專利名稱：：一種用于生物傳感器的導電聚合物及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于生物傳感器的導電聚合物及其制備方法，具體說，是涉及一種采用原位電化學組合合成(combinatorialsynthesis)方法，使帶有生物活性單元(如DNA,RNA，肽，蛋白質，酶，適配物(aptamer)，組織，細胞等)的導電聚合物一步直接固定于電極之上，得到功能化微電極陣列以應用于生物傳感器。
背景技術：
：生物傳感器是一門由生物信息學、生物控制論、仿生學、生物計算機、生物、化學、物理、醫(yī)學、電子技術等多種學科互相滲透成長起來的高新技術，是一種對物質進行分子水平的快速、平行、微量化的分析方法。待測物質流經生物傳感器，經分子識別，將生物活性單元之間交互反應表達的信號經物理或化學換能器轉換成為可定量和可處理的電信號，并用電腦進行信息化和數字化。生物傳感器技術是介于信息和生物技術之間的新增長點，隨著物聯網的發(fā)展和生物科學、信息科學和材料科學發(fā)展的推動，以及光導、光纖、超導、納米技術、智能材料等新技術的應用，進一步實現信息的采集與傳輸、處理集成化、智能化，特別是分子生物學與微電子學、光電子學、微細加工技術及納米技術等新學科、新技術結合，正改變著傳統(tǒng)醫(yī)學、醫(yī)療保健、疾病診斷、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測的面貌。生物傳感器是生物技術與信息技術的完美融合，是生物信息的物化，是物聯網的戰(zhàn)略前沿，掌握了生物傳感器技術并將之數字化、自動化、微型化、集約化、智能化，就等于占領了物聯網的一個戰(zhàn)略制高點。生物傳感器的研究開發(fā)，已成為世界科技發(fā)展的新熱點，形成21世紀新興的高技術產業(yè)的重要組成部分，具有重要的戰(zhàn)略意義。導電聚合物因其特殊的結構和優(yōu)異的物理化學性能，在光學、電磁學和化學等領域具有廣闊的應用前景。近年來，導電聚合物在生物材料領域的應用，取得了一定的研究成果。導電聚合物在生物材料領域中的應用，以作為生物傳感器最為多見。通常情況下，將不同的酶、輔酶、抗體、DNA、甚至細胞和組織等生物活性物質固定于導電聚合物中，形成各種新型的生物傳感器。這種傳感器具有響應性能強，制作過程簡單、可控等特點。在構建導電聚合物生物傳感器過程中，聚合物的合成通常采用操作簡單、易于控制的電化學方法。在聚合過程中，生物活性物質既可與聚合物單體同時聚合到電極表面，也可先與其單體吸附在電極表面，再氧化聚合形成生物識別固態(tài)元件。其間，通過有效地控制聚合物電聚合過程，生物活性物質可固定到各種類型的電極或者電極的特定部位，也可將兩種或多種酶等生物活性物質同時固定于同一層聚合膜或分別固定于多層聚合膜上。導電聚合物作為分子導線，其三維立體結構可使電子在生物分子(活性中心)與電極表面直接傳遞，顯著提高生物傳感器的響應特性。通過控制聚合膜的厚度、生物分子在膜中的空間分布、聚合膜的空隙度等指標可以調整生物傳感器的響應特性和選擇性。構建導電聚合物生物傳感器的關鍵是如何將生物活性物質有效地固定在導電聚合膜上，且最大限度地保持其生物活性，形成可長期反復作用的生物識別固態(tài)元件。生物活性物質常用的固定方法主要有包埋法、共價法、吸附法和交聯法。其中以包埋法最為多見，該法依賴于電化學聚合而實現，即，在電化學聚合的同時，生物活性物質以包埋的形式固定到導電聚合膜中。目前，導電聚合物生物傳感器的研究雖然取得了一定的成果，但同時也面臨了一些問題。如無常規(guī)設備可制造穩(wěn)定的可重復生產的導電聚合物生物傳感器，這在很大程度上限制了此類傳感器在分析領域的廣泛應用。
發(fā)明內容本發(fā)明為了解決困擾學術界已久的如何將生物活性單元不失活地且永久地結合到金屬上而且還能一步到位地將生物活性分子接入導電聚合物的難題，提供了一種用于生物傳感器的導電聚合物及其制備方法，使生物傳感器的集約化、微型化和微功耗成為了現實。為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的具體技術方案如下本發(fā)明的用于生物傳感器的導電聚合物，具有如下通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>通式中的R=S或NH;通式中的Rl為I其中的η可為1、2或3;X代-(CH2)η—O、v/ww/w/wv\](表生物活性單元，可以是DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞，優(yōu)選輔酶R-生物素(Biotin)；通式中的R2可以是氫，也可以是飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環(huán))類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環(huán))醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。本發(fā)明的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，包括如下具體步驟a)制備帶有生物活性單元的導電聚合物單體將帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入導電聚合物單體的無水乙腈溶液，其中帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺與導電聚合物單體的摩爾比為101110；加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑(activator)，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌2040分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液(oxidationsolution)，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=811的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%；室溫下攪拌515分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入-4°C冰箱備用；b)將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)晶體管的開關連接，通過發(fā)送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的靜態(tài)隨機存取記憶體(SRAM)導通該開關；微電極陣列放置在一個流體反應器中，反應器中的反應液為步驟a)制備得到的帶有生物活性單元的導電聚合物單體與其摩爾量的110倍的未經修飾的導電聚合物單體及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在0.51.5伏，30秒總時間的邏輯電路控制下，具有生物活性的導電聚合物立即在電極表面原位迅速生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干即得用于生物傳感器的功能化微電極陣列。所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺是指帶有DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞單元的甘醇亞磷酰胺，優(yōu)選生物素甘醇亞磷酰胺。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述的導電聚合物單體可以是通式為(》I\的口比FMOC或BOC咯衍生物，其中的η可為1、2或3;其中的R2可以是氫，也可以是飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環(huán))類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環(huán))醚或硫醚類取代基、鹵素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>所述的導電聚合物單體還可以是通式為#\的噻吩衍生物，其中的η可為1、2或3；其中的R2可以是氫，也可以是飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環(huán))類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環(huán))醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。所述電極可以是金屬、不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料，優(yōu)選金屬。所述金屬可選自鉬、銥、鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢或鋁，優(yōu)選鉬。正因為每個電極都與其下的獨立尋址邏輯及放大電路連接，所以都具有智能傳感和訊號放大功能，當以一定的脈沖波掃描每個電極時，會產生一個微小的偶極化電子信號，此信號因電極所處的生物環(huán)境(有無分子識別反應)的變化而略有差異，因此，CMOS的運用提供了前所未有的可重復性，高度靈活的微米和亞微米范圍內合成聚合物微陣列的能力，使生物傳感得以成為現實。本發(fā)明人還研究發(fā)現隨著反應的進行，具有生物活性并導電的聚合物分子在形成電流通路的同時不斷延伸，依次從納米顆粒到納米纖維，最后纖維與纖維連接成片狀網絡結構。通過調控單體濃度、電流密度和反應時間等活性自由基聚合條件，可以控制具有生物活性并導電的聚合物生長成納米纖維。因為納米纖維狀的導電聚合物具有納米的三維微觀結構，具有獨特的化學、物理性質，因此，可大幅提高對生物分子或者細胞的檢測靈敏度，大大縮短檢測的反應時間，使生物傳感器向集約化、微型化和微功耗方向發(fā)展成為可能。與現有技術相比，本發(fā)明的突破點主要有以下幾點1、通過先將生物活性單元引入導電聚合物單體中，然后采用原位電化學組合合成方法，可以一步直接在原位形成具有生物活性的導電聚合物，解決了困擾學術界已久的如何將生物活性單元不失活地且永久地結合到電極上、而且還能一步到位地將生物活性分子接入導電聚合物的難題。2、通過調控單體濃度、電流密度和反應時間等活性自由基聚合條件，可以控制導電聚合物生長成納米纖維狀，從而大幅提高對生物分子或者細胞的檢測靈敏度，大大縮短檢測的反應時間，使生物傳感器向集約化、微型化和微功耗方向發(fā)展成為可能。3、由于本發(fā)明的生物傳感器是用導電納米纖維作為探頭，具有靈敏度高、采樣量小、重現性好、速度快、高通量、微型化、微功耗、數位化、便于攜帶和現場操作等優(yōu)點，在與物聯網的互動下，能夠實現公共場所流行性傳染病的監(jiān)測，達到防患于未然的目的。因此，本發(fā)明可以推動疾病診斷、藥物篩選、醫(yī)療保健、司法鑒定、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測、個性化藥物等以及以上產業(yè)鏈的發(fā)展，具有深遠的社會意義和廣闊的市場價值。圖1是本發(fā)明中的獨立尋址邏輯電路芯片的結構示意圖；圖中1是指聚合反應驅動電路；2是指通過內部尋址連接導通的電極；3是指通過內部尋址連接的電極但在實驗中有意不通電而保持惰性；圖2是實施例3所制備的功能化微電極陣列在室光下的照片(16微米直徑的電極經100倍光學放大得到)；圖3是實施例4所制備的功能化微電極陣列在室光下的照片(16微米直徑的電極經50倍光學放大得到)。