專利名稱：殺蟲劑的篩選測定法的制作方法
殺蟲劑的篩選測定法本發(fā)明涉及作為殺蟲劑靶標(biāo)的優(yōu)選來自黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)活性的(DmSial)鉀通道。在一個實施方案中，電壓門控性鉀通道Sial與其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，優(yōu)選地其假定的輔助蛋白CG5890，果蠅屬KChIP(鉀通道相互作用蛋白)直向同源物共表達(dá)。本發(fā)明提供具有優(yōu)選來自黑腹果蠅(DmSiaI)昆蟲電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)及其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，優(yōu)選其假定的輔助蛋白CG5890，果蠅屬KChIP(鉀通道相互作用蛋白)直向同源物活性作為殺蟲劑靶標(biāo)的多肽，提供編碼具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)及其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及具有昆蟲電壓門控性鉀通道Shal和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽，在鑒定降低昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法中的用途。此外，本發(fā)明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及具有優(yōu)選來自黑腹果蠅Siaker鉀通道活性的作為殺蟲劑靶標(biāo)的鉀通道。在一個實施方案中，Siaker通道與優(yōu)選來自黑腹果蠅的 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型共表達(dá)。本發(fā)明還提供在殺蟲劑篩選測定法中使用的具有優(yōu)選來自黑腹果蠅昆蟲Siaker 通道和Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽，提供編碼具有昆蟲 Shaker通道和Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發(fā)明此外還涉及具有昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽分別在鑒定分別降低昆蟲a^ker通道和 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲活性化合物中的方法和測定中的用途。此外，本發(fā)明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及具有優(yōu)選來自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的作為殺蟲劑靶標(biāo)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。本發(fā)明還提供殺蟲劑的篩選測定法中使用的具有優(yōu)選來自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的多肽，提供編碼具有優(yōu)選來自黑腹果蠅酚乙醇胺受體活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct-β和Oct-β _3R 的酚乙醇胺受體活性的多肽，在鑒定降低選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct_i3-2R和 Oct-β-3R的酚乙醇胺受體活性的殺蟲活性化合物的方法和測定中的用途。此外，本發(fā)明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及作為殺蟲劑靶標(biāo)的SK-通道。本發(fā)明此外提供作為殺蟲劑靶標(biāo)的具有昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽，提供編碼具有昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的新核酸序列及其上述核酸序列的功能等同物。本發(fā)明還涉及具有昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽，在鑒定降低昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法和測定中的用途。此外，本發(fā)明涉及通過上述方法鑒定的殺蟲化合物和這些化合物用作殺蟲劑的用途.昆蟲引起許多人和動物疾病。昆蟲還引起相當(dāng)大的農(nóng)業(yè)和財產(chǎn)損害，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。盡管使用和濫用了所有的昆蟲毒藥，但是昆蟲還是每年破壞超過30 %的全球糧食作物。已經(jīng)開發(fā)出許多方法以限制由昆蟲引起的破壞。一種方法是使用用于昆蟲控制的化學(xué)藥品。許多殺蟲劑如DDT的問題在于它們需要高濃度應(yīng)用和它們具有非特異的廣譜活性的事實。化學(xué)殺蟲劑通常影響有益和無益的物種。它們當(dāng)中許多久存于環(huán)境中并且因此在食物鏈中積累。另一種方法是表達(dá)殺蟲毒素，例如來自細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)蛋白質(zhì)毒素的轉(zhuǎn)基因作物。昆蟲害蟲有獲得對所有殺蟲劑抗性的傾向，因為它們具有適應(yīng)其環(huán)境的罕見能力，這是因為它們具有在昆蟲群體中引起快速出現(xiàn)抗性的機制，如短生活周期、高繁殖率和長距離行進(jìn)的能力?，F(xiàn)在，表現(xiàn)出殺蟲劑抗性的害蟲在日益增加。因此，仍然有尋找具有對昆蟲害蟲極其特異作用的有效且經(jīng)濟(jì)的殺蟲劑的需求。 殺蟲劑越有效，其造成的環(huán)境危險越小。這可以通過鑒定和分離編碼將會控制昆蟲發(fā)育和/或存活的蛋白質(zhì)的基因?qū)崿F(xiàn)。本發(fā)明提供昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)作為殺蟲劑的新的靶標(biāo)。本發(fā)明還提供用于鑒定降低昆蟲電壓門控性鉀通道aial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。在許多果蠅屬胚胎和幼體神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的外向電壓依賴性K+電流源于Siaker 家族成員 Shaw、Shab 和 Shal 產(chǎn)生的混合電流(Tsunoda，S.和 L. Salkoll (1995) J Neuroscience. March ；15 (3) 1741-1754)。Shal 產(chǎn)生這些宏觀 K+ 電流的瞬時部分(“A-型” 電流)并且通過例如某些神經(jīng)元中引起延緩的電流脈沖調(diào)整這些電流(Yu，D.，i^ng，C.和 A. Guo (1999) JNeurobiology. Aug ；40 (2) :158-70)。選擇性剪接、翻譯后修飾和其他 Shal 相關(guān)的加工可能部分地負(fù)責(zé)在這些神經(jīng)元中觀察到的廣泛的調(diào)整(Choi，J. C.，Park，D.和 L. C. Griffith(2004)J Neurophysiology. 91 :2353-2365)。已經(jīng)證明Kv4. X(Shal)輔助蛋白KChIP可能通過促進(jìn)四聚體通道組裝急劇增加 Shal向細(xì)胞膜的運輸，和引起Sial通道門控特性的不同變化(KunjiIwar, K.，Strang, C. ， DeRubeis, D.禾口 P.J.Pfaffinger(2004)JBiological Chemistry. Dec ；279 (52) 54542-54551)。不管ami在神經(jīng)元傳導(dǎo)中的作用如何，對于該靶標(biāo)的確認(rèn)案例仍有待確立。我們的原位數(shù)據(jù)表明在胚胎腹神經(jīng)索和內(nèi)臟肌肉組織中低水平表達(dá)。位于Berkeley的果蠅屬基因組計劃顯示在胚胎/幼體內(nèi)臟肌肉、縱向內(nèi)臟肌肉纖維、腹中線和胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腹神經(jīng)索中有染色。DmaiaImRNA是在胚胎中期表達(dá)達(dá)到高峰的罕見轉(zhuǎn)錄物(內(nèi)部Lynx 數(shù)據(jù))。在哈佛醫(yī)學(xué)院果蠅保藏中心有兩個內(nèi)含子轉(zhuǎn)座子插入系，但是沒有與此相關(guān)的生存力數(shù)據(jù)，并且也得不到其它的Sial突變體。在公眾領(lǐng)域也沒有微列陣或者northern數(shù)據(jù)。在市場上還沒有已經(jīng)鑒定具有Sial鉀通道調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲劑， 這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。在另一實施方案中，本發(fā)明提供分別作為殺蟲劑新靶標(biāo)的昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kvi3亞基A或C亞型。本發(fā)明還提供用于鑒定分別降低昆蟲 Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。果蠅Hyperkinetic (Hk)突變改變編碼哺乳動物K+通道P亞基同系物的基因。 Wang 等(Biophysical Journal Volume 71, December 1996,3167-3176)已經(jīng)證明，Hk P 亞基調(diào)節(jié)大范圍的 Shaker(Sti)K+ 電流特性。從 CH0UINARD 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92，pp. 6763-6767，July 1995 Neurobiology)還可知道 Hk 與 Sh 在爪蟾卵母細(xì)胞中共表達(dá)，這證明該共表達(dá)增加電流波幅并且改變電壓依賴性和活化與失活的動力學(xué)。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，Shaker通道和Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β亞基A或B亞型的共表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生新的殺蟲劑篩選測定法。在市場上還沒有已經(jīng)鑒定具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選 H-kv β亞基A或C亞型調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲劑，這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。在另一實施方案中，本發(fā)明提供選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct_i3-2R和 Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體作為殺蟲劑的新靶標(biāo)。本發(fā)明還提供用于鑒定降低選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。酚乙醇胺是結(jié)構(gòu)上與去甲腎上腺素有關(guān)的生物源單胺，其是在脊椎動物外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中介導(dǎo)不同生理過程的主要神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和神經(jīng)激素。酚乙醇胺與酪胺一起僅是神經(jīng)活性的非肽遞質(zhì)，其生理作用局限于脊椎動物。酚乙醇胺的作用通過多種受體類別像oa2、Oamb, Oct-β _2R或Oct-β _3R介導(dǎo)。酚乙醇胺受體僅僅/主要發(fā)現(xiàn)于無脊椎動物中這一事實使得它們成為殺蟲劑的重要的靶標(biāo)。因此，特異性調(diào)節(jié)酚乙醇胺受體的化合物將具有低的脊椎動物毒性。除了選擇性之外，酚乙醇胺受體由于其在神經(jīng)元中表達(dá)而成為殺蟲劑的良好靶標(biāo)。酚乙醇胺與酪胺一起僅是神經(jīng)活性的非肽遞質(zhì)，其生理作用局限于無脊椎動物。雖然酚乙醇胺是昆蟲中的主要神經(jīng)介質(zhì)，但是已經(jīng)證明其受體難以克隆。目前，僅少數(shù)酚乙醇胺受體已經(jīng)被克隆。本發(fā)明提供克隆章魚堿受體并將其引入優(yōu)選細(xì)胞的膜中的方法。優(yōu)選地，額外連接的蛋白質(zhì)引入到膜中。取決于受體同種型，酚乙醇胺受體可通過環(huán)AMP產(chǎn)生或細(xì)胞內(nèi)鈣釋放調(diào)節(jié)它們的活性。酚乙醇胺受體，優(yōu)選oa2內(nèi)源性地通過cAMP傳導(dǎo)信號。受體活性的檢測是困難的。因此，本發(fā)明提供強制偶聯(lián)至鈣的方法，這導(dǎo)致當(dāng)其活化時鈣釋放。鈣釋放通過熒光的鈣傳感染料測量。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β -2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體的表達(dá)和泛宿主性G-α蛋白的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生新的殺蟲劑篩選測定法。當(dāng)配體結(jié)合至GPCR細(xì)胞外部分時，GPCR介導(dǎo)跨細(xì)胞膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPCR的細(xì)胞內(nèi)部分與G-蛋白相互作用以調(diào)整從細(xì)胞外至細(xì)胞內(nèi)部的信號傳導(dǎo)。因此，GPCR被稱作“偶聯(lián)”至G-蛋白。G-蛋白由三個多肽亞基組成結(jié)合和水解GTP的α亞基，和二聚體的β Y 亞基。某些G-蛋白被認(rèn)為是”泛宿主性”G-蛋白，因為它們的G亞基允許它們偶聯(lián)至正常情況下與其它家族G-蛋白偶聯(lián)的GPCR。在市場上還沒有已經(jīng)鑒定具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的Oa2、0amb、0Ct-i3 -2R和 Oct-β-3R的酚乙醇胺受體調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲劑，這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。在另一實施方案中，本發(fā)明提供作為殺蟲劑的新靶標(biāo)的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道。本發(fā)明還提供用于鑒定降低昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。鈣激活鉀通道是由細(xì)胞內(nèi)鈣增加所活化的功能多種多樣的一組離子通道。在哺乳動物中，它們主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，在其中它們促進(jìn)動作電位的形成并調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性。更加具體而言，它們的電流是動作電位后超極化的基礎(chǔ)；它們還表現(xiàn)出參與神經(jīng)元放電頻率精度(對于綜述見=Stocker 等，Nature Reviews Neuroscience 5，2004)。該類型鉀通道基于單通道導(dǎo)電性存在于三大通用類型中。大、中和小電導(dǎo)通道分別被稱作BK、IK和SK。在果蠅中，基因分別被稱作slo、slack和SK。每一類型的鉀離子通道表現(xiàn)出不同的藥理學(xué)特性。鉀離子通道與大量生理過程相關(guān)，包括心跳的調(diào)節(jié)、動脈的擴張、胰島素的釋放、神經(jīng)細(xì)胞的興奮和腎電解質(zhì)運輸?shù)恼{(diào)節(jié)。因此，鉀離子通道早已知作為治療大量疾病中的治療靶標(biāo)，如WO 2005099711和US 20050239800中所公開。特別地，SK通道已經(jīng)顯示具有不同的藥理學(xué)特性。如在WO 2005100349中所公開，使用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同化合物具有臨床相關(guān)的心理活性。所評價的化合物結(jié)構(gòu)上與三環(huán)抗抑郁劑相關(guān)并且包括阿米替林、卡馬西平、氯丙嗪、賽庚啶、丙咪嗪、他克林和三氟拉嗪。發(fā)現(xiàn)所測試的每一化合物以微摩爾親和性封閉SK2通道電流。存在影響SK通道的大量神經(jīng)肌肉抑制劑，如蜂毒明肽、阿曲庫銨、泮庫溴銨和筒箭毒堿(Siah等，Br J Pharmacol 129 :627-30(2000)) 。還描述了使用SK通道作為藥物活性化合物靶標(biāo)用于治療疾病的測定法重組大鼠腦SK2通道在HEK293哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)以通過膜片鉗技術(shù)研究中心作用性肌肉松弛劑化合物如氯唑沙宗的作用(Cao等，J. Pharmaco 1. Exp. Ther. 296 683-689，2001)。還使用轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞通過膜片鉗技術(shù)研究了金屬離子對重組人SK4 通道活化的影響(Cao 等，F(xiàn)EBS，446 137-141，1999)。鑒定增加或降低經(jīng)鈣激活鉀SK通道的鉀離子流的化合物的方法描述于WO 98/11139 中。時至今日，典型的昆蟲中的分子靶標(biāo)是乙酰膽堿酯酶、電壓依賴性鈉通道、離子型受體例如煙堿型乙酸膽堿和GABA受體。Gautier等(J. Pharm. Exp. Therapeutics, jpet. 107. 128694,2007)已經(jīng)得到了鈣激活鉀通道作為間接靶標(biāo)參與殺蟲劑神經(jīng)毒性的證據(jù)。他們通過使用反義寡核苷酸處理蟑螂(美洲蟑螂(Periplaneta americana))DUM(背側(cè)不成對中線)神經(jīng)元敲低DUM神經(jīng)元BK通道，指出DMDS ( 二甲基二硫)抑制鈣激活鉀電流。抑制Ca2+激活鉀通道活性的另外的特異毒素已經(jīng)從幾種生物中鑒定，最熟知的是如在US 5，607，843中所述的來自蜂毒的蜂毒明肽。然而，目前在市場上還沒有已經(jīng)鑒定具有Ca2+激活鉀通道，優(yōu)選SK通道調(diào)節(jié)作為其主要作用方式的殺蟲劑，這意味著化合物不僅僅通過殺蟲活性的“副作用”起作用，而且其活性是關(guān)鍵的致死作用。通常，極大地需要檢測可能組成殺蟲劑新靶標(biāo)的多肽。原因是上述抗性問題和不懈的努力以鑒定新的殺蟲活性成分，其通過盡可能寬的作用譜、生態(tài)和毒理學(xué)可接受性和/ 或低應(yīng)用率相區(qū)別?，F(xiàn)在本發(fā)明提供昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/ 或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)作為殺蟲劑靶標(biāo)和用于鑒定降低昆蟲電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。本發(fā)明還分別提供Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A 或C亞型作為殺蟲劑靶標(biāo)和用于鑒定分別降低Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。本發(fā)明還提供選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體作為殺蟲劑靶標(biāo)和用于鑒定降低選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和 Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。本發(fā)明此外提供昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道作為殺蟲劑靶標(biāo)和用于鑒定降低昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法和測定法。實際上，新靶標(biāo)的檢測具有極大困難，因為多肽活性的抑制經(jīng)常對昆蟲的存活無進(jìn)一步的影響。這可歸因于昆蟲可以轉(zhuǎn)變至替代的活性這一事實，由此編碼蛋白質(zhì)的基因的數(shù)量比微生物中的高至少3倍。此外，以SK-通道為例，關(guān)于在人醫(yī)學(xué)中的研究結(jié)果，例如WO 2005100349，其教導(dǎo)甚至對經(jīng)鉀離子通道的鉀離子流的抑制在治療疾病中是有用的，令人驚奇的是本發(fā)明的SK 通道是殺蟲劑的靶標(biāo)，因為它們影響其存活。本發(fā)明的目標(biāo)是鑒定對于昆蟲發(fā)育或存活必需的新靶標(biāo)，和提供適宜鑒定殺蟲活性化合物的方法。我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過使用具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽實現(xiàn)。本發(fā)明的一個實施方案涉及用于鑒定降低具有昆蟲電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的殺蟲活性化合物的方法，該方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽，
b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。在另一實施方案中，我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過分別使用具有昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽實現(xiàn)。本發(fā)明的一個實施方案涉及用于鑒定分別降低具有昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選_kv β亞基A或C亞型活性的多肽活性的殺蟲活性化合物的方法，所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、分別具有昆蟲Siaker通道和/或 Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選_kvi3亞基A或C亞型活性的多肽，b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。在另一實施方案中，我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過使用具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、 Oamb, Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽實現(xiàn)。本發(fā)明的一個實施方案涉及用于鑒定降低具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、 Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽活性的殺蟲活性化合物的方法， 所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct-β -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽，b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。在另一實施方案中，我們發(fā)現(xiàn)，該目標(biāo)通過使用具有昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的的多肽實現(xiàn)。本發(fā)明的一個實施方案涉及鑒定降低昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的殺蟲活性化合物的方法，所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽，b)在一側(cè)膜上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。根據(jù)本發(fā)明，膜是類似于半滲透板或?qū)拥慕Y(jié)構(gòu)，其充當(dāng)兩相或溶液之間的屏障， 因此膜是溶劑滲透性的，優(yōu)選水滲透性的。在一個實施方案中，膜是生物的膜、生物膜或者脂質(zhì)層或者脂質(zhì)雙層。膜優(yōu)選由流體脂質(zhì)雙層組成。在一個實施方案中，膜是細(xì)胞的
