專利名稱：體外檢測(cè)乙肝病毒c抗體的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)乙肝病毒抗體的組合物，尤其涉及一種體外檢測(cè)乙肝病 毒C抗體的組合物。用該組合物檢測(cè)乙肝病毒C抗體能使檢測(cè)更準(zhǔn)確，且結(jié)果更直觀。
背景技術(shù)：
乙型(病毒性)肝炎是由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus,HBV)引起的一種世 界性疾病。發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界無(wú)癥狀乙肝病毒攜帶者超過(guò)2. 8億。我國(guó) 約占9300萬(wàn)，大多數(shù)人無(wú)癥狀，但其中的1/3會(huì)出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)。目前通過(guò)三種途徑對(duì)乙型肝炎進(jìn)行診斷，如檢測(cè)病毒的抗原、檢測(cè)體內(nèi)抗體以及 檢測(cè)病毒的DNA。臨床上，通常使用五種標(biāo)識(shí)物進(jìn)行判斷，如乙肝表面抗原(h印atitis B surface antigen,HBsAg) > Zi 13^ Jfi{φ (antibodies to hepatitis B surface antigen, HBsAb)、乙月干 e 抗原(hepatitisB core antigen, HBeAg)、乙月干 e 抗體(antibodies to the' e' antigen, anti-Hbe/HBeAb)禾口乙月干核心抗體(antibodies to the core antigen, anti-Hbc/HBcAb)，又稱“兩對(duì)半”。乙肝病毒DNA則用來(lái)診斷和觀察慢性乙型肝炎。當(dāng)血液 中病毒DNA數(shù)量穩(wěn)定或增加較少時(shí)，說(shuō)明病情較為穩(wěn)定；當(dāng)病毒DNA數(shù)量不斷增多，則說(shuō)明 病情正在惡化。HBsAg出現(xiàn)于乙肝患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高之前，直至恢復(fù)期時(shí)，HBsAg的滴度 才會(huì)逐步降低乃至消失，但有部分患者HBsAg可持續(xù)存在。在絕大多數(shù)乙肝病毒感染者的 外周血中，含有5ng-600y g/ml的HBsAg。血清中的HBsAg僅僅是個(gè)體受到HBV感染的標(biāo) 志，并不反映病毒復(fù)制與否、病毒復(fù)制程度以及病毒的傳染性強(qiáng)弱等。急性乙肝病人恢復(fù)期 后，隨著HBsiVg逐步降低乃至消失，血清中會(huì)出現(xiàn)對(duì)HBV感染具有保護(hù)性免疫作用的HBsAb。 一般情況下，血清中的HBsAb和HBsAg不會(huì)被同時(shí)檢出。HBV的前核心(pre-core) /核心(core)基因直接編碼兩種多肽，其為組成病毒核 殼體的21kD亞基p21c和經(jīng)分泌過(guò)程產(chǎn)生的17kD亞基肽pl7e (切去定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的四個(gè) 氨基酸的pre-core信號(hào)肽)。p21c即為血清學(xué)上定義的HBcAg，pl7e即為血清學(xué)上定義的 HBeAgo也有文獻(xiàn)報(bào)道在血清分離出帶有-10—1前核區(qū)段的HBeAg(Virology 1988，163， 268-275)和含有全部四個(gè)氨基酸的 HBeAg(J. Immunol.，1991，147，3156-3160)。HBeAg 和 HBcAg約有75%的同源性，其在血清中的出現(xiàn)時(shí)間稍晚于HBsAg。一般情況下，若HBeAg檢 測(cè)為陽(yáng)性時(shí)，HBsAg檢測(cè)亦為陽(yáng)性，HBeAg陽(yáng)性結(jié)果還表明病毒的傳染性強(qiáng)。若這種情況持 續(xù)3個(gè)月以上，則有慢性化傾向。當(dāng)血清中的HBeAg標(biāo)識(shí)物檢測(cè)結(jié)果為陰性后，體內(nèi)會(huì)出現(xiàn) HBeAb。血清檢測(cè)HBeAb陽(yáng)性結(jié)果表明病毒復(fù)制減少，傳染性減弱。因此，對(duì)乙肝病人血清 中HBeiVg和HBeAb標(biāo)識(shí)物的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)乙型肝炎的診斷、預(yù)防和治療具有重要的指導(dǎo)作用。HBcAb是判斷乙肝病情的重要指標(biāo)。隨著急性乙肝的恢復(fù)，HBcAb滴度會(huì)降低乃 至消失。若該標(biāo)識(shí)物在血清中持續(xù)高滴度，則表明乙肝病情有向慢性化發(fā)展的傾向。在慢 性乙肝患者中，HBcAb的檢出率及滴度較高說(shuō)明乙肝病毒復(fù)制活躍，還表明了病毒的傳染性 強(qiáng)。
在乙肝的臨床診斷和治療過(guò)程中，通常采用將HBsAg、HBsAb, HBeAg, HBeAb和 HBcAb等五種標(biāo)識(shí)物中的幾種相結(jié)合的方式來(lái)判斷乙肝病情。若病人血清中HBsAg、HBeAg 和HBcAb三種標(biāo)識(shí)物檢測(cè)均為陽(yáng)性時(shí)，就可以確定該患者正受到乙肝病毒感染，且病毒正 在活躍復(fù)制，病毒數(shù)量較多，傳染性也較強(qiáng)。若病人血清中HBsAg、HBeAb和HBcAb三種標(biāo)識(shí) 物檢測(cè)均陽(yáng)性時(shí)，表明乙肝病情好轉(zhuǎn)，病毒復(fù)制數(shù)量減少。酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前用于HBsAg、 HBsAb, HBeAg, HBeAb和HBcAb五種標(biāo)識(shí)物體外檢測(cè)的常用方法。其中，HBsAg、HBsAb和 HBeAg采用ELISA雙抗體(雙抗原)夾心法，如中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200610030783. 3公開(kāi) 的對(duì)乙肝病毒核心抗原的體外檢測(cè)，HBeAb和HBcAb均采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法，即在抗體結(jié)合抗 原的過(guò)程中，待測(cè)樣品中的抗體與標(biāo)記抗體相競(jìng)爭(zhēng)。使用“夾心法”檢測(cè)時(shí)，溶液顯色則表 明該標(biāo)識(shí)物檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性(+)，溶液無(wú)色表明檢測(cè)結(jié)果呈陰性(_)。