專利名稱：：胎兒常見染色體異常診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于染色體異常診斷試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種胎兒常見染色體異常診斷試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：染色體異常是人類常見的重大出生缺陷，多伴有多發(fā)畸形或嚴重的智力障礙。唐氏綜合征，即21-三體綜合征(Down'ssyndrome,DS)是其中最多見的染色體病(發(fā)生率為1/800-1000活產(chǎn)或1/150妊娠)。唐氏綜合征患者患者平均壽命只有16.2歲，臨床表現(xiàn)以中到重度智能及體格發(fā)育障礙為主，50%有先天性心臟畸形，如房、室間隔缺損，動脈導管未閉、法洛四聯(lián)癥等；消化道畸形、臍疝、裂唇、裂腭及多指(趾)、并指(趾)等畸形亦較多見；該癥患者白血病的發(fā)生率較正常兒高20倍左右，10%伴有癲癇且易早發(fā)Alzheimer's病。目前無特效治療方法，主要是加強護理，針對性地進行智力和勞動技能訓練，使其能夠自食其力地生活。因此應(yīng)用產(chǎn)前篩查和診斷的方法以降低該類患兒的出生率是當前圍產(chǎn)優(yōu)生和產(chǎn)前診斷的重要任務(wù)。目前常規(guī)產(chǎn)前篩查技術(shù)均采用靜脈取血的采血方法。即采用真空采血管抽取病人靜脈血5ml，離心得到血清后，采用冷鏈的方式(5°C)進行運送，在實驗室進行甲胎蛋白和游離HCG的檢測。檢測技術(shù)平臺一般為時間分辨免疫熒光技術(shù)和化學發(fā)光技術(shù)。由于靜脈取血的篩查方法具有篩查成本偏高，檢測技術(shù)依賴性大、標本不便于遠距離寄送等固有的局限性，目前我國的產(chǎn)前篩查覆蓋率仍不足30%，尤其在我國中西部地區(qū)及偏遠農(nóng)村，受到當?shù)亟?jīng)濟條件及運輸條件的限制，唐氏綜合癥篩查難以得到廣泛的開展。并且由于血樣無法轉(zhuǎn)運，只能當?shù)貦z測，造成我國目前產(chǎn)前篩查中心分布分散，設(shè)備重復，血樣檢測和質(zhì)量控制及機構(gòu)管理的成本很大。發(fā)明目的本發(fā)明的目的之一在于提供一種干血片法診斷孕期胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，通過靜脈取血或末梢血取血制成干血片，實現(xiàn)標本的簡易遠程寄送，再通過一系列復溶技術(shù)實現(xiàn)在現(xiàn)有技術(shù)平臺上各篩查指標(甲胎蛋白、游離βHCG)的準確檢測。本發(fā)明所述的技術(shù)的應(yīng)用完全改變了現(xiàn)有取血技術(shù)存在的標本保存、運送需冷鏈管理、易碎、成本較高等的巨大缺陷，有利于大規(guī)模推廣產(chǎn)前篩查的覆蓋面和技術(shù)可及性，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是所述試劑盒包括全血干血片濾紙；標準品血片及質(zhì)控品血片；復溶洗脫緩沖液；血清學檢測試劑。優(yōu)選的是所述的血清學檢測試劑為1)抗AFP-Eu示蹤劑，該示蹤劑為銪標記的AFPIgG；2)抗freeβHCG-Sm示蹤劑，該示蹤劑為釤標記的freeβHCGIgG；上述標記的IgG將通過抗原抗體反應(yīng)與待測標本中的AFP與freeβHCG結(jié)合，并在標記有固相AFP/freeβHCG抗體表面形成免疫復合物，每個樣本的Eu和Sm熒光強度分別與樣品中的AFP和游離βHCG含量成正比例關(guān)系。更優(yōu)的是所述的血清學檢測試劑為抗AFP和hAFP/Free-β-HCG示蹤劑及檢測洗脫緩沖液。更優(yōu)的是所述的復溶或者檢測洗脫緩沖液為ρΗ為7.27.6的0.010.03Μ的Na2HP04-KH2P04緩沖液體系。稱取8gNaCl,0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04,溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的ρΗ值至7.4，最后加蒸餾水定容至IL即可。