專利名稱：梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種梅毒特異性IgM抗體檢測試劑，尤其是涉及一種采用膠體金免疫 層析技術(shù)(immunochromatography)進(jìn)行的梅毒特異性IgM抗體快速檢測試劑條及其制備方法。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播 性疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或 者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液，播散全身，使機(jī)體幾乎 所有的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和 潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言“由于有高敏度檢測方法和高效的治療方案， 梅毒是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，至今梅毒 依然是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大約有1200萬的患 #，胃中 60 力■^女gii#。 ( :He￡ilth Protection Agency Centre for Infections. International Encyclopediaof Public Health-Syphi1 is[M] London, UK :Health Protection Agency Centre，2008，289-297)事實(shí)上，梅毒的感染現(xiàn)狀可能要比想象中的更 讓人悲觀。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試 驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測兩大類型。梅毒特異性抗體IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗體分別于2周和4周后產(chǎn)生，即使患者經(jīng)過足夠治療，其仍能長期存在，甚至終身不消失 (參見:Luis J F, Felipe U S, Santa G C, et al. Evaluation of a rapid strip and a particle agglutinationtests for syphilis diagnosis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2007，59 :123_126)；而另一種抗體物質(zhì)反應(yīng)素產(chǎn)生較晚，一般 在受感染后5 7周產(chǎn)生(參見林月圓.TPPA和TRUST在梅毒診斷中的價(jià)值與臨床相關(guān) 問題[J].放射免疫學(xué)雜志，2009，22 (3) :295-297.)，而且晚期梅毒、梅毒治療后期以及潛 伏梅毒可能陰性。因此梅毒特異性抗體的陽性率、敏感性顯著高于反應(yīng)素。TP-IgM是梅 毒感染后，機(jī)體最先出現(xiàn)的特異性抗體。只要有活的梅毒螺旋體存在，其TP-IgM將會(huì)維持
胃白勺TfC。 Martina H ^ ( #JAL :Martina H, Daan ff N, Mart M, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19S fluorescenttreponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis [J]. DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease,2007,59 :61_66.)認(rèn)為 TP-IgM 是 梅毒早期感染并活動(dòng)的一項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志，李步榮等(參見李步榮，賀軍濤，張毅，等.梅 毒螺旋體IgM抗體檢測的臨床意義[J],第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,28(16) 1495-1497) 認(rèn)為TP-IgM與TP-DNA —樣，代表著梅毒傳染性指標(biāo)。在排除近期抗梅毒治療的前提下，TP-IgM若不轉(zhuǎn)陰，提示體內(nèi)可能殘存梅毒螺旋體或治療不徹底。TP-IgM陰轉(zhuǎn)者隨訪時(shí)再轉(zhuǎn) 陽性，表明再次感染梅毒(參見Rawstron SA, Mehta S, Bromberg K, et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specific IgMenzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in the diagnosisofmaternal and congenital syphilis [J], Sex Transm Dis，2004，31 (2) : 123-126)。盡管 TP-IgM 陰性不能完全排除傳 染性，但TP-IgM陽性必定提示該患者具有傳染性。早期的血清學(xué)方法使用完整梅毒螺旋體作為抗原，研究和診斷用的TP是以TP感 染兔睪丸獲得，這種方法花費(fèi)大、獲得的TP量少、不純(混有宿主蛋白)，與其他病原體存 在交叉反應(yīng)，因此假陽性也時(shí)有發(fā)生。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的普及及梅毒螺旋體抗原的相 繼克隆，將重組抗原應(yīng)用于梅毒實(shí)驗(yàn)已經(jīng)越來越多。目前研究比較多的TP抗原有TPW7、 TPN47、TPN15, TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。采用重組 DNA 技術(shù)制備的重 組抗原可以克服完整TP抗原的缺點(diǎn)，能快速、經(jīng)濟(jì)地制備無限量特異重組TP抗原。梅毒特異性抗體檢測是梅毒確證試驗(yàn)，包括TPHA，TPPA，ELISA，F(xiàn)TA-ABS及 Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對(duì)嚴(yán)峻的防制形式，不但需要特異準(zhǔn)確的檢測 手段，還需要一種更簡便快捷的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對(duì)策。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其 制備方法。本發(fā)明所述梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條設(shè)有載體板、加樣 墊、膠體金墊、硝酸纖維膜(NC膜)、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對(duì)照線和吸收墊。加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端 設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在 硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在 梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段y鏈單克隆抗體，在對(duì)照線處包被 羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體。所述載體板可采用PVC板。所述梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，包括以下步 驟1)制備梅毒重組抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達(dá)，得梅毒重組抗原TPN17和TPN472)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜IgM檢測線上包被抗人IgM特異性片段y鏈單克隆抗體，在對(duì)照 線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47 IgG抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸lmL加入到100mL去離 子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0. 