這種判斷方式與人們 的習(xí)慣相一致。而在“競(jìng)爭(zhēng)法”中，其是待測(cè)樣品中的抗體與標(biāo)記抗體對(duì)結(jié)合抗原的競(jìng)爭(zhēng)， 當(dāng)標(biāo)記抗體的濃度大于待測(cè)樣品中的抗體時(shí)，溶液色深，表明標(biāo)識(shí)物呈陰性(_)；當(dāng)待測(cè)樣 品中的抗體的濃度大于標(biāo)記抗體時(shí)，溶液無(wú)色或色淺，表明檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(+)。在應(yīng)用于 ELISA檢測(cè)的酶標(biāo)記結(jié)合物由于溫度、濕度或化學(xué)氧化等原因而使蛋白酶發(fā)生變性、失活或 降解時(shí)，就無(wú)法實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)使底物生色，這對(duì)于采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的HBeAb和HBcAb 而言，其將直接導(dǎo)致假陽(yáng)性(+)的檢測(cè)結(jié)果。這妨礙了醫(yī)生對(duì)患者采用正確的方法或藥物 進(jìn)行治療，使醫(yī)療資源無(wú)法高效配置。此外，對(duì)受試者的心理狀態(tài)也會(huì)產(chǎn)生較大影響，還會(huì) 對(duì)其日常生活產(chǎn)生種種影響。另外，ELISA競(jìng)爭(zhēng)法在檢測(cè)HBeAb和HBcAb標(biāo)識(shí)物中檢測(cè)靈 敏度較低，因此，不能準(zhǔn)確檢測(cè)待測(cè)標(biāo)本中HBeAb和HBcAb標(biāo)識(shí)物的含量。一方面，ELISA競(jìng)爭(zhēng)法在檢測(cè)HBeAb和HBcAb標(biāo)識(shí)物中存在諸多問(wèn)題與缺陷。另一 方面，也由于HBeAg和HBcAg這兩種抗原的分子量比較小(小于20kDa)，當(dāng)應(yīng)用于ELISA時(shí) 很難通過(guò)物理吸附的方式有效包被于酶標(biāo)板表面，而對(duì)相應(yīng)抗體的準(zhǔn)確檢測(cè)產(chǎn)生影響。目 前這些問(wèn)題主要可以通過(guò)兩種方法進(jìn)行解決，如雅培(Abbott)公司推出了一款將化學(xué)發(fā) 光技術(shù)應(yīng)用于免疫檢測(cè)的系列產(chǎn)品——ARCHITECT。檢測(cè)過(guò)程中，先將稀釋的樣品和HBc/ HBe抗原包被的順磁顆?；旌?，使樣品中的抗HBc/抗HBe與包被于微球的HBc/HBe抗原結(jié) 合。清洗后，加入對(duì)水解更為穩(wěn)定的吖啶(acridinium) (US5，468，646)標(biāo)記的抗人IgG抗 體結(jié)合物。之后，再次清洗，向反應(yīng)容器中加入預(yù)觸發(fā)O^re-Trigger)和觸發(fā)(Trigger)溶 液。最后檢測(cè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的相對(duì)光單位(relative light imitS，RLUS)。該檢測(cè)的 專一性可以達(dá)到99. 37%-99. 73%。中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200510033411. 1和200610107394. 6 也公開(kāi)了幾種化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒抗體的方法，比較后發(fā)現(xiàn)，其各自的原理是相 一致的。由于這類方法需要重新配置專用儀器，不僅將對(duì)現(xiàn)有儀器造成空置，該儀器也不能 適用于其它檢測(cè)。因此，其可替代性、通用性和普及性等諸多方面都存在一些缺陷。CORNING公司目前提供一種檢測(cè)表面處理技術(shù)(Corning AssaySurface)，對(duì) 普通的聚苯乙烯酶標(biāo)板表面進(jìn)行處理，使其表面產(chǎn)生官能基團(tuán)，如羧基、巰基或氨基等， 然后再與特定的分子通過(guò)共價(jià)鍵、疏水相互作用或氫鍵等方式包被抗原。此外，還有NUNC 公司銷售的丹麥ExiqonA/S公司許可的ImmobilizerTM酶標(biāo)板，其上共價(jià)固定有谷胱甘肽 (glutathione，GST)、鏈霉親和素(Sti^ptavidin)或鰲合鎳(Nickel-Chelate)等。這些技 術(shù)目前僅能滿足于科學(xué)研究的需要，還無(wú)法滿足于醫(yī)療和臨床觀察上大批量體外檢測(cè)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種體外檢測(cè)抗體的組合物，該組合物無(wú)需事先在檢 測(cè)介質(zhì)，如96孔聚苯乙烯檢測(cè)板，表面包被抗原或抗體。避免了生產(chǎn)后對(duì)試劑盒檢測(cè)產(chǎn)生 的影響，更有利于在日常檢測(cè)中大規(guī)模應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，根據(jù) ELISA “夾心法”原理，當(dāng)HBcAb檢測(cè)溶液顯色時(shí)，則表明HBcAb呈陽(yáng)性(+)，反之則為陰性 (-)，使檢測(cè)結(jié)果與人的認(rèn)識(shí)習(xí)慣相一致，更便于操作和判斷。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種體外檢測(cè)抗體，如乙肝病毒C抗體的定量檢 測(cè)方法，通過(guò)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液所得曲線，對(duì)血清中特定抗體，如HBcAb，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。本發(fā)明體外檢測(cè)抗體的組合物，包括具有兩個(gè)以上抗體識(shí)別表位的抗原、抗體結(jié) 合蛋白和標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記抗體?？乖?，或稱目標(biāo)抗原，具有兩個(gè)以上相同或不同的抗體識(shí)別表位(Epitope)。該識(shí) 別表位可以是由不相同抗體識(shí)別表位構(gòu)成的蛋白或多肽；也可以是兩個(gè)以上相同抗體識(shí)別 表位構(gòu)成的蛋白或多肽；還可以在有兩個(gè)以上相同抗體識(shí)別表位的抗原中加入一個(gè)以上另 一種或幾種抗體識(shí)別表位組成。