專利名稱：：一種法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，特別涉及一種通過檢驗(yàn)臟器組織器官中硅藻種類及含量鑒定水中尸體死因的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法。
背景技術(shù)：
：水中尸體的死因分析一直是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的難點(diǎn)之一。20世紀(jì)40年代以來，許多法醫(yī)學(xué)者在溺死者尸體上證實(shí)，硅藻可進(jìn)入大循環(huán)的各臟器。盡管理論上對(duì)硅藻檢驗(yàn)的診斷價(jià)值仍存在分歧，但在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，硅藻檢驗(yàn)仍被認(rèn)為是一種相對(duì)可靠的溺死診斷手段，尤其對(duì)于水中腐敗尸體死亡原因的鑒定，被視為最佳的鑒定方法。在能防止污染的情況下，從肺邊緣組織、肝、腎、骨髓等多個(gè)臟器中檢出與現(xiàn)場水樣相同種類的較多硅藻，一般可作出溺死的鑒定。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的硅藻檢驗(yàn)方法有很多，如強(qiáng)酸消解法、灰化法、Soluene-350消解法、硅膠梯度離心法、酶消解法和PCR法等。與其它檢驗(yàn)方法相比，強(qiáng)酸消解法具有組織消解時(shí)間短、消解完全、程序簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因而在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中應(yīng)用最為普遍。如GA/T813-2008標(biāo)準(zhǔn)(《人體組織器官中硅藻硝酸破機(jī)法檢驗(yàn)》)中，利用濃硝酸和無水乙醇(或乙醚)，在電爐加熱條件使組織器官消解，消解充分后，將消化液倒入離心管經(jīng)反復(fù)離心后制片；最后采用光鏡觀察法，以10倍或40倍物鏡檢查硅藻。傳統(tǒng)的強(qiáng)酸消解法是敞開式的，消解過程中存在強(qiáng)酸噴出灼傷人體的危險(xiǎn)，而且大量的強(qiáng)酸與法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的腐敗檢材在消解過程中釋放出二氧化氮和惡臭氣體，不僅污染環(huán)境而且使法醫(yī)檢驗(yàn)人員的工作環(huán)境異常惡劣；而且傳統(tǒng)強(qiáng)酸消解法一般在采取重復(fù)多次離心后再制片觀察，反復(fù)的離心處理過程將導(dǎo)致硅藻的損失，實(shí)驗(yàn)表明離心一次導(dǎo)致大約10%的硅藻損失，增加離心速度不能顯著提高硅藻的回收率，因此導(dǎo)致臟器組織中硅藻提取回收率低。目前法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室大多只采用光學(xué)顯微鏡對(duì)消解后組織內(nèi)的硅藻進(jìn)行定性定量分析，然而光學(xué)顯微鏡分析工作強(qiáng)度大，而且受放大倍數(shù)的限制，對(duì)于微型硅藻容易出現(xiàn)漏檢或無法準(zhǔn)確鑒定其種屬。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，設(shè)計(jì)一種檢測靈敏度高、能有效避免污染、定性定量分析準(zhǔn)確，改善工作環(huán)境、降低勞動(dòng)強(qiáng)度的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明包括如下技術(shù)特征一種法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其至少包括如下幾個(gè)步驟—種法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于至少包括以下步驟(1)微波消解將待檢驗(yàn)樣品加至微波消解罐內(nèi)，加入濃硝酸和過氧化氫溶液后進(jìn)行微波消解，消解后加入超純水稀釋消解液；將消解液轉(zhuǎn)移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超純水清洗；(2)真空抽濾采用真空抽濾裝置，將稀釋后的消解液進(jìn)行真空抽濾，消解液抽濾完后加超純水繼續(xù)抽濾，使濾膜表面接近中性，最后加無水乙醇抽濾以去除濾膜水分；(3)掃描電鏡自動(dòng)拍照并存儲(chǔ)圖像在真空鍍膜儀或離子濺射儀中將濾膜表面鍍上金屬膜，使其具有導(dǎo)電性，然后在掃描電鏡放大下，將濾膜含樣品區(qū)域化分成若干個(gè)相同大小、緊密相鄰的視場，對(duì)每個(gè)視場進(jìn)行自動(dòng)拍照并存儲(chǔ)其圖像；(4)硅藻定性定量分析對(duì)所拍攝視場圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計(jì)處理。本發(fā)明在微波消解步驟前設(shè)有防止污染影響的空白試驗(yàn)步驟，以確認(rèn)所有試劑、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。