10外表面、細(xì)胞腔室、泡、脂質(zhì)體(由為兩性分子的磷脂組成的泡)、聚合物囊泡或者合成體 (synthosome)0聚合物囊泡常常稱作“聚合物體”，其已經(jīng)被詳細(xì)研究并且進(jìn)展已經(jīng)在綜述中總結(jié) [Discher等，Science 2002,297 ；967 973]。聚合物體或聚合物囊泡由自組裝的二或三嵌段共聚物組成。合成體是功能化的納米腔室系統(tǒng)，其已經(jīng)被開發(fā)出用于推定的生物技術(shù)應(yīng)用 [Nardin等，Chem. Commun. 2000,1433 1434]。合成體是中空球體，其由具有嵌段共聚物膜的機械穩(wěn)定囊泡和充當(dāng)選擇性門的工程改造跨膜蛋白組成。本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲的電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/ 或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)被裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語是同義詞并且可互換。本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲的Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選亞基 A或C亞型被分別裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語是同義詞并且可互換。本發(fā)明的優(yōu)選昆蟲的選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct-β _2R和Oct-β _3R 的酚乙醇胺受體被裝配入或嵌入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語是同義詞并且可互換。昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道被裝配入或插入、植入或整合入膜中，這些術(shù)語是同義詞并且可互換。為了本發(fā)明的目的，通常復(fù)數(shù)旨在包括單數(shù)，反之亦然。除非另外指出，術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文上下文中可互換。 除非另外指出，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文上下文中可互換。術(shù)語“序列”將涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白質(zhì)，這取決于術(shù)語“序列”所使用的環(huán)境。如本文所使用的術(shù)語“一個或多個基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“一個或多個核酸分子”指任何長度的聚合形式的核苷酸，或者是核糖核苷酸或者是脫氧核糖核苷酸。 這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，如本文所使用的術(shù)語“一個或多個基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“一個或多個核酸分子”包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。它們還包括已知類型的修飾， 例如具有類似物的一個或一個以上天然存在核苷酸的甲基化作用、“加帽”、取代。優(yōu)選地， DNA或RNA序列包含編碼本文所定義多肽的編碼序列?！熬幋a序列”是這樣的核苷酸序列，當(dāng)其置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列控制之下時被轉(zhuǎn)錄成 RNA，例如調(diào)節(jié)RNA如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核糖核酸酶等或者被轉(zhuǎn)錄成被翻譯成多肽的mRNA。編碼序列的邊界通過位于5’ -末端的翻譯起始密碼子和位于3’ -末端的翻譯終止密碼子決定。編碼序列可以包括，但不限于mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或基因組DNA，而在某些情況下也將出現(xiàn)內(nèi)含子。如在本文上下文中所使用，核酸分子還可以包括位于編碼基因區(qū)3’和5’端的非翻譯序列，例如編碼區(qū)5’端上游序列的至少500、優(yōu)選200、特別優(yōu)選100個核苷酸和編碼基因區(qū)3’端下游序列的至少100、優(yōu)選50、特別優(yōu)選20個核苷酸。在例如反義核酸、RNAi、 snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta_siRNA、共抑制分子、核糖核酸酶等技術(shù)的情況下，可有利地使用編碼區(qū)以及5’ -和/或3’ -區(qū)。然而，僅選擇編碼區(qū)用于克隆和表達(dá)目的常常是有利的。
“多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不指特定長度的分子。因此，肽和寡肽被包括在多肽的定義之內(nèi)。該術(shù)語還指或者包括多肽的翻譯后修飾，例如糖基化、乙?；⒘姿峄鹊?。定義所包含的是例如包含一個或更多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽、具有取代連接的多肽，以及本領(lǐng)域已知的天然存在或者非天然存在的其他修飾。術(shù)語“包含”、其語法變體當(dāng)在本說明書中使用時用于指其所述特征、整數(shù)、步驟或構(gòu)成成分或基團(tuán)的存在，但不排除其一種或更多種其他特征、整數(shù)、步驟、構(gòu)成成分或基團(tuán)的存在或加入。術(shù)語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”涉及生物、生物部分如組織或細(xì)胞內(nèi)特性
的相應(yīng)改變?！疤匦缘母淖儭睉?yīng)當(dāng)理解為活性以相對于對照、參照或野生型相應(yīng)容量或數(shù)量蛋白質(zhì)的指定容量或指定數(shù)量蛋白質(zhì)的改變。術(shù)語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”包括所述特性在僅本發(fā)明受試者的部分中的改變，例如修飾可以存在于細(xì)胞腔室如細(xì)胞器中或者生物的部分如組織、翼、腿、軀干等中。優(yōu)選地，“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”被發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞內(nèi)的，因此術(shù)語“活性的減少、 降低或抑制”涉及與野生型細(xì)胞或者對照細(xì)胞相比細(xì)胞內(nèi)的減少、降低或抑制。因此，術(shù)語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”意思是指，基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)或者調(diào)節(jié)性RNA比活性以及化合物或如多肽、核酸分子代謝物、離子或編碼mRNA或DNA的量可以在比容量內(nèi)被減少、降低或抑制。術(shù)語“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”包括，對于所述“減少”、“阻抑”、“降低”或“抑制”的理由可以是向生物或其部分施用的化學(xué)化合物。術(shù)語“減少”、“阻抑”或“降低”是可互換的。如果不另外指出的話，術(shù)語“減少”將包括術(shù)語“阻抑”，“降低”或“抑制”。減少還理解為意思是指活性的修飾。在該上下文中，功能或活性，如“功能性活性” 或“生物學(xué)活性”與對照、參照或野生型相比減少至少10%、有利的20%、優(yōu)選30%、特別優(yōu)選40 %、50 %或60 %、非常特別優(yōu)選70 %、80 %、85 %或90 %或更多，非常特別優(yōu)選的是 95%，更優(yōu)選地是99%或更高。最優(yōu)選地，活性的減少、降低或缺失總計基本上100%。因此，特別有利的實施方案是失活，例如化合物如多肽或核酸分子功能的抑制。術(shù)語“野生型”、“對照”或“參照”可互換并且可以是沒有根據(jù)本文所述方法修飾或處理的生物的細(xì)胞或部分，例如細(xì)胞器或組織，或者生物，特別是昆蟲。因此，用作野生型、 對照或參照的生物的細(xì)胞或部分，例如細(xì)胞器或組織，或者生物，特別是昆蟲盡可能對應(yīng)于其細(xì)胞、生物或部分并且除了本發(fā)明方法的結(jié)果，在任何其他性質(zhì)中盡可能與本發(fā)明的主題相同。因此，野生型、對照或參照被同樣地處理或者盡可能相同的處理，也就是說，僅條件或特性將不同，這不影響所測試特性的性質(zhì)。優(yōu)選地，任何比較在相似條件下開展。術(shù)語“相似條件”意思是指所有條件例如培養(yǎng)或生長條件、測定條件(例如緩沖液組成、溫度、底物、病原體品種、濃度等等)在待比較的實驗之間保持相同。“參照”、“對照”或“野生型”優(yōu)選沒有用本發(fā)明所述方法修飾或處理的并且具有與本發(fā)明受試者盡可能相似的任何其他特性的受試者，例如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、生物、特別是昆蟲。參照、對照或野生型在其基因組、轉(zhuǎn)錄物組、蛋白質(zhì)組或代謝物組上盡可能與本發(fā)明受試者相似。優(yōu)選地，術(shù)語“參照”、“對照”或“野生型”細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或生物涉及遺傳上與本發(fā)明的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或者生物或其部分幾乎相同，優(yōu)選95%、更優(yōu)選98%、甚至更優(yōu)選 99. 00%、特別是 99. 10%,99. 30%,99. 50%,99. 70%,99. 90%,99. 99%,99. 999% 或更高相同的細(xì)胞器、細(xì)胞、組織或者生物。最優(yōu)選地，“參照”、“對照”或“野生型”是除了負(fù)責(zé)核酸分子活性賦予核酸分子或它們所編碼的基因產(chǎn)物根據(jù)本發(fā)明的方法被修正、操作、 交換或引入之外，與根據(jù)本發(fā)明方法使用的生物、細(xì)胞或細(xì)胞器遺傳上相同的受試者，例如細(xì)胞器、細(xì)胞、組織、生物。優(yōu)選地，參照、對照或野生型與本發(fā)明的受試者僅在本發(fā)明多肽或者本發(fā)明方法中所使用多肽的活性上不同?！帮@著降低”關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的核酸序列所編碼多肽的活性，其應(yīng)理解為意思是指，與對照相比，例如與沒有與測試化合物溫育的多肽活性相比，以測試化合物處理的多肽以測量誤差之外的量度降低。關(guān)于離子通道的“功能活性”應(yīng)當(dāng)理解為離子通道表現(xiàn)出或者參與的任何一個或更多個功能和/或特性。關(guān)于酚乙醇胺受體的“功能活性”應(yīng)當(dāng)理解為酚乙醇胺受體表現(xiàn)出或者參與的任何一個或更多個功能和/或特性。在一個實施方案中，術(shù)語具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的“功能性活性” 或“生物學(xué)活性”通過鉀離子的跨膜運輸定義。在另一實施方案中，術(shù)語分別具有昆蟲Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽的“功能性活性”或“生物學(xué)活性”通過鉀離子跨膜的運輸定義。在另一實施方案中，術(shù)語具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct_i3-2R和 Oct- β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的“功能性活性”或“生物學(xué)活性”通過這樣的事實定義，即酚乙醇胺受體被α-腎上腺素能拮抗劑選擇性封閉和被α-腎上腺素能激動劑活化。在另一實施方案中，術(shù)語具有昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的“功能性活性”或“生物學(xué)活性”通過鉀離子跨膜的運輸定義。該運輸被鈣離子以選自200-1000nM、 300-900nM、300-800nM和400_800nM間隔的半最大活化或Ca2+敏感性K0. 5活化。本發(fā)明的SK通道具有選自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和5-lOpS間隔的單通道電導(dǎo)。本發(fā)明多肽的生物學(xué)活性是蜂毒明肽不敏感性的。術(shù)語化合物的“活性”指生物系統(tǒng)中，例如細(xì)胞、器官或者生物內(nèi)化合物的功能。例如，術(shù)語化合物的“活性”指化合物的酶功能、調(diào)節(jié)功能或其作為結(jié)合配偶體、轉(zhuǎn)運體、調(diào)節(jié)物或者載體等的功能。化合物的殺蟲活性指所述化合物殺死或者麻痹昆蟲的能力，或者以昆蟲提供較少損害的方式抑制昆蟲發(fā)育或者生長的能力。具有殺蟲活性的化合物也被稱為對昆蟲具有毒性?；衔锏臍⑾x活性不只引起昆蟲的死亡，還包括對昆蟲的其它有害作用，例如疾病、抗飼育劑活性、生長遲緩、降低的繁殖能力和降低的生殖力。如本文所使用的具有殺蟲活性的化合物是“殺蟲劑”。術(shù)語“殺蟲劑”通常指不利影響昆蟲生存力的化學(xué)藥品、生物學(xué)試劑和其他化合物，其例如殺死、麻痹農(nóng)作物保護(hù)、人和動物健康區(qū)的昆蟲物種、使其不育消滅或者致殘。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現(xiàn)a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID而1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的
核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與核酸分子(a)至(c)所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所述共有序列或SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 中分別所述一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :3、4 ;7、8 ;11、 12 ；15,16 ；19,20 ；23,24 ；27J8和/或31、32中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，探針包含 (a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現(xiàn)，例如Shal_ delN突變體，其具有2-40個氨基酸編碼區(qū)的N末端缺失。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含具有SEQ ID而2、6、10、14、18和/或 22所述電壓門控性鉀通道Sial或其同源物活性的多肽的至少一種功能等同物或同源物和 /或Shal_delN突變體的膜實現(xiàn)，Shal_delN突變體具有連接至具有SEQ ID NO 26和/或 30中所述其輔助蛋白KChIP或其同源物活性的多肽的2-40個氨基酸編碼區(qū)的N末端缺失。在另一實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現(xiàn)a)編碼包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核
14酸分子；b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；d)與包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷
酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有昆蟲Siaker通道和/或Hyperkinetic β 亞基，優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所述共有序列或者SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128中分別所述一個或更多個基序的
多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO 88,89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、
h)、i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現(xiàn)，由此核酸分子包含Kozak序列(例如ACCATG)。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、
i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現(xiàn)，由此核酸分子包含編碼Shaker通道的400bp或500bp的5，-片段的序列，優(yōu)選包含Shaker ATG密碼子，優(yōu)選加上適當(dāng)?shù)腒ozak，和/或Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-kv β 亞基A或C亞型的1770bp片段。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用選自SEQ ID NO :73、75、77、79、81和83的至少一種多肽或其功能等同物或同源物和選自SEQ ID NO :85和87的多肽或其功能等同物或同源物的任意組合的膜實現(xiàn)。在另一實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現(xiàn)
a)編碼 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO 130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或
173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β _3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, 0ct-^-2R 和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 177、178和/或179中分別所述共有序列或者 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、 210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 中分
別所述一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO 131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的昆蟲酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的標(biāo)記蛋白質(zhì)如GFP的膜實現(xiàn)，由此其優(yōu)選地與本發(fā)明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、 i)或j)項的核酸分子編碼的多肽連接。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其同源物編碼的，SEQ ID NO :46中所示多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現(xiàn)。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、 h)、i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的”泛宿主性”G-蛋白的膜實現(xiàn)，其G亞基使得G-蛋白與正常情況下與其它家族G-蛋白偶聯(lián)的GPCR 偶聯(lián)，由此”泛宿主性”G-蛋白優(yōu)選地與本發(fā)明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、 g)、h)、i)或j)項的核酸分子編碼的多肽連接。
在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、
h)、i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物和另外的標(biāo)記蛋白質(zhì)如GFPjP /或另外的“泛宿主性”G-蛋白的膜實現(xiàn)，由此標(biāo)記蛋白質(zhì)和/或“泛宿主性”G-蛋白優(yōu)選地與本發(fā)明的多肽，例如由選自a)、b)、c)、d)、e)、f)、g)、h)、i)或j)項的核酸分子編碼的多肽連接。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由SEQ ID NO :173中所述核酸分子或其同源物編碼的，SEQ ID NO :46中所示多肽至少一種功能等同物或同源物和另外的“泛宿主性”G-蛋白的膜實現(xiàn)，由此蛋白質(zhì)優(yōu)選地與其連接。在一個實施方案中，“泛宿主性”G-蛋白是泛宿主性G- α -16-蛋白質(zhì)或其同源物。在另一實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽的膜實現(xiàn)a)編碼SEQ ID NO :228,230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO 227、229、231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :228,230,232 的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :227、2四、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(c)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO 240, 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發(fā)明方法使用包含由選自上面a)、b)、c) ,d)、e)、f)、g)、h)、
i)或j)項所述核酸分子所編碼多肽的至少一種功能等同物或同源物的膜實現(xiàn)。術(shù)語如上所述多肽的“功能等同物”是基本上賦予如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、 22,26和/或30中所述多肽活性的多肽，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87，至于G蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、 230、232。