對(duì)于第三種方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇抗原的組合方 式，如但不僅限于，在兩個(gè)以上相同抗體識(shí)別表位組成的抗原的N末端或C末端增加一個(gè) 以上另一種抗體識(shí)別表位；或在所述兩個(gè)以上相同抗體識(shí)別表位之間增加一個(gè)以上另一種 抗體識(shí)別表位；或一種抗體識(shí)別表位與另一種抗體識(shí)別表位互相間隔。這些抗原均能適用于本發(fā)明體外檢測(cè)抗體的組合物，即具有兩個(gè)以上抗原識(shí)別表 位，能同時(shí)識(shí)別或結(jié)合兩個(gè)以上抗體的抗原。與這些抗原相結(jié)合的抗體可以相同也可以不 相同，如但不僅限于，在檢測(cè)過(guò)程中，抗體通常分別為來(lái)自于血清中的待測(cè)抗體和結(jié)合有 標(biāo)記物的標(biāo)記抗體。組成抗原的蛋白或多肽可以是生物體中自身存在的，也可以是通過(guò)人工方式合成 的，還可以是將生物體中的抗原經(jīng)水解得到的多肽?；蚬こ讨亟M表達(dá)是一種可選擇的，通 過(guò)人工合成得到所述目標(biāo)抗原的方式。即將不同或相同抗體識(shí)別表位的DNA序列連接于表 達(dá)載體上(如表達(dá)質(zhì)粒)，再轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化入基因工程菌后，再由發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)等方式進(jìn) 行表達(dá)，最后經(jīng)過(guò)分離和純化步驟得到。組成目標(biāo)抗原的基因數(shù)量不同，所適用的表達(dá)載 體亦有不同。不同的表達(dá)載體也適用于不同的菌種或菌株。常用的基因工程表達(dá)體系如 大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和動(dòng)物細(xì)胞等。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員根據(jù)教科書(shū)、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、設(shè)備手冊(cè)(如GE Healthcare為AKTA系列純化系 統(tǒng)配置的純化指導(dǎo)手冊(cè)或光盤(pán))、試劑手冊(cè)和相應(yīng)的載體設(shè)計(jì)軟件(如=DNAMAN和Vector NTISuite)及其使用說(shuō)明就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)重組抗原的制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，一個(gè) 具備一般生物學(xué)常識(shí)的技術(shù)人員根據(jù)“《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002” 一書(shū)所記載的各種方法，就能夠?qū)崿F(xiàn)基因工程領(lǐng)域的分子生物學(xué)各項(xiàng)操作和相應(yīng)的分離純 化。本發(fā)明所述抗原還可以采用化學(xué)方式(如有機(jī)合成)合成或連接。抗原的化學(xué) 合成可以參照多肽合成的常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)?？乖幕瘜W(xué)連接是將不同或相同抗體識(shí)別表位連接在一起而得到。由于抗體識(shí)別表位的分子量較小，將兩個(gè)相同或不同的抗體識(shí)別表位通 過(guò)化學(xué)方式連接于高分子聚合物所得到的抗原，其能夠避免分子間空間構(gòu)想的干擾，更有 利于特異抗體與抗體識(shí)別表位的結(jié)合。抗體結(jié)合蛋白是能與抗體共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的多種氨基酸，如但不僅限于，色氨 酸、蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨 酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天(門(mén))冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰 胺，的聚合體。這些結(jié)合蛋白能與抗體的某些區(qū)域，如Fc片段和抗體輕鏈，非共價(jià)結(jié)合。這 些非共價(jià)鍵，如氫鍵、離子鍵、疏水相互作用和范德華力。根據(jù)抗體上結(jié)合標(biāo)記物的類型，需要再次加入底物以完成檢測(cè)。檢測(cè)應(yīng)當(dāng)理解為 單獨(dú)或結(jié)合運(yùn)用肉眼觀察和儀器識(shí)別顏色、在特定波長(zhǎng)下的光吸收值或化學(xué)發(fā)光的方法。 如當(dāng)結(jié)合于抗體的標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶時(shí)，需要加入顯色反應(yīng)物后先 使溶液顯色，再通過(guò)肉眼辨別顏色或在特定波長(zhǎng)下通過(guò)儀器檢測(cè)吸收光值的方式確定樣品 中是否存在待測(cè)抗體；當(dāng)結(jié)合于抗體的標(biāo)記物為半乳糖苷酶時(shí)，加入的反應(yīng)底物先發(fā) 出熒光，再通過(guò)儀器測(cè)定的方式確定樣品中是否存在待測(cè)抗體；當(dāng)結(jié)合于抗體的標(biāo)記物為 化學(xué)發(fā)光物時(shí)，直接通過(guò)儀器對(duì)標(biāo)記抗體上結(jié)合的標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定，就能確定樣品中是否 存在待測(cè)抗體。用于體外檢測(cè)抗體的組合物，抗體結(jié)合蛋白包被于檢測(cè)板表面，抗體結(jié)合蛋白能 與待測(cè)抗體結(jié)合，抗原同時(shí)與待測(cè)抗體和結(jié)合有標(biāo)記物的標(biāo)記抗體相結(jié)合。根據(jù)標(biāo)記物的 種類，加入必要的底物后完成對(duì)待測(cè)抗體的體外檢測(cè)?？贵w結(jié)合蛋白能與抗體共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，如但不僅限于，抗人IgG抗體；葡萄 球菌蛋白A (Protein A)，其來(lái)自于葡萄球菌的細(xì)胞壁，分子量42kD，能夠與抗體的Fc非共 價(jià)結(jié)合；大消化鏈球菌蛋白UProtein L)，其能與抗體輕鏈非共價(jià)結(jié)合。