本發(fā)明的微波消解步驟具體為所述待檢驗(yàn)樣品為l-10g肺組織、l-10g肝、l-10g腎組織、l-10g骨髓或l-10ml的現(xiàn)場水樣；將待檢驗(yàn)樣品置微波消解儀的消解罐內(nèi)，加入l-10ml濃硝酸和l-5ml的30%過氧化氫，然后將消解罐置于微波消解儀內(nèi)進(jìn)行微波消解；微波消解儀消解條件為5-10min內(nèi)將微波功率由0升至600-1000W，保持該功率10-20min后停止微波輻射，通風(fēng)冷卻，直至消解罐外部溫度降至30-50°C，然后加入30-60mL超純水以稀釋組織消解液的酸度；將稀釋后的消解液轉(zhuǎn)移至試管中；用l-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超純水洗凈。由于法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)中，既要將組織消解徹底，又不能對(duì)硅藻形態(tài)造成大的破壞，因此必須選擇合適的消解體系和微波消解條件，本發(fā)明的消解體系和微波消解條件的選擇和確定針對(duì)法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)的特點(diǎn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)證明，該條件下的微波消解會(huì)導(dǎo)致單個(gè)長鏈狀硅藻(如直鏈藻)被分離為多個(gè)形態(tài)完整的硅藻，但不會(huì)破壞直鏈藻、小環(huán)藻、橋彎藻等單個(gè)硅藻的硅質(zhì)外殼特征，因此不影響硅藻的檢測和種屬的鑒定。鑒于硅藻檢驗(yàn)中除肺組織外，其它臟器中硅藻含量通常較低，為避免污染，本發(fā)明微波消解步驟前除設(shè)有防止污染影響的空白試驗(yàn)步驟外，微波消解后消解罐用l-5NNaOH溶液浸泡，再用超純水洗凈。本發(fā)明的真空抽濾步驟中真空度為100-800mmHg，所采用濾膜直徑10-50cm，孔徑為O.l-1.0iim。所述真空抽濾步驟中采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置進(jìn)行真空抽濾，所述單聯(lián)真空抽濾裝置每次只對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行抽濾；所述多聯(lián)真空抽濾裝置，每次可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行抽濾處理。進(jìn)一步的，所述真空抽濾裝置包括濾杯、濾膜、抽濾接口、濾液收集瓶、抽真空管、真空泵；所述濾杯下設(shè)濾膜，濾膜下設(shè)抽濾接口和濾液收集瓶，真空泵通過抽真空管與抽濾接口連接，真空泵抽真空后濾液通過濾膜進(jìn)入濾液收集瓶；所述多聯(lián)真空抽濾裝置的抽真空管道包括總管和與總管相連的若干個(gè)支管，總管與真空泵連接，各個(gè)支管與每個(gè)抽濾接口連接，實(shí)現(xiàn)同時(shí)真空抽濾功能。傳統(tǒng)的采用硝酸乙醇法消解的組織消解液，通常含有未完全消解的組織殘留物，在進(jìn)行真空抽濾時(shí)容易堵塞濾膜，使抽濾無法進(jìn)行，因此不宜將硝酸乙醇法與真空抽濾相結(jié)合用于臟器組織內(nèi)硅藻的提取。本發(fā)明采用的微波消解法消解組織更加完全，因此適用真空抽濾處理。與傳統(tǒng)的反復(fù)多次離心步驟程序相比，真空抽濾過程大大簡化了處理過程，而且減少硅藻損失，提高了回收率。本發(fā)明中的真空度、濾膜材質(zhì)和孔徑范圍綜合考慮到了抽濾效率和抽濾的效果，避免了真空度過高導(dǎo)致濾膜破和真空度過低導(dǎo)致過濾效率低的情形。本發(fā)明的多聯(lián)式真空抽濾具有有簡單、高效、應(yīng)用靈活、成本低等優(yōu)點(diǎn)。更進(jìn)一步，本發(fā)明在掃描電鏡放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域分成若干個(gè)相同大小、緊密相鄰的視場，通過計(jì)算機(jī)程序驅(qū)動(dòng)掃描電鏡樣品臺(tái)自動(dòng)移動(dòng)，逐個(gè)拍攝所劃分視場的圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行存儲(chǔ)，具體參數(shù)設(shè)置為加速電壓10-20KV，放大倍數(shù)300-10000X，圖像分辨率為1024X800-2048X1600;樣品掃描區(qū)域?yàn)?X5mm2-20X20mm2的矩形區(qū)域。本發(fā)明硅藻定性定量分析步驟采用人工識(shí)別方式或計(jì)算機(jī)自動(dòng)化識(shí)別方式對(duì)所拍攝圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計(jì)處理。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果1、靈敏度高。本發(fā)明的微波消解和真空抽濾步驟，避免了傳統(tǒng)技術(shù)中硝酸乙醇法消解對(duì)部分硅藻的破壞，以及多次離心處理過程所導(dǎo)致硅藻的損失。微波消解對(duì)硅藻破壞程度的評(píng)價(jià)研究結(jié)果表明，所采用的微波消解條件對(duì)硅藻的破壞只限于將長鏈狀硅藻(如直鏈藻)的長鏈打斷，不影響硅藻的檢測，因此，與傳統(tǒng)強(qiáng)酸消解法相比，通過微波消解和真空抽濾從臟器中提取硅藻，回收率更高。2、高效性、安全性和環(huán)保性。微波消解技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的一種先進(jìn)、高效的樣品消解技術(shù)，它利用微波的穿透性和激活反應(yīng)能力加熱密閉容器內(nèi)試劑和樣品使反應(yīng)容器內(nèi)壓力增加，溫度提高，從而大大提高反應(yīng)速率，縮短樣品消解時(shí)間，具有快速、分解完全、酸消耗少、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。