專利名稱：檢測(cè)美澳型核果褐腐病菌的引物、探針、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，具體地說，涉及一種對(duì)美澳型核果褐腐病菌 (Monilinia fructicola(Winter)Honey)進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速、特異、靈敏地探針實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)方法及其試劑盒；適合于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等部門使用。
背景技術(shù)：
美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola (Winter) Honey)已列入我國(guó) 2007 年5月公布的“中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病蟲雜草名錄”，同時(shí)也列入歐盟檢疫 性有害生物名錄。該病原菌為害李子、杏、桃、油桃、櫻桃、梅李、蘋果、梨和葡萄等多種水果 以及木瓜屬、山楂屬、枇杷屬等寄主，引起果腐、花腐和葉枯等。它既能在果園中引起危害， 又能為害儲(chǔ)藏期 果實(shí)，還可在果實(shí)中潛伏侵染。該病菌在世界分布于北美洲、大洋洲、歐洲、 亞洲、非洲、中美及加勒比海地區(qū)的許多國(guó)家，我國(guó)的北京部分桃園和臺(tái)灣也有報(bào)道。我國(guó) 從美國(guó)等國(guó)家進(jìn)口大量李子、蘋果等水果，美澳型核果褐腐病菌隨貿(mào)易性水果進(jìn)入我國(guó)風(fēng) 險(xiǎn)極大，對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成潛在威脅，因此，需要在口岸檢疫部門嚴(yán)格加強(qiáng)檢疫工作， 防止該病原真菌的傳入。由于美澳型核果褐腐病菌與該屬的另外兩個(gè)種核果褐腐病菌(M. Iaxa)和歐洲種 仁果褐腐病菌(M. fructigena)在病原菌形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、危害癥狀等方面相似，用形 態(tài)學(xué)方法不易區(qū)分，需要豐富的鑒定經(jīng)驗(yàn)，一般需要經(jīng)驗(yàn)豐富的真菌鑒定專家。而且需要分 離培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法是一種在定性PCR基礎(chǔ)上于1996年才發(fā)展起來的一種檢 測(cè)方法，該方法因?yàn)樵赑CR的同時(shí)加入了一段TaqMan探針，從而可以較有效地避免定性PCR 無法避免的非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性現(xiàn)象，該方法在醫(yī)學(xué)上得到較廣泛的應(yīng)用，近幾年該方 法又應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測(cè)。在國(guó)外，實(shí)時(shí)熒光PCR首次應(yīng)用于植物真菌病害檢測(cè) 領(lǐng)域是在2000年。在我國(guó)，章桂明、程穎慧等人首次于2001年將實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng) 用于小麥印度腥黑穗病菌及其近似種的檢測(cè)中。TaqMan MGB探針方法是在TaqMan方法之后產(chǎn)生的更新的方法，MGB的全稱為 Minor Groove Binder，在2001年被推出。與TaqMan探針相比，其原理是TaqMan MGB探針 一是在探針的3’端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo) 記；二是探針的3’端另結(jié)合了 Minor Groove binder結(jié)合物，使探針的Tm值提高，大大增 加了探針的雜交穩(wěn)定性。但是，將TaqMan MGB探針的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng)用于病原真菌的檢測(cè)，無論 在國(guó)外，還是在國(guó)內(nèi)，還是剛剛起步，需要做更多的探索研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的意在于提出快速、可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng)和價(jià)格便宜地檢測(cè)美澳 型核果褐腐病菌的引物、探針、試劑盒及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一條引物，其序列為SEQ ID NO 1 =SZMfc-F 5， -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3，。還提供了另一條引物，其序列為SEQ ID NO 2 SZMfc-R 5， -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3，。 又提供了 一條寡核苷酸探針，其序列為SEQ ID NO :3: 5，-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，，其中 FAM 為熒光分子，MGB 指另結(jié)合了 Minor Groove binder結(jié)合物。