此外，還可以使用 鏈球菌蛋白G(Protein G)，如65kD的G148蛋白G和58kD的C40蛋白G，或葡萄球菌蛋白 A和鏈球菌蛋白G的融合蛋白A/G(Protein A/G)。抗體結(jié)合蛋白選自于這些蛋白之一種或 幾種?？贵w結(jié)合蛋白包被于檢測(cè)板表面的量為0. lng/Cm2-9，000ng/Cm2，通常為Ing/ cm2-5, 000ng/cm2，進(jìn)一步選擇 lng/cm2_l，000ng/cm2，優(yōu)先選擇 100ng/cm2_500ng/cm2?？?體結(jié)合蛋白于檢測(cè)板包被量可以使用蛋白的定量檢測(cè)方法進(jìn)行確定，如直接紫外吸收法、 Bradford法、Lorry法和BCA法等確定。本發(fā)明中優(yōu)先使用BCA法確定抗體結(jié)合蛋白在檢 測(cè)板表面的包被量。檢測(cè)板為固相介質(zhì)，選自于塑料或玻璃。塑料應(yīng)當(dāng)理解為全部或部份由碳與氧、氫、氮及其它有機(jī)及無(wú)機(jī)元素化合而成，在 制造的最后階段成為固體，在制造中某些階段是液體(塑料材料在成為最終產(chǎn)品以前，在 某些階段必需要能夠流動(dòng))，因而可以加熱或加壓力，或二者并用的方式，使其形成各種形 狀，此龐大而變化多端的材料族類中的任何一種，如樹(shù)脂、熱固性樹(shù)脂、纖維素衍生物等，在 一條長(zhǎng)鏈的分子結(jié)構(gòu)中存在眾多的重復(fù)原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有機(jī)材 料。制成載體介質(zhì)的所用的塑料或使用一種塑料材料，或使用幾種塑料材料在物理上的疊 加或相加后的復(fù)合，其具體形態(tài)為塑料板。玻璃應(yīng)當(dāng)被理解為易碎的非晶體物質(zhì)，這些物質(zhì)可以是透明的也可以是半透明的，通常由熔融硅和硅碳酸鹽融合組成。玻璃還可以認(rèn)為是一類不具有結(jié)晶過(guò)程，而是由熔 化狀態(tài)固化而來(lái)的材料，大體上由Na20、Ca0和化學(xué)氧化物組成，具有光學(xué)屬性和各種 機(jī)械屬性。具體地說(shuō)，所述的檢測(cè)板由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯或玻璃等制成， 具有多孔構(gòu)造，如96孔或48孔酶標(biāo)板。抗原，應(yīng)當(dāng)具有兩個(gè)以上相同或不同的抗體識(shí)別表位，并可以選擇基因重組方式 實(shí)現(xiàn)。對(duì)于具有相同或不同抗體識(shí)別表位的蛋白或多肽融合后的抗原，其構(gòu)建原則和方法 是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所周知。為了不影響待融合肽段的各自的功能，一般需要在不同肽 段之間添加一個(gè)接頭。文獻(xiàn)ftOtein Eng.，2001，14，5四-532中提供并詳細(xì)描述了多種用 于多肽或蛋白融合的接頭，這些內(nèi)容可以作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選擇適合接頭提供一些 參考。一般而言，用于將兩個(gè)以上相同或不同的抗原識(shí)別表位相連接而形成的重組抗原 所選擇的多肽或蛋白質(zhì)，其序列長(zhǎng)度一般為1-100個(gè)氨基酸，通常選擇長(zhǎng)度為4-30個(gè)氨基 酸的多肽，優(yōu)先選擇長(zhǎng)度為4-15個(gè)氨基酸的多肽。組成這些多肽和蛋白質(zhì)的氨基酸指既具 有共價(jià)連接氨基又共價(jià)連接羧基的不對(duì)稱中心碳原子的有機(jī)分子?；瘜W(xué)方式(如有機(jī)合成)合成或連接是另一種得到本發(fā)明所述抗原的方式。抗 原的化學(xué)合成可以參照多肽合成的常規(guī)方法，如，但不僅限于，F(xiàn)moc多肽合成方法(J. Org. Chem.，1972，37，3404-3409 ；Eur. J. Immunol.，1994，24，3188-3193 ；黃惟德，陳常慶多肽合 成，北京科學(xué)出版社，198 。抗原的化學(xué)連接是將不同或相同抗體識(shí)別表位連接在一起而 得到。這些連接方式，如但不僅限于，將兩個(gè)相同或不同的抗原表位經(jīng)化學(xué)過(guò)程直接連接； 或通過(guò)化學(xué)方式將兩個(gè)相同或不同的抗原表位均與一個(gè)長(zhǎng)度為4-15個(gè)氨基酸的多肽接頭 相連；或通過(guò)化學(xué)方式將兩個(gè)相同或不同的抗原表位均與一個(gè)有機(jī)小分子或有機(jī)大分子相 連。此外，由于抗體識(shí)別表位分子量通常較小，還可以將兩個(gè)相同或不同的抗體識(shí)別 表位通過(guò)化學(xué)方式連接于高分子聚合物的方式得到目標(biāo)抗原。高分子聚合物(polymer)是指分子量大于2，OOODa的化合物，分子間由結(jié)構(gòu)單位 (structural unit)或單體經(jīng)由共價(jià)鍵相互連接在一起。其結(jié)構(gòu)可以為直線型(linear)、 分枝型(branch/multi-arm)或分叉型(dendrimer)。所述聚合物選自于，但不僅限于，聚乙 二醇、聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚賴氨酸、聚亞胺和10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵形成的 多聚糖(polysaccharide)，如但不僅限于，淀粉及其水解產(chǎn)物、纖維素、甲殼素或葡聚糖。分叉型聚合物(dendrimer) —般為聚氨基胺(poly (amidoamine)，PAMAM)，可以分 別由氨或乙二胺為起始物制備(Clin. Chem.，1994，40，1845-1849)，也有使用氨基酸聚合而 成(J. Immuno. Method.，1996，196，17-32)，如賴氨酸和精氨酸。所得聚合物具有活性基 團(tuán)，如氨基、羥基或羧基，聚合次數(shù)越多，其分子量越大，官能團(tuán)也越多，所能結(jié)合的分子也 相應(yīng)增加。聚乙二醇選自于兩端均未封閉或一端封閉的聚乙二醇，封閉基團(tuán)選自于C1-C30 烷基，C1-C30脂肪酸或C3-C30糖基。聚乙二醇選自于分子量2，000-100，OOODa，可以選擇 2，000-50, OOODa, 一般選擇5，000-50, OOODa0進(jìn)一步的，所述封閉基團(tuán)選自于C1-C20烷基， 通常選擇Cl-ClO烷基，優(yōu)先選擇甲基、乙基或丙基。