在151bf/in2(1034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌(至少20分鐘)，保存于室溫或4°C環(huán)境。更優(yōu)的是還包括增強液，所述的增強液含有TritonX-100，乙酸和螯合劑的復合溶液。更優(yōu)的是增強液為β萘甲酰三氟丙酮1.995mg；三辛基氧化膦9.840mg,TritonX-1000.5mL，鄰苯二甲酸氫鉀0.695g，冰醋酸2.95mL，溶于500mL水，調(diào)ρΗ至3.2，4°C避光保存。增強液將Eu和Sm從標記抗體分離至溶液中，從而與增強液中的成分生成高熒光強度螯合物，將提高待測物質(zhì)的檢出低限濃度。本發(fā)明的目的之二在于提供一種干血片法診斷孕期胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，采用如下技術(shù)方案一種胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，包括標準品血片及質(zhì)控品血片的制備；打孔及洗脫；血清學檢測；結(jié)果計算。所述的AFP或/和HCG標準品血片及質(zhì)控品血片的制備包括1)采集男性健康志愿者靜脈血4050ml，所述靜脈血的血清AFP^2ug/l；2)40C1000rpm/min離心15分鐘，棄上清液，加入等量PBS溶液，充分混勻，重復離心洗滌步驟三次；3)取制備完成的濃縮洗滌紅細胞與試劑標準品溶液等量混合。檢測混合液紅細胞壓積45%左右，將此混合液滴至濾紙片上，自然晾干，獲得標準血片濃度分別為0，0.5，5，50,250,500U/ml；4)將制備好的標準干血片4°C冰箱保存；5)質(zhì)控干血片的制備同標準血片，取濃縮洗滌紅細胞與質(zhì)控品等量混合制備而成。所述的打孔及洗脫包括用專用打孔鉗在血片相同部位打下直徑6mm標準品、質(zhì)控品和樣本血片放入相應(yīng)的微孔中，加入IOOul專用洗脫緩沖液，室溫下鐘)，保存于室溫或4°C環(huán)境。更優(yōu)的是還包括增強液，所述的增強液含有TritonX-100，乙酸和螯合劑的復合溶液。更優(yōu)的是增強液為β萘甲酰三氟丙酮1.995mg；三辛基氧化膦9.840mg,TritonX-1000.5mL，鄰苯二甲酸氫鉀0.695g，冰醋酸2.95mL，溶于500mL水，調(diào)pH至3.2，4°C避光保存。增強液將Eu和Sm從標記抗體分離至溶液中，從而與增強液中的成分生成高熒光強度螯合物，將提高待測物質(zhì)的檢出低限濃度。本發(fā)明的目的之二在于提供一種干血片法診斷孕期胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，采用如下技術(shù)方案一種胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，包括標準品血片及質(zhì)控品血片的制備；打孔及洗脫；血清學檢測；結(jié)果計算。所述的AFP或/和HCG標準品血片及質(zhì)控品血片的制備包括1)采集男性健康志愿者靜脈血4050ml，所述靜脈血的血清AFP^2ug/l；2)40C1000rpm/min離心15分鐘，棄上清液，加入等量PBS溶液，充分混勻，重復離心洗滌步驟三次；3)取制備完成的濃縮洗滌紅細胞與試劑標準品溶液等量混合。檢測混合液紅細胞壓積45%左右，將此混合液滴至濾紙片上，自然晾干，獲得標準血片濃度分別為0，0.5，5，50,250,500U/ml；4)將制備好的標準干血片4°C冰箱保存；5)質(zhì)控干血片的制備同標準血片，取濃縮洗滌紅細胞與質(zhì)控品等量混合制備而成。所述的打孔及洗脫包括用專用打孔鉗在血片相同部位打下直徑6mm標準品、質(zhì)控品和樣本血片放入相應(yīng)的微孔中，加入IOOul專用洗脫緩沖液，室溫下需要血清樣本轉(zhuǎn)運時所需的冷凍設(shè)備。且血片法適用的檢測技術(shù)多費用較低，適于國民公共衛(wèi)生預算有限的國家及地區(qū)應(yīng)用。3.穩(wěn)定性本技術(shù)條件下AFP血片在37°C下至少可保存1個月。國外相關(guān)研究認為AFP血片在4°C下可保存至少6個月本技術(shù)體系的創(chuàng)新點為在國際上首次提出完整的血片法產(chǎn)前篩查的思路，并發(fā)展出完整的技術(shù)體系及流程標準。