研究表明微波消解法所需時(shí)間約為傳統(tǒng)硝酸乙醇法的1/5，而且組織消解更加完全。采用真空抽濾處理，避免了繁瑣的離心處理過程；微波消解過程是在密閉環(huán)境下進(jìn)行的，安全性好，而且酸使用量少、組織消解徹底，因而腐敗臟器和強(qiáng)酸在消解過程中釋放的惡臭氣體和二氧化氮?dú)怏w大大減少，減少了對(duì)環(huán)境的污染，極大程度地改善了工作環(huán)境。3、定性定量分析準(zhǔn)確性、勞動(dòng)強(qiáng)度低。目前，法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍采用光學(xué)顯微鏡對(duì)消解后組織內(nèi)的硅藻進(jìn)行定性定量分析，而進(jìn)入溺死尸體內(nèi)部器官中的硅藻一般個(gè)體小，含量低，光鏡檢驗(yàn)由于放大倍數(shù)限制(最大IOOOX左右)容易出現(xiàn)漏檢，或無法準(zhǔn)確判斷微型硅藻種屬，因此有必要使用更高分辨率的顯微鏡檢測組織臟器中的硅藻。掃描電鏡景深大、分辨率高，是硅藻檢測和種屬分類最有效的技術(shù)手段。本發(fā)明通過微波消解和真空抽濾處理后的樣品適合用掃描電鏡分析，相對(duì)于光學(xué)顯微鏡以人工方式對(duì)每個(gè)視野中的硅藻進(jìn)行檢測，自動(dòng)化掃描電鏡以自動(dòng)方式拍攝并存儲(chǔ)每個(gè)視場圖像，根據(jù)高分辨圖像進(jìn)行硅藻定性定量分析，結(jié)果更加準(zhǔn)確，并顯著減少了分析人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。圖1為本發(fā)明多聯(lián)式真空抽濾裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明采用所建立的檢驗(yàn)硅藻方法，過程分為四步(1)空白試驗(yàn)步驟通過光學(xué)顯微鏡或掃描電子顯微鏡確認(rèn)所有試劑、工具、器皿以及微波消解罐不含硅藻。(2)微波消解分別取l-10g肺組織、l-10g肝、l-10g腎組織、l-10g骨髓或l-10ml的現(xiàn)場水樣置微波消解罐內(nèi)；加入l-10ml濃硝酸和l-5ml的30%過氧化氫，然后在微波消解儀內(nèi)進(jìn)行消解；微波消解條件為5-10min內(nèi)將微波功率由0升至600-1000W，保持該功率10_20min后停止微波輻射，通風(fēng)冷卻，直至消解罐外部溫度降至30-50°C，然后加入30-60mL超純水以稀釋組織消解液的酸度。將稀釋后的消解液轉(zhuǎn)移至塑料試管中。用l-5NNaOH溶液浸泡消解罐，用超純水洗凈。(3)真空抽濾采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置對(duì)微波消解后的組織消解液進(jìn)行真空抽濾，真空度100-800mmHg，有機(jī)濾膜(如尼龍濾膜)直徑10_50cm，孔徑為0.1-1.0ym。將消解液抽濾完全后，繼續(xù)加50-100mL超純水使濾膜表面接近中性，再加5-10mL乙醇去除濾膜內(nèi)水分由于微波消解儀對(duì)每一個(gè)消解罐內(nèi)的樣品處理量有限制，且在實(shí)際溺死案例中肝和腎組織中硅藻含量通常較低或不含硅藻，因此對(duì)于肝或腎檢材，可一次取多份樣品分別消解，消解后將消解液合并，再進(jìn)行上述的真空抽濾處理步驟。[OO36](4)濾膜導(dǎo)電處理在真空鍍膜儀或離子濺射儀中將濾膜表面鍍上金屬(金、鉬)膜，使其具有導(dǎo)電性(5)掃描電鏡自動(dòng)拍照和圖像存儲(chǔ)采用掃描電鏡，在一定放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域分成若干個(gè)相同大小、緊密相鄰的視場，通過計(jì)算機(jī)程序驅(qū)動(dòng)掃描電鏡樣品臺(tái)自動(dòng)移動(dòng)，逐個(gè)拍攝所劃分視場的圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行存儲(chǔ)。具體參數(shù)設(shè)置為加速電壓10-20KV，放大倍數(shù)300-10000X，圖像分辨率為1024X800-2048X1600;樣品掃描區(qū)域?yàn)?X5mm2-20X20mm2的矩形區(qū)域。(6)硅藻定性定量分析采用人工識(shí)別方式或計(jì)算機(jī)自動(dòng)化識(shí)別方式對(duì)所拍攝視場圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計(jì)處理。在人工識(shí)別方式下，如某些視場中的微型硅藻，由于放大倍數(shù)所限，不能滿足種屬鑒定的要求，則回訪相應(yīng)視場，增大放大倍數(shù)觀察硅藻細(xì)微結(jié)構(gòu)并確認(rèn)其種屬。本發(fā)明也可以簡稱為MD-VF-AutoSEM法。其中，MD代表MicrowaveDigestion，即微波消角牟，VF代表VacuumFiltration,艮卩真空抽濾，AutoSEM代表AutomatedScanningElectronMicroscopy,即自動(dòng)化掃描電鏡。與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明具有靈敏度高、高效、安全、環(huán)保、準(zhǔn)確、勞動(dòng)強(qiáng)度低的優(yōu)點(diǎn)。