聚氨基酸包括由相同氨基酸聚合而成的寡聚分子，也包括由不同分子聚合而成的 多聚分子，蛋白質(zhì)或多肽是其天然存在形式。這些蛋白質(zhì)包括從生物體中分離得到的天然 產(chǎn)物及其水解產(chǎn)物，也包括基因工程重組的產(chǎn)物及其水解產(chǎn)物，還包括通過(guò)化學(xué)方式直接 合成的或?qū)⒉煌嚯钠芜B接而成的產(chǎn)物。多肽的長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)15個(gè)氨基酸以上，包括從生物 體中分離得到的天然產(chǎn)物及其水解產(chǎn)物，也包括基因工程重組的產(chǎn)物及其水解產(chǎn)物，還包 括通過(guò)化學(xué)方式直接合成的或?qū)⒉煌嚯钠芜B接而成的產(chǎn)物。各種相同或不同的抗體識(shí)別表位與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合 (covalentconjugate)，形成的共價(jià)鍵如但不僅限于，酰胺鍵(amide bond)、尿鍵(urine bond)、酯鍵或二硫鍵?？贵w識(shí)別表位通過(guò)其氨基酸側(cè)鏈、N末端氨基或C末端羧基與高 分子聚合物相結(jié)合。這種結(jié)合可以通過(guò)如但不僅限于，N-羥基琥珀酰亞胺、馬來(lái)酸酐或 丙/乙醛基等試劑將氨基酸側(cè)鏈、N末端氨基或C末端羧基進(jìn)行活化后與高分子聚合物相 結(jié)合，也可以適用前述相同或不同的方式，先活化高分子聚合物的基團(tuán)后，再與目標(biāo)抗原 (如乙肝病毒C抗原)相結(jié)合。其它還有通過(guò)腙(hydrazone)、肟(oxime)、巰基或噻唑烷 (thiazolidine)等方式結(jié)合(J. Immuno. Method, 1996，196，17-32)。各種相同或不同的抗體識(shí)別表位與糖類分子之間的結(jié)合方式參見(jiàn)J. Wiarma. Sci. 87,326-332 ；Adv.Drug deliv. Rev. ，6，103-131 ；Adv. Drugdeliv. Rev. ，13，251—267。 聚乙二醇與各種抗原表位的結(jié)合方式參見(jiàn)Adv. Drug deliv. Rev. ,28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev.，54，453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev.，60，1-88。由于抗原表位與高分子聚合物 結(jié)合所涉及的化學(xué)反應(yīng)相同或相似，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在參考這些結(jié)合方式的情況下， 可以將其同樣應(yīng)用于各種抗體識(shí)別表位與其它聚合物結(jié)合的反應(yīng)當(dāng)中以得到目標(biāo)抗原。各種相同或不同的抗體識(shí)別表位還可以通過(guò)連接子(space linker)以化學(xué)連接 的方式與高分子聚合物間接連接。這種連接子選自于氨基酸長(zhǎng)度1-500的多肽或蛋白質(zhì)、 分子量在100-2，OOODa的聚合物或有機(jī)小分子。如但不僅限于，分子量為200-2，OOODa 的兩端活化的聚乙二醇(NOFCorporation)、NH2 (CH2)nC00H、SH(CH2)nCOOH或兩端活化的 C1-C30的脂肪酸(J. Gene. Med.，2005，7，604-612)?；瘜W(xué)連接可以是抗體識(shí)別表位N末端 或C末端與上述連接子上的活化基團(tuán)連接，也可以由抗體識(shí)別表位某一個(gè)氨基酸側(cè)鏈與連 接子上的活化基團(tuán)連接。連接子與抗體識(shí)別表位之間形成共價(jià)鍵，如但不僅限于，酰胺鍵、 尿鍵、酯鍵、、硫醚鍵、腙鍵(-CH = N-NH-)、肟鍵(-CH = N-0-)和二硫鍵。所形成的共價(jià)鍵 選自于這些化學(xué)鍵之一種或幾種。本發(fā)明使用標(biāo)記物的目的在于，當(dāng)結(jié)合有標(biāo)記物的抗體與已結(jié)合血清中抗體的 抗原相結(jié)合后，通過(guò)儀器可以將該標(biāo)記直接檢測(cè)，或通過(guò)顯色反應(yīng)檢測(cè)溶液吸光度，從而 對(duì)血清是否存在待測(cè)抗體進(jìn)行判斷。這些標(biāo)記物選自于，但不僅限于，熒光標(biāo)記物(如 異硫氰基熒光素)、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記物(如堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶)和化學(xué) 發(fā)光標(biāo)記物(美國(guó)專利5，468，646)等。以酶標(biāo)記為為例，當(dāng)使用辣根過(guò)氧化物酶(horse radishperoxidase, HRP，EC. 1. 11. 1.7)標(biāo)記抗體時(shí)，所用的顯色反應(yīng)物可以為3,3'，5， 5'-四甲基聯(lián)苯胺(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine, TMB) 在檢測(cè)過(guò)程中，標(biāo)記物含量的差異，就使得檢測(cè)值產(chǎn)生高低差異，再配合一條標(biāo)準(zhǔn) 曲線，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知濃度的血清樣品中待測(cè)抗體進(jìn)行定量檢測(cè)。為了提高檢測(cè)效果，可以在加入抗原和結(jié)合有標(biāo)記物的抗體同時(shí)加入血清或純化的IgG蛋白。在總體積為100 μ L的反應(yīng)體系中，血清的加入量> 1 μ L ；或純化的IgG蛋白 加入量> 50 μ go對(duì)于人特異抗體(如=Anti-HBc)的體外檢測(cè)中，優(yōu)選的，使用健康人血清(含有 人IgG)或純化得到的人IgG蛋白來(lái)封閉抗體結(jié)合蛋白游離位點(diǎn)，以防止假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以直接購(gòu)買(mǎi)或委托定制已純化的人IgG蛋白試劑，也可以通 過(guò)教科書(shū)或?qū)嶒?yàn)手冊(cè)中的方式從健康人血清中純化人IgG蛋白，如采用商品化的親和層 析試劑、商品化的IgG結(jié)合蛋白試劑(Pierce ，Thermo Scientific)對(duì)人IgG進(jìn)行純