包括適宜干血片的制備，干血片保存及轉(zhuǎn)運的技術(shù)要求，復溶技術(shù)體系(復溶液及復溶條件)，后續(xù)檢測技術(shù)，以及獲得多種指標的檢測結(jié)果后將其結(jié)合孕婦的孕周、年齡等因素綜合計算胎兒患唐氏綜合征、18三體綜合征等重大染色體異常的風險，以指導后續(xù)的產(chǎn)前診斷。本技術(shù)是在傳統(tǒng)的靜脈取血進行胎兒染色體異常產(chǎn)前篩查基礎(chǔ)上加以完善和革新，通過對于孕婦甲胎蛋白(AFP)和游離人絨毛膜促性腺激素(freeβhCG)的檢測，改變其取血途徑，并結(jié)合后續(xù)的一整套針對干血片技術(shù)建立起的產(chǎn)前篩查檢測及風險計算系統(tǒng)，來完成產(chǎn)前篩查的過程，并達到傳統(tǒng)靜脈取血產(chǎn)前篩查技術(shù)的性能水平，同時使產(chǎn)前篩查標本的轉(zhuǎn)運、保存、處理過程便捷，成本低廉，為全國形成集中檢測及大規(guī)模檢測的局面奠定技術(shù)基礎(chǔ)。血片技術(shù)具有血樣采集方法簡單、成本低廉、減少溶血和樣本降解、不需要離心、增強標本在高溫情況下的穩(wěn)定性、提高了對生物有害物的管理、減少了運輸和貯存費用等優(yōu)勢。通過采取指尖末梢血于特定干血片濾紙上自然風干，在檢測前通過洗脫液將血片復溶，再進行檢測。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用血片法AFP的洗脫率可以達到90.1%。且血片法穩(wěn)定性較好，研究顯示AFP及freeβhCG血片即使在37°C存放9天以上仍保持穩(wěn)定性。目前在北京協(xié)和醫(yī)院完成的的大規(guī)模實驗證明干血片法相對于染色體異常血清學產(chǎn)前篩查是一種經(jīng)濟有效的方法，適用于大規(guī)模的人群篩查。圖1為AFP血片在不同溫度下的穩(wěn)定性實驗結(jié)果示意圖；圖2為Free-βHCG血片在不同溫度下的穩(wěn)定性實驗結(jié)果示意圖；圖3為血片在不同條件下的洗脫結(jié)果示意圖。圖4為AFP標準曲線示意圖(抗AFP-Eu熒光強度)?？v軸是熒光強度，橫軸均為濃度，其中呈反比例(或大致平行的，用圓點表示)的是檢測變異系數(shù)(CV)，即說明濃度越高，檢測精密度越高(CV值越低)。圖5為βHCG的工作曲線示意圖(抗βHCG-Sm熒光強度)。縱軸是熒光強度，橫軸均為濃度，其中呈反比例(或大致平行的，用圓點表示)的是檢測變異系數(shù)(CV)，即說明濃度越高，檢測精密度越高(CV值越低)。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。實施例1試劑盒的制備標準及質(zhì)控干血片的制備(以AFP血片為例)1.1肝素抗凝，采集男性健康志愿者靜脈血(血清AFP(2ug/l)50ml。1.24°ClOOOrpm/min離心15分鐘，棄上清液，加入等量PBS溶液，充分混勻，重復離心洗滌步驟三次。1.3取制備完成的濃縮洗滌紅細胞與試劑標準品溶液等量混合。檢測混合液紅細胞壓積45%左右，將此混合液滴至濾紙片上，自然晾干，獲得標準血片濃度分別為0，0.5，5，50，250，500U/ml。1.4將制備好的標準干血片4°C冰箱保存。1.5質(zhì)控干血片的制備同標準血片，取濃縮洗滌紅細胞與質(zhì)控品等量混合制備而成。實施例2標本采集采集對象本研究收集2008年11月至2009年4月期間，于本院產(chǎn)前篩查中心接受唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的孕婦共計約500例，每個孕周約100例左右。入組條件⑴單胎中孕期妊娠15+°周-20+6周孕婦；⑵孕周核對準確；(3)孕婦知情同意，并簽署知情同意書。排除條件⑴多胎妊娠；(2)孕周計算不準確者。采集方法血清學標本采集抽取靜脈血4_5ml，置室溫60分鐘待血液完全凝集后，2000rpm離心10分鐘并分離血清，避免溶血，將血清用一次性吸管裝入血清保存管中，保存管蓋需擰緊，防止血清漏出。在血清保存管上注明標本編號，申請單上均須注明孕婦的姓名和標本編號。同一標本血清管使用同一編碼，各血清標本統(tǒng)一編碼。新鮮血清1周內(nèi)于北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前篩查中心或海淀婦產(chǎn)醫(yī)院檢驗科完成TRAFIA法檢測AFP、游離βHCG及uE3，剩余血清-20°C溫度下保存，備TotalHCG檢測，避免反復凍融。