術(shù)語如上所述核酸分子的“功能等同物”是基本上賦予如SEQ ID N0:l、5、 9、13、17、21、25和/或四中所述核酸分子活性的多核苷酸，至于shaker通道和/或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)或多肽具有如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所述多肽的活性，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :73、75、77、79、 81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、 158、162、166、170和/或174并且至于SK-通道為SEQ ID NO :228、230、232，如果其活性的減少、阻抑、降低或抑制介導(dǎo)經(jīng)膜的鉀流降低的話。根據(jù)本發(fā)明，核酸分子或多核苷酸具有如SEQ ID而1、5、9、13、17、21、25和/或四中所述核酸分子的活性，至于shaker通道和/或Hyperkinetic^亞基為SEQ ID NO :72、 74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、 149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231 如果其表達(dá)的減少、阻抑、降低或抑制介導(dǎo)經(jīng)膜的鉀流降低的話。本發(fā)明多肽的同源物(=同源物)，特別是由如SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和/或四中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO 33和/或34 中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、 70和/或71的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，本發(fā)明多肽的同源物(=同源物)， 特別是由如SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。至于G蛋白偶聯(lián)受體，本發(fā)明多肽的同源物(=同源物)，特別是由如SEQ ID NO 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID而177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、 193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。至于SK-通道，本發(fā)明多肽的同源物(=同源物)，特別是由如SEQ ID NO :227、 229、231中所示核酸分子編碼或者包含其的多肽，或者包含含有SEQ ID NO :239中所示共有序列或選自 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和
18253的一個或更多個基序的多肽的多肽的同源物，可以衍生自任何生物，只要同源物賦予本文所述活性即可，即其是所述分子的功能等同物。此外，根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“同源物”涉及生物的、與所述生物的所有表達(dá)序列的本文所述或所列序列具有優(yōu)選最高或者基本最高序列同源性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知如何發(fā)現(xiàn)、鑒定和證實假定的同源物具有本文所述的相同活性。如果知道的話，生物中的生物學(xué)功能或活性基本上涉及或?qū)?yīng)于如對于SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25和/或四中所述基因所述的活性或功能，至于shaker通道和/或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、231。因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID N0:l、5、9、13、 17、21、25和/或四中所指出序列的核酸分子編碼的多肽的序列或者在SEQ ID NO :2、6、10、 14、18、22、26和/或30中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO 33和/或34中所示的共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID Ν0:2、6、10、14、18、22、26和/或30中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在SEQ ID而73、75、77、79、81、83、85和/或87中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO :102和/或103中所示的共有序列或分別選自SEQ ID N0:104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124和/或125和/或1沈、127和/或1 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85和/或87中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。至于G蛋白偶聯(lián)受體，因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、 170和/或174中所述的多肽序列、如分別在SEQ ID NO 177、178和/或179中所示的共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或2 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。至于SK-通道，因此，在一個實施方案中，同源物或功能等同物包含由含有SEQ ID NO :227,229,231所指出序列的核酸分子編碼的多肽序列或者在SEQ ID NO :228,230,232 中所述的多肽序列、如在SEQ ID NO :239中所示的共有序列或選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序，或者其是包含SEQ ID N0:2^、230、232中所指出多核苷酸的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)物。本文所公開的關(guān)于序列、活性、共有序列、多肽基序和測試的信息將本領(lǐng)域技術(shù)人員引向生物中的各個同源或功能等效表達(dá)產(chǎn)物。在一個實施方案中，任何一個本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50 % 的序列同一性并且優(yōu)選與昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和 /或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)分別具有基本相同或者相似的活性。在另一實施方案中，任何一個本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50% 的序列同一性并且優(yōu)選與Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型分別具有基本相同或者相似的活性。在另一實施方案中，任何一個本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50% 的序列同一性并且優(yōu)選與選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體具有基本相同或者相似的活性。在進(jìn)一步的實施方案中，任何一個本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲并且具有至少50%的序列同一性并且優(yōu)選與昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道具有基本相同或者相似的活性。在一個實施方案中，任何一個本發(fā)明多肽的同源物衍生自昆蟲，優(yōu)選來自選自有翅亞綱、新翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅目、擬步行蟲總科、擬步行蟲科、擬步行蟲屬、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蟲黽禾斗、Drosophilinae 禾口果蟲黽屬的昆蟲并且具有至少50%的序列同一性并且優(yōu)選與i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii) Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型，或iii)選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β 和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體， 或iv)昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道分別具有基本相同或者相似的活性。在一個實施方案中，任何一個本發(fā)明多肽的同源物衍生自i)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲、擬谷盜屬、褐稻飛虱，或者ii)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲、擬谷盜屬、桃蚜、棉蚜和/或苜蓿蚜，或者iii)黑腹果蠅、亞熱帶粘蟲(Spodoptera eridania)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、桃蟲牙(Myzus persicae)禾口銀葉粉風(fēng)(Bemisia argentifolii),或者iv)昆蟲，優(yōu)選來自選自有翅亞綱、新翅目、半翅目、鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅目、擬步行蟲總科、擬步行蟲科、擬步行蟲屬、Sternorrhyncha、Aphidina、Brachycera、果蠅科、Drosophilinae and果蠅屬的昆蟲并且具有至少50%的序列同一性并且優(yōu)選與昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道具有基本相同或者相似的活性。本發(fā)明多肽的功能等同物或者同源物分別具有i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆蟲酚乙醇胺受體，或 iv)昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道的活性和與選自SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30的序列所示多肽具有至少 55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62% 或 63%、優(yōu)選至少 64 %、65 %、66 %、67 %、 68%或 69%、更優(yōu)選至少 70%、71%、72%、73%、74%，75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81%、82%、83%、84%或 85%、最優(yōu)選 86%、87%、88%、89%或 90%、特別優(yōu)選至少 91 %、 92%、93%，94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，至于shaker通道和/ 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、230、232?！肮δ艿韧铩痹诒疚纳舷挛闹忻枋鲈跇?biāo)準(zhǔn)條件下與編碼具有下列生物學(xué)活性的多肽的核酸序列雜交的核酸序列i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct- β 和Oct- β -3R的酚乙醇胺受體， 或iv)昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道或上述核酸序列的部分，其能夠在細(xì)胞或生物內(nèi)引起具有下列生物學(xué)活性的多肽的表達(dá)i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆蟲酚乙醇胺受體，或iv)昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。為了開展雜交，有利的是使用如保守區(qū)或其它區(qū)域長度約10_50bp、優(yōu)選15_40bp 的短寡核苷酸，其可以以技術(shù)人員熟悉的方式通過與其它相關(guān)基因的比較確定。然而，本發(fā)明核酸的長度100-500bp的較長片段或完整序列也可用于雜交。取決于所使用的核酸/寡核苷酸、片段或完整序列的長度或取決于什么類型核酸用于雜交，即DNA或RNA，這些標(biāo)準(zhǔn)條件可變化。因此，例如，對于DNA DNA雜合體的解鏈溫度比相同長度DNA RNA雜合體的解鏈溫度低大約10°C。標(biāo)準(zhǔn)雜交條件應(yīng)理解為意思是指，取決于核酸，例如42和58°C之間的溫度，在水性緩沖溶液中具有0. 1至切之間的SSC濃度(1XSSC = 0. 15M NaCl, 15mM檸檬酸鈉，pH 7.2)或者另外在50%甲酰胺存在下，例如42°C，5xSSC，50%甲酰胺。對于DNA DNA雜合體的雜交條件有利的是0. IxSSC和約20°C和65°C之間的溫度，優(yōu)選約30°C和45°C之間的
21溫度。以DNA RNA雜合體為例，雜交條件有利的是0. IxSSC和約30 V和65°C之間的溫度， 優(yōu)選約45°C和55°C之間的溫度。已經(jīng)描述的這些雜交溫度是解鏈溫度值，其已經(jīng)通過實例如在甲酰胺缺乏下長度約100個核苷酸和50%的G+C含量的核酸計算出。對于DNA雜交的實驗條件描述于遺傳學(xué)的專業(yè)教科書中，例如在Sambrook等，‘‘Molecular Cloning"， Cold Spring Harbor Laboratory，1989中，并且可以使用技術(shù)人員熟悉的公式，例如作為核酸長度、雜合體類型或G+C含量的函數(shù)計算。技術(shù)人員將在下列教科書中找到關(guān)于雜交的進(jìn)一步的信息Ausubel 等(eds)，1985，Current 方案 s in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York ；Hames and Higgins(eds),1985, Nucleic Acids Hyb ridization APractical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown(ed), 1991, Essential Molecular Biology :A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford。此外，功能等同物還理解為意思是指，尤其是由根據(jù)本發(fā)明的核酸序列所編碼蛋白質(zhì)的各個核酸序列的天然或人工突變和來自其他生物的它們的同源物。因此，本發(fā)明還包括，例如，通過修飾SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25和/或29的核酸序列得到的那些核苷酸序列，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :129、133、137、 141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :227、229、 231。例如，此類修飾可以通過技術(shù)人員熟悉的技術(shù)，例如“定點誘變”、“易錯PCR”、“DNA改組” (Nature 370，1994，pp. 389-391)或者“交錯延伸方法” (Nature Biotechnol. 16，1998， pp. 258-261)產(chǎn)生。此種修飾的目的可以是，例如插入用于限制酶的更多的酶切位點、去除 DNA以便將序列截短、替代核苷酸以優(yōu)化密碼子或加入更多的序列。由所修飾核酸序列編碼的蛋白質(zhì)必須保留預(yù)期的功能，盡管是有偏差的核酸序列，其是下列的生物學(xué)活性i)昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)，或ii)昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型， 或iii)選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb、Oct-β-2R和Oct-β-3R的昆蟲酚乙醇胺受體，或iv)昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。因此功能等同物包括本文所述序列的天然存在變體和人工核酸序列，例如已經(jīng)通過化學(xué)合成得到的那些和適應(yīng)密碼子選擇以及從它們衍生的氨基酸序列的那些。對應(yīng)于包含SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26 和 / 或 30，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于 SK-通道為SEQ ID Ν0:2^、230、232中所示多核苷酸的核酸分子的天然變體同源物的核酸分子，例如本發(fā)明的核酸分子和還可以是cDNA的核酸分子，可以基于它們與本文所公開核酸分子的同源性，使用SEQ ID而1、5、9、13、17、21、25和/或四，至于81^1 ^通道和/或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于
22SK-通道為SEQ ID N0:227、2^K231中所示核酸分子，如本發(fā)明的核酸分子或其片段作為雜交探針，根據(jù)嚴(yán)格雜交條件下的標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離。有利地用于本發(fā)明方法的核酸分子可以基于它們與本文所公開核酸分子的同源性，使用序列或其部分作為雜交探針并在嚴(yán)格雜交條件下按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離。術(shù)語“同源性”意思是指，各個核酸分子或所編碼的蛋白質(zhì)是功能和/或結(jié)構(gòu)等效的。與上述核酸分子同源和為所述核酸分子衍生物的核酸分子是，例如，核酸分子的變體， 所述變體呈現(xiàn)出具有相同的生物學(xué)功能，特別是編碼具有相同或者基本相同生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)的修飾。它們可以是天然存在的變體，例如來自其他植物品種或物種或突變的序列。 這些突變可天然發(fā)生或者可通過誘變技術(shù)得到。等位基因變體可以是天然存在的等位基因變體以及合成產(chǎn)生的或遺傳工程產(chǎn)生的變體。結(jié)構(gòu)等同物可以通過例如測試所述多肽與抗體的結(jié)合或者基于計算機的預(yù)測鑒定。結(jié)構(gòu)等同物具有相似的免疫學(xué)特性，例如包含相似的表位?！半s交”意思是指，核酸分子在常規(guī)雜交條件，優(yōu)選在嚴(yán)格雜交條件下，例如 Sambrook(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual, 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)) 5 Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6 中所述的條件下雜交。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明核酸的DNA以及RNA分子可以用作探針。此外，作為用于鑒定功能同源物的模板，可以開展Northern印跡分析以及Southern印跡分析。Northern印跡分析有利地提供關(guān)于所表達(dá)基因產(chǎn)物的更多的信息例如表達(dá)模式、加工步驟的出現(xiàn)，像剪接和加帽等。Southern印跡分析提供關(guān)于編碼本發(fā)明核酸分子的基因的染色體定位和組織的附加信息。嚴(yán)格Southern印跡雜交條件的優(yōu)選、非限定實例是，在6x氯化鈉/檸檬酸鈉 (=SSC)中于大約45 °C下雜交，接著是在0. 2xSSC,0. 1% SDS中于50至65°C，例如在 50°C、55°C或60°C下開展一次或更多次的洗滌步驟。技術(shù)人員已知，這些雜交條件因核酸類型的不同而不同，并且例如當(dāng)存在有機溶劑時，關(guān)于溫度和緩沖液的濃度的雜交條件因核酸類型的不同而不同。“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”下的溫度因核酸類型的不同而不同，例如在具有0. Ix,0. 5x、lx、2x、3x、4x或5xSSC(pH 7. 2)濃度的水性緩沖液中在42°C和58°C之間， 優(yōu)選在45°C和50°C之間。如果在上述緩沖液中存在一種或多種有機溶劑，例如50%甲酰胺，標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度約40°C、42°C或45°C。對于DNA DNA雜合體的雜交條件優(yōu)選的為例如 0. IxSSC 和 20°〇、251、301、351、401或451，優(yōu)選在 30°C禾口 45°C之間。對于DNA RNA雜合體的雜交條件優(yōu)選的為例如0. 1乂55(和301、；351、401、451、501或 55°C，優(yōu)選在45°C和55°C之間。對于例如在甲酰胺缺乏下長度約100bp(=堿基對)和 50%的G+C含量的核酸確定了上述雜交溫度。技術(shù)人員知道借助于教科書確定所需要的雜交條件，例如上面提到的教科書或者下列教科書=Sambrook等，‘‘Molecular Cloning"， Cold Spring Harbor Laboratory,1989 ;Hames 禾口 Higgins(Ed.) 1985, " Nucleic Acids Hybridization :A Practical Approach " , IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown (Ed. )1991, " Essential Molecular Biology :A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford。一個此類嚴(yán)格雜交條件的其他實例是在4XSSC中于65°C下雜交，接著在0. IXSSC中于65 °C下洗滌一小時。備選地，示例性的嚴(yán)格雜交條件是在50 %甲酰胺，4XSSC中于42 °C 下雜交。此外，洗滌步驟過程中的條件可以選自由低嚴(yán)格條件(約2X SSC中于50°C下)和高嚴(yán)格條件(約0. 2XSSC中于50°C下，優(yōu)選于65°C下)(20XSSC :0. 3M檸檬酸鈉，3M NaCl, PH 7.0)所界定的條件范圍。此外，洗滌步驟過程中的溫度可以從室溫約22°C的低嚴(yán)格條件升高約65°C的較高嚴(yán)格條件。鹽濃度和溫度參數(shù)兩者可同時變化，或者兩個參數(shù)之一可以保持恒定而僅另一個變化。在雜交過程中還可以使用變性劑，例如甲酰胺或SDS。在50%甲酰胺存在下，雜交優(yōu)選地在42°C下實現(xiàn)。相關(guān)因素如i)處理長度、ii)鹽濃度、iii)去污劑條件、iv)競爭DNA、 ν)溫度和vi)探針選擇可以依情況組合以致于并非所有的可能性均在此提到。對于DNA雜交(Southern印跡分析)和洗滌步驟的條件的一些實例示于下面(1)可以從下列條件中選擇雜交條件a)4XSSC，65°C，b)6XSSC，45°C，c) 6XSSC，100mg/ml 變性的片段化的魚精 DNA，68°C，d)6XSSC，0. 5% SDS, 100mg/ml 變性的鮭精 DNA，68°C，e)6XSSC,0. 5% SDS, 100mg/ml 變性的片段化鮭精 DNA，50% 甲酰胺，42°C，050%甲酰胺，4父55(，421，g)50% (vol/vol)甲酰胺，0. 牛血清白蛋白，0. 1 % Ficoll，0. 1 %聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸鈉緩沖液pH 6. 5,750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42°C，h) 2X 或 4XSSC，50°C (低嚴(yán)格條件)，或i)30至40%甲酰胺，2X或4XSSC，42°C (低嚴(yán)格條件)。(2)洗滌步驟可以從例如下列條件中選擇a) 0. 015M NaCl/0. 0015M 檸檬酸鈉 /0. 1 % SDS, 50°C。b)0. 1XSSC，65°C。c)0. 1XSSC，0. 5% SDS，68°C。d)0. 1XSSC,0. 5% SDS，50% 甲酰胺，42°C。e) 0. 2XSSC, 0. 1 % SDS, 42°C。f) 2XSSC,65°C (低嚴(yán)格條件)·g)0, 2XSSC,0, 1% SDS,60°C (中高嚴(yán)格條件)，或h)0, 1XSSC,0, 1% SDS,60°C (中高嚴(yán)格條件)，或i)0, 2XSSC,0, 1% SDS,65°C (高嚴(yán)格條件)，或h) 0，1XSSC, 0，1 % SDS, 65°C (高嚴(yán)格條件)。在一個實施方案中，術(shù)語“嚴(yán)格條件下的雜交”旨在描述對于這樣的雜交和洗滌的條件，在該條件下彼此至少30^^40^^50%或65%同一性的核苷酸序列通常仍然彼此雜交。優(yōu)選地，條件是這樣的，以致于彼此至少約70 %、更優(yōu)選至少約75 %或80 %并且甚至更優(yōu)選至少約85%、90%或95%或更高同一性的序列通常仍然保持彼此雜交。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1、5、9、13、17、 21、25和/或29中所示序列，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基情況下SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86，在 G 蛋白偶聯(lián)受體情況下 SEQ ID NO 129、133、137、