01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱 攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)膠體金與TPm7、TPN47的標(biāo)記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標(biāo)記取膠體金IOm L，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 pH5. 4，加 IOOyg 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 Im L 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh， 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10m L，40C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至lmL，得膠體金標(biāo)記的TPN17抗原。膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標(biāo)記同上操作，得膠體金標(biāo)記的TPN47抗原；
將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一 端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè) 在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上； 在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對(duì)照線處包 被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得梅毒特異性IgM抗體膠 體金免疫層析檢測試劑條。在步驟2)中，所述抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL，羊 抗梅毒抗原TPNl7和TPN47的IgG抗體由抗TPm7_IgG抗體與抗TPN47_IgG抗體按體積比 1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL ；三者點(diǎn)樣量為1 μ L/cm。在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的濃度可為2%。在步驟4)中，所述將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合， 最好膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原以體積比1 (0. 2 5)混合； 所述烘干的溫度可為37°C。本發(fā)明提供了一種采用膠體金免疫層析技術(shù)建立梅毒特異性IgM抗體快速檢測 試劑條，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標(biāo)本中梅毒特異性IgM抗體的檢測。該檢測方 法所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性強(qiáng)，靈 敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。


圖1為本發(fā)明所述梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條實(shí)施例的結(jié)構(gòu) 組成示意圖。圖2為實(shí)驗(yàn)結(jié)果模式示意圖。在圖2中，A為使用前的示意圖，B為無效試驗(yàn)(產(chǎn) 品質(zhì)量問題)，C為陰性結(jié)果，D為TP-IgM陽性結(jié)果；6為梅毒特異性IgM抗體檢測線，7為 對(duì)照線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。參見圖1，本發(fā)明所述 梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條實(shí)施例設(shè) 有載體板1、加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜(NC膜)4、梅毒特異性IgM抗體檢測線6、對(duì)照線7和吸收墊8。加樣墊2、膠體金墊3、硝酸纖維膜4和吸收墊8依次粘貼在載體板1上表面，加樣 墊2的一端設(shè)在膠體金墊3的一端上，膠體金墊3的另一端設(shè)在硝酸纖維膜4的一端上，吸 收墊8的一端設(shè)在硝酸纖維膜4的另一端上，梅毒特異性IgM抗體檢測線6和對(duì)照線7依 次設(shè)在硝酸纖維膜4上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單 克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗體。所述載體板采用PVC板。所述梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，包括以下步驟1)制備梅毒重組抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其 表達(dá)，得梅毒重組抗原TPN17和TPN47 ；2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜IgM檢測線上包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對(duì)照 線處包被羊抗梅毒抗原TPW7和ΤΡΝ47 IgG抗體，晾干；所述抗人IgM特異性片段μ鏈單克 隆抗體的濃度為1 4mg/mL，羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體由抗TPm7_IgG抗 體與抗TPN47-IgG抗體按體積比1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL;三者點(diǎn)樣量為IyL/ cm03)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去離 子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱 攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于 棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫凰鰴幟仕崛c的濃度為2%。4)膠體金與TPm7、TPN47的標(biāo)記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標(biāo)記取膠體金IOm L，用0. lmol/L NaOH調(diào)至 ρΗ5· 4，加 100 μ g 丁卩附7，混勻，放置51^11，加入5%85八 ImL 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10m L，40C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀 釋至lmL，得膠體金標(biāo)記的TPN17抗原。膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標(biāo)記同上操作，得膠體金標(biāo)記的TPN47抗原。將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃 纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；所述將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47 抗原混合，是膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原以體積比1 (0. 2 5) 混合；所述烘干的溫度為37°C。5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一 端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè) 在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上； 在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對(duì)照線處包 被羊抗梅毒抗原ΤΡΝ17和ΤΡΝ47的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。