為了進(jìn)一步說明，本發(fā)明還包括如下具體實(shí)施例實(shí)施例一，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例—、實(shí)驗(yàn)取材和設(shè)備取30只新西蘭大白兔由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌雄不限，體重1.03.0kg，隨機(jī)分成2組溺死組(n=15)和死后入水組(n=15)。選擇珠江廣州市海珠大橋處中央位置作為實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)。將溺死組兔置兔籠中，沉入水下O.5m處，lmin后提出水面，30s后重新沉入相同水深處，重復(fù)數(shù)次使大白兔緩慢溺死，死后在水中浸泡30min;死后入水組實(shí)驗(yàn)兔采用空氣栓塞方法處死后，置于相同地點(diǎn)相同深度浸泡30min后取出。提取實(shí)驗(yàn)兔肺、肝、腎、股骨骨髓并提取現(xiàn)場水樣作硅藻檢驗(yàn)。為評(píng)價(jià)本發(fā)明方法在水中腐敗尸體硅藻檢驗(yàn)中的優(yōu)越性，取2例實(shí)際案例中的水中高度腐敗人體尸體的肺臟。實(shí)驗(yàn)的具體設(shè)備包括麗3000微波消解系統(tǒng)AntonParr公司生產(chǎn)；單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置為自行研制，如圖1所示，真空抽濾裝置包括濾杯1、濾膜2、抽濾接口3、濾液收集瓶4、抽真空管5、真空泵6;所述濾杯1下設(shè)濾膜2，濾膜2下設(shè)抽濾接口3和濾液收集瓶4，真空泵6通過抽真空管5與抽濾接口3連接，真空泵6抽真空后濾液通過濾膜2進(jìn)入濾液收集瓶4;所述多聯(lián)真空抽濾裝置的抽真空管道5包括總管51和與總管51相連的若干個(gè)支管52，總管51與真空泵6連接，各個(gè)支管52與每個(gè)抽濾接口3連接，實(shí)現(xiàn)同時(shí)真空抽濾功能。其中濾膜規(guī)格為直徑25mm孔徑0.45ym的尼龍濾膜，抽濾區(qū)域的直徑為9mm;FEIQuanta600型掃描電鏡配EDAXGenesis7000型能譜儀分別由FEI公司和EDAX公司生產(chǎn)，具有自動(dòng)分析功能，自動(dòng)分析過程由能譜分析系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)；射擊殘留物提取器公安部物證鑒定中心，其表層為保護(hù)膜，里層為強(qiáng)粘性的碳導(dǎo)電膠；分析級(jí)濃硝酸廣州化學(xué)試劑廠；分析級(jí)30%過氧化氫廣州化學(xué)試劑廠。分別采用所本發(fā)明的方法和基于傳統(tǒng)的硝酸乙醇消解、離心處理、自動(dòng)化掃描電鏡檢測的方法(傳統(tǒng)處理法)對(duì)溺死組和死后入水組共30例實(shí)驗(yàn)兔臟器組織和現(xiàn)場水樣進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)方法2.1、實(shí)驗(yàn)兔臟器組織和現(xiàn)場水樣中的硅藻檢驗(yàn)1、按照本發(fā)明方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(1)微波消解分別取2g肺、肝、腎組織、l/2股骨骨髓(0.51.Og)禾口2mL現(xiàn)場水樣置消解罐內(nèi)，加入8mL濃硝酸和2mL30X過氧化氫后進(jìn)行微波消解，每批同時(shí)消解8個(gè)樣品，消解條件如下5min內(nèi)將微波功率由0升至800W，保持該功率10min后停止微波輻射，通過強(qiáng)風(fēng)冷卻方式使消解罐外部溫度降至50°C。在消解罐內(nèi)加入40mL不含硅藻的超純水以稀釋組織消解液的酸度，然后進(jìn)行下一步真空抽濾處理。由于密閉微波消解對(duì)每一個(gè)消解罐內(nèi)的樣品量有限制，且在許多實(shí)際溺死案例中肝和腎組織中不含硅藻或含量較低，因此對(duì)于每一例實(shí)驗(yàn)兔肝和腎組織，按每份2g各取5份分別消解，消解后將消解液合并作下一步處理。為防止污染，首先做空白實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)所有試劑、工具、器皿以及消解罐不含硅藻后再進(jìn)行微波消解實(shí)驗(yàn)。消解后按中的方法，立即加2NNaOH至消解罐浸泡24h，然后用超純水清洗。(2)真空抽濾設(shè)置真空度為200mmHg。將消解液倒入濾杯內(nèi)抽濾；抽濾完后加50mL超純水繼續(xù)抽濾使濾膜表面接近中性，最后加10mL乙醇抽濾以去除濾膜內(nèi)水分。抽濾完成后，取出濾膜，剪取濾膜與消解液接觸部分，在離子濺射儀中鍍金膜后用自動(dòng)化掃描電鏡分析。(3)自動(dòng)化掃描電鏡分析掃描電鏡參數(shù)加速電壓20kV，放大倍數(shù)600X，圖像分辨率1024X800。設(shè)定將所剪取濾膜包含在內(nèi)的約10X10mm2的矩形區(qū)域?yàn)閽呙璺秶?，設(shè)定放大倍數(shù)為600X，將掃描范圍分成21X27個(gè)相鄰視場(Field)，每個(gè)視場大小為0.472X0.368咖2，設(shè)定每個(gè)視場圖像采集時(shí)間為10s。分析開始后，系統(tǒng)自動(dòng)掃描并存儲(chǔ)每一個(gè)視場的圖像，分析所需總時(shí)長約1.5小時(shí)。