24141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且在 SK-通道情況下 SEQ ID NO :227、 229,231中所示序列雜交，并且對應(yīng)于天然存在的核酸分子。如本文所使用，“天然存在”核酸分子指具有自然出現(xiàn)的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如編碼天然蛋白質(zhì))。除了在種群中存在的核酸或蛋白質(zhì)序列的天然存在變體之外，技術(shù)人員將進(jìn)一步地認(rèn)識到，可通過向編碼多肽的核酸分子的核苷酸序列中引入突變而引入改變，由此導(dǎo)致所編碼多肽氨基酸序列中的改變并且由此改變多肽的功能能力，這意味著優(yōu)選減少、降低或缺失所述活性。例如，導(dǎo)致“必需”氨基酸殘基位置上氨基酸替代的核苷酸替代可以在本發(fā)明方法中待減少的核酸分子序列中進(jìn)行，所述序列例如包含如SEQ ID N0:l、5、9、13、17、 21、25和/或四中所示對應(yīng)核酸分子，在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基情況下 SEQ ID N0:72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶聯(lián)受體情況下SEQ ID Ν0:129、 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且在 SK-通道情況下 SEQ ID Ν0:227、2^、231?！氨匦琛卑被釟埢沁@樣的殘基，即如果來自一個多肽野生型序列的殘基改變導(dǎo)致所述多肽活性改變，而“非必需”氨基酸殘基對于蛋白質(zhì)活性，例如對于作為酶或通道的活性而言是不需要的。“必需”殘基的改變常常導(dǎo)致多肽活性減少、降低或缺失。優(yōu)選地，多肽氨基酸以如此方式改變以致于活性被減少、降低或缺失，這意味著優(yōu)選地必需氨基酸殘基和/或更多非必需殘基被改變并且由此在降低多肽的表達(dá)或活性之后活性減少。 然而，其它氨基酸殘基(例如在具有所述活性的結(jié)構(gòu)域中不保守的或僅半保守的那些)對于活性而言不是必需的，并且因此可以被改變而不改變所述活性，這是較不優(yōu)選的。優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30 中所示序列或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列至少約60%、70%或80%相同，更優(yōu)選與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30所示序列之一或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID而2、6、10、14、18、22、沈和/或30中所示序列或者與包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一個或更多個基序的序列至少約90%, 91%、92%、93%、94%、95% 同源，并且最優(yōu)選與 SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、洸和/或30 中所示序列或者與包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列至少約 96%、97%、98%或 99% 同一。在shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基的情況下，優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQ ID NO: 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或126,127和/或128的一個或更多個基序的序列至少約60%、70%或80%同一，更優(yōu)選與 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :102 禾口 / 或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 /或1 的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :73,75,77, 79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個或更多個基序的序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優(yōu)選與SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示序列或者與包含SEQ ID NO 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個或更多個基序的序列至少約96%、97%、98%或99%同一。在G蛋白偶聯(lián)受體的情況下，優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO 180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225和/或226的一個或更多個基序的序列至少約 60%、70%或 80% 同一，更優(yōu)選與 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174中所示序列或者與包含SEQ ID NO 177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、 和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225和/或226的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO 180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個或更多個基序的序列至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95% 同源，并且最優(yōu)選與 SEQ ID NO 130、134、138、142、 146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示序列或者與包含 SEQ ID NO :177,178 和 /或179中分別所示共有序列或者分別選自SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、 187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225和/或226的一個或更多個基序的序列至少約96%、97%、 98%或 99% 同一。在SK-通道的情況下，優(yōu)選地，由核酸分子編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO =228,230, 232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的序列至少約60%、70%或80%同一，更優(yōu)選與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239 所示共有序列或者選自 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、 249、250、251、252和253的一個或更多個基序的序列至少約85%同一，甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%同源，并且最優(yōu)選與SEQ ID NO :228、 230、232所示序列或者與包含SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的序列至少約 96%、97%、98%或 99% 同一。為了確定兩個氨基酸序列或者兩個核酸分子的同源性(=同一性)百分?jǐn)?shù)，將一個序列寫在另一個序列的下方以便優(yōu)化比較。可以向蛋白質(zhì)或核酸分子序列中插入空位以便產(chǎn)生與另一蛋白質(zhì)或者另一核酸的最佳比對。然后在兩個聚合物之間比較對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或者核苷酸。如果在一個序列中的一個位置被與另一序列對應(yīng)位置上的相同的氨基酸殘基或相同的核苷酸占據(jù)，則在該位置上分子是相同的。氨基酸或者核苷酸“同一性”，如在本文上下文中所使用，對應(yīng)于氨基酸或者核酸“同源性”。通常，兩個序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)是序列共享的相同位置數(shù)量的函數(shù)(即％同源性=相同位置數(shù)量/總位置數(shù)量xlOO)。因此，術(shù)語“同源性”和“同一性”被認(rèn)為對于本說明書是同義詞。為了確定兩個或更多個氨基酸序列或者兩個或更多個核苷酸序列之間的同源性 (=同一性)百分?jǐn)?shù)，已經(jīng)開發(fā)出數(shù)個計算機軟件程序。兩個或更多個序列的同源性可用軟件fasta計算，其目前已經(jīng)有版本fasta 3在使用(W. R. Pearson和D. J. Lipman (1988)， Improved Tools for Biological Sequence Comparison.PNAS 85 2444-2448 ； W. R. Pearson(1990)Rapid and Sensitive Seq uence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology 183 :63-98 R. Pearson 禾口 D. J. Lipman(1988)Improved Tools for Biological Sequence Comparison. PNAS 85 :2444-2448 ；W. R. Pearson(1990) ；Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA Methods in Enzymology 183 :63-98)。用于計算不同序列同源性的另一有用的程序是標(biāo)準(zhǔn)的blast程序，其包含在 Biomax pedant軟件之中(Biomax，Munich，德意志聯(lián)邦共和國)。不幸的是，這有時產(chǎn)生亞最佳的結(jié)果，因為blast不是經(jīng)常把目標(biāo)和查詢序列的全部包括在內(nèi)。雖然該序列極其有效，其可以用于比較極大數(shù)量的序列。對于此類序列比較有代表性地使用下列設(shè)置-p 程序名稱[字符串]；-d數(shù)據(jù)庫[字符串]；默認(rèn)=nr;-i查詢文件[文件輸入]；默認(rèn)= stdin ；-e期望值(E) [Real]；默認(rèn)=10. O ；-m比對觀察選項0 =配對；1 =查詢錨定的顯示同一性；2 =查詢錨定的無同一性；3 =平面查詢錨定的，顯示同一性；4 =平面查詢錨定的，無同一性；5 =查詢錨定的無同一性和平端；6 =平面查詢錨定的，無同一性和平端；7 =XML Blast輸出；8 =列表；9帶有注解行的列表[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-o BLAST報告輸出文件[文件輸出]可選；默認(rèn)=stdout ；-F過濾查詢序列(DUST具有blastn，SEG具有其他)[字符串]；默認(rèn)=T ；-G空位打開代價(零調(diào)用默認(rèn)行為)[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-E空位延長代價(零調(diào)用默認(rèn)行為)[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-X對于有空位比對的X減少(in bits)
27(零調(diào)用默認(rèn)行為)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，所有其他15[整數(shù)]；默認(rèn)=
0；-I Show GI' s in deflines[T/F]；默認(rèn)=F ；-q核苷酸錯配罰分(僅blastn)[整數(shù)]； 默認(rèn)=-3 ；_r核苷酸匹配獎勵(僅blastn)[整數(shù)]；默認(rèn)=1 ；_v對于(V)顯示一行描述的數(shù)據(jù)庫序列數(shù)量[整數(shù)]；默認(rèn)=500 ；-b顯示對于(B)比對的數(shù)據(jù)庫序列數(shù)量[整數(shù)]； 默認(rèn)=250 ；_f對于延長命中的閾值，如果是零為默認(rèn)；blastp 11，blastn 0，blastx 12， tblastn 13 ；tblastx 13，megablast 0 [整數(shù)]；默認(rèn)=0 ；-g 執(zhí)行有缺口的比對(對于 tblastx不可用)[T/F]；默認(rèn)=T ；-Q使用的查詢遺傳密碼子[整數(shù)]；默認(rèn)=1 ；-D DB遺傳密碼子(僅對于tbiastfcx])[整數(shù)]；默認(rèn)=1 ；-a使用的處理器數(shù)量[整數(shù)]；默認(rèn)=
1；-0 SeqAlign文件[文件輸出]可選；-J相信查詢def line [T/F]；默認(rèn)=F;_M矩陣[字符串]；默認(rèn)=BL0SUM62 ；-W字大小，如果是零為默認(rèn)(blastn 11，megablast 28，所有其他3)[整數(shù)]；默認(rèn)=0;-z數(shù)據(jù)庫的有效長度(對應(yīng)真實大小使用零)[真]；默認(rèn)=0;-K 來自待保留區(qū)域的最佳命中數(shù)(默認(rèn)為關(guān)，如果使用則數(shù)值100是推薦的)[整數(shù)]；默認(rèn) =0 ；-P對于多次命中為0，對于一次命中為1 [整數(shù)]；默認(rèn)=0 ；-Y搜索空間的有效長度 (對于真實大小使用零)[真]；默認(rèn)=0;_s針對數(shù)據(jù)庫搜索的查詢鏈(對于blast[nx]， 和tblastx) ；3是兩者，1是上面的，2是下面的[整數(shù)]；默認(rèn)=3 ；-T產(chǎn)生HTML輸出[T/ F]；默認(rèn)=F ;-1對數(shù)據(jù)庫搜索限制于GI' s列表[字符串]可選；-U使用小寫過濾FASTA 序列[T/F]可選；默認(rèn)=F ；-y在命中中對于非空位延伸的X減少值(0.0調(diào)用默認(rèn)行為)； blastn20, megablast 10，所有其他7 [真]；默認(rèn)=0. 0 ；-Z在命中中對于最終缺口比對的 X減少值(0.0調(diào)用默認(rèn)行為)；blastn/megablast 50, tblastx 0，所有其他25 [整數(shù)]；默認(rèn)=0 ；-R PSI-TBLASTN檢查點文件[文件輸入]可選；_n MegaBlast搜索[T/F]；默認(rèn)= F ；-L查詢序列上的位置[字符串]可選；-A多重命中窗口大小，如果是零為默認(rèn)(blastn/ megablast 0，所有其他40 [整數(shù)]；默認(rèn)=0;_w移碼罰分(對blastx為OOF算法)[整數(shù)]；默認(rèn)=0 ；-t用于連接HSR的tblastn中允許的最大內(nèi)含子長度(0不能連接)[整數(shù)]；默認(rèn)=0。通過使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法達(dá)到高質(zhì)量的結(jié)果。因此基于所述算法的程序是優(yōu)選的。有利的，序列比較可以用程序PileUp(J.Mol. Evolution.，25，351-360，1987，Higgins 等，CABI0S，51989 151-153)或優(yōu)選用程序 Gap 和 BestFit 進(jìn)行，它們分別基于 Needleman 和 Wunsch [J. Mol. Biol. 48 ；443-453 (1970)]以及 Smith 和 Waterman [Adv. App 1. Math. 2 ；482-489 (1981)]的算法。兩個程序是 GCG 軟件包的一部分[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991) ；Altschul 等(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389 以及下列等等]。因此，優(yōu)選地使用Gap程序在序列的整個范圍上開展計算以確定序列同源性百分?jǐn)?shù)。對于核酸序列比較使用下列標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整空位加權(quán):50，長度加權(quán):3，平均匹配10. 000，平均錯配0. 000。例如在核酸水平與SEQ ID N0. 1所示序列具有80%同源性的序列理解為意思是指，當(dāng)通過上述Gap程序算法應(yīng)用上述參數(shù)設(shè)置與SEQ ID NO 1的序列比較時序列具有 80%同源性。兩個多肽之間的同源性理解為意思是指，通過借助于程序算法Gap (Wisconsin Package Version 10. 0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA)，設(shè)置以下參數(shù)空位加權(quán)8 ；長度加權(quán)2 ；平均匹配2. 912 ；平均錯配-2. 003經(jīng)比較計算的，每一情況下整個序列長度上的氨基酸序列的同一性。例如在蛋白質(zhì)水平與SEQ ID NO :2的序列具有80%同源性的序列理解為意思是指，當(dāng)通過上述Gap程序算法應(yīng)用上述參數(shù)設(shè)置與SEQ ID NO 2的序列比較時序列具有 80%同源性。根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或 30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的序列之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70和/或71的一個或更多個基序的多肽之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過與SEQ ID而2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29 所示核酸序列衍生的功能等同物與SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示的根據(jù)本發(fā)明的核酸具有至少30%、；35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%優(yōu)選至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優(yōu)選至少95 %、 97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽具有基本相同特性的多肽。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失,從SEQ ID N0:73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽之一或者包含SEQ ID NO: 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO 104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 1沈、127和/或1 的一個或更多個基序的多肽之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124 和 / 或 125 和 / 或 126、127 和 / 或 128 的一個或更多個基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，優(yōu)選至少55 %、60 %、 65 %或70 %，優(yōu)選至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優(yōu)選至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且通過與 SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85 和/或87所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸序列衍生的功能等同物， 與根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID而72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸之一具有至少 30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91%、92%、93%或94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽具有基本相同特性的多肽。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO 130, 134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 中所示多肽之一或者包含 SEQ ID NO 177、178和/或179中分別所示共有序列或者分別選自SEQ ID NO 180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226 的一個或更多個基序的多肽之一衍生的功能等同物，與 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 /或174中所示多肽之一或者包含SEQ ID而177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207和/或208、 和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 /或226的一個或更多個基序的多肽之一具有至少30%、35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91 %、92%、93%或 94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過與SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170和/或174所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO 129, 133、137、141、145、149、153、157、161、165、169和/或173中所示核酸序列衍生的功能等同物，與根據(jù)本發(fā)明的 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173中所示核酸之一具有至少30%、；35%、40%、45%或50%，優(yōu)選至少55%、60%、65%或 70 %，優(yōu)選至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94 %，非常特別優(yōu)選至少 95%、97%、98% 或 99% 同源性，并且編碼與 SEQ ID NO :130、134、138、142、146、150、 154、158、162、166、170和/或174中所示多肽具有基本相同特性的多肽。以SK-通道為例，根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO =228,230, 232所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :239中所示共有序列或選自SEQ ID NO :240、241、 242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多Jft之一衍生的功能等同物，與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示多肽之一或者包含SEQ ID NO :239 所示共有序列或選自 SEQ ID NO :240,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251, 252和253的一個或更多個基序的多肽之一具有至少30 %、35 %、40 %、45 %或50 %，優(yōu)選至少55%、60%、65%或70%，優(yōu)選至少80%，特別優(yōu)選至少85%或90%、91 %、92%、93%或 94%，非常特別優(yōu)選至少95%、97%、98%或99%同源性，并且通過與SEQ ID NO :228,230, 232所示多肽具有基本相同的特性相區(qū)別。以SK-通道為例，根據(jù)本發(fā)明通過取代、插入或者缺失，從SEQ ID NO =227,229, 231中所示核酸序列衍生的功能等同物，與根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID N0:227、2^、231中所示核酸之一具有至少30 %、；35 %、40 %、45 %或50 %，優(yōu)選至少55 %、60 %、65 %或70 %，優(yōu)選至少80 %，特別優(yōu)選至少85 %或90 %、91 %、92 %、93 %或94%，非常特別優(yōu)選至少95 %、 97%、98%或99%同源性，并且編碼與SEQ ID NO :2觀、230、232中所示多肽具有基本相同特性的多肽。