以下給出采用梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢測患者的臨床標(biāo)本取待檢標(biāo)本(全血、血清、血漿、腦脊液)5 40 μ L，加樣于梅毒特異性IgM抗體膠 體金免疫層析檢測試劑條樣品處，滴加100 μ L生理鹽水，靜置20min觀察結(jié)果。只在檢測條 對(duì)照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)(T)及對(duì)照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)， 則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對(duì)照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無效結(jié)果(見圖2)。以下給出梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的性能檢定1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點(diǎn)、無裂縫，膠帶無開膠，無切 斜現(xiàn)象。2)陽性標(biāo)本符合率用TP-IgM陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用梅毒 特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢定，計(jì)算陽性符合率。陽性參比血清的確定 采用FTA-ABS(德國歐蒙公司)法確定的臨床標(biāo)本。3)陰性標(biāo)本符合率用50份陰性參比血清檢定，計(jì)算陽性符合率。陰性參比血清 的確定采用TPPA(日本富士株式會(huì)社)法確定的臨床標(biāo)本。4)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征 性血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征 性血清檢測，要求陽性血清檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測結(jié)果不受標(biāo)本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。血清(或血漿)來自本申請(qǐng)人臨床標(biāo)本。7)交叉反應(yīng)采用本梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，進(jìn)行系統(tǒng) 性紅斑狼瘡(η = 30)、類風(fēng)濕病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢 測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。自身免疫系統(tǒng)疾病的血清來自本申請(qǐng)人臨床確診患者。8)穩(wěn)定性檢測應(yīng)用Arrhenius法則，將梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢 測試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下 保存，有效期為18個(gè)月。本發(fā)明的檢測在一條梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條上進(jìn)行，通 過以下兩種方式實(shí)現(xiàn)梅毒特異性IgM抗體的檢測方式一利用膠體金免疫層析技術(shù)，在硝酸纖維素膜上IgM檢測線和對(duì)照線處分 別包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體和羊抗梅毒抗原TPW7和ΤΡΝ47 IgG抗體。 將已純化的金標(biāo)記的梅毒重組抗原TPN17和TPN47以一定的比例混合后預(yù)包被在玻璃纖維 紙上，干燥處理，制備成金膠體墊，再輔以恰當(dāng)?shù)募訕訅|，組合梅毒特異性IgM抗體膠體金 免疫層析檢測試劑條(組裝方式見圖1)。檢測陽性樣本時(shí)，樣本中梅毒特異性IgM抗體與 膠體金標(biāo)記的重組抗原TPN17和/或TPN47結(jié)合形成免疫復(fù)合物。由于層析作用，復(fù)合物 沿吸收墊的吸水紙方向向前移動(dòng)。經(jīng)過檢測線時(shí)，①TP-IgM類免疫復(fù)合物與預(yù)包被的抗人 IgM單克隆抗體結(jié)合形成“AU-TPN17 (和/或TPN47)-特異性抗梅毒IgM抗體-抗人IgM單 克隆抗體_固相材料”夾心物而凝聚顯色；②游離金標(biāo)抗原則在對(duì)照線處與羊抗梅毒抗原 (TPN17和TPN47)抗體結(jié)合而富集顯色。陰性標(biāo)本則僅在對(duì)照線處顯色。
方式二，將方式一的包被抗原、抗體對(duì)調(diào)在硝酸纖維素膜上IgM檢測線和對(duì)照線 處分別包被梅毒重組抗原(TPm7/TPN47組合)和羊抗鼠IgG抗體，將金標(biāo)記的抗人IgM特 異性片段μ鏈單克隆抗體預(yù)包被在玻璃纖維紙上。以下給出具體實(shí)施例。實(shí)施例1
在硝酸纖維素膜(NC膜)IgM檢測線上包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體， 在對(duì)照線處包被羊抗梅毒抗原(ΤΡΝ17和ΤΡΝ47)抗體，室溫晾干，密封室溫保存?zhèn)溆?。其中?抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為lmg/mL，羊抗梅毒抗原(TPN17和TPN47) IgG抗體由抗TPm7-IgG抗體與抗TPN47-IgG抗體按體積比1 1混合，其終濃度為Img/ mL ；二者點(diǎn)樣量為1 μ L/cm。將已純化的金標(biāo)記的梅毒重組抗原TPN17和TPN47以體積比1 1混合后，均勻 地涂于玻璃纖維紙上，在37°C烘干，制備成金膠體墊，密封備用。將固相化的纖維膜與膠體 金結(jié)合的玻璃纖維、吸水紙等按一定順序，通過PVC不干膠底板組合在一起，用切條機(jī)切成 一定寬度檢測條。把梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條與干燥劑一起裝入鋁 箔袋中，機(jī)器封口，密封保存。取待檢標(biāo)本血清10 μ L，加樣于梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條 加樣區(qū)，同時(shí)滴加100 μ L生理鹽水，靜置20min觀察結(jié)果。只在梅毒特異性IgM抗體膠體 金免疫層析檢測試劑條對(duì)照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)及對(duì)照區(qū)均有 一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對(duì)照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無 效結(jié)果。(見圖2)實(shí)施例2與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由TPW7組成，不含有TPN47。結(jié)果判斷與 實(shí)施例1相同。實(shí)施例3與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊僅由TPN47組成，不含有TPW7。結(jié)果判斷與 實(shí)施例1相同。實(shí)施例4與實(shí)施例1相似，區(qū)別在于待檢標(biāo)本為腦脊液標(biāo)本，結(jié)果判斷與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4性能驗(yàn)證試驗(yàn)按實(shí)施例1的方案制備梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測 試劑條，然后進(jìn)行性能驗(yàn)證。1)外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無污染斑點(diǎn)、無裂縫，膠帶無開膠，梅毒 特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條寬度在3士0. 1mm，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標(biāo)本符合率50份經(jīng)FTA-ABS (德國歐蒙公司)檢測確定的TP-IgM陽性參 比血清，采用發(fā)明的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢出TP-IgM陽性50 份，陽性標(biāo)本符合率100%。3)陰性標(biāo)本符合率50份梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(yàn)(TPPA)(日本富士 株式會(huì)社)陰性參比血清，采用梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條檢測未檢 出陽性標(biāo)本，陰性標(biāo)本符合率100%。
