雄魚則由于分離的鰭條較長以致其臀鰭是凸起的)；(4)生長繁殖能力強(qiáng)；(5)半透明的卵和幼體(直至孵化后15天)，其有助于放置DNA微注射針以及觀察內(nèi)部器官；和(6)能適合用于生產(chǎn)其他青鏘種(例如日本青鏘)轉(zhuǎn)基因魚的各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。關(guān)于黑點(diǎn)青鏘魚的強(qiáng)生產(chǎn)繁殖能力，該魚可以在全年誘導(dǎo)產(chǎn)卵，在保持的室內(nèi)環(huán)境下(例如，觀士 rc，14小時-光/8小時-暗的恒定光循環(huán)，飼喂商購的無激素片狀食物和鹵蟲(Artemia salina))，每對雌魚和雄魚能夠在長達(dá)數(shù)月的時間內(nèi)每天產(chǎn)卵20-30枚。 卵通常在孵化11-15天。日本青鏘已用于生產(chǎn)攜帶各種轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因魚(例如，K. Ozato et al.，Cell Differ. 19 :237-244(1986) ；K. Inoue et al.，Cell Difer. Dev. 27(1) :57-68(1989); Ε. Tamiya et al., Nucleic Acids Res. 18 :1072(1990) ；K. Inoue et al., Cell Differ. Dev. 29 (2) :123-128(1990) ;J. Lu et al. , Mol. Marine Biol, and Biotechnol. 1(4/5) 366-375(1992) ；H. J. Tsai et al. ,Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 4(1) :1-9(1995) ；R. N. Winn et al.，Marine Env. Res. 40 (3) :247-265 (1995))。研究顯示黑點(diǎn)青鏘和日本青鏘這兩種青鏘之間具有高度的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和基因組類似性，并且易于將日本青鏘的轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于黑點(diǎn)青鏘(X. Chen et al. , Ectoxicol. Environ. Saf. 71 :200-208(2008) ；X. Chen et al. , Comp.Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 149 :647-655 (2009))。在一個實(shí)施方式中，對本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行工程化，使其包含一個或多個拷貝的線性化核酸序列，所述核酸序列包含雌激素靶基因的啟動子區(qū)，其與報告基因(例如，熒光蛋白基因)的編碼區(qū)可操作地連接，然后側(cè)翼有終止序列(例如，mRNA聚腺苷酸化信號序列)。啟動子區(qū)序列和終止序列可源自相同的雌激素靶基因，但本發(fā)明并不要求它們具有相同的來源。適合的啟動子區(qū)可以是源自雌激素依賴性基因的啟動子區(qū)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及的具體雌激素依賴性基因可包括，但不限于來自黑點(diǎn)青鏘的卵殼蛋白 H(choriogenin H)基因(此基因縮寫為"omChgH")和來自日本青鏘的卵殼蛋白H基因 (此基因縮寫為〃 olChgH")。已表征黑點(diǎn)青鏘omChgH基因?qū)Υ萍に睾痛萍に貥游镔|(zhì)高度敏感。已測定出黑點(diǎn)青鏘omChgH基因的完整編碼序列，并保藏為GenBank登錄號No. EF392365。在本文中使用的omChgH基因編碼序列對應(yīng)于SEQ ID N0. 1，如下所示1gaattcactagtgattactatagggcacgcgtggtcgacggcccgggctggtatcgtgag
61ccatgtatcgcgtatcgtatcgtatcgtgaggtacccagtgattcccagccctaataatt
121atggctaaatactatatatgtagaaatctaactgttgttaaaaaagccagagttttttta
181atcttcacaaagaaattgttttgcaaattaatgaaaatccaatgcaaaagctgttaggac
241agtcgaagcctggacttgtttggcatcatattttattattattattatgattcctttctt
301ttgttaccccctggcaagttcatatcaattattctgtaattctcggtattggatcattta
361ttctttatatgtgctacattttgacaaaaaaaaatcgatattatgaacattataccttta
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)盒，其包含編碼報告蛋白的報告核苷酸序列；從青鏘魚分離的雌激素反應(yīng)5'-調(diào)控核苷酸序列，其中所述調(diào)控核苷酸序列可操作地連接到所述報告核苷酸序列的5'端，以在雌激素或雌激素樣化合物存在下誘導(dǎo)報告蛋白表達(dá)；和可操作地連接到所述報告核苷酸序列3'端的3'-調(diào)控區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述5'-調(diào)控核苷酸序列分離自黑點(diǎn)青鏘魚。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其中所述5'-調(diào)控核苷酸序列源自黑點(diǎn)青鏘卵殼蛋白H基因的啟動子區(qū)，所述卵殼蛋白H基因具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其中所述源自黑點(diǎn)青鏘卵殼蛋白H基因的啟動子區(qū)的 5'-調(diào)控核苷酸序列包含選自SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4組成的組的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述報告蛋白是自體熒光蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)盒，其中所述自體熒光蛋白選自增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、黃色熒光蛋白(YFP)和紅色熒光蛋白 (RFP)組成的組。