具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細、完整地說明；實施例中所用化學試劑均向美國Sigma-Aldrich公司采購，生物素甘醇亞磷酰胺及供DNA合成之用的活化劑(activator)和氧化溶液(oxidationsolution)是從美國GlenResearch公司采購。實施例1制備帶有生物活性單元的吡咯衍生物單體將生物素甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入1-FM0C-3-吡咯甲醇的無水乙腈溶液，其中生物素甘醇亞磷酰胺與1-FM0C-3-吡咯甲醇的摩爾比為101110;加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌30分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=811的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%；室溫下攪拌10分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入_4°C冰箱備用即可，本實施例的化學反應式如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>類似的合成方法也適用于4位上具有飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環(huán))類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環(huán))醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基的1-FM0C-3-吡咯甲醇、1-FM0C-3-吡咯乙醇、1-FM0C-3-吡咯丙醇、1-B0C-3-吡咯甲醇、1-B0C-3-吡咯乙醇或1-B0C-3-吡咯丙醇。實施例2制備帶有生物活性單元的噻吩衍生物單體將生物素甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入3-噻吩甲醇的無水乙腈溶液，其中生物素甘醇亞磷酰胺與3-噻吩甲醇的摩爾比為101110;加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌30分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=8:1:1的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%；室溫下攪拌10分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入_4°C冰箱備用即可，本實施例的化學反應式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>類似的合成方法也適用于4位上具有飽和或不飽和烴類取代基、芳香族(包括雜環(huán))類取代基、烴類和/或芳香族(包括雜環(huán))醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基的3-噻吩甲醇、3-噻吩乙醇或3-噻吩丙醇。實施例3制備用于生物傳感器的導電聚吡咯將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片(見圖1所示)上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)晶體管的開關連接，通過發(fā)送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的靜態(tài)隨機存取記憶體(SRAM)導通該開關；微電極陣列放置在一個流體反應器中，反應器中的反應液為制備得到的帶有生物素取代基的吡咯單體與其摩爾量的110倍的吡咯及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在1.5伏，30秒總時間的邏輯電路控制下，具有生物活性的導電聚吡咯立即在電極表面原位迅速生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干即得用于生物傳感器的功能化微電極陣列，圖2即為室光下電極的照片(16微米直徑的電極經100倍光學放大得到，其中圓形為電極，電極周圍為絕緣體)。實施例4制備用于生物傳感器的導電聚噻吩將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片(見圖1所示)上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)晶體管的開關連接，通過發(fā)送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的靜態(tài)隨機存取記憶體(SRAM)導通該開關；微電極陣列放置在一個流體反應器中，反應器中的反應液為制備得到的帶有生物素取代基的噻吩單體與其摩爾量的110倍的噻吩及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在2.0伏，30秒總時間的邏輯電路控制下，具有生物活性的導電聚噻吩立即在電極表面原位迅速生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干即得用于生物傳感器的功能化微電極陣列，圖3即為室光下電極的照片(16微米直徑的電極經50倍光學放大得到，其中圓形為電極，電極周圍為絕緣體)。實施例中使用的電極為鉬金屬，可由銥或其他金屬(例如鈀、金、銀、銅、汞、鎳、鋅、鈦、鎢、鋁)或不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料所替代。權利要求一種用于生物傳感器的導電聚合物，其特征在于，具有如下通式通式中的R＝S或NH；通式中的R1為其中的n為1、2或3；X代表生物活性單元；通式中的R2是氫，或是飽和或不飽和烴類取代基、芳香族類取代基、烴類和/或芳香族醚或硫醚類取代基、鹵素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。