末梢血標本采集同時應(yīng)用一次性采血針采集入組孕婦手指末梢血，使血滴自然滲透至S&S903濾紙，采集3個血斑。將采集的血片置于清潔空氣中，避免陽光直射，自然晾干呈深褐色，并登記孕婦臨床資料；檢查合格的濾紙干血片，置于塑料袋內(nèi)，保存在4°C冰箱中。末梢血標本采集注意事項(1)本研究所有入組孕婦末梢血標本均為研究生本人采集，減少不同采血人員造成的偏移；(2)采血前清洗雙手并佩帶手套；(3)自孕婦左手無名指側(cè)采血，深度小于3毫米，用干棉球拭去第一滴血，取第二滴血；(4)將濾紙片接觸血滴，切勿觸及指尖皮膚；(5)取血完畢，血片應(yīng)在室溫中水平放置清潔干燥處自然晾干(24小時)，然后裝入密封塑料袋內(nèi)，放置4°C冰箱中保存。血片應(yīng)避免潮濕、日照，不可烘烤。放置時應(yīng)頭尾交叉，避免血標本互相污染。(6)滴在濾紙圓圈內(nèi)的血液，必須從正面吸入并滲透到濾紙背面。正反面的血斑直徑要求一致。避免正反兩面滴血及采集有大量組織液的血液或凝固的血液。避免血斑血量不足，滲透不夠，而出現(xiàn)梅花狀、夾心狀和直徑<8mm血斑。(7)未采血的濾片應(yīng)放置在干燥處保存，濾紙表面必須保持清潔，不能與手、奶、消毒液、清潔劑、水等物質(zhì)接觸防止污染。合格血斑標準①每個血斑直徑要達到IOmm；②同時取3個血斑；③血液必須完全滲透到濾紙背面；④無重疊；⑤無污染；⑥易洗脫。于篩查同時收集符合要求的孕婦對象信息，包括姓名，病案號(或標本編號)，出生日期，聯(lián)系電話；月經(jīng)史，末次月經(jīng)，篩查抽血日期，篩查當日體重，篩查孕周，孕周核對方式(LMP或B超)；既往1型糖尿病史，煙酒史，既往不良孕產(chǎn)史；孕期病史，妊娠結(jié)局。實施例3打孔及洗脫AFP、free-β-HCG血片檢測用專用打孔鉗盡量在血片相同部位打下直徑6mm標準品、質(zhì)控品和樣本血片放入相應(yīng)的微孔中，加入IOOul專用洗脫緩沖液，室溫(20-25攝氏度)下慢速震蕩Ih洗脫。實施例4基于時間分辨免疫熒光技術(shù)的血清學檢測l)Free3HCG的檢測1.1將抗FreeβHCG示蹤劑貯存液按比例稀釋。1.2在96微孔板中分別加入200ul示蹤劑稀釋液及25ul標準品或待測品。1.3室溫慢速震蕩2.5小時(最大溫度30°C)1.4洗板6次。1.5在96孔板中加入200ul增強液，慢速震蕩5分鐘。1.6ffallacDELFIA系統(tǒng)根據(jù)標準品運行標準曲線，計算待測品濃度。2)AFP的檢測2.1在96微孔板中分別加入200ul專用洗脫液及25ul標準品或待測品，慢速震蕩Ih02.2洗板2次。2.3在微孔中加入200ul抗AFP示蹤劑稀釋液。2.4室溫下靜置Ih(TotalHCG檢測時需慢速震蕩0.5小時)。2.5洗板6次。2.6在96孔板中加入200ul增強液，慢速震蕩5分鐘。2.7ffallacDELFIA系統(tǒng)根據(jù)標準品運行標準曲線，計算待測品濃度。實施例5結(jié)果計算根據(jù)標準血片洗脫液的平均熒光值，建立標準曲線，使用標準品的熒光值與其相對應(yīng)的濃度繪制標準曲線。熒光值為縱軸(Y軸)，濃度為橫軸(X軸)；根據(jù)待測血片洗脫液熒光值與標準血片洗脫液熒光值的對應(yīng)關(guān)系，計算待測血片濃度值。血片法的評價5.1洗脫分別在洗脫lh、2h、4h、8h、16h及過夜情況下檢測洗脫液的濃度，以尋找最佳洗脫條件(η=8)。5.2打孔分別在血片中心、邊緣及中心1/2處、邊緣處打孔，在同一塊微孔板上測定其濃度，觀察不同部位所取血片對洗脫液濃度值測定的影響，重復實驗10次，以統(tǒng)計學t檢驗處理數(shù)據(jù)，比較各取血部位有無顯著性差異。5.3血片法精密性評價取低、中、高三個濃度血片通過8次試驗，每次試驗采用10復孔，采用方差分析方法計算組內(nèi)及組間變異系數(shù)(CV)、平均值及標準差等，并利用以下公式將血片法方差與廠家給出的血清學測量方差進行檢驗。χ2=(n-1)S1Vs22其中，S12為血片法測量值的方差，S22為血清學測量值的方差。5.4重吸收率計算分別向低、中、高三個濃度AFP(或HCG)樣本中加入等量已知濃度的AFP(或HCG)后，制備成干血片。通過實際測得血片濃度與期待濃度值計算血片重吸收率。5.5靈敏度檢測取男性志愿者靜脈血制備為干血片，測量其洗脫液濃度。