7.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述3'-調(diào)控區(qū)包含mRNA聚腺苷酸化信號。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)盒，其中所述mRNA聚腺苷酸化信號是青鏘魚卵殼蛋白H基因的3'-側(cè)翼區(qū)，所述青鏘魚選自黑點(diǎn)青鏘和日本青鏘組成的組。
9.如權(quán)利要求8所述的表達(dá)盒，其中所述卵殼蛋白H基因的3'-側(cè)翼區(qū)包含卵殼蛋白H基因的3’ -UTR(非翻譯區(qū))和聚腺苷酸化尾序列。
10.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)盒，其中所述3'-調(diào)控區(qū)包含SEQID NO :5的核苷酸序列。
11.一種轉(zhuǎn)化載體，其包含權(quán)利要求1的表達(dá)盒。
12.—種宿主細(xì)胞，其是由權(quán)利要求1的表達(dá)盒轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
13.—種水生動物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞包含至少一個權(quán)利要求1的表達(dá)盒。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述水生動物選自青鏘種和鯉種組成的組。
15.如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中所述青鏘種選自黑點(diǎn)青鏘和日本青鏘組成的組。
16.一種轉(zhuǎn)基因魚，其包含 至少一個權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中所述轉(zhuǎn)基因魚在接觸包含雌激素或雌激素樣化合物的液體介質(zhì)時表現(xiàn)出可觀測的標(biāo)記，并且其中所述可觀測的標(biāo)記包含由至少一個表達(dá)盒表達(dá)的報告蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述可觀測的標(biāo)記是在體內(nèi)可見的。
18.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是半咸水魚。
19.如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述半咸水魚是黑點(diǎn)青鏘魚。
20.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚處于選自由胚胎階段、幼體階段和成體階段組成的組的發(fā)育階段。
21.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因魚，其中所述魚是雄性成體魚。
22.一種用于檢測液體介質(zhì)中雌激素或雌激素樣化合物存在的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法， 所述方法包括使用權(quán)利要求1的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化非轉(zhuǎn)基因魚，從而獲得包含至少一個所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因魚。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述魚是黑點(diǎn)青鏘魚。
24.一種篩選液體介質(zhì)中雌激素物質(zhì)的方法，所述方法包括使權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)基因魚接觸用于檢測雌激素物質(zhì)的存在的液體介質(zhì)；和測定所述轉(zhuǎn)基因魚是否表現(xiàn)出通過誘導(dǎo)報告基因表達(dá)產(chǎn)生的可觀測的標(biāo)記， 其中所述可觀測的標(biāo)記的存在表明所述液體介質(zhì)包含雌激素物質(zhì)。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述液體介質(zhì)包括已添加有目標(biāo)測試物質(zhì)的水樣。
26.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述液體介質(zhì)包括未添加目標(biāo)測試物質(zhì)的水樣。
27.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述測定步驟包括體內(nèi)自體熒光顯微鏡檢查，其中所述報告基因編碼自體熒光報告蛋白。
28.如權(quán)利要求M所述的方法，還包括對根據(jù)所述測定步驟鑒定為雌激素物質(zhì)的測試物質(zhì)的雌激素樣活性進(jìn)行量化，其中如果所述轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出可觀測的標(biāo)記，則將所述測試物質(zhì)鑒定為雌激素物質(zhì)。
29.如權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述量化包括 產(chǎn)生所述可觀測的標(biāo)記的至少一副圖像；和使用圖像分析軟件處理所述可觀測的標(biāo)記的至少一副圖像，以量化所述可觀測的標(biāo)記的信號強(qiáng)度。