化；還可以使用硫酸銨鹽析和DEAE-纖維素層析法對(duì)人IgG純化，或由DEAE-纖維素或 DEAE-S印hadeXA50樹(shù)脂對(duì)人IgG直接提取。此外，還可以通過(guò)基因工程方式，通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞 及表達(dá)載體得到含有重組的人IgG蛋白(如單克隆IgG蛋白)的發(fā)酵液，再通過(guò)后續(xù)純化 得到人IgG蛋白。純化后產(chǎn)物純度的檢測(cè)方法，如但不僅限于，瓊脂雙相雙擴(kuò)散法、免疫電 泳法或圓盤(pán)電泳法。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為一條區(qū)帶時(shí)，認(rèn)為已獲得人IgG蛋白純品。一種本發(fā)明體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，主要包括抗體結(jié)合蛋白包被的檢 測(cè)板、具有兩個(gè)以上抗體識(shí)別表位的乙肝病毒C抗原、健康人血清或純化的人IgG蛋白、結(jié) 合有標(biāo)記物的乙肝病毒C抗體和顯色底物。另一種本發(fā)明體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，主要包括抗體結(jié)合蛋白包被的 檢測(cè)板、具有兩個(gè)以上抗體識(shí)別表位的乙肝病毒C抗原、健康人血清或純化的人IgG蛋白、 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的乙肝病毒C抗原的抗體和TMB底物?？贵w結(jié)合蛋白選自于抗人IgG抗體、Protein A、Protein L、Protein G和 Protein A/G之一種或幾種，優(yōu)先選擇ftOtein Α?？贵w結(jié)合蛋白包被于檢測(cè)板的量為Ing/ cm2-5, 000ng/cm2,通常為 lng/cm2_l，000ng/cm2,進(jìn)一步選擇 lng/cm2_500ng/cm2，優(yōu)先選擇 100ng/cm2-200ng/cm2。在總體積100 μ L的待測(cè)抗體-抗原-標(biāo)記抗體的體系中(即反應(yīng)體系)，健康人 血清加入量彡1 μ L，優(yōu)先選擇5 μ L0在總體積100 μ L的待測(cè)抗體-抗原-標(biāo)記抗體的體系中(即反應(yīng)體系)，純化的 人IgG蛋白加入量> 50 μ g，優(yōu)先選擇100 μ g。檢測(cè)中，需要先將抗體結(jié)合蛋白，如葡萄球菌蛋白A，包被于酶標(biāo)板表面，加入稀 釋或未稀釋的待測(cè)血清樣品，使酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合蛋白與樣品中抗體相結(jié)合；清洗后，加 入HBcAg、HRP標(biāo)記的抗HBcAg抗體(優(yōu)先選擇單克隆抗體)和健康人血清或純化的人IgG 蛋白，使樣品中的乙肝病毒C抗體和HRP標(biāo)記的抗HBcAg抗體都與HBcAg相結(jié)合。再次清洗 后，加入顯色底物TMB和反應(yīng)終止液，最后在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。隨著樣品中所含HBcAb的 量不同，其顯色后溶液吸光度也有變化，這樣通過(guò)若干個(gè)檢測(cè)點(diǎn)就可以得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線， 用以血清中未知含量HBcAb的定量。另一種本發(fā)明所述的乙肝病毒C抗體的體外檢測(cè)方法，包括如下步驟1.將葡萄球菌蛋白A包被于多孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；2.除去包被液，加入200 μ 1/孔封閉液(如:ρΗ7. 4，1 % (w/v) BSA的PBS溶液)， 4°C過(guò)夜或37°C孵育1-2小時(shí)；3.除去封閉液，清洗酶標(biāo)板，將已知不同濃度的HBcAb標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋或不稀釋的 待測(cè)血清樣品分別加入酶標(biāo)板各個(gè)孔中，100 μ 1/孔，37°C孵育1小時(shí)；
4.清洗酶標(biāo)板，加入HBcAg、HRP標(biāo)記的抗HBcAg單克隆抗體和健康人血清或純 化的人IgG蛋白，混勻，37°C孵育30分鐘，再次清洗酶標(biāo)板，加入顯色底物TMB，37°C孵育 15-30分鐘，加入終止液；5.在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔中溶液的吸光度值。通過(guò)建立不同濃度HBcAb與吸光度的坐標(biāo)關(guān)系，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及其公式，然 后將未知濃度的血清樣品吸光度值代入公式中就可得到相應(yīng)的HBcAb含量。最后結(jié)合樣品 稀釋度得出實(shí)際的定量結(jié)果。本發(fā)明所述的乙肝病毒C抗原，包括SEQ ID No :1所示的序列，也包括從其抗原序 列上獲取的具有70%以上同源性的2種以上抗體結(jié)合表位的多肽進(jìn)行重組后得到的重組C 抗原。本發(fā)明所述的乙肝病毒C抗原還可以使用蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件，如=BIOSUN(北京 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所計(jì)算生物學(xué)中心)，選取抗原中具有一個(gè)或多個(gè)表位、尤其是優(yōu)勢(shì)表位(能 夠激發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)的表位)的相應(yīng)肽段，通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)方法釣取其編碼序 列并表達(dá)出該抗原多肽；或依據(jù)功能區(qū)段對(duì)C抗原表位進(jìn)行篩選(J. Immunol.，1988，141， 4376-4380 ；Immuno. Lett.，1991，30，59-68 J. Gen. Virol.，1993，74，1335-1340)。從特定 抗原表位中選擇適宜的抗體，可以采用免疫抗體庫(kù)的噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選(J. Immunol Method,2008，329，176-183)。本發(fā)明所述的乙肝病毒C抗原可以為如SEQ ID No 1所示序列。也可以從SEQ ID No 1上選擇兩個(gè)以上的抗體識(shí)別表位，使用基因工程方法在體外進(jìn)行重組，如以大 腸桿菌(Virus Res, 1989，14,27-48)、酵母(J Biotechnol.