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在一個實施方案中，兩個核酸序列或多肽序列之間的“同源性”或“同一性”通過每一情況中核酸序列/多肽序列整個序列長度上的同一性定義，同一性通過借助于設(shè)置如下參數(shù)空位加權(quán)8 ；長度加權(quán)2 ；平均匹配2，912 ；平均錯配-2，003以程序算法 GAP(Wisconsin Package VersionlO.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG)，Madison, USA)進(jìn)行的比對計算。在下文中，術(shù)語同一性也代替術(shù)語“同源的”或“同源性”同義地使用。“突變”包括取代、添加、缺失、倒位或插入一個或更多個核苷酸殘基，這也可通過取代、插入或者缺失一個或更多個氨基酸帶來靶標(biāo)蛋白質(zhì)對應(yīng)氨基酸序列的改變。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的
核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :7、8 ；9,10 ；IU 12中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核
酸分子；b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；d)與包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷
酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、IM和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :88,89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的0&2、0&1^、0(^-3-21 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
226的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO 131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以SK-通道為例，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及選自下列的分離的核酸分子a)編碼SEQ ID NO =230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO =229,231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO =230,232的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :2四、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO 240, 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明分離的核酸分子的核酸構(gòu)建體。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或者分離的核酸分子的載體。
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在一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化方式包含本發(fā)明的載體、核酸構(gòu)建體或者分離的核酸分子的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞?！胺蛛x的”多核苷酸或者核酸分子與存在于該核酸分子天然來源的其它多核苷酸或者核酸分子分離。分離的核酸分子可以是數(shù)kb的染色體片段，或者優(yōu)選地僅包含基因編碼區(qū)的分子。因此，分離的核酸分子可包含臨近5’和3’的染色體區(qū)或者進(jìn)一步臨近染色體區(qū)，但是優(yōu)選地不包含如此的序列，即其天然位于在核酸分子所來源生物基因組或染色體背景中核酸分子的側(cè)翼(例如臨近編碼核酸分子5’ -和3’ -UTR區(qū)的序列)。在多種實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的分離的核酸分子可以例如包含小于約5kb、4kb、3kb、 2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列，這些核苷酸序列天然位于核酸分子所來源細(xì)胞基因組DNA中核酸分子的側(cè)翼。在方法中使用的核酸分子或其部分可以使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和本文提供的序列信息分離。同樣，例如在DNA或者氨基酸水平同源的序列或者同源、保守序列區(qū)可以借助于比較算法鑒定。前者可以用作標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2ndEd. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的那些)下的雜交探針用于分離在該方法中有用的更多的核酸序列。包含其活性待在本發(fā)明方法中降低的分子的整個序列或其部分的核酸分子，可額外地通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基于被使用的該序列或其部分的寡核苷酸引物分離。例如，包含完整序列或其部分的核酸分子可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用已經(jīng)基于該每一序列產(chǎn)生的寡核苷酸引物分離。例如，mRNA可以通過例如Chirgwin等(1979)Biochemistry 18: 5294-5299的硫氰酸胍提取法從細(xì)胞分離，并且cDNA可通過逆轉(zhuǎn)錄酶(例如Moloney MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Gibco/BRL，Bethesda, MD得到，或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，可從Seikagaku America, Inc.，St. Petersburg, FL 得到)產(chǎn)生。用于通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增的合成的寡核苷酸引物可以基于本文所示序列產(chǎn)生。此類引物可以用于從cDNA文庫或者從基因組文庫擴增核酸序列和鑒定在本發(fā)明方法中有用的核酸分子。此外，通過與根據(jù)本發(fā)明方法待減少的核酸分子所編碼蛋白質(zhì)，特別是SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子，在 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基情況下，SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86，在G蛋白偶聯(lián)受體情況下，SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和/ 或 173，并且在 SK-通道情況下，SEQ ID Ν0:227、229、231所編碼的序列開展蛋白質(zhì)序列比對，可以鑒定來自不同生物的保守區(qū)，并且反過來從這些保守區(qū)可以衍生簡并引物。保守區(qū)是在來自不同來源的數(shù)個同源物的一個特定位置中的氨基酸極少變異的那些區(qū)。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比對。此外，通過與根據(jù)本發(fā)明方法待減少的核酸分子所編碼蛋白質(zhì)，特別是由SEQ ID而2、6、10、14、18、22、26和/或30所示多肽分子編碼的序列，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :73、 75、77、79、81、83、85和/或87，至于6蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、 150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :228、230、232 開展蛋白質(zhì)序列比對，可以鑒定來自多種生物的保守區(qū)，并且反過來從這些保守區(qū)可以衍生簡并引物。保守區(qū)是在來自不同來源的數(shù)個同源物的一個特定位置中的氨基酸極少變異的那些區(qū)。本文所示的共有序列和多肽基序衍生自所述比對。在一個有利的實施方案中，在本發(fā)明方法中，包含SEQ ID NO :33和/或34，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :102和/或103，至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID NO 177、178和/或179， 并且至于SK-通道為SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54和 / 或55、和 / 或56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128，至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209,210, 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽或者由它們組成的多肽的活性被降低，并且在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO :33和/或34，至于shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為SEQ ID NO :102和/或103，至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID NO :177、178和/或179， 并且至于SK-通道為SEQ ID NO :239所示共有序列或者選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO:104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128，至于G蛋白偶聯(lián)受體為SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189和/或190、和/或191、192、193、194、 195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209,210, 211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或 226，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO :240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽或者由它們組成的多肽，由此所指定的20或更少、優(yōu)選15或 10、優(yōu)選9、8、7或6、更優(yōu)選5或4、甚至更優(yōu)選3、甚至更優(yōu)選2、甚至更優(yōu)選1、最優(yōu)選0個氨基酸位置被任意氨基酸代替。在一個實施方案中，由字母指定的不大于15%、優(yōu)選10%、 甚至更優(yōu)選5%、4%、3%或2%、最優(yōu)選1 %或0 %的氨基酸位置被另一氨基酸代替。在一個實施方案中，20或更少、優(yōu)選15或10、優(yōu)選9、8、7或6、更優(yōu)選5或4、甚至更優(yōu)選3、甚至更優(yōu)選2、甚至更優(yōu)選1、最優(yōu)選0個氨基酸被插入至共有序列或蛋白質(zhì)基序中。共有序列衍生自如SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于shaker通道和 / 或Hyperkinetic^ 亞基為 SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174，并且至于SK-通道為SEQ ID NO 228、230、232所示序列的多重比對。字母表示單字母氨基酸密碼子并且表明氨基酸在所有比對的蛋白質(zhì)中是保守的。字母X代表在所有序列中不保守的氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域從所有序列鑒定并且使用亞類標(biāo)準(zhǔn)Prosite標(biāo)記法描述，例如模式
35Y-x (21，23) - [FW]意思是指，保守酪氨酸被來自苯丙氨酸或色氨酸的最小21和最大23個氨基酸殘基分隔開。保守模式使用軟件工具M(jìn)EME版本3. 5. 1或者手工鑒定。MEME由Timothy L. Bailey 禾口 Charles Elkan, Dept. of Computer Science and Engeneering, University of California, San Diego, USA 開發(fā)并且由 Timothy L. Bailey 禾口 Charles Elkan [Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology,pp. 28-36,AAAI Press,Menlo Park,California, 1994]描述。獨立程序的源代碼可以從San Diego Supercomputer center (http//meme. sdsc. edu)公開獲得。為了用軟件工具M(jìn)EME鑒定所有序列中的共同基序，使用下列設(shè)置-maxsize 500000, -nmotifs 15, -evt 0. 001，-maxw 60, _ 巨畠 le-3, -minsites Μ 白勺 歹(J·。 對于MEME的輸入序列是Fasta格式的非對齊的序列。其它參數(shù)在該軟件版本中使用默認(rèn)設(shè)置。對于保守結(jié)構(gòu)域的Prosite模式使用軟件工具Pratt版本2. 1或手工產(chǎn)生。 Pratt 由 Inge Jonassen, Dept. of Informatics, University of Bergen, Norway 開發(fā)并 由 Jonassen 等.[I. Jonassen, J. F. Collins and D. G. Higgins, Finding flexible patterns in unaligned protein sequences, Protein Science 4(1995), pp.1587-1595 ； I. Jonassen, Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph, Submitted to CABIOS Febr. 1997]描述。對于獨立程序的源代碼(ANSI C)在例如建立的生物信息中心像 EBI (European Bioinformatics Institute)中公開得到。為了使用軟件工具Pratt產(chǎn)生模式，使用下列設(shè)置PL(max Pattern Length) 100,PN(max Nr of Pattern Symbols) : 100,PX(max Nr of consecutive x' s) 30,FN(max Nr of flexible spacers) :5, FL(max Flexibility) :30, FP(max Flex. Product) 10, ON (max number patterns) :50。對于Pratt的輸入序列是如從軟件工具M(jìn)EME所鑒定的表現(xiàn)出高相似性的蛋白質(zhì)序列的不同區(qū)。不得不匹配所產(chǎn)生模式的序列的最低數(shù)量(CM，min Nr of Seqs to Match)被設(shè)置成是所提供序列的至少80%。本文未提到的參數(shù)使用它們的默認(rèn)設(shè)置。保守結(jié)構(gòu)域的Prosite模式可以用于搜尋匹配該模式的蛋白質(zhì)序列。多個建立的生物信息中心提供公開的英特網(wǎng)入口用于在數(shù)據(jù)庫搜索中使用那些模式(例如PIR[蛋白質(zhì)信息資源，位于 Georgetown University Medical Center]或 ExPASy [Expert Protein Analysis System])。備選地，可利用獨立軟件，像程序Fuzzpro，它是EMBOSS軟件包的部分。例如，程序Fuzzpro不但允許搜索精確的模式-蛋白質(zhì)匹配，而且還允許在開展的搜索中設(shè)置不同的模糊。比對使用軟件ClustalK版本1. 83)開展并描述于Thompson等· [Thompson, J. D. , Higgins, D.G.and Gibson, T. J. (1994)CLUSTALff improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22 :4673_4680]。對立程序的源代碼從 European Molecular Biology Laboratory ；Heidelberg, Germany 公開獲得。分析使用 Clustalff vl. 83 默認(rèn)參數(shù)(空位開口罰分10.0 ；空位延長罰分0.2 ；蛋白質(zhì)矩陣Gonnet ；pprotein/DNA endgap -1 ；蛋白質(zhì) /DNA gapdist 4)開展。然后，如上述設(shè)計的簡并引物可被PCR采用用于擴增編碼具有上述活性的蛋白質(zhì)的新編碼區(qū)片段。然后，這些片段可用作雜交探針用于分離完整的基因序列。備選地，缺失的5’和 3’序列可以通過RACE-PCR手段分離。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以使用cDNA，備選地使用基因組DNA作為模板和適宜寡核苷酸引物，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增技術(shù)擴增。因此，擴增的核酸分子可以被克隆入適宜的載體中并通過DNA序列分析的方式表征。對應(yīng)于用于本發(fā)明方法的核酸分子之一的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成方法，例如使用自動DNA合成儀產(chǎn)生。有利地用于根據(jù)本發(fā)明方法的核酸分子可以基于它們與本文所公開核酸分子的同源性，使用序列或其部分作為雜交探針并且按照嚴(yán)格雜交條件下的標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)分離。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29 中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或29所示核酸分子的多核苷酸的
核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1 或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :7、8 ；9,10 ；IU 12中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽
a)編碼SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87中所示多肽的核酸分子；b) SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84 和 / 或 86 所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ IDN0:73、75、77、79、 81、83、85和/或87的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86所示核酸分子的多核苷
酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、124和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :88、89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C 亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO 130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列；d)與包含 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或
173所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與核酸分子(a)至(c)所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對