30.一種篩選具有抗雌激素活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求16的第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚，其中所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚為相同的種，并且處于基本相同的發(fā)育階段；(b)使所述第一轉(zhuǎn)基因魚接觸第一液體介質(zhì)，其中所述第一液體介質(zhì)包含雌激素或雌激素樣化合物；(c)使所述第二轉(zhuǎn)基因魚接觸第二液體介質(zhì)，其中所述第二液體介質(zhì)包含第一液體介質(zhì)和測試化合物；和(d)將所述第一轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的任何可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度與所述第二轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的任何可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度進(jìn)行比較，其中，與所述第一轉(zhuǎn)基因魚中可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度相比，所述第二轉(zhuǎn)基因魚中可觀測的標(biāo)記的定量強(qiáng)度下降表明所述測試化合物具有抗雌激素活性。
31.一種用于研究雌激素化合物對肝臟再生的影響的方法，所述方法包括對權(quán)利要求16的成體轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述轉(zhuǎn)基因魚的部分肝臟；使所述轉(zhuǎn)基因魚接觸包含測試雌激素化合物的測試液體介質(zhì)；和分析所述轉(zhuǎn)基因魚的肝臟以檢測肝組織的任何再生。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述分析步驟包括比較取自以下階段的所述轉(zhuǎn)基因魚的肝臟再生參數(shù)(i)部分肝切除之前；( )部分肝切除之后，但在接觸步驟之前；和(iii)部分肝切除之后且在接觸步驟之后，其中所述肝臟再生參數(shù)包括肝臟體積、肝臟形狀、肝臟重量和/或肝臟重量與體重的比值，和其中轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的可觀測的標(biāo)記的存在和/或強(qiáng)度的測定有效地輔助肝臟再生參數(shù)的測量。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中使用共聚焦顯微鏡并結(jié)合圖像分析軟件，通過獲得肝臟的三維圖像來測量所述肝臟形狀和肝臟體積參數(shù)。
34.一種用于研究不同雌激素化合物對肝臟再生的影響的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求16的第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚，其中所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚為相同種的成體魚；(b)使所述第一轉(zhuǎn)基因魚接觸包含第一測試雌激素化合物溶液的第一液體介質(zhì)；(c)使所述第二轉(zhuǎn)基因魚接觸包含第二測試雌激素化合物溶液的第二液體介質(zhì)；(d)量化所述第一轉(zhuǎn)基因魚和所述第二轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的任何可觀測的標(biāo)記的強(qiáng)度；(e)對所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚進(jìn)行部分肝切除，其中所述部分肝切除是有效去除所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚的部分肝臟；(f)重復(fù)步驟(b)到步驟(d)；和(g)分析所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚的肝臟，以比較所述第一液體介質(zhì)和所述第二液體介質(zhì)中包含的雌激素化合物對肝組織任何再生的影響。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分析步驟包括比較取自以下階段的所述轉(zhuǎn)基因魚的肝臟再生參數(shù)(i)部分肝切除之前；( )部分肝切除之后，但在接觸步驟之前；和(iii)部分肝切除之后且在接觸步驟之后，其中所述肝臟再生參數(shù)包括肝臟體積、肝臟形狀、肝臟重量和/或肝臟重量與體重的比例，和其中轉(zhuǎn)基因魚表現(xiàn)出的可觀測的標(biāo)記的存在和/或強(qiáng)度的測定有效地輔助肝臟再生參數(shù)的測量。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中使用共聚焦顯微鏡并結(jié)合圖像分析軟件，通過獲得肝臟的三維圖像來測量所述肝臟形狀和肝臟體積參數(shù)。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，還包括將表現(xiàn)出可觀測的標(biāo)記的肝細(xì)胞與其他未表現(xiàn)出可觀測的標(biāo)記的肝細(xì)胞分離，其中使用流式細(xì)胞計進(jìn)行所述分離。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，還包括對所述第一轉(zhuǎn)基因魚和第二轉(zhuǎn)基因魚的肝臟進(jìn)行肝細(xì)胞代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)盒，其包含編碼報告蛋白的報告核苷酸序列、從青鳉魚分離的雌激素反應(yīng)5′-調(diào)控核苷酸序列和可操作地連接到所述報告核苷酸序列3′端的3′-調(diào)控區(qū)，其中所述調(diào)控核苷酸序列可操作地連接到所述報告核苷酸序列的5′端，以在雌激素或雌激素樣化合物存在下誘導(dǎo)報告蛋白表達(dá)。本發(fā)明還涉及具有上述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因魚。本發(fā)明還涉及出于各種目的使用所述轉(zhuǎn)基因魚的方法，所述目的包括例如(1)鑒定雌激素內(nèi)分泌干擾物；(2)監(jiān)測測試樣品的雌激素樣活性；(3)鑒定抗雌激素內(nèi)分泌干擾物；和(4)研究內(nèi)分泌干擾物對肝臟再生的影響。本發(fā)明還公開了宿主細(xì)胞和水生動物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞等。
文檔編號G01N21/64GK102199595SQ20101024687
公開日2011年9月28日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者鄭淑嫻, 陳雪平 申請人:香港城市大學(xué)