FSA00000084268400011.tif,FSA00000084268400012.tif2.根據權利要求1所述的用于生物傳感器的導電聚合物，其特征在于，所述生物活性單元是DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞。3.根據權利要求2所述的用于生物傳感器的導電聚合物，其特征在于，所述生物活性單元是輔酶R-生物素。4.一種權利要求1所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，包括如下具體步驟a)制備帶有生物活性單元的導電聚合物單體將帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺溶解在無水乙腈中，然后加入導電聚合物單體的無水乙腈溶液，其中帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺與導電聚合物單體的摩爾比為101110;加入適量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化劑，使形成的活化劑無水乙腈溶液的濃度為0.25mol/L；在室溫下攪拌2040分鐘后，進行減壓蒸鎦至粉末狀；加入過量氧化溶液，所述氧化溶液是由單質碘溶于四氫呋喃水三乙胺=811的混合溶劑中形成，溶液的質量百分比濃度為4%；室溫下攪拌515分鐘后，以硫代硫酸鈉還原至中性，然后減壓蒸出四氫呋喃，以氯仿萃取，有機層經無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸干有機溶劑；最后加入10%氫氧化銨脫保護，減壓蒸出過量氨氣后以0.2M鹽酸中和至中性，放入-4°C冰箱備用；b)將微電極陣列建立在獨立尋址的邏輯電路芯片上，此電路上的每個電極由互補金屬氧化物半導體(CMOS)晶體管的開關連接，通過發(fā)送電子地址信號到共同結點電路進而到與每個電極相關的靜態(tài)隨機存取記憶體(SRAM)導通該開關；微電極陣列放置在一個流體反應器中，反應器中的反應液為步驟a)制備得到的帶有生物活性單元的導電聚合物單體與其摩爾量的110倍的未經修飾的導電聚合物單體及適量作為電解質的氯化鉀混合而成；在邏輯電路控制下，以10毫秒開，10毫秒關的脈沖，在0.51.5伏，30秒總時間內，具有生物活性的導電聚合物即刻在電極表面原位生成，經去離子水清洗后用氮氣吹干即得用于生物傳感器的功能化微電極陣列。5.根據權利要求4所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺是指帶有DNA、RNA、肽、蛋白質、酶、輔酶、抗體、組織或細胞單元的甘醇亞磷酰胺。6.根據權利要求5所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，所述的帶有生物活性單元的甘醇亞磷酰胺是指生物素甘醇亞磷酰胺。7.根據權利要求4所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，所<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>述的導電聚合物單體是通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>的吡咯衍生物，其中的η為1、2或3；其中的R2是氫或是飽和或不飽和烴類取代基、芳香族類取代基、烴類和/或芳香族醚或硫醚類取代基、商素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。8.根據權利要求4所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，所<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>述的導電聚合物單體是通式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>的噻吩衍生物，其中的η為1、2或3;其中的R2是氫或是飽和或不飽和烴類取代基、芳香族類取代基、烴類和/或芳香族醚或硫醚類取代基、鹵素類取代基、經硅烷保護的一級或二級醇類取代基、經FMOC或BOC保護的胺類取代基、對稱或不對稱取代的三級胺、酰胺或磺酰胺類取代基、飽和或不飽和烴取代的羧酸酯類取代基。9.根據權利要求4所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，所述電極是金屬、不銹鋼、金屬合金、碳納米管、玻璃碳、網狀玻璃碳、石墨、摻雜氧化物、銦錫氧化物、氧化硅、砷化鎵半導體、金屬摻雜聚合物或陶瓷材料。10.根據權利要求9所述的用于生物傳感器的導電聚合物的制備方法，其特征在于，所述電極是鉬金屬。全文摘要本發(fā)明為了解決困擾學術界已久的如何將生物活性單元不失活地且永久地結合到金屬上而且還能一步到位地將生物活性分子接入導電聚合物的難題，提供了一種用于生物傳感器的導電聚合物及其制備方法，通過先將生物活性單元引入導電聚合物單體中，然后采用原位電化學組合合成方法及獨立尋址的微電極陣列技術，一步直接在電極表面原位形成具有生物活性的導電聚合物，得到功能化微電極陣列以應用于生物傳感器。本發(fā)明使生物傳感器向集約化、微型化和微功耗方向發(fā)展成為可能，可以推動疾病診斷、藥物篩選、醫(yī)療保健、司法鑒定、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測、個性化藥物等以及以上產業(yè)鏈的發(fā)展，具有深遠的社會意義和廣闊的市場價值。文檔編號G01N27/327GK101812171SQ20101014602公開日2010年8月25日申請日期2010年4月13日優(yōu)先權日2010年4月13日發(fā)明者王巍申請人:無錫中美億芯生物科技有限公司