38(a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, 0ct-^-2R 和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
226的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO 131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt。以SK-通道為例，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO =230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :229、231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :230、232的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :229、231所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO 240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID N0:233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽的膜，由此膜不具有本發(fā)明多肽的內(nèi)源活性。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞，由此宿主的膜不顯示本發(fā)明多肽的內(nèi)源活性。措辭“膜不具有本發(fā)明多肽的最初活性”意思是指，本發(fā)明的多肽不是天然存在膜的部分，但是其被裝配入根據(jù)本發(fā)明方法的膜中。在一個實施方案中，本發(fā)明方法包括編碼分別具有下列活性的多肽的基因的表達(dá)i)在宿主膜中的昆蟲電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和 /或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，或ii)在宿主膜中的昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型，或iii)在宿主膜中的選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的0￡12、0_13、0(^-0-21 和0(^-0-31 的昆蟲酚乙醇胺受體，或iv)在宿主膜中的昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是在其天然狀態(tài)下具有低或者無興趣的電活性的細(xì)胞。與此相比，表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞顯示選自2-20pS、3-20pS、4-15pS、5-12pS和 5-10pS間隔的電導(dǎo)。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞選自CHO細(xì)胞、HEK293、COS、HeLa, NIH3T3、BAK21、 Jurkat, CV-1、H印C-2-、爪蟾卵母細(xì)胞；Sf9, S2、Sf21、Hi5、Pcl2、U20S。為了產(chǎn)生包含具有下列活性的本發(fā)明多肽的本發(fā)明宿主細(xì)胞i)離子通道和/或其輔助蛋白，編碼多肽的核苷酸序列，或ii)離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型，編碼多肽的核苷酸序列，或iii)酚乙醇胺受體和優(yōu)選額外的標(biāo)記蛋白質(zhì)，如GFP，和/或額外的“泛宿主性” G-蛋白，編碼多肽的至少一個核苷酸序列，或iv)離子通道，編碼多肽的核苷酸序列被引入其被重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞中。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是微生物，其中編碼具有下列活性的多肽的核苷酸序列被根據(jù)描述于例如 T. Maniatis, E. F. Fritsch和 J. Sambrook, “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY (1989) 的一般克隆技術(shù)引入以增殖所述核苷酸序列i)本發(fā)明的鉀離子通道和/或其輔助蛋白，或ii)本發(fā)明的鉀離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型，或iii)本發(fā)明的酚乙醇胺受體和優(yōu)選額外標(biāo)記蛋白質(zhì)，如GFP，和/或額外的“泛宿主性” G-蛋白，或iv)本發(fā)明的通道。上述核酸分子可以與更多的基因一起被克隆入根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或者載體中，或者不同的基因通過將數(shù)個核酸構(gòu)建體或載體(包括質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞中而引入。
因此，本發(fā)明還涉及包含功能性連接至一個或更多個調(diào)節(jié)元件或信號的用于本發(fā)明方法中的一個或多個核酸分子或其片段的核酸構(gòu)建體，優(yōu)選表達(dá)構(gòu)建體。此外，本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生同源重組事件的包含用于本發(fā)明方法的核酸分子或其部分的核酸構(gòu)建體。核酸構(gòu)建體還可以包含待引入宿主細(xì)胞內(nèi)的更多的基因。如本文所述，調(diào)節(jié)序列或因子可對優(yōu)選引入的構(gòu)建體的表達(dá)具有正作用，因此增加構(gòu)建體的表達(dá)。因此，通過使用強轉(zhuǎn)錄信號例如啟動子和/或增強子可有利地在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生調(diào)節(jié)元件的增強。此外，然而，轉(zhuǎn)錄的增強也可通過例如增加RNA穩(wěn)定性實現(xiàn)。因此，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以用作表達(dá)盒并且因此可以用于直接引入至宿主細(xì)胞中，或者它們可以被引入至載體中。因此，在一個實施方案中，核酸構(gòu)建體是包含微生物啟動子或微生物終止子或者兩者的表達(dá)盒。在另一實施方案中，表達(dá)盒包含真核啟動子或者真核終止子或者兩者。如果預(yù)期以數(shù)個構(gòu)建體或者載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，則上述轉(zhuǎn)化的標(biāo)記必須去除或者在后續(xù)轉(zhuǎn)化中采用另外的標(biāo)記?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員的方法如現(xiàn)有技術(shù)中所述將標(biāo)記從宿主細(xì)胞中去除。在一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明方法的核酸序列可有利的有效連接至一個或更多個調(diào)節(jié)信號以便增加基因表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列旨在使核酸分子，例如用于本發(fā)明方法的基因或基因片段或基因產(chǎn)物或核酸的特異表達(dá)成為可能。取決于宿主生物，例如真核細(xì)胞或微生物，這將意味著例如基因或基因構(gòu)建體僅在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過表達(dá)，或其組成型表達(dá)和/或過表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列為例如誘導(dǎo)子或阻抑物結(jié)合并因此調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的序列。此外，基因構(gòu)建體還可有利的包含一個或更多個與啟動子有效連接的稱作增強子序列的序列，并且它們使核酸序列增強表達(dá)。同樣，可以在DNA序列3’端插入另外有利的序列，例如其他的調(diào)節(jié)元件或終止子。術(shù)語“增加的表達(dá)”或“過表達(dá)”，如本文所使用，意思是指原始野生型表達(dá)水平之外的任何形式的表達(dá)。用于增加基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中廣泛記錄并且包括例如由適當(dāng)啟動子驅(qū)動的過表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子的使用。充當(dāng)啟動子或增強子元件的分離的核酸可以引入至非異源形式多核苷酸的適當(dāng)位置中(通常是上游)，以致于上調(diào)編碼目的多肽的核酸的表達(dá)。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發(fā)明的一個實施方案中使用Kozak序列。編碼根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子和編碼另外的多肽的核酸分子可以存在于一個核酸構(gòu)建體或載體中或者存在于數(shù)個核酸構(gòu)建體或載體中。在一個實施方案中，僅用于本發(fā)明方法的核酸分子或其編碼基因的一個拷貝存在于核酸構(gòu)建體或載體中。數(shù)個載體或核酸構(gòu)建體或載體可以在宿主生物中一起表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或核酸構(gòu)建體可以插入在載體中并以自由形式存在于細(xì)胞中。如果優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，則使用超過數(shù)個世代穩(wěn)定復(fù)制或者它們或它們的部分被插入至基因組中的載體。以哺乳動物細(xì)胞為例，可以發(fā)生向細(xì)胞核基因組中的整合。為了向宿主基因組中插入一個以上的構(gòu)建體，待表達(dá)的構(gòu)建體將一起存在于一個載體中，例如在攜帶多個構(gòu)建體的上述載體中。
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通常，用于構(gòu)建體表達(dá)率的調(diào)節(jié)序列位于與待調(diào)節(jié)核酸分子序列相對而言的上游 (5’)、當(dāng)中和/或下游(3’)。它們特別是控制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯和/或轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。表達(dá)水平依賴于更多細(xì)胞調(diào)節(jié)系統(tǒng)，例如細(xì)胞的蛋白質(zhì)生物合成和降解系統(tǒng)的結(jié)合。調(diào)節(jié)序列包括轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列或信號，例如尤其與轉(zhuǎn)錄或翻譯起始調(diào)節(jié)有關(guān)的位于上游(5’ )的序列，如啟動子或起始密碼子，和尤其與轉(zhuǎn)錄或翻譯終止和轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定性有關(guān)的位于下游(3’ )的序列，如多腺苷化信號或終止密碼子。特別有利的啟動子是組成型啟動子、組織或區(qū)室特異啟動子和可誘導(dǎo)啟動子。通常，“啟動子”在本文上下文中被理解為意思是指核酸分子中的介導(dǎo)核酸分子的編碼序列片段表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。原則上，可以使用天然啟動子和它們的調(diào)節(jié)序列。用于哺乳動物細(xì)胞的一些啟動子是例如CMV、SV40、ΤΚ、β -肌動蛋白。核酸構(gòu)建體有利地如此構(gòu)建，以致于啟動子之后是用于插入待表達(dá)核酸的適宜切割位點，有利地在多接頭中，如果合適，之后是位于多接頭后面的終止子。如果合適，該次序被重復(fù)數(shù)次以致于數(shù)個基因被組合在一個構(gòu)建體中，并且因此可以被引入至轉(zhuǎn)基因植物中以便被表達(dá)。序列被重復(fù)如直至三次。為了表達(dá)，核酸序列通過適宜的切割位點插入在例如啟動子后面的多接頭中。對于每一核酸序列，有利的是具有其自身的啟動子，并且，如果合適，具有其自身的終止子，如上面所提到。然而，還可以在啟動子后面并且如果合適在終止子之前插入數(shù)個核酸序列，特別是當(dāng)在宿主或靶細(xì)胞中多順反子轉(zhuǎn)錄可能時。在該上下文中，插入位點或者插入至核酸構(gòu)建體中的核酸分子序列不是決定性的，也就是說核酸分子可以插入至盒的第一個或最后一個位置而對表達(dá)沒有實質(zhì)性的影響。然而，還可以在構(gòu)建體中僅使用一個啟動子類型。本發(fā)明的一個實施方案還涉及產(chǎn)生載體的方法，包括將本文表征的核酸分子、根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒插入至載體中。載體可以例如引入至細(xì)胞，如微生物或哺乳動物細(xì)胞中，如本文對于核酸構(gòu)建體或下面轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染所述或?qū)嵤├尽?宿主或靶細(xì)胞可以瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，然而，優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。根據(jù)本發(fā)明的載體優(yōu)選是適宜在細(xì)胞中、優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明多肽的載體。因此，方法還包括用于將調(diào)節(jié)信號，特別是介導(dǎo)在生物如微生物或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的信號整合入載體的一個或更多個步驟。因此，本發(fā)明還涉及包含本文所表征核酸分子作為適于根據(jù)本發(fā)明核酸分子的植物表達(dá)的核酸構(gòu)建體部分的載體。用于本發(fā)明方法的有利的載體，如本發(fā)明的載體包含編碼用于本發(fā)明方法的核酸分子的核酸分子，或適用于在細(xì)胞中表達(dá)的包含如上所述適用于本發(fā)明方法的核酸分子的核酸構(gòu)建體，或者單獨或者與更多的基因如標(biāo)記或者選擇基因一起。因此，有利的用于本發(fā)明方法的重組表達(dá)載體包含用于本發(fā)明方法的核酸分子或者根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，其為這樣的形式，即適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)包含SEQ ID NO 2、6、10、14、18、22、26和/或30，至于81^1 ^通道和/或！^ 6『1^1^^化0 亞基為 SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 130、134、138、 142、146、150、154、158、162、166、170 和/ 或 174，并且至于 SK-通道為 SEQ ID NO 228、230、 232中所示多核苷酸的核酸分子或其同源物和/或同時表達(dá)與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子伴隨的或本文所述的另外的基因。因此，重組表達(dá)載體包含與待表達(dá)核酸序列有效連接的、基于待用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的一個或更多個調(diào)節(jié)信號。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體”指能夠運輸與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保湟馑际侵缚梢韵蚱渲羞B接另外的DNA片段的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。更多類型的載體是病毒載體，其可以將額外的DNA片段連接入病毒基因組中。某些載體能夠在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起始點的細(xì)菌載體)。其它優(yōu)選的載體當(dāng)它們被引入至宿主細(xì)胞中時有利地全部或部分整合入宿主細(xì)胞的基因組中，并因此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠控制與它們有效連接的基因的表達(dá)。在本文上下文中，這些載體被稱為“表達(dá)載體”。如上面所提到，它們能夠自主復(fù)制或者可以部分或全部整合入宿主基因組中。適用于DNA重組技術(shù)的表達(dá)載體通常采用質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因為質(zhì)粒是最頻繁使用形式的載體。然而，本發(fā)明還旨在包括發(fā)揮相似功能的其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體。此外，術(shù)語載體還包括技術(shù)人員已知的其他載體，例如噬菌體、病毒例如SV40、CMV、TMV、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒和線性或環(huán)狀DNA。在重組表達(dá)載體中，“有效連接”意思是指目的核酸分子以基因表達(dá)成為可能的方式連接至調(diào)節(jié)信號它們彼此如此連接以致于兩個序列實現(xiàn)對于序列所指定的預(yù)期功能 (例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或在宿主細(xì)胞中，如果載體被引入宿主細(xì)胞中的話)。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動子、增強子和其他表達(dá)控制元件(例如多腺苷化信號)。這些調(diào)節(jié)序列描述于例如 Goeddel :Gene Expression Technology =Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990),或參見Gruber 禾口 Crosby, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida,Ed. :Glick和Thompson，第7章，89-108中，包括它們當(dāng)中所引用的文獻(xiàn)。調(diào)節(jié)序列包括控制核苷酸序列在許多類型宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)的那些，和控制核苷酸序列僅在特定細(xì)胞中和在特定條件下直接表達(dá)的那些。技術(shù)人員知道，表達(dá)載體的設(shè)計將取決于多種因素如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)量減少的程度等等。對調(diào)節(jié)序列的優(yōu)選選擇描述于上面，例如啟動子、終止子、增強子等等。術(shù)語調(diào)節(jié)序列被認(rèn)為包含在術(shù)語調(diào)節(jié)信號之內(nèi)。 數(shù)個有利的調(diào)節(jié)序列，尤其是啟動子和終止子在上面描述。通常，作為適宜表達(dá)的有利核酸構(gòu)建體描述的調(diào)節(jié)序列也適用于載體。備選地，核酸序列可以使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)?？捎糜谠谒囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等 (1983)Mol. Cell Biol. 3 :2156_2165)和 ρVL 系列(Lucklow 和 Summers(1989)Virology 170:31-39)。上面提到的載體僅是可能的適宜載體的小的概述。更多的質(zhì)粒是技術(shù)人員己知的并且描述于例如 Cloning Vectors (Ed. Pouwels, P. H.等，Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018)。用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的更多的適宜表達(dá)系統(tǒng)見 Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, Τ. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 中的第 16 禾Π 17 章。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及包含用于根據(jù)本發(fā)明方法中的核酸分子或用于本發(fā)明方法中的核酸構(gòu)建體，例如本發(fā)明的核酸分子或核酸構(gòu)建體的載體。所述載體可用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以便提供根據(jù)本發(fā)明多肽的表達(dá)。有利地，所述核酸分子與用于在