(4)硅藻定性定量分析對(duì)每一個(gè)視場圖像中的硅藻進(jìn)行定性定量分析，如所設(shè)定的放大倍數(shù)不能滿足某些微型硅藻種屬鑒定的要求，回訪相應(yīng)視場，增大放大倍數(shù)觀察硅藻細(xì)微結(jié)構(gòu)以確定硅藻種屬，并可通過儀器自帶的XTDocu分析軟件對(duì)硅藻尺寸進(jìn)行準(zhǔn)2.傳統(tǒng)處理法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)參考GA/T813-2008標(biāo)準(zhǔn)，采用硝酸乙醇法對(duì)2g實(shí)驗(yàn)兔肺(硝酸10mL，乙醇3mL)、10g肝(硝酸25mL，乙醇3mL)、10g腎組織(硝酸25mL，乙醇3mL)、剩余的1/2股骨骨髓(硝酸10mL，乙醇3mL)進(jìn)行消解；現(xiàn)場水樣取2mL，4000轉(zhuǎn)/min離心15min，吸去上層液，往沉淀中加入硝酸5mL，使之充分反應(yīng)。消解液按[8]中的方法，2500rpm下離心25min，倒去上層液，加入超純水，重復(fù)該過程3次，最后在3000rpm下離心，去掉上層液后，取沉淀液置掃描電鏡鋁樣品座上，烘干鍍金膜后用自動(dòng)化掃描電鏡按上述方法設(shè)置參數(shù)后自動(dòng)分析。2.2、微波消解對(duì)硅藻破壞程度的評(píng)價(jià)分別取2份2mL現(xiàn)場水樣，一份按上述微波消解_真空抽濾的方法處理，另一份直接進(jìn)行真空抽濾。兩種處理方法得到的濾膜鍍金膜后用掃描電鏡檢測。通過比較兩者的硅藻檢驗(yàn)結(jié)果，評(píng)價(jià)微波消解對(duì)硅藻的破壞程度。2.3、微波消解法與硝酸乙醇法消解時(shí)間與消解效果實(shí)驗(yàn)按上述的微波消解法和硝酸乙醇法分別消解2g溺死實(shí)驗(yàn)兔肺、肝、腎組織，記錄溶液變?yōu)槌吻逋该鲿r(shí)所需的時(shí)間。組織消解液均采用上述真空抽濾處理，通過掃描電鏡觀察微孔濾膜上組織殘留物評(píng)價(jià)兩種方法的消解效果。2.4、離心處理對(duì)硅藻回收率的影響實(shí)驗(yàn)采用微波消解法消解2g溺死實(shí)驗(yàn)兔肺組織，將組織消解液分為兩等份，分別在3000rpm和10000rpm下離心30min，小心吸取上層液置干凈塑料試管內(nèi)，保留2mL下層液；對(duì)上層液和下層液真空抽濾后，用掃描電鏡進(jìn)行硅藻分析。硅藻回收率計(jì)算公式如下R=D下層液/(D上層液+D下層液)X100%式中R代表硅藻回收率，D上層液、D下層液分別代表上層液和下層液中所含的硅藻數(shù)量。2.5、麗-VF-AutoSEM法在水中腐敗人體尸體硅藻檢驗(yàn)中的優(yōu)越性評(píng)價(jià)按上述的微波消解_真空抽濾處理方法和硝酸乙醇消解_離心處理方法對(duì)2g水中高度腐敗人體尸體的肺組織進(jìn)行處理。從樣品處理步驟繁簡、消解液體惡臭程度、污染氣體排放量等方面評(píng)價(jià)麗-VF-AutoSEM法在水中腐敗人體尸體硅藻檢驗(yàn)中的優(yōu)越性。2.6、自動(dòng)化掃描電鏡與光學(xué)顯微鏡檢測硅藻效果比較分別用掃描電鏡和光學(xué)顯微鏡檢測現(xiàn)場水樣中的硅藻。兩種檢測方法分別如下自動(dòng)化掃描電鏡檢測按上述麗-VF-AutoSEM法檢測2mL現(xiàn)場水樣中的硅藻；光學(xué)顯微鏡檢測將2mL現(xiàn)場水樣按上述微波消解及反復(fù)離心處理后，取沉淀液1滴至2滴，盡量薄且均勻地涂布在載玻片上，烘干，蓋上蓋玻片，用環(huán)氧樹脂封閉，以人工方式鏡檢。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為有顯著性差異。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1實(shí)驗(yàn)兔臟器組織中硅藻檢驗(yàn)1、定量分析結(jié)果采用麗-VF-AutoSEM法和傳統(tǒng)處理法檢測現(xiàn)場水樣和溺死組實(shí)驗(yàn)兔各臟器組織中的硅藻，定量分析結(jié)果如表1所示，對(duì)定量分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如表2所示，采用以上兩種方法，從死后入水組實(shí)驗(yàn)兔肺、肝、腎及骨髓中均未檢測出硅藻。表1溺死組各臟器組織和現(xiàn)場水樣的硅藻定量分析結(jié)果實(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*:D代表硅藻數(shù)量△:A代表麗-VF-AutoSEM法ft:B代表傳統(tǒng)處理法表2溺死組各臟器硅藻檢驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>A:A代表麗-VF-AutoSEM法#:B代表傳統(tǒng)處理法2、定性分析結(jié)果采用麗-VF-AutoSEM法和傳統(tǒng)處理法從現(xiàn)場水樣和臟器組織內(nèi)提取的硅藻種類相同。現(xiàn)場水樣中主要含有直鏈藻、小環(huán)藻、輻環(huán)藻、菱形藻、舟形藻，所含比例較少的硅藻種類有針桿藻、、曲殼藻、布紋藻、冠盤藻、卵形藻、海鏈藻、菱板藻，硅藻大小相差很大，小的如卵形藻縱軸只有7ym，大的直鏈藻可長達(dá)lmm。肺組織中硅藻種類較豐富，含有現(xiàn)場水樣中的大多數(shù)種類硅藻，主要種類有直鏈藻、小環(huán)藻、輻環(huán)藻、舟形藻、菱形藻、曲殼藻，最常見硅藻大小約10-20iim，極少超過80踐。肝、腎、股骨骨髓中硅藻種類很少，通常只有1-3種硅藻，常見的種類有小環(huán)藻、舟形藻、曲殼藻，大小約7-30iim。