靈敏度為測定平均值以上3個標準差(平均值+3SD)(η=20)·5.6與血清學方法相關(guān)性分別測量106例患者AFP、FreeβHCG、HCG及uE3血清及血片濃度，作散點圖，且測血清法與血片法測量的線性關(guān)系；并運用以下公式計算相關(guān)系數(shù)作散+"片法測量的線性關(guān)系；并運用以下公式計算相關(guān)系數(shù)-—Σi^i-κ)2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>等計算得到回歸方程。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>a=y-bx得到線形方程:Y=bX+a5.7質(zhì)量控制5.7.1溫度穩(wěn)定性干血片分別在-20°C、4°C、室溫(約25°C)及35°C下保存4周，檢測血片在各溫度下的穩(wěn)定性(η=10)。5.7.2打孔位置不同對血片測量值的影響分別在血片中心、中心與邊緣1/2交界處及邊緣處打孔(η=10)并測量，以驗證位置對血片測量值的影響。5.7.3末梢血片與靜脈血片對40例孕婦同時收集靜脈血片(靜脈采血同時直接由采血器滴到濾紙片上)及末梢血片，分別檢測兩種血片，并對測量結(jié)果行一致性分析。實驗結(jié)果一、AFP+FreeβHCG二聯(lián)血片法初步評價1二聯(lián)血片法檢測精密度評價1.1統(tǒng)計結(jié)果如表1-2所示。表1血片法檢測AFP的精密度評價<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2血片法檢測Free-βHCG的精密度評價<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.2將測得AFPFree-^HCG組內(nèi)及組間差異與目前公認的血清學檢測金標準時間分辨技術(shù)檢測數(shù)據(jù)進行方差檢驗(X2檢驗)，結(jié)果如表3-4所示表3血片法與血清法檢測組內(nèi)差異的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4血片法與血清法檢測組間差異的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3AFP及Free-βHCG溫度穩(wěn)定性研究3.IAFP溫度穩(wěn)定性AFP分別在4°C、室溫(約25°C)、35°C及_20°C下溫度穩(wěn)定性如圖1所示。由圖可知，AFP血片4°C、室溫(約25V)及_20°C下均可保存28天，差異無統(tǒng)計學意義。而在35°C下保存結(jié)果經(jīng)SNK多重比較，如下表所示。表7AFP35°C溫度穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如上表示，第12天與第18天測量均數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P=0.018，a=0.05)，因此，我們認為AFP血片35°C下最長可以保存12天。3.2Free-βHCG溫度穩(wěn)定性Free-βHCG分別在4°C、室溫(約25°C)、35°C及_20°C下溫度穩(wěn)定性如圖2所示。由圖2可知，F(xiàn)ree-βHCG血片4°C及_20°C下均可保存28天，差異無統(tǒng)計學意義。而在室溫(約25°C)及35°C下保存結(jié)果經(jīng)SNK多重比較，如表17-18所示。表8Free_βHCG室溫溫度穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表8所示，F(xiàn)ree-βHCG血片室溫下可保存6天，測量值差異無顯著意義。保存期后測量值較前逐漸升高，可以考慮為HCG降解為Free-β亞基形式所致。表9Free-i3HCG在35°C溫度穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表9所示，F(xiàn)ree-βHCG血片35°C下可保存3天，測量值差異無顯著意義。保存期后測量值較前逐漸升高。4.靈敏度測定靈敏度為測定平均值以上三個標準差(平均值+3SD)(η=0)。AFP及FreeβHCG血片法測量的靈敏度如表19所示。表10血片法二聯(lián)測定的靈敏度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>5.血片法質(zhì)量控制5.1末梢血片與靜脈血片對比分析臨床工作中，靜脈血片往往更易得到。末梢血片與靜脈血片是否有區(qū)別？對40例孕婦同時收集靜脈血片(靜脈采血同時直接由采血器滴到濾紙片上)及末梢血片，統(tǒng)計結(jié)果如表11-12所示。表11末梢及靜脈血片AFP測量對比研究<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表12末梢及靜脈血片F(xiàn)reeβHCG測量對比研究<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由上可知，末梢血片與靜脈血片二聯(lián)法測量差異無統(tǒng)計學意義。6.2血片洗脫時間摸索干血片洗脫條件各文獻報道不一，為此，本研究就干血片的各種洗脫條件進行試驗。分別將干血片在洗脫液中慢速震蕩洗脫1、2、4、8、16小時，或4°C過夜(ri=8)，實驗結(jié)果如圖3所示。如上圖所示，室溫下慢速震蕩1小時與4°C過夜洗脫效果近似。6.3打孔位置對血片測量值的影響分別在血片中心、中心與邊緣1/2交界處及邊緣處打孔(η=10)，測量統(tǒng)計結(jié)果如表13-14所示。表13打孔位置對AFP測量值的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表14可知，血片中心、中心-邊緣交界處及邊緣處FreeβHCG測量值均有顯著差異，其中邊緣處FreeβHCG測量值最高，血片中心處最低。通過血清學檢測試劑1)抗AFP-Eu示蹤劑，該示蹤劑為銪標記的AFPIgG；2)抗freeβHCG-Sm示蹤劑，該示蹤劑為釤標記的freeβHCGIgG；上述標記的IgG將通過抗原抗體反應(yīng)與待測標本中的AFP與freeβHCG結(jié)合，并在標記有固相AFP/freeβHCG抗體表面形成免疫復合物，每個樣本的Eu和Sm熒光強度分別與樣品中的AFP和游離0HCG含量成正比例關(guān)系。檢測結(jié)果如圖4及圖5所示，縱軸是熒光強度，橫軸均為濃度，其中呈反比例(或大致平行的，用圓點表示)的是檢測變異系數(shù)(CV)，即說明濃度越高，檢測精密度越高(CV值越低)。結(jié)論1.血片法AFP的組內(nèi)差異在6.35-7.71%、組間差異在13.51-22.6%，總差異8.08-8.97%，F(xiàn)reeβHCG組內(nèi)差異6.40-9.99%，組件差異9.44-15.23%，總差異在6.71-10.55%。檢測均與血清學方法有很好的相關(guān)性。2.血片法AFP及FreeβHCG的重吸收率均在93%以上。3.4攝氏度下保存標本，AFP及FreeBHCG血片均可保存28天，室溫(25攝氏度)下保存標本，AFP可保存28天，F(xiàn)reeBHCG血片可保存6天，在35°C保存AFP血片保存達12天，F(xiàn)reeBHCG血片可保存3天4.血片法AFP+FreeβHCGTRAFIA檢測的靈敏度分別為1.51u/ml、0.65ng/ml。權(quán)利要求胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是所述試劑盒包括全血干血片濾紙；標準品血片及質(zhì)控品血片；復溶洗脫緩沖液；血清學檢測試劑。2.如權(quán)利要求1所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是所述的血清學檢測試劑為1)抗AFP-Eu示蹤劑，該示蹤劑為銪標記的AFPIgG；2)抗freeβHCG-Sm示蹤劑，該示蹤劑為釤標記的freeβHCGIgG；上述標記的IgG將通過抗原抗體反應(yīng)與待測標本中的AFP與freeβHCG結(jié)合，并在標記有固相AFP/freeβHCG抗體表面形成免疫復合物，每個樣本的Eu和Sm熒光強度分別與樣品中的AFP和游離βHCG含量成正比例關(guān)系。3.如權(quán)利要求1所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是所述的血清學檢測試劑為抗AFP和hAFP/Free-β-HCG示蹤劑及檢測洗脫緩沖液。4.如權(quán)利要求13任一項所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是所述的復溶洗脫緩沖液為ρΗ為7.27.6的0.010.03Μ的Na2HP04_KH2P04緩沖液體系。