43原核或真核宿主中或者在原核和真核宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接。此外，適宜同源重組的載體也處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及已經(jīng)用適宜本發(fā)明方法的載體，特別是用根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，由此宿主的膜不內(nèi)源顯示本發(fā)明多肽的活性。本發(fā)明的更多實施方案還涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，例如真核或原核宿主或宿主細(xì)胞，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因哺乳動物細(xì)胞的方法，包括向宿主細(xì)胞中引入根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、 根據(jù)本發(fā)明的載體或根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，由此宿主的膜不內(nèi)源顯示本發(fā)明多肽的活性。載體DNA可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入至原核或真核細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)化” 和“轉(zhuǎn)染”包括接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且如在本文上下文中所使用，旨在包括用于將外來核酸分子 (例如DNA)引入宿主細(xì)胞內(nèi)的多種多樣的現(xiàn)有技術(shù)方法，包括磷酸鈣共沉淀或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、PEG-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、天然感受態(tài)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔或粒子轟擊。用于宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的適宜方法可以在Sambrook等 (Molecular Cloning :A Laboratory Manual.，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)禾口其它實驗室手冊如 Methods in Molecular Biology，1995，Vol. 44, Agrobacterium protocols，Ed. Gartland and Davey, Humana Press，Totowa, New Jersey 中找到。為了選擇核酸分子、載體或核酸構(gòu)建體向宿主生物內(nèi)的成功轉(zhuǎn)移，有利的是使用已經(jīng)在上面詳細(xì)描述的標(biāo)記基因。對于核酸向植物細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定或瞬時整合，已知僅少數(shù)細(xì)胞攝入外來DNA并且如果預(yù)期的話，將其整合入其基因組中，這取決于所使用的表達(dá)載體和所使用的轉(zhuǎn)染技術(shù)。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標(biāo)記的基因(如上所述，例如對抗生素的抗性)與目的基因一起引入到宿主細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是例如編碼參與抗性的基因的標(biāo)記，優(yōu)選抗生素抗性基因或者如糖或氨基酸生物合成途徑中的基因，例如半乳糖苷酶、ura3或ilv2。編碼基因如螢光素酶、gfp或其他熒光基因的標(biāo)記同樣適用。這些標(biāo)記和上述標(biāo)記可以用于突變體中，在所述突變體中這些基因不具有功能，因為它們已經(jīng)通過常規(guī)方法被缺失。此外，編碼可選擇標(biāo)記的核酸分子可以與編碼本方法所用核苷酸分子在同一載體上引入至宿主細(xì)胞中，或者在分開的載體上引入至宿主細(xì)胞中。已經(jīng)以所引入核酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以通過例如選擇來鑒定(例如，已經(jīng)整合入可選擇標(biāo)記的細(xì)胞存活而其它細(xì)胞死亡)?！皥蟾婊颉本幋a容易定量的蛋白質(zhì)，如上述標(biāo)記基因一樣。轉(zhuǎn)化效率或表達(dá)位點或時限可通過這些基因經(jīng)生長測定、熒光測定、化學(xué)發(fā)光測定、生物發(fā)光測定或抗性測定或光度測量(內(nèi)在顏色)或酶活性評價。在該上下文中，極其特別優(yōu)選的是報告蛋白質(zhì)(Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999 ；13(1) :29_44)例如“綠色熒光蛋白”(GFP) (Gerdes HH 和 Kaether C, FEBS Lett. 1996 ；389(1) 44-47 ；Chui WL 等，Curr Biol 1996,6 325-330 ；Leffel SM 等，Biotechniques. 23 (5) :912_8，1997)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、螢光素酶(Giacomin，Plant Sci 1996,116 59-72 ；Scikantha, J Bact 1996,178 121 ；Millar 等，Plant Mol Biol Rep 199210:324-414)和一般的螢光素酶基因、β _ 半乳糖苷酶或β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，EMBO J. 1987，6，3901-3907)或Ura3基因。
“選擇標(biāo)記”賦予對抗生素或其他毒性化合物的抗性在該上下文中可以提到的實例是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對氨基葡糖苷抗生素新霉素(G 418)、卡那霉素、巴龍霉素的抗性(Deshayes A等，EMBO J. 4 (1985) 2731-2737)，編碼突變的二氫蝶酸合酶的sul 基因(Guerineau F 等，Plant Mol Biol. 1990 ；15(1) 127-136)，潮霉素 B 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Gen Bank登錄號K 01193)和she ble抗性基因，其賦予對博來霉素抗生素如zeocin 的抗性。選擇標(biāo)記基因的更多實例是賦予對2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(W0 98/45456)或膦絲菌素等等抗性的基因，或賦予對抗代謝物抗性的那些基因，例如dhfr基因(Reiss， Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149)。其他適宜的基因?qū)嵗?trpB 或 hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85 (1988) 8047-8051)。 另一適宜基因是甘露糖磷酸異構(gòu)酶基因(W0 94/20627)，ODC(鳥氨酸脫羧酶)基因(McConlogue,1987 in :Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed.)或土曲霉脫氨酶(Tamura K 等，Biosci Biotechnol Biochem. 59(1995)2336-2338)。在一個實施方案中，本發(fā)明的載體或核酸構(gòu)建體包括編碼親和標(biāo)記的核酸序列。 “親和標(biāo)記”指肽或多肽，其編碼核酸序列可使用慣?？寺〖夹g(shù)直接或通過連接體方式與編碼本發(fā)明多肽的核酸序列融合。親和標(biāo)記用于通過親和層析從總細(xì)胞提取物中分離、濃縮和/或特異純化重組靶蛋白質(zhì)。上述連接體可有利的包含蛋白酶切割位點(例如凝血酶或因子Xa的切割位點)，由此當(dāng)需要時可從靶蛋白質(zhì)上將親和標(biāo)記切割下來。常用的親和標(biāo)記的實例為來自Quiagen的“His標(biāo)記”、Hilden、“Str印標(biāo)記”、“Myc標(biāo)記”(Invitrogen， Carlsberg)、來自New England Biolabs的由殼多糖-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)含肽組成的標(biāo)記、來自New England Biolabs的麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(pMal)和來自Novagen的稱作CBD的標(biāo)記。 在該上下文中，親和標(biāo)記可以連接至編碼靶蛋白質(zhì)的編碼核酸序列的5’或3’端。本發(fā)明的核酸分子可以用于產(chǎn)生雜交探針，通過雜交探針可以分離根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的功能等同物。這些探針的產(chǎn)生和實驗步驟是已知的。例如，這涉及通過PCR特異性產(chǎn)生放射性或非放射性探針和適宜標(biāo)記的寡核苷酸的使用和之后的雜交實驗。對于此目的所需要的技術(shù)在例如 T. Maniatis, E. F. Fritsch 和 J. Sambrook, Molecular Cloning ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989) 中提到。此外，所討論的探針可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Lit. SDM或隨機誘變)以如此方式修飾， 以致于它們能夠用于更多目的，例如用作與mRNA和相應(yīng)編碼序列特異性雜交的探針以便分析其它生物中的相應(yīng)序列。探針可以用于例如篩選所述昆蟲的基因組文庫或cDNA文庫或者在電子數(shù)據(jù)庫中計算機搜索類似序列。“遺傳控制序列，，術(shù)語“遺傳控制序列，，被認(rèn)為與術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”等同，并且描述對根據(jù)本發(fā)明的核酸在原核或真核生物中的轉(zhuǎn)錄并且如果合適對翻譯具有影響的序列。實例是啟動子、終止子或稱作“增強子”的序列。除了這些控制序列外或者代替這些序列，這些序列的天然調(diào)節(jié)可仍存在于實際結(jié)構(gòu)基因之前，并且如果合適，會以如此方式進(jìn)行遺傳修飾以致于關(guān)閉天然調(diào)節(jié)并且靶標(biāo)基因的表達(dá)已經(jīng)被修飾，也就是說增加了或者減少了?？刂菩蛄械倪x擇取決于宿主生物或起始生物。此外，遺傳控制序列還包括基因的5’ -非翻譯區(qū)、內(nèi)含子或非編碼3’區(qū)。此外，控制序列理解為意思是指允許向宿主生物基因組中進(jìn)行同源重組或插入的那些或者允許從基因組去除的那些。
“敲除轉(zhuǎn)化體”指在其中特定基因已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化手段以定向方式被分別失活，特定基因的活性已經(jīng)被降低、下調(diào)、減少或缺失的個體轉(zhuǎn)基因生物?！疤烊贿z傳環(huán)境”指原來生物中的天然染色體基因座。以基因組文庫為例，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選地至少部分保留。該環(huán)境至少在核酸序列5’或3’側(cè)面，并且具有至少50bp、優(yōu)選至少IOObp、特別優(yōu)選至少500bp、非常特別優(yōu)選至少IOOObp和最優(yōu)選至少 5000bp的序列長度。“反應(yīng)時間”指開展活性測定直至得到關(guān)于活性的重要發(fā)現(xiàn)所需要的時間；它取決于在測定法中所采用蛋白質(zhì)的比活性和所使用方法以及所用設(shè)備的靈敏度。技術(shù)人員熟悉反應(yīng)時間的確定。以基于光度鑒定殺真菌活性化合物的方法為例，反應(yīng)時間通常在> 0和 360分鐘之間。“重組DNA”描述可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的DNA序列的組合。“重組DNA技術(shù)”是用于融合DNA序列的通常已知的技術(shù)(例如描述于Sambrook 等，1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中)。“復(fù)制起點”保證了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒或載體在微生物和酵母中的繁殖，例如大腸桿菌(E. coli)中的 pBR322 ori、ColEl 或 P15A ori (Sambrook 等.=Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)和酵母中的 ARSl ori (Nucleic Acids Research, 2000, 28 (10) 2060-2068)?！鞍袠?biāo)/靶標(biāo)蛋白質(zhì)”具有下列活性的本發(fā)明的多肽、蛋白質(zhì)i)鉀離子通道和/或其輔助蛋白，或ii)鉀離子通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型，或iii)具有酚乙醇胺受體活性的蛋白質(zhì)，或iv)鉀離子通道。所有的靶標(biāo)或作用位點共有特征，即靶標(biāo)蛋白質(zhì)功能的存在是昆蟲存活所必須的?！稗D(zhuǎn)化”描述向原核或真核細(xì)胞內(nèi)引入異源性DNA的過程。所轉(zhuǎn)化細(xì)胞不僅描述了轉(zhuǎn)化過程本身的產(chǎn)物，還描述了通過轉(zhuǎn)過過程所產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因生物的所有轉(zhuǎn)基因后代?！稗D(zhuǎn)基因的”指包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的核酸序列、表達(dá)盒或載體或者以根據(jù)本發(fā)明的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物，術(shù)語轉(zhuǎn)基因描述已經(jīng)通過遺傳工程方法產(chǎn)生的所有那些構(gòu)建體，其中靶標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列，或者有效連接至靶標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列的遺傳控制序列，或者上述可能性的組合不在它們的天然遺傳環(huán)境中或者已經(jīng)通過重組方法修飾。在該上下文中，修飾可以通過例如將所述核酸序列的一個或更多個核苷酸殘基突變實現(xiàn)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽、膜或宿主細(xì)胞用作殺蟲靶標(biāo)的用途。編碼黑腹果蠅昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣) 和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)的基因的缺失，或電壓門控性鉀通道 Shal (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的抑制對黑腹果蠅而言是致死性的。
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因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子;b)SEQ ID NO :1、5、9、13、17、21、25 和 / 或四中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :2、6、10、14、 18、22、26和/或30的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、26和/或30所示核酸分子的多核苷酸
的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 33和/或34中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :7、8 ；9,10 ；IU 12中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，探針包含 (a)或(b)的核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt,或其同源物用作殺蟲靶標(biāo)的用途。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，黑腹果蠅中編碼昆蟲Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型的基因的缺失，或Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選H_kvi3亞基A或C亞型活性的抑制對黑腹果蠅而言是致命性的。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示多肽的多肽的核酸分子；b)包含SEQ ID NO :72、74、76、78、80、82、84和/或86中所示核酸分子的核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :73、75、 77、79、81、83、85和/或87的多肽序列的多肽；d)與包含SEQ ID NO :73、75、77、79、81、83、85和/或87所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或 C亞型活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(c)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有Siaker通道和/或Hyperkinetic β亞基， 優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :102和/或103中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、 120、121、122、123、IM和/或125和/或126、127和/或128的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :88,89 ；90,91 ； 92,93 ；94,95 ；96,97 ；98,99和/或100、101中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，探針包含 (a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η-Ι νβ亞基A或C亞型活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，或其同源物用作殺蟲靶標(biāo)的用途。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，黑腹果蠅或其他昆蟲中編碼選自優(yōu)選來自黑腹果蠅的 Oa2、0amb、0Ct-i3 -2R和Oct-β -3R的昆蟲酚乙醇胺受體的基因的缺失，或選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的抑制對黑腹果蠅或其它昆蟲而言是致命性的。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174
中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 中所
示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自包含根據(jù)SEQ ID NO :130,134, 138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174 的多肽序列的多肽；d)與包含 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170 和 / 或 174所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, 0c和Oct-β -3R的酚乙醇胺受體活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO 177、178和/或179中分別所示共有序列或分別選自 SEQ ID NO :180、181、182、183、184、185、186、187、188、189 和 / 或 190、和 / 或 191、 192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207 和 / 或 208、和 / 或 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225 和 / 或
226的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO 131、132 ； 135、 136 ；139,140 ；143,144 ；147,148 ；151,152 ； 155、156、159、160 ；163,164 ；167,168 ；171,172 和/或175、176中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，或其同源物用作殺蟲靶標(biāo)的用途。以SK-通道為例，黑腹果蠅中編碼昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道基因的缺失，或昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的抑制對黑腹果蠅而言是致命性的。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由選自下列的核酸分子編碼的多肽a)編碼SEQ ID NO :228,230,232中所示多肽的核酸分子；b)SEQ ID NO :227、229、231 中所示核酸分子；c)核酸分子，其因遺傳密碼子的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQ ID NO :228,230,232 的多肽序列；d)與包含SEQ ID NO :2觀、230、232所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，其編碼與(a)至(C)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少 50%同一性并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(C)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對(a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，編碼包含SEQ ID NO :239中所述共有序列或選自SEQ ID NO :240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252 和 253 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQ ID NO :233、234、235、 236 ；和237、238中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；和j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含(a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼具有小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、 30nt、50nt、100nt、200nt 或 500nt,