還提供了用于美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物及寡核苷酸探針，所 述寡核苷酸探針包括特異性檢測(cè)美澳型核果褐腐病菌的TaqManMGB探針和特異結(jié)合的寡 核苷酸序列。優(yōu)選地，所述引物具有如下的核酸序列SZMfc-F :5，-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3，SEQ ID NO 1SZMfc-R :5，-CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3，SEQ ID NO :2。優(yōu)選地，所述寡核苷酸探針具有如下的核酸序列SZMfc-Pb :5，-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ ID NO :3。本發(fā)明另提供了一種用于美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，所述 試劑盒包含上述的引物和寡核苷酸探針。本發(fā)明還提供了一種美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括如下步 驟(1)先對(duì)美澳型核果褐腐病菌、核果褐腐病菌和歐洲種仁果褐腐病菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔 區(qū)(ITS)進(jìn)行序列測(cè)定及比較分析，分別找出美澳型核果褐腐病菌不同于其它近似種的獨(dú) 有的堿基位點(diǎn)；(2)設(shè)計(jì)美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物和寡核苷酸探針；(3)對(duì)所設(shè)計(jì)的探針進(jìn)行篩選及反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，篩選出優(yōu)化的引物 和探針，并優(yōu)化出合適的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件；(4)加入上述的引物、探針進(jìn)行美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。采用該檢測(cè)方法的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是1)若定量PCR儀檢測(cè)到以美澳型核果褐腐病 菌DNA為模板的陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)告熒光有明顯信號(hào)增長(zhǎng)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照的報(bào)告熒光沒有 熒光信號(hào)增長(zhǎng)，而樣品的檢測(cè)結(jié)果是報(bào)告熒光信號(hào)有明顯增長(zhǎng)，則表示所檢測(cè)的真菌是美 澳型核果褐腐病菌；2)若定量PCR儀檢測(cè)到以美澳型核果褐腐病菌DNA為模板的陽(yáng)性對(duì) 照?qǐng)?bào)告熒光有明顯信號(hào)增長(zhǎng)，陰性對(duì)照和空白對(duì)照的報(bào)告熒光沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，而樣品 的檢測(cè)結(jié)果是報(bào)告熒光也沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，則表示所檢測(cè)的真菌不是美澳型核果褐腐病 菌。采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明突出的技術(shù)進(jìn)步在于1、設(shè)計(jì)出了針對(duì)適用于美澳型 核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)的引物、寡核苷酸探針和試劑盒，克服了現(xiàn)有的形態(tài) 學(xué)鑒定方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、需要豐富經(jīng)驗(yàn)的缺點(diǎn)，也克服了現(xiàn)有的分子檢測(cè)方法操作復(fù)雜或 檢測(cè)靈敏度不高、或特異性不強(qiáng)、或重復(fù)性不好等缺點(diǎn)。2、本發(fā)明適合美澳型核果褐腐病菌 的檢測(cè)，而且也適合水果寄主傳帶的美澳型核果褐腐病菌的檢測(cè)。3、由于本發(fā)明檢測(cè)快速、 特異性強(qiáng)，特別適用于口岸檢疫等時(shí)效性要求特別強(qiáng)的場(chǎng)合使用。
綜上所述，采用本發(fā)明能對(duì)實(shí)際檢疫和田間調(diào)查過程中所發(fā)現(xiàn)的病組織進(jìn)行美澳 型核果褐腐病菌分子生物學(xué)鑒定或檢測(cè)，其意義重大。


圖1是本發(fā)明具體實(shí)施方式
實(shí)施例2中特異性引物探針擴(kuò)增結(jié)果，右邊為檢測(cè)樣 品的編號(hào)；812672為美澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，816263為美澳型核果褐腐 病菌M. fructicola菌株，815702為美澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，MFC-nb為美 澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，P4236-nb為美澳型核果褐腐病菌Μ. fructicola 菌株，10923為美澳型核果褐