專利名稱：一種基于Fe₃O₄@Au的磁性弛豫開關(guān)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于磁性弛豫開關(guān)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于Fe304@AU磁性納米顆 粒的磁性弛豫開關(guān)及其制備方法。
背景技術(shù)：
基于超順磁性納米顆粒的生物傳感器是近幾年發(fā)展起來的一種高效檢測技 術(shù)，它突破了磁共振在體外應(yīng)用的限制，這種技術(shù)被稱為磁性弛豫開關(guān)技術(shù)(Magnetic RelaxationSwitch)。在一個外加磁場中，順磁性顆粒本身的磁偶極會在其周圍產(chǎn)生一個微 小的磁場擾動，引起在此影響范圍內(nèi)的水分子中^核自旋退化，這樣通過無線電波脈沖序 列檢測的屮信號會減弱，得到的弛豫指數(shù)退化曲線所確定的時間常數(shù)即為T2，當目標分子 出現(xiàn)在溶液中時，磁性顆粒表面的基團與目標分子結(jié)合，引起磁性顆粒從分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?團聚狀態(tài)，本來分散的微磁場“團聚”以后對水分子中^核的自旋退化作用發(fā)生改變，導(dǎo)致 T2的變化，T2的變化量與目標分子濃度相關(guān)，據(jù)此可對目標分子作定量分析，而在檢測目標 分子的過程中，磁顆粒濃度無需知道。目前對生物分子的檢測大多采用光學(xué)分析的辦法，包括紫外可見吸收分析、熒光 發(fā)光分析、濁度分析等，這些技術(shù)都需要樣品有良好的透光性。MRSw技術(shù)的優(yōu)勢在于可以檢 測渾濁溶液中目標分子的含量，例如血液，細胞培養(yǎng)液，牛奶等，這樣可以大大減少繁復(fù)的 樣品預(yù)處理步驟。MRSw技術(shù)目前處于起步階段，盡管有明顯的實用前景，但MRSw的T2信號變化與 被分析物的濃度相關(guān)性不夠穩(wěn)定，而且T2信號在被分析物的濃度達到檢測范圍最高值之前 和之后有截然不同的變化趨勢，很有必要采用其它檢測手段對弛豫開關(guān)技術(shù)進行補充和論 證，以多重檢測的方式提高MRSw的實際應(yīng)用價值。另一方面，一般的磁性納米顆粒表面修 飾基團并不容易，要修飾不同的基團更是困難，而利用Au與巰基的特殊鍵合作用可以使探 針顆粒表面修飾識別基團或抗體變得輕而易舉。以 magnetic relaxation switches 和 Fe304@Au 納米顆粒為關(guān)鍵詞分別對 1992 年以來的全球?qū)＠麢z索，其中以magnetic relaxation switches為關(guān)鍵詞沒有找到相關(guān) 的專利，另以Magnetic、Relaxation以及Sensor為關(guān)鍵詞組合對國際專利檢索，其中涉 及磁性弛豫開關(guān)的專利 1 項 US20060269965(Water Relaxation-Based Sensor)；而涉及 Fe304iAu納米顆粒的專利有2項，分別是一種金磁核殼納米粒子的制備方法(申請專利號 CN200810029399. 0)，該專利描述了一種在超聲作用下合成Fe304@Au納米顆粒的方法；另一 篇專利是一種金包覆磁粒原位引發(fā)高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測大腸桿菌的新方法(申請專利號 CN200810031350. 9)，該專利描述的是一種利用Fe304@Au納米顆粒被氧化釋放出Au3+，加入 魯米諾后弓I發(fā)化學(xué)發(fā)光，然后對大腸桿菌進行檢測的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計一種基于Fe304@AU核殼結(jié)構(gòu)磁性納米顆粒的磁性弛豫開關(guān)及其制備方法。