或其同源物用作殺蟲靶標(biāo)的用途。 本發(fā)明此外涉及包含下列的核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒a)與包含下列的核酸序列有效連接的遺傳控制序列i)具有 SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO 72，74，76，78，80，82，84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為SEQ ID NO 227,229,231中所示核酸序列的核酸序列；或ii)基于遺傳密碼子簡并性，可以通過回譯從SEQ ID NO 2、6、10、14、18、22、26和 / 或 30，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、 85 和 / 或 87，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 130、134、138、142、146、150、154、158、162、 166、170和/或174，并且至于SK-通道為SEQ ID NO 2觀、230、232所示氨基酸序列衍生的核酸序列；或iii)核酸序列 SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25 和 / 或 29，至于 shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基為 SEQ ID NO 72，74，76，78，80，82，84 和 / 或 86，至于 G 蛋白偶聯(lián)受體為 SEQ ID NO 129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173，并且至于 SK-通道為SEQ ID NO 227、229、231的功能等同物；禾口b)額外的功能元件；或c) a)和b)的組合并且涉及包含下列的核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒a)與根據(jù)本發(fā)明的核酸序列有效連接的遺傳控制序列；b)額外的功能元件；或c) a)和b)的組合在“體外”或“體內(nèi)”測定系統(tǒng)中的用途。本發(fā)明此外涉及核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒的上述實施方案用于在體外或體內(nèi)測定系統(tǒng)中表達(dá)本發(fā)明多肽的用途。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽、膜或宿主細(xì)胞用于鑒定具有殺蟲活性的化合物的用途。本發(fā)明此外涉及本發(fā)明的多肽在用于鑒定殺蟲化合物的方法中的用途。根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案包括下列步驟i.將本發(fā)明的多肽在允許一種或更多種測試化合物與本發(fā)明多肽結(jié)合的條件下與一種或更多種測試化合物接觸，ii.檢測測試化合物是否結(jié)合在i)中所述本發(fā)明的多肽；或iii.檢測測試化合物是否減少或抑制或封閉在i)中所述本發(fā)明多肽的活性；或iv.檢測測試化合物是否減少或抑制或封閉具有下列活性的多肽的轉(zhuǎn)錄、翻譯或表達(dá)1.在i)中所述電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，或2.在i)中所述Shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型，或3.在i)中所述選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β _2R和Oct- β _3R的酚乙醇胺受體，或4.在i)中所述昆蟲小電導(dǎo)Ca2+激活鉀通道。按照上述方法步驟ii或iii對本發(fā)明多肽活性的檢測，可以使用多種體外和體內(nèi)測定法評價，例如測量電流、測量膜電位、測量離子流如鉀或銣、測量鉀濃度、測量第二信使和轉(zhuǎn)錄水平、使用鉀依賴性酵母生長測定法和使用如電壓敏感染料、放射性示蹤劑和膜片鉗電生理學(xué)。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，按照上述方法步驟ii或iii對本發(fā)明多肽活性的檢測， 可以使用多種體外和體內(nèi)測定法評價，例如測量電流、測量膜電位、測量離子流如鈣、優(yōu)選測量鈣濃度、測量第二信使和轉(zhuǎn)錄水平、使用鉀依賴性酵母生長測定法和使用如鈣濃度敏感染料或放射性示蹤劑。按照上述方法步驟ii或iii的檢測可使用鑒定蛋白質(zhì)和配體之間相互作用的技術(shù)實現(xiàn)。在該上下文中，測試化合物或者多肽可包含可檢測標(biāo)記例如熒光標(biāo)記、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或膜或電位標(biāo)記。標(biāo)記的實例選自來自Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料、ANEP (氨基萘基乙烯基吡啶錯)染料像di-4-ANEPPS、di-8-ANEPPS、di-2-ANEPEQ+、 di-8-ANEPPQ、di-12-ANEPPQ ；RH 染料(最初由 Rina Hildesheim 合成)，包括來自 Molecular ftx)bes的一系列的二烷基氨基苯基多烯基吡啶鎮(zhèn)染料像RH 414(T_1111)、 RH 795 (R-649)和 RH 237(S_1109)。RH 421(S_1108)或來自 Molecular Probes 的基于羰花青和氧雜菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發(fā)明的一個實施方案中， 檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID Ν0 72，74，76，78，80，82，84 和 / 或 86 的昆蟲 Shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基，優(yōu)選H-kv β亞基A或C亞型穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)受加載至少一種上述染料，優(yōu)選來自 Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料，達(dá)0. 1-3小時、優(yōu)選0. 5-1小時、優(yōu)選0. 45小時，通過以l-120mM、優(yōu)選10_60mM、更優(yōu)選50mM KCl的EC50值濃度增加KCl的細(xì)胞外水平活化^iaker通道和/或Hyperkinetic β亞基，優(yōu)選Η_1 νβ亞基A或C亞型，優(yōu)選以1μΜ-100πιΜ、10-10000μΜ、優(yōu)選100-1000 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合物，測量發(fā)光、熒光，與對照比較染料的發(fā)光/熒光數(shù)據(jù)和確定所測試化合物是否具有抑制通道活性的能力。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，按照上述方法步驟ii或iii的檢測可使用鑒定蛋白質(zhì)和配體之間相互作用的技術(shù)實現(xiàn)。在該上下文中，測試化合物或者多肽可包含可檢測標(biāo)記例如熒光標(biāo)記、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或膜或電位標(biāo)記。標(biāo)記的實例可以選自鈣濃度敏感性染料，例如 Fluo-4Calcium Crimson 、Calcium Green 、Calcium Orange 、Calcium Yellow 、Fura Red >Oregon Green ν Rhod-3>X-rhod-5F>Fura-2>bis-fura-2>f luo-5F> fluo_5N、fura dextran、fura_4F、fura_5F、fura_6F、fura—FF、fura—FF、quin—2、rhod
51dextran、rhod-2、rhod_5N 或 rhod-FF 或來自 Molecular Probes 的基于羰花青禾口氧雜菁的其它染料，如在1999年出版的第七版Molecular Probes' Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 中所述。以SK-通道為例，在本發(fā)明的一個實施方案中檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO :227,229,231的昆蟲小電導(dǎo)Ca2+ 激活鉀通道穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)受加載至少一種上述染料，優(yōu)選來自Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料，達(dá)2_6 小時、優(yōu)選-5小時、優(yōu)選4小時，以100-500nM、更優(yōu)選200nM的EC50值濃度的離子載體，優(yōu)選離子霉素活化小電導(dǎo) Ca2+激活鉀通道，意思是指以1-5 μ M的濃度溫育細(xì)胞，以5-50 μ Μ、5-20 μ Μ、優(yōu)選10 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合物測量發(fā)光、熒光與對照比較染料的發(fā)光/熒光數(shù)據(jù)和確定所測試化合物是否具有抑制通道活性的能力。在本發(fā)明的一個實施方案中檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO 1、5、9、13、17、21、25和/或四的昆蟲電壓門控性鉀通道Sml (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞經(jīng)受，加載至少一種上述染料，優(yōu)選來自Molecular Devices的藍(lán)色膜電位染料，達(dá) 0. 5-3小時、優(yōu)選1. 5小時、優(yōu)選2-2. 5小時，通過以10-120mM、優(yōu)選10_60mM、更優(yōu)選30mM EC50值的KCl濃度增加KCl的細(xì)胞外水平活化電壓門控性鉀通道^ial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)，以1-200 μ Μ、5-100 μ Μ、優(yōu)選25-30 μ M的濃度加入懷疑具有抑制通道活性能力的化合物，測量發(fā)光、熒光與對照比較染料的發(fā)光/熒光數(shù)據(jù)和確定所測試化合物是否具有抑制通道活性的能力。懷疑具有抑制本發(fā)明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。備選地，按照上述方法步驟ii或iii的檢測可使用膜片鉗技術(shù)實現(xiàn)?？墒褂没炯夹g(shù)的一些變型選自內(nèi)部-外、外部-外、細(xì)胞連接的、雙切割膜片、全細(xì)胞膜片和穿孔膜片技術(shù)。隨后的測定取決于標(biāo)記并且是技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO :2、6、10、14、18、22、沈和/或30的昆蟲電壓門控性鉀通道Shal (Shaker同族物1或Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在室溫Q2-25°C )下經(jīng)受全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗技術(shù)，使用當(dāng)充滿吸管溶液時具有2-3M0hm電阻的硼硅玻璃毛細(xì)管并且在槽溶液中測量，優(yōu)選補償槽和吸管溶液之間的液體接頭電位，在全細(xì)胞鉗下測量膜電流，以2kHz取樣并以IkHz過濾，將細(xì)胞保持在_70mV下并以每2秒IOmV的增量應(yīng)用從-100至+130mV的一系列400ms測試電壓脈沖，測量波幅，如測量電流-電壓相互關(guān)系一樣，并且定義為在給定去極化電位下的最大外向電流。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，在本發(fā)明的一個實施方案中， 檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID NO 73、75、77、79、81、83、85 和 / 或 87 的昆蟲 Shaker 通道和 / 或 Hyperkinetic β 亞基，優(yōu)選 H-kv^亞基A或C亞型穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在室溫02-25°C)下經(jīng)受全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗技術(shù)。本發(fā)明的全細(xì)胞電壓鉗方法包括使用EPClO數(shù)字控制的放大器與PATCHMASTER軟件 (HEKA Electronics，Lambrect，Germany)組合進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和進(jìn)一步的分析。EPClO通過前脈沖手段提供電容和泄漏電流的自動扣除。數(shù)據(jù)以66. 7KHz過濾(-3dB，8-pole Bessel 低通濾波器)并以每個點5μ s數(shù)字化。膜片吸管的輸入電阻是2.0-4. 0ΜΩ并且細(xì)胞的電容是15. 3士2. IpFOi = 45)；殘留系列電阻(在直到80%補償之后)是4. 2士0. 4ΜΩ。常規(guī)應(yīng)用對液體接頭電位的修正。膜電位固定在-IOOmV并且電流通過從_60mV至+IOOmV(或 +60mV)的50ms去極化脈沖(0. IHz)引出。懷疑具有抑制本發(fā)明多肽活性的化合物直接加入至槽溶液中。在一個實施方案中，剩余電容和泄漏電流的扣除使用pClamp的在線P/4方案開展。以G蛋白偶聯(lián)受體為例，在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測測試化合物是否減少、 抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括使穩(wěn)定表達(dá)G-α-16泛宿主性G蛋白質(zhì)和穩(wěn)定或瞬時表達(dá)優(yōu)選選自 SEQ ID NO :129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169 和 / 或 173 的選自優(yōu)選來自黑腹果蠅oa2、Oamb, Oct- β -2R和Oct- β -3R的酚乙醇胺受體的CHO細(xì)胞進(jìn)行加載至少一種上述染料，優(yōu)選Fluo-4，達(dá)0. 1-3小時、優(yōu)選0. 5-2小時、優(yōu)選1小時，置于FLIPR中并使用兩次添加方案運行，由此測試化合物，懷疑具有封閉或活化酚乙醇胺受體能力的化合物在第一次添加中加入并溫育3分鐘，然后激活劑酚乙醇胺在第二次添加中以EC80濃度引入并且讀取熒光2分鐘。對于兩次添加均運行對照。在第一次添加中高于基線的熒光增加將表明是可能的激活劑并且在第二次添加中反應(yīng)降低或者沒有增加可表明是可能的抑制劑。隨后的檢測依賴于標(biāo)記并且是技術(shù)人員已知的。以SK-通道為例，在本發(fā)明的一個實施方案中，檢測測試化合物是否減少、抑制或封閉本發(fā)明多肽活性的方法包括以優(yōu)選選自SEQ ID N0:2^、230、232的昆蟲小電導(dǎo)Ca2+ 激活鉀通道穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在室溫Q2-25°C )下經(jīng)受全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗技術(shù)，使用當(dāng)充滿電極溶液時具有2-3M0hm抗性的硼硅玻璃毛細(xì)管并且在槽溶液中測量，優(yōu)選補償槽和電極溶液之間的液體接頭電位，在全細(xì)胞鉗下測量膜電流，以2kHz取樣并以IkHz過濾， 將細(xì)胞保持在_70mV下并以每2秒IOmV的增量應(yīng)用從-100至+130mV的一系列400ms測試電壓脈沖，測量波幅，如測量電流-電壓相互關(guān)系，并且定義為在給定去極化電位下的最大外向電流。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，還可以采用多個測試化合物。如果一組測試化合物影響靶標(biāo)，則可直接分離各個測試化合物或者可以將測試化合物組分成許多亞組，例如當(dāng)其由數(shù)個不同成分組成時，以便減少根據(jù)本發(fā)明的方法中的不同測試化合物的數(shù)量。然后，根據(jù)本發(fā)明的方法以各個測試化合物重復(fù)或者相關(guān)亞組的測試化合物重復(fù)。取決于樣品的復(fù)雜性，上述步驟可以重復(fù)開展，優(yōu)選地直到依照根據(jù)本發(fā)明方法鑒定的亞組僅包含小數(shù)量的測試化合物或者實際上僅一種測試化合物。根據(jù)本發(fā)明的方法可有利的作為HTS步驟開展。HTS使得同時測試大量不同化合物成為可能。高通量篩選的質(zhì)量由兩種因素確定，即測定窗口的相對大小和該測定窗口在從對照實驗到對照實驗間的穩(wěn)定性(即 20個測定篩選板對照中的測定信號穩(wěn)定性)。這表示為篩選的ζ’因子并且等式為V = 1-((30 max+3 O fflin) / (I μ max_ μ minI))。以SK-通道外例，高通量篩選的質(zhì)量由兩種因素確定，即測定窗口的相對大小，在該例中來自完全活化通道的信號減去來自非活化通道的信號(通常表示成任意單位)。第二個因素是該測定窗口在從對照實驗到對照實驗間的穩(wěn)定性(即 20個測定篩選板對照中的測定信號穩(wěn)定性)。這表示為篩選的ζ’因子并且等式為Z，= 1-[3 * (σ max+ σ min) /Abs (Ave (MAX) -Ave (MIN))]。所計算的Ζ’ > 0. 5被認(rèn)為是極佳的測定。以shaker通道和/或Hyperkinetic β亞基為例，備選地為了計算Ζ，因子使用下
列公式
權(quán)利要求
1.鑒定分別降低昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物的方法，所述方法包括a)在膜中裝配最初不存在于所述膜中的、具有昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽，b)在膜的一側(cè)上應(yīng)用懷疑具有抑制最初不存在于所述膜中的所述多肽活性的能力的化合物，c)檢測所述多肽的活性，和d)鑒定在(b)中應(yīng)用的降低所述多肽活性的化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中編碼分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物1或Srnker樣)和/或其輔助蛋白KChIP (鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的基因表達(dá)于宿主細(xì)胞的膜中。
3.權(quán)利要求1或2任意一項的方法，其中所述膜包含由選自下列的核酸分子編碼的至少一種多肽a)編碼SEQID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示多肽的核酸分子;b)SEQID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQID N0:2、6、10、14、18、22、26 和/或30的多肽序列；d)與包含SEQID而1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，其編碼與(a)至(c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(c)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，其編碼包含SEQID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個基序的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQID N0:3、4;7、8;ll、12;15、 16,19,20 ；23,24 ；27,28和/或31、32中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含 (a)或(b)核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、 50nt、100nt、200nt 或 500nt。
4.權(quán)利要求1的方法，其中具有昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的所述多肽的活性通過電生理學(xué)方法測定，優(yōu)選通過膜片鉗或者在HTS測定中測定。
5.權(quán)利要求2的方法，其中編碼分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物 1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)選在選自CHO細(xì)胞和HEK293的哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。
6.權(quán)利要求1的方法，其包括e)向昆蟲、昆蟲群體或在其中將控制所述昆蟲的場所應(yīng)用昆蟲控制量的根據(jù)權(quán)利要求 Id)鑒定的化合物，和f)測定所處理昆蟲或昆蟲群體或所述場所上的昆蟲或昆蟲群體和未處理的昆蟲、昆蟲群體或場所的生長或生存力，和g)選擇在步驟e)的應(yīng)用化合物后降低所處理昆蟲或昆蟲群體或所述場作上的昆蟲或昆蟲群體的生長或生存力的化合物。
7.測定系統(tǒng)，其用于鑒定分別降低昆蟲電壓門控性鉀通道SiaKShaker同族物1或 Shaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的殺蟲活性化合物，所述測定系統(tǒng)包含宿主生物、組織、細(xì)胞或其細(xì)胞消化物或膜，其已經(jīng)包埋、裝配入、插入或整合入選自如權(quán)利要求3a)至3 j)中所述核酸分子的核酸分子，并且基于該核酸分子的表達(dá)， 分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)的生物學(xué)活性的多肽。
8.權(quán)利要求7的測定系統(tǒng)，其中宿主生物是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選選自CHO 細(xì)胞、HEK293, COS、HeLa, NIH3T3、BAK21、Jurkat, CV-U H印C_2_、爪蟾卵母細(xì)胞、Sf9, S2、 Sf21、Hi5、Pcl2和U20S，所述宿主生物表達(dá)選自權(quán)利要求3a)至3j)中所述核酸分子的核酸分子。
9.殺死昆蟲或者抑制昆蟲生長或生存力的方法，其包括向昆蟲應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求1的方法鑒定的化合物。
10.核酸分子，其選自a)編碼在SEQID而2、6、10、14、18、22、26和/或30中所示多肽的核酸分子；b)SEQID NO :1、5、9、13、17、21、25和/或四中所示核酸分子;c)核酸分子，其因遺傳密碼的簡并性可以衍生自根據(jù)SEQID N0:2、6、10、14、18、22、26 和/或30的多肽序列；d)與包含SEQID而1、5、9、13、17、21、25和/或四所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少50%同一性的核酸分子；e)核酸分子，其編碼與(a)至(c)的核酸分子所編碼多肽的氨基酸序列具有至少50% 同一性并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽；f)在嚴(yán)格雜交條件下與(a)至(c)的核酸分子雜交的核酸分子；g)核酸分子，其編碼可以借助于單克隆或者多克隆抗體分離的多肽，所述抗體針對 (a)至(e)之一的核酸分子所編碼并且分別具有電壓門控性鉀通道Sial (Shaker同族物1 或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽產(chǎn)生；h)核酸分子，其編碼包含SEQID NO :33和/或34中分別所示共有序列或分別選自SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54 和 / 或 55、和 / 或 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70 和 / 或 71 的一個或更多個結(jié)構(gòu)域的多肽；i)包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸通過使用SEQID N0:3、4;7、8;ll、12;15、 16 ；19,20 ；23,24 ；27J8和/或31、32中分別所示的引物擴增cDNA文庫或者基因組文庫得到；禾口j)通過在嚴(yán)格雜交條件下用探針篩選適當(dāng)核酸文庫得到的核酸分子，所述探針包含 (a)或(b)的核酸分子的互補序列或具有其片段，具有與(a)至(e)中所表征核酸分子序列互補并編碼分別具有鉀通道Sial (Shaker同族物1或Smker樣)和/或其輔助蛋白 KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽的核酸分子的至少15nt、優(yōu)選20nt、30nt、50nt、 100nt、200nt 或 500nt。
11.核酸構(gòu)建體，其包含根據(jù)權(quán)利要求10的核酸分子。
12.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求10的核酸分子。
13.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求12的載體、根據(jù)權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求10的核酸分子。
14.由根據(jù)權(quán)利要求10的核酸分子編碼的多肽。
15.分別具有昆蟲電壓門控性鉀通道Sial(Shaker同族物1或Siaker樣)和/或其輔助蛋白KChIP(鉀通道相互作用蛋白)活性的多肽用作殺蟲靶標(biāo)的用途，優(yōu)選地多肽由選自如權(quán)利要求3a)至3j)中所述核酸分子的核酸分子編碼。
16.控制殺蟲害蟲的方法，包括應(yīng)用含有至少一種如表I所示化合物或其衍生物作為殺蟲活性成分的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及多肽，優(yōu)選來自黑腹果蠅的多肽(DmShal)作為殺蟲劑的靶標(biāo)。
文檔編號G01N33/68GK102272603SQ200980153714
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者A·霍夫海因, B·韋德爾, D·倫敦, D·豪茨, F·馬隆, F-J·布勞恩, G·魯, J·多施, J·迪克豪特, J·青克, L·斯塔姆, M·格里斯沃爾德, N·B·蘭克爾, P·貝爾納斯科尼, R·D·柯克敦, R·坎德薩米, S·格羅斯, S·齊特科, T·M·格加納斯 申請人:巴斯夫歐洲公司