5.如權(quán)利要求4所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是還包括增強液，所述的增強液為含有TritonX-100，乙酸和螯合劑的復合溶液。6.如權(quán)利要求5所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒，其特征是所述的增強液為β萘甲酰三氟丙酮1.995mg;三辛基氧化膦9.840mg，TritonX-1000.5mL，鄰苯二甲酸氫鉀0.695g，冰醋酸2.95mL,溶于500mL水，調(diào)ρΗ至3.2，4°C避光保存。7.一種胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，包括AFP或/和HCG標準品血片及質(zhì)控品血片的制備；打孔及洗脫；血清學檢測；結(jié)果計算。8.如權(quán)利要求7所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，其特征為所述的AFP或/和HCG標準品血片及質(zhì)控品血片的制備包括1)采集男性健康志愿者靜脈血4050ml，所述靜脈血的血清AFP≤2ug/l；2)40C1000rpm/min離心15分鐘，棄上清液，加入等量PBS溶液，充分混勻，重復離心洗滌步驟三次；3)取制備完成的濃縮洗滌紅細胞與試劑標準品溶液等量混合。檢測混合液紅細胞壓積45%左右，將此混合液滴至濾紙片上，自然晾干，獲得標準血片濃度分別為0，0.5，5，50，250，500U/ml；4)將制備好的標準干血片4°C冰箱保存；5)質(zhì)控干血片的制備同標準血片，取濃縮洗滌紅細胞與質(zhì)控品等量混合制備而成。9.如權(quán)利要求7所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，其特征為所述的打孔及洗脫包括用專用打孔鉗在血片相同部位打下直徑6mm標準品、質(zhì)控品和樣本血片放入相應(yīng)的微孔中，加入IOOul專用洗脫緩沖液，室溫下慢速震蕩Ih洗脫。10.如權(quán)利要求7所述的胎兒常見染色體異常診斷試劑盒的制備方法，其特征為所述的血清學檢測包括DFreeβHCG的檢測1.1將抗FreeβHCG示蹤劑貯存液按比例稀釋；1.2在96微孔板中分別加入200ul示蹤劑稀釋液及25ul標準品或待測品；1.32530°C慢速震蕩2.5小時;1.4洗板46次；1.5在多孔板中加入200ul增強液，慢速震蕩5分鐘；1.6ffallacDELFIA系統(tǒng)根據(jù)標準品運行標準曲線，計算待測品濃度；2)AFP的檢測2.1在96微孔板中分別加入200ul專用洗脫液及25ul標準品或待測品，慢速震蕩Ih；2.2洗板2次；2.3在微孔中加入200ul抗AFP示蹤劑稀釋液；2.4室溫下靜置Ih；2.5洗板6次；2.6在96孔板中加入200ul增強液，慢速震蕩5分鐘；2.7ffallacDELFIA系統(tǒng)根據(jù)標準品運行標準曲線，計算待測品濃度。全文摘要本發(fā)明公開了一種胎兒常見染色體異常診斷試劑盒及其制備方法，其中試劑盒包括由全血干血片濾紙，標準品血片及質(zhì)控品血片，復溶洗脫緩沖液，血清學檢測試劑組成。本發(fā)明通過靜脈取血或末梢血取血制成干血片，實現(xiàn)標本的簡易遠程寄送，再通過一系列復溶技術(shù)實現(xiàn)在現(xiàn)有技術(shù)平臺上各篩查指標(甲胎蛋白、游離βHCG)的準確檢測。本發(fā)明所述的技術(shù)的應(yīng)用完全改變了現(xiàn)有取血技術(shù)存在的標本保存、運送需冷鏈管理、易碎、成本較高等的巨大缺陷，有利于大規(guī)模推廣產(chǎn)前篩查的覆蓋面和技術(shù)可及性，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。文檔編號G01N33/68GK101825639SQ201010163449公開日2010年9月8日申請日期2010年5月6日優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日發(fā)明者蔣宇林,邊旭明申請人:北京中誠晶創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司