本發(fā)明設(shè)計的基于Fe304@AU的磁性弛豫開關(guān)，采用的探針為表面修飾有識別分子 的花朵狀磁性納米顆粒，該花朵狀磁性納米顆粒為Fe304@AU核殼結(jié)構(gòu)。所述的表面修飾有識別分子的花朵狀磁性納米顆粒探針的粒徑在50-70nm范圍， 外觀呈花朵狀。所述的表面修飾有識別分子的花朵狀磁性納米顆粒探針的元素質(zhì)量比(通過ICP 測定)為 Fe Au = 1 3.4。所述的表面修飾有識別分子的花朵狀磁性納米顆粒探針的紫外可見吸收峰在 578nm 處。所述的表面修飾有識別分子的花朵狀磁性納米顆粒探針的弛豫度為R2 = 9. 35mM_1 s-1。本發(fā)明提出的基于Fe304@AU核殼結(jié)構(gòu)磁性納米顆粒的磁性弛豫開關(guān)的制備步驟 如下a.在葡聚糖溶液中通過共沉淀的方法合成直徑小于5nm的Fe304顆粒；b.在鐵濃度為14—16mg Fe/mL的Fe304水溶液中通過葡萄糖還原氯金酸的方法 合成花朵狀Fe304@AU核殼結(jié)構(gòu)磁性納米顆粒；c.在Fe304@AU納米顆粒表面自組裝上胱胺，并通過EDC/NHS催化連接上生物素， 獲得功能化的磁性納米顆粒BiOtin-Fe304@Au。往上述分散好的BiOtin-Fe304@Au水溶液中加入不同量的抗生物素蛋白Avidin， 反應(yīng)lOmin后測定溶液的自旋-自旋弛豫時間T2。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點1、采用的花朵狀Fe304@AU納米顆粒探針弛豫度大小合適，能在溶液中長時間保持
穩(wěn)定；2、顆粒尺寸均勻，粒徑分布在50-70nm之間，非常有利于依據(jù)分散和團聚間轉(zhuǎn)換 而進行檢測的磁性弛豫開關(guān)技術(shù)的實施，有較低的檢測限；3、磁性納米顆粒表面包覆有金層，能夠很方便地針對所要檢測的被分析物的類型 和性質(zhì)修飾上特定的識別分子或蛋白；4、核殼結(jié)構(gòu)顆粒在紫外可見吸收光譜中有特殊吸收，能夠方便的引入紫外可見吸 收檢測技術(shù)對檢測結(jié)果進行印證。


圖1 (A)為花朵狀Fe304@Au磁性納米顆粒的TEM全貌圖；⑶為花朵狀Fe304@Au磁 性納米顆粒的TEM放大圖。圖2 (A)為花朵狀Fe304@Au磁性納米顆粒的X射線能譜(EDX)圖；(B)為EDX測得 的花朵狀Fe304@AU磁性納米顆粒的元素質(zhì)量百分數(shù)圖。圖3 (A)為花朵狀Fe304@Au磁性納米顆粒溶液的紫外可見吸收光譜圖；(B)為通過 擬合1/T2對Fe濃度的關(guān)系直線求出Fe304@AU磁性納米顆粒的弛豫度。圖4為Biotin-Fe304@Au溶液以及未修飾Biotin的Fe304@Au溶液的T2時間與 Avidin濃度的關(guān)系圖；插圖為0-40nM的Avidin濃度范圍內(nèi)溶液T2對Avidin濃度的擬合線性關(guān)系圖。圖5為不同Avidin濃度下，BiOtin-Fe304@Au溶液的紫外可見吸收光譜圖；插圖為 各吸收譜線最大吸收峰位置與Avidin濃度的關(guān)系圖。圖6 (A)為不同Avidin濃度下，BiOtin-Fe304@Au溶液顆粒的動態(tài)光散射粒徑分布 圖；(B)為各粒徑分布圖分布峰位置與Avidin濃度的關(guān)系圖。圖7為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)圖示。