，1993，四，243-255 ；美國(guó)專利 6，277，631)、赤畢酵母(J Biotechnol.，2008，138，1-8)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Antiviral Res, 2006，72，116-124)或昆蟲(chóng)細(xì)胞(Biotechnology, 1995,13, 261-264)為重組表達(dá)系統(tǒng)，使經(jīng) 重組后表達(dá)的重組乙肝病毒C抗原(rifficAg)具有2個(gè)以上的抗體結(jié)合(識(shí)別)表位。本發(fā)明所述的乙肝病毒C抗原如SEQ ID No 1所示序列，或從SEQID No 1上選 擇兩個(gè)以上的抗體結(jié)合表位，通過(guò)化學(xué)方式連接后得到的抗原，或從SEQ ID No :1上選擇兩 個(gè)以上的抗體結(jié)合表位，通過(guò)化學(xué)方式與高分子聚合物連接后得到的抗原。本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明體外檢測(cè)抗體的組合物使用特定包被量的抗體結(jié)合蛋白的酶標(biāo)板，使得抗 體的Fc片段與抗體結(jié)合蛋白相結(jié)合，有效提高檢測(cè)效果。當(dāng)該組合物用于乙肝病毒C抗體體外檢測(cè)時(shí)，在加入抗原和結(jié)合有標(biāo)記物的抗體 同時(shí)使用健康人血清或從血清中純化得到的人IgG蛋白，增強(qiáng)了檢測(cè)效果。本發(fā)明所涉及的術(shù)語(yǔ)與其一般概念相同。所述的“抗體識(shí)別表位通過(guò)化學(xué)方式連接于高分子聚合物”指抗原直接或通過(guò)連 接子間接與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合。所述的“乙肝病毒C抗原與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合”指乙肝病毒C抗原直接或通 過(guò)連接子間接與高分子聚合物共價(jià)結(jié)合。所述的“C1-C10烷基”、“C1-C20烷基”和“C1-C30烷基”指直鏈或支鏈烷基，如甲
基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基等。其中，字母C表示碳原子，其后數(shù)字為正整數(shù)，如 1、2、3、4或5等，表示基團(tuán)所含的碳原子個(gè)數(shù)。
所述的“C1-C30的脂肪酸”指飽和或不飽和的直鏈或支鏈碳鏈，其上至少有一個(gè)羧 基，如甲酸、乙酸、丙酸、油酸、亞油酸、軟脂酸，十八碳四烯酸、琥珀酸和蘋(píng)果酸等。其中，字 母C表示碳原子，其后數(shù)字為正整數(shù)，如1、2、3、4或5等，表示基團(tuán)所含的碳原子個(gè)數(shù)。所述的“C3-C30的糖基”，如丙糖基、丁糖基、戊糖基和己糖基等。其中，字母C表 示碳原子，其后數(shù)字為正整數(shù)，如3、4或5等，表示基團(tuán)所含的碳原子個(gè)數(shù)。所述的“血清”指血清來(lái)源于經(jīng)診斷為健康的個(gè)體的血液，且不含有待測(cè)抗體以及 對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生交叉反應(yīng)(假陽(yáng)性)的抗體。健康的個(gè)體為臨床診斷為健康的人、獸醫(yī)診斷為健康的野生動(dòng)物和家畜 (Livestock) 0野生動(dòng)物為自然狀態(tài)下未經(jīng)人工馴化的動(dòng)物。家畜是為了提供食物來(lái)源而 人工飼養(yǎng)的動(dòng)物，如狗、鼠、倉(cāng)鼠、豬、兔、奶牛、水牛、公牛、綿羊、山羊、鵝和雞等。所述的“健康人血清”指血清來(lái)源于臨床診斷為健康人體的血液，且不含有待測(cè)抗 體以及對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生交叉反應(yīng)(假陽(yáng)性)的抗體。以體外檢測(cè)患者的乙肝抗體為例，健康人 血清應(yīng)當(dāng)理解為乙肝表面抗原(HBsAg)、抗HCV抗體和抗HIV抗體檢測(cè)均為陰性的血清。在 檢測(cè)乙肝病毒C抗體，同時(shí)應(yīng)不含有待測(cè)抗體的血清。如當(dāng)組合物是檢測(cè)乙肝病毒C抗體 時(shí)，健康人血清為來(lái)自于非肝炎和艾滋病患者的血液。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而 非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍， 其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自于西格瑪-奧德里奇 (Sigma-Aldrich)。實(shí)施例IProtein A包被于酶標(biāo)板選擇未經(jīng)處理的聚苯乙烯酶標(biāo)板，加入1.2 μ g/ml Protein A溶于碳酸鹽緩沖 液，ρΗ9. 2-9.8，100μ 1/孔，4°C過(guò)夜。去除包被液，每孔加入1 % (w/v)BSA溶液(PBS， PH7. 4) 200 μ 1進(jìn)行封閉，4°C過(guò)夜(12-18小時(shí))或37°C 1-2小時(shí)，所得酶標(biāo)板表面包被有 100-200ng/cm2Protein A。實(shí)施例2血清樣品檢測(cè)方法用PBST (含有0. 05% Tween-20的PBS緩沖液)清洗酶標(biāo)板1_2次，每次拍干。每孔加入90 μ 1 PBS后，每孔加入待測(cè)血清10 μ 1，混勻后于37°C孵育60分鐘。去除反應(yīng)液并拍干后，用PBST洗板4次，每次均拍干。每孔加入40 μ 1重組HBcAg(SEQ ID NO :1，由上海榮盛生物藥業(yè)有限公司提供) (用PBS稀釋1 2000)、40 μ 1經(jīng)HRP標(biāo)記的抗HBcAg抗體(用PBS稀釋1 20000)以及 20 μ 1含有健康人血清(25 %，ν/ν)。每孔分別加入底物A和B液各50 μ 1，混勻，37°C孵育15分鐘，然后加入終止液， 450nm酶標(biāo)儀測(cè)定。底物A液配制稱取檸檬酸17. 9g和Na2HPO4 · 1220 4. 67g溶解于400ml去離子水中，然后緩慢加入30% (w/w)H2A330yL，攪拌均勻后，加水至500ml。分裝成IOml/瓶，2 8°C下保存。底物B液配制稱取TMB 0. Ig于IOOml去離子水中，加入DMSO 2. 5ml，在攪拌的同時(shí)，緩慢加入 0. 5ml 6M HCl，直至完全溶解，最后加水至500ml。分裝成IOml棕色小瓶，2 8°C下保存。底物反應(yīng)終止液的配制分別量取98% H2S0455ml和去離子水445ml，然后將濃硫酸緩慢加入到去離子水 中，混勻，分裝成IOml/瓶，2 8°C下保存。