4)批內(nèi)差異同一批次梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征 性陽性血清(FTA-ABS(德國歐蒙公司)檢測確定的臨床標(biāo)本陽性TP-IgM參比高、中、低血 清)檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，用特征 性陽性血清(FTA-ABS(德國歐蒙公司)檢測確定的臨床標(biāo)本陽性TP-IgM參比高、中、低血 清)檢測，相同滴度檢測結(jié)果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結(jié)果陰性。6)干擾試驗(yàn)檢測結(jié)果不受標(biāo)本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。7)交叉反應(yīng)采用本梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，進(jìn)行系統(tǒng) 性紅斑狼瘡(η = 30)、類風(fēng)濕病(η = 38)、免疫性肝炎(η = 40)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢 測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。8)穩(wěn)定性檢測將梅 毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條放置37°C 20 天后檢測，以上各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化。
權(quán)利要求
梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對(duì)照線和吸收墊；加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于 所述載體板為PVC板。
3.如權(quán)利要求1所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法， 其特征在于包括以下步驟1)制備梅毒重組抗原TPm7、TPN47采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表 達(dá)，得梅毒重組抗原TPN17和TPN472)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣在硝酸纖維素膜IgM檢測線上包被抗人IgM特異性片段y鏈單克隆抗體，在對(duì)照線處 包被羊抗梅毒抗原TPN17和TPN47IgG抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸lmL加入到100mL去離子雙 蒸水中，得到的氯金酸濃度為0. 01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌 下加入1 %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL,繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色 瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)膠體金與TPW7、TPN47的標(biāo)記膠體金與梅毒特異性抗原TPW7的標(biāo)記取膠體金10mL，用0. Imol/LNaOH調(diào)至pH5. 4， 加 100 u g TPN17，混勻，放置 5min，加入 5% BSA lmL 混勻，4°C、10000r/min 離心 lh，棄上 清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至 lmL，得膠體金標(biāo)記的TPN17抗原；膠體金與梅毒特異性抗原TPN47的標(biāo)記同上操作，得膠體金標(biāo)記的TPN47抗原；將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維 膜上，烘干，制備成膠體金墊；5)制備免疫層析檢測條將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè) 在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝 酸纖維膜的另一端上，梅毒特異性IgM抗體檢測線和對(duì)照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在梅 毒特異性IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段y鏈單克隆抗體，在對(duì)照線處包被羊 抗梅毒抗原TPN17和TPN47的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得梅毒特異性IgM抗體膠體金 免疫層析檢測試劑條。
4.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法， 其特征在于在步驟2)中，所述抗人IgM特異性片段y鏈單克隆抗體的濃度為1 4mg/mL。
5.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法， 其特征在于在步驟2)中，所述羊抗梅毒抗原TPW7和TPN47的IgG抗體由抗TPm7_IgG抗 體與抗TPN47-IgG抗體按體積比1 1混合，其終濃度為1 4mg/mL;三者點(diǎn)樣量為lyL/ cm0
6.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法， 其特征在于在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的濃度為2%。
7.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法， 其特征在于在步驟4)中，所述將膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原混 合，是膠體金標(biāo)記的TPN17抗原和膠體金標(biāo)記的TPN47抗原以體積比1 0. 2 5混合。
8.如權(quán)利要求3所述的梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法， 其特征在于在步驟4)中，所述烘干的溫度為37°C。
全文摘要
梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法，涉及一種梅毒特異性IgM抗體檢測試劑。提供一種梅毒特異性IgM抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法。試劑條設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、梅毒特異性IgM抗體檢測線、對(duì)照線和吸收墊。制備梅毒重組抗原TPN17、TPN47；硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣；制備膠體金；膠體金與TPN17、TPN47的標(biāo)記；制備免疫層析檢測條。該檢測方法所需的標(biāo)本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果，且檢測簡便快速，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，成本低，應(yīng)用廣泛。
文檔編號(hào)G01N33/532GK101858916SQ20101017913
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月19日
發(fā)明者張忠英, 張長弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院