具體實施例方式實施例1 合成葡聚糖包裹的納米Fe304室溫下在15mL葡聚糖水溶液(15% w/w，Mw = 20000)溶液中加入4mL濃NH40H( > 25%w/w)，使溶液pH值約為11. 7，然后在磁力攪拌下水浴加熱到25°C。把0. 75gFeCl3 -6H20 和0. 28g FeS04 *4H20溶解在5mL水中，用0. 22 y m的濾膜過濾后逐滴加入到葡聚糖溶液中， 溶液變?yōu)楹谏珳啙嵋?，攪?. 5h。之后渾濁液lOOOOrpm離心20min除去較大的顆粒，上層 橙紅色澄清液用去離子水透析24h(使用25kDa的透析袋)，以除去溶液中過量的銨離子、 游離的葡聚糖等。之后再通過離心超濾對上述溶液進行濃縮處理。TEM圖顯示得到的Fe304 納米顆粒尺寸在3-5nm之間，ICP結(jié)果顯示濃縮后的溶液濃度為0. 602mgFe/mL。 實施例2 合成花朵狀Fe304@Au磁性納米顆粒取5mL上述濃縮后的Fe304納米顆粒溶液，加入4mL去離子水，磁力攪拌下加入 200 uL的NH20H(w/w = 1% )水溶液，攪拌lOmin，加入0. 5g葡萄糖作為還原劑，然后加入 50 ii L的NH40H(7% ),使溶液pH值約為9. 0，之后分4次每次加入100 uL 0. 25%的HAuC14 水溶液，一共加入400 u L，每兩次之間間隔為lOmin，隨著HAuC14的加入，溶液逐漸從紅棕 色轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色。之后在7000rpm下離心6min，去除上清液，下層沉淀重新溶解在水中，之 后經(jīng)過反復(fù)超聲分散(80W)和離心分離洗滌5次去除沒有包裹Au的Fe304，最終溶解在1 % 葡聚糖溶液中，溶液呈深藍色，能在一周內(nèi)保持穩(wěn)定。TEM圖顯示顆粒外形類似花朵，粒徑分 布在50-70nm之間(圖1)，EDX顯示顆粒中Fe與Au的比值為1 11 (w/w)(圖2)，與ICP 結(jié)果吻合，UV-Vis顯示在578nm處有明顯的吸收峰(圖3A)。實施例3 在Fe304@Au磁性納米顆粒表面修飾生物素首先在顆粒表面自組裝上胱胺取2mL上述Fe304@Au溶液7000rpm離心6mins去 除上清液，加入2mL ImM的PBS (pH = 8. 0)，邊超聲邊加入胱胺溶液，使其最終濃度為4mM， 繼續(xù)超聲lOmin，然后磁力攪拌8h，再離心并用去離子水洗滌3次，最后超聲分散在5mL ImM 的PBS(pH = 8. 0)溶液中，加入200 y L 5%的葡聚糖溶液以提高溶液的穩(wěn)定性。然后通過胱胺連接Biotin 把 2mg Biotin, 10mg EDC, lmg NHS 溶解在 2mL 2mM 的PBS(pH = 7.4)緩沖液中，輕輕振搖lOmins，然后加入到上述Fe304@Au溶液中，磁力 攪拌12h后7000rpm離心6min，去除上清液，并用去離子水離心洗滌3次，然后分散在 3mL去離子水中，得到Biotin-Fe304@Au溶液，ICP測得溶液中Fe含量為31. 65 u g/mL, Au含量為107. 47 u g/mL,通過核磁共振成像分析儀測得BiOtin-Fe304@Au的弛豫度R2為 9. 35mM_1 ‘ (圖 3B)實施例4 磁性弛豫開關(guān)分析檢測抗生物素蛋白先對上述BiOtin-Fe304@Au溶液超聲分散5min，再用0. 22 y m的濾膜過濾溶液，得到的濾出液即可作為母液使用。往核磁管中加入150 yL母液，加入不同量的0. lmg/ mLAvidin溶液，再加入一定量的2mM PBS(pH = 7. 4)緩沖液，使總體積為200 u L，此時各 核磁管中 Avidin 的濃度分別為0. 00，0. 15，3. 79，6. 06，7. 58，22. 73，37. 88，53. 03，75. 76， 151. 52和227. 27nM。搖勻后放在37°C水浴中反應(yīng)5min，之后把核磁管依次放在核磁共振 成像分析儀中測定自旋_自旋弛豫時間T2，得到不同的Avidin濃度下溶液的T2時間，每個 濃度測定三次，最后以T2對Avidin濃度作圖(圖4)，為了證明顆粒的團聚是由Biotin與 Avidin特異性相互作用而不是Avidin的非特異性吸附所引起，往不含Biotin的Fe304@Au 溶液中加入0-150nM的Avidin，再測定溶液的T2時間，以T2對Avidin濃度作圖(圖4)。