除硅藻外，現(xiàn)場水樣和少數(shù)溺死實(shí)驗(yàn)兔臟器組織中還檢出魚鱗藻(屬金藻門)的鱗片，其大小為3-4iim，死后入水組實(shí)驗(yàn)兔臟器組織中則未發(fā)現(xiàn)有該藻類的鱗片。4.2微波消解對(duì)硅藻破壞程度的評(píng)價(jià)未消解的水樣中含有大量的長鏈狀直鏈藻，最長的可達(dá)到lmm;微波消解后的水樣中則只含有短的直鏈藻；未消解的水樣中還含有少量的長鏈狀小環(huán)藻，微波消解后如直鏈藻一樣，長鏈被打斷，從而分離成多個(gè)小環(huán)藻。水樣中的其它屬的硅藻如菱形藻、針桿藻、舟形藻在微波消解后形態(tài)均保持完整。由此可見，合適條件下的微波消解只會(huì)導(dǎo)致單個(gè)長鏈狀硅藻被分離為多個(gè)形態(tài)完整的硅藻，因此不影響硅藻的檢測和種屬鑒定。4.3組織消解所需時(shí)間和消解效果比較兩種方法消解2g臟器組織所需時(shí)間如表3所示。采用硝酸乙醇法消解得到的組織消解液中含有大量未消解完全的組織殘留物，同種組織經(jīng)微波消解后，則較少見有未消解完全的組織殘留物。表3兩種方法消解2g臟器組織所需時(shí)間(x士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*P<0.014.4離心過程對(duì)硅藻回收率的影響3000rpm和lOOOOrpm離心處理的硅藻回收率如表4所示。離心后上層液中硅藻的尺寸大多為7-20iim。表4離心處理對(duì)硅藻回收率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>4.5麗-VF-AutoSEM法在水中腐敗尸體硅藻檢驗(yàn)中的優(yōu)越性從樣品處理步驟繁簡、消解液體惡臭程度、污染氣體排放量、處理后樣品有無臭味等方面對(duì)麗-VF-AutoSEM法和傳統(tǒng)處理法進(jìn)行比較的結(jié)果如表5所示。表5兩種方法在水中高度腐敗尸體硅藻檢驗(yàn)中的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.6自動(dòng)化掃描電鏡與光學(xué)顯微鏡檢測硅藻效果比較光學(xué)顯微鏡檢測時(shí)，受分辨本領(lǐng)限制，微型的舟形藻、卵形藻、曲殼藻等硅藻容易被漏檢，即使被檢測到，亦無法根據(jù)硅藻表面紋飾鑒別其種屬；而且因?yàn)楣鈱W(xué)顯微鏡景深小，在進(jìn)行高倍(如1000X)觀察時(shí)，需反復(fù)調(diào)焦。掃描電鏡分辨本領(lǐng)高，可觀察硅藻的細(xì)微結(jié)構(gòu)，有利于對(duì)硅藻進(jìn)行種屬鑒定，而且景深大，在對(duì)每個(gè)視場自動(dòng)掃描時(shí)，不需要反復(fù)聚焦，加快了樣品分析的速度。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡以人工方式對(duì)每個(gè)視野中的硅藻進(jìn)行檢測，自動(dòng)化掃描電鏡以自動(dòng)方式拍攝并存儲(chǔ)每個(gè)視場圖像，根據(jù)圖像再進(jìn)行硅藻定性定量分析，結(jié)果更加準(zhǔn)確，并大大減少了分析人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。五、試驗(yàn)實(shí)施例有益效果5.1靈敏度與抗污染能力在能防止污染的情況下，從肺邊緣組織、肝、腎、骨髓等多個(gè)臟器中檢出與現(xiàn)場水樣相同種類的較多硅藻，一般可作出溺死的鑒定。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用麗-VF-AutoSEM法從溺死實(shí)驗(yàn)兔各臟器組織(肺、肝、腎、股骨骨髓)中檢出硅藻的比例均高于傳統(tǒng)處理法。溺死組(n=15)中，13例實(shí)驗(yàn)兔肺及內(nèi)部器官組織(肝、腎、骨髓)中均檢出硅藻(硅藻檢驗(yàn)陽性)，占86.7%，而采用傳統(tǒng)處理法，該比例為66.7%(共10例)，另一方面，采用麗-VF-AutoSEM法檢測的硅藻含量均顯著高于傳統(tǒng)處理法(表2)，因此，微波消解-自動(dòng)化掃描電鏡法具有更高的硅藻提取回收率。死后入水組實(shí)驗(yàn)兔臟器組織硅藻檢驗(yàn)呈陰性，進(jìn)一步證明硅藻檢驗(yàn)在法醫(yī)學(xué)溺死診斷中的合理性，同時(shí)亦表明，所建立的新方法能有效避免污染。5.2高效性、安全性和環(huán)保性微波消解技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的一種先進(jìn)、高效的樣品消解技術(shù)，它利用微波的穿透性和激活反應(yīng)能力加熱密閉容器內(nèi)試劑和樣品使反應(yīng)容器內(nèi)壓力增加，溫度提高，從而大大提高反應(yīng)速率，縮短樣品消解時(shí)間，具有快速、分解完全、酸消耗少、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)。微波消解過程中，既要將組織消解徹底，又不能對(duì)硅藻形態(tài)造成大的破壞，因此必須選擇合適的消解體系和微波消解條件，硝酸_過氧化氫消解法被認(rèn)為能減輕傳統(tǒng)強(qiáng)酸消解對(duì)硅藻的破壞[10]，因此本研究采用以硝酸_過氧化氫作為消解體系，所使用的微波消解條件為經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的較佳條件。