在酶標(biāo)板中加入5種不同濃度的已知HBcAb標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋的待測(cè)血清樣品分別加 入酶標(biāo)板各個(gè)孔中，使用相同的檢測(cè)方法就能實(shí)現(xiàn)HBcAb的定量檢測(cè)。實(shí)施例3HBcAb檢測(cè)平行對(duì)照以目前使用的HBcAb競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)進(jìn)行 對(duì)照。共有350例標(biāo)本用于此實(shí)驗(yàn)，其中，大三陽(yáng)(HBsAg、HBeAg和 HBcAb 陽(yáng)性):110 例;小三陽(yáng)(HBsAg、HBeAb和 HBcAb 陽(yáng)性):100 例；健康人血清(來(lái)自血庫(kù))140例。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。表IHBcAb檢測(cè)平行對(duì)照
權(quán)利要求
1.一種體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，包括具有兩個(gè)以上抗體識(shí)別表位的抗原、 包被有抗體結(jié)合蛋白的檢測(cè)板、標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記抗體和血清或純化的IgG蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的檢測(cè) 板表面包被的抗體結(jié)合蛋白量為0. lng/cm2-9, OOOng/cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述血清使 用量彡1 μ 1/100 μ 1反應(yīng)體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述純化的 IgG蛋白使用量彡50μδ/100μ 1反應(yīng)體系。
5.一種體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，主要包括抗體結(jié)合蛋白包被的檢測(cè)板、具 有兩個(gè)以上抗體識(shí)別表位的乙肝病毒C抗原、健康人血清或純化的人IgG蛋白、結(jié)合有標(biāo)記 物的乙肝病毒C抗體和顯色底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述檢測(cè)板 的表面包被的抗體結(jié)合蛋白量為lng/cm2-5，OOOng/cm2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述檢測(cè)板 的表面包被的抗體結(jié)合蛋白量為lng/Cm2-500ng/Cm2。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述血清使 用量彡1 μ 1/100 μ 1反應(yīng)體系。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述純化的 IgG蛋白使用量彡50μδ/100μ 1反應(yīng)體系。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的抗體 結(jié)合蛋白選自于Protein A、Protein G、Protein A/G、Protein L和抗人IgG抗體之一種 或幾種。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的抗原 為乙肝病毒C抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為重組乙肝病毒C抗原。
13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原氨基酸序列選自于SEQ ID No:l。
14.根據(jù)權(quán)利要求5-13之一所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所 述的乙肝病毒C抗原由赤畢酵母重組表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為將兩個(gè)相同或不同的抗體識(shí)別表位通過(guò)化學(xué)方式連接于高分子聚合物所得 到的抗原。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述抗體 識(shí)別表位與所述高分子聚合物之間的共價(jià)鍵選自于酰胺鍵、尿鍵、酯鍵、、硫醚鍵、腙鍵、肟 鍵和二硫鍵之一種或幾種。
17.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為從SEQ ID No :1上選擇兩個(gè)以上的抗體結(jié)合表位，通過(guò)化學(xué)方式連接后得到 的抗原。
18.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的乙肝 病毒C抗原為從SEQ ID No :1上選擇兩個(gè)以上的抗體結(jié)合表位，通過(guò)化學(xué)方式與高分子聚 合物連接后得到的抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求5所述的體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，其特征在于所述的標(biāo)記 物選自于熒光標(biāo)記物、同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記物或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。
全文摘要
一種體外檢測(cè)乙肝病毒C抗體的組合物，包括具有兩個(gè)以上抗體識(shí)別表位的乙肝病毒C抗原、抗體結(jié)合蛋白和標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記抗體。通過(guò)在檢測(cè)介質(zhì)上包被特定量的抗原結(jié)合蛋白，使其對(duì)待測(cè)抗體更有效的結(jié)合從而增強(qiáng)檢測(cè)效果。
文檔編號(hào)G01N33/576GK102062779SQ20091019883
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月17日
發(fā)明者朱紹榮 申請(qǐng)人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司