實施例5 紫外可見(UV-Vis)吸收光譜及動態(tài)光散射(DLS)粒徑分析印證檢測結(jié) 果上述測完T2后的溶液分別注入微量比色皿中測定紫外可見吸收光譜，以去離子水 作為空白，分析采用尋峰方式，最后把各濃度對應(yīng)的吸收光譜繪于同一張圖中(圖5)，并以 各吸收光譜的吸收峰位置對Avidin濃度作圖(圖5插圖)。上述各溶液稀釋10倍后通過動態(tài)光散射粒度儀測定溶液中顆粒粒徑的強度分布 (圖6A)，再以各溶液中顆粒粒徑強度分布的峰位置對原溶液中Avidin濃度作圖(圖6B)。采用本發(fā)明檢測技術(shù)以Avidin作為模型蛋白能夠檢測到lOnM的蛋白濃度，檢測 線性范圍在5-35nM之間。在Fe304@AU顆粒表面修飾不同類型的識別分子要比在普通磁顆 粒表面修飾方便得多。而且Fe304@AU復(fù)合型探針有著特殊優(yōu)勢，能夠方便的引入UV-Vis分 析和DLS粒徑分析技術(shù)對檢測結(jié)果進行相互印證，可以保證檢測有較高的置信度。
權(quán)利要求
一種基于Fe3O4@Au的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于采用的探針為表面修飾有識別分子的花朵狀磁性納米顆粒，該花朵狀磁性納米顆粒為Fe3O4@Au核殼結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于表面修飾有識別分 子的花朵狀磁性納米顆粒探針的粒徑在50-70nm范圍。
3.如權(quán)利要求2所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于表面修飾有識別分 子的花朵狀磁性納米顆粒探針的元素質(zhì)量比為Fe Au=I 3.4。
4.如權(quán)利要求2所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于表面修飾有識別分 子的花朵狀磁性納米顆粒探針的紫外可見吸收峰在578nm處。
5.如權(quán)利要求2所述的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫開關(guān)，其特征在于表面修飾有識別分 子的花朵狀磁性納米顆粒探針的弛豫度為R2 = 9. 35ml-1 · s—1。
6.如權(quán)利要求1所采用的基于Fe3O4OAu的磁性弛豫開關(guān)的制備方法，其特征在于具體 步驟如下a.在葡聚糖溶液中通過共沉淀的方法合成直徑小于5nm的Fe3O4顆粒；b.在鐵濃度為14—16mgFe/mL的Fe3O4水溶液中通過葡萄糖還原氯金酸的方法合成 花朵狀Fe3O4OAu核殼結(jié)構(gòu)磁性納米顆粒；c.在Fe3O4OAu納米顆粒表面自組裝上胱胺，并通過EDC/NHS催化連接上生物素 Biotin,獲得功能化的磁性納米顆粒Biotin-Fe304@Au。
全文摘要
本發(fā)明屬于磁性弛豫開關(guān)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于Fe3O4@Au的磁性弛豫開關(guān)及其制備方法。本發(fā)明的磁性弛豫開關(guān)，采用的探針為表面修飾有識別分子的花朵狀磁性納米顆粒，該花朵狀磁性納米顆粒為Fe3O4@Au核殼結(jié)構(gòu)。探針的粒徑在50-70nm，探針的弛豫度為R2＝9.35mM-1·s-1。本發(fā)明通過在納米顆粒表面金層上修飾識別分子生物素，實現(xiàn)對模型蛋白Avidin的快速簡便檢測，檢測限低至10nM的水平。本發(fā)明解決了目前磁性弛豫開關(guān)技術(shù)實施不方便，檢測結(jié)果不穩(wěn)定的問題。
文檔編號G01N21/33GK101865984SQ20101019163
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者孔繼烈, 梁國海 申請人:復(fù)旦大學(xué)