微波消解對(duì)硅藻破壞程度的評(píng)價(jià)研究結(jié)果表明，所采用的微波消解條件對(duì)硅藻的破壞只限于將長鏈狀硅藻的長鏈打斷，不影響硅藻的檢由表3可知，對(duì)于2g臟器組織，微波消解所需時(shí)間約為硝酸乙醇法的1/5，而且組織消解更加完全。與硝酸乙醇法相比，微波消解酸消耗少，且在密閉環(huán)境下進(jìn)行，因而更加安全、環(huán)保。表4表明，離心一次導(dǎo)致大約10%的硅藻損失，增加離心速度并不能顯著提高硅藻回收率。所建立的麗-VF-AutoSEM法，避免了傳統(tǒng)硅藻檢驗(yàn)中的反復(fù)離心過程，采用更直接的真空抽濾方式，將組織消解液中的硅藻富集于微孔濾膜，最大程度地減少硅藻損失。采用硝酸乙醇法的組織消解液，由于含有未完全消解的組織殘留物，在進(jìn)行真空抽濾時(shí)容易堵塞濾膜，并影響硅藻的檢測，因此不宜將硝酸乙醇法與真空抽濾相結(jié)合用于臟器組織內(nèi)硅藻的提取。本研究中，為使麗-VF-AutoSEM法更具高效性，研制了一種多聯(lián)真空抽濾抽濾裝置，該裝置具有簡單、應(yīng)用靈活、成本低等優(yōu)點(diǎn)，具有實(shí)用價(jià)值。在對(duì)水中高度腐敗尸體進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)時(shí)，與傳統(tǒng)處理方法相比，微波消解和真空抽濾相結(jié)合的硅藻提取技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢樣品處理過程簡單、直接，由于組織消解過程在密閉環(huán)境中進(jìn)行、酸使用量少、組織消解徹底，因而腐敗臟器和強(qiáng)酸在消解過程中釋放的惡臭氣體和二氧化氮?dú)怏w大大減少，減少了對(duì)環(huán)境的污染，極大程度地改善了工作環(huán)境。5.3硅藻定性定量分析的準(zhǔn)確性及勞動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)入溺死尸體內(nèi)部器官中的硅藻一般個(gè)體小，含量低。本研究中發(fā)現(xiàn)，溺死實(shí)驗(yàn)兔臟器組織內(nèi)中心綱硅藻最小直徑約7ym，羽紋綱硅藻縱軸最短約8ym。因此，應(yīng)使用較高的放大倍數(shù)檢測臟器組織內(nèi)的硅藻。掃描電鏡景深大、分辨率高，可能是硅藻檢測和種屬分類最有效的技術(shù)手段。本研究中采用掃描電鏡還從溺死實(shí)驗(yàn)兔臟器組織中檢測到來自于現(xiàn)場水樣的大小為3-4ym魚鱗藻鱗片。相對(duì)于光學(xué)顯微鏡以人工方式對(duì)每個(gè)視野中的硅藻進(jìn)行檢測，自動(dòng)化掃描電鏡以自動(dòng)方式拍攝并存儲(chǔ)每個(gè)視場圖像，根據(jù)圖像進(jìn)行硅藻定性定量分析，結(jié)果更加準(zhǔn)確，并顯著減少了分析人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。實(shí)施例二典型的刑事案例一3歲女童謝某失蹤，3個(gè)月后，在一住宅小區(qū)的蓄水池中發(fā)現(xiàn)其尸體。因尸體已經(jīng)高度腐敗，尸表檢查后難以確定死因和案件性質(zhì)。硅藻檢驗(yàn)時(shí)采用硝酸乙醇法消解和光學(xué)顯微鏡觀察，結(jié)果從肺中檢出與蓄水池中相同類型的硅藻，含量為550個(gè)/10g肺組織，肝臟和腎臟組織硅藻檢驗(yàn)呈陰性。采用麗-VF-AutoSEM法檢驗(yàn)，從死者肺、14肝、腎中均檢出與蓄水池水樣中相同類型的硅藻，含量分別為720個(gè)/10g肺組織、3個(gè)/10g肝組織、2個(gè)/10g腎組織，因此診斷死因?yàn)槟缢馈＝Y(jié)合其它調(diào)查結(jié)果，最后證實(shí)死者為意外落水死亡。實(shí)施例三典型的刑事案例二事主黃某被綁架勒索100萬元。10日后在郊區(qū)一湖里發(fā)現(xiàn)其已高度腐敗的尸體。為證實(shí)死者是在生前被拋入水中溺死還是死后被拋尸入水，尸體解剖后取肺、肝和腎組織，采用硝酸乙醇法消解，消解液經(jīng)離心處理后用自動(dòng)化掃描電鏡進(jìn)行硅藻檢測，僅在肺中檢出與現(xiàn)場水樣相同類型的硅藻，含量為2030個(gè)/10g肺組織，而肝、腎組織的硅藻檢驗(yàn)呈陰性，因此無法作出明確的溺死診斷結(jié)論。后采用麗-VF-AutoSEM法檢驗(yàn)，從肺、肝中均檢出與現(xiàn)場水樣相同類型的硅藻，其中肺組織中硅藻含量為2580個(gè)/10g肺組織，肝組織中硅藻含量為5個(gè)/10g肝組織，根據(jù)該該檢驗(yàn)結(jié)論，診斷死因?yàn)槟缢?。案件偵破后證實(shí)犯罪嫌疑人將事主綁架后，因害怕事主反抗和其家屬報(bào)案，于當(dāng)晚將事主裝入鐵籠后拋入湖里致其溺死。權(quán)利要求一種法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于至少包括以下步驟(1)微波消解將待檢驗(yàn)樣品加至微波消解罐內(nèi)，加入濃硝酸和過氧化氫溶液后進(jìn)行微波消解，消解后加入超純水稀釋消解液；將消解液轉(zhuǎn)移后，消解罐用NaOH溶液浸泡，再用超純水清洗；(2)真空抽濾采用真空抽濾裝置，將稀釋后的消解液進(jìn)行真空抽濾，消解液抽濾完后加超純水繼續(xù)抽濾，使濾膜表面接近中性，最后加無水乙醇抽濾以去除濾膜水分；(3)掃描電鏡自動(dòng)拍照并存儲(chǔ)圖像在真空鍍膜儀或離子濺射儀中將濾膜表面鍍上金屬膜，使其具有導(dǎo)電性，然后在掃描電鏡放大下，將濾膜含樣品區(qū)域化分成若干個(gè)相同大小、緊密相鄰的視場，對(duì)每個(gè)視場進(jìn)行自動(dòng)拍照并存儲(chǔ)其圖像；(4)硅藻定性定量分析對(duì)所拍攝視場圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計(jì)處理。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于微波消解步驟前設(shè)有防止污染影響的空白試驗(yàn)步驟，以確認(rèn)所有試劑、工具、器皿以及消解罐不含硅藻。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于所述微波消解步驟具體為所述待檢驗(yàn)樣品為l-10g肺組織、l-10g肝、l-10g腎組織、l-10g骨髓或l-10ml的現(xiàn)場水樣；取待檢驗(yàn)樣品置微波消解儀的消解罐內(nèi)，加入1-lOml濃硝酸和l-5ml的30%過氧化氫，然后將消解罐置于微波消解儀內(nèi)進(jìn)行微波消解；微波消解儀消解條件為5-10min內(nèi)將微波功率由0升至600-1000W，保持該功率10-20min后停止微波輻射，通風(fēng)冷卻，直至消解罐外部溫度降至30-5(TC，然后加入30-60mL超純水以稀釋組織消解液的酸度；將稀釋后的消解液轉(zhuǎn)移至試管中；用l-5NNaOH溶液浸泡消解罐，并用超純水洗凈。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于所述真空抽濾步驟的真空度為100-800mmHg，所采用濾膜直徑10-50cm，孔徑為0.1-1.Oiim。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于所述真空抽濾步驟中采用單聯(lián)或多聯(lián)真空抽濾裝置進(jìn)行真空抽濾，所述單聯(lián)真空抽濾裝置每次只對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行抽濾；所述多聯(lián)真空抽濾裝置，每次可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行抽濾處理。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于所述真空抽濾裝置包括濾杯、濾膜、抽濾接口、濾液收集瓶、抽真空管、真空泵；所述濾杯下設(shè)濾膜，濾膜下設(shè)抽濾接口和濾液收集瓶，真空泵通過抽真空管與抽濾接口連接，真空泵抽真空后濾液通過濾膜進(jìn)入濾液收集瓶；所述多聯(lián)真空抽濾裝置的抽真空管道包括總管和與總管相連的若干個(gè)支管，總管與真空泵連接，各個(gè)支管與每個(gè)抽濾接口連接，實(shí)現(xiàn)同時(shí)真空抽濾功能。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于在掃描電鏡放大倍數(shù)下，將濾膜含樣品區(qū)域分成若干個(gè)相同大小、緊密相鄰的視場，通過計(jì)算機(jī)程序驅(qū)動(dòng)掃描電鏡樣品臺(tái)自動(dòng)移動(dòng)，逐個(gè)拍攝所劃分視場的圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行存儲(chǔ)，具體參數(shù)設(shè)置為加速電壓10-20KV，放大倍數(shù)300-10000X，圖像分辨率為1024X800-2048X1600;樣品掃描區(qū)域?yàn)?X5mm2-20X20mm2的矩形區(qū)域。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法，其特征在于硅藻定性定量分析步驟采用人工識(shí)別方式或計(jì)算機(jī)自動(dòng)化識(shí)別方式對(duì)所拍攝圖片中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計(jì)處理。全文摘要本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，為一種法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)方法。其至少包括以下步驟(1)微波消解在檢驗(yàn)樣品中加入濃硝酸和過氧化氫溶液后進(jìn)行微波消解；(2)真空抽濾將消解液進(jìn)行真空抽濾，消解液抽濾完后加超純水繼續(xù)抽濾，使濾膜表面接近中性，最后加無水乙醇抽濾去除濾膜水分；(3)掃描電鏡自動(dòng)拍照并存儲(chǔ)圖像；(4)硅藻定性定量分析采用人工識(shí)別方式或計(jì)算機(jī)自動(dòng)化識(shí)別方式對(duì)所拍攝視場圖像中的硅藻進(jìn)行檢查、分類和統(tǒng)計(jì)處理。本發(fā)明檢測靈敏度高，能有效避免污染，簡單、高效、環(huán)保、定性定量分析準(zhǔn)確，大大改善了法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗(yàn)技術(shù)人員的工作環(huán)境、降低了勞動(dòng)強(qiáng)度，在法醫(yī)學(xué)溺死診斷實(shí)踐中具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)G01N1/34GK101776623SQ200910214550公開日2010年7月14日申請日期2009年12月31日優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日發(fā)明者劉超,張小婷,戴維列,方超,沈輝,溫錦鋒,王松才,胡孫林申請人:廣州市公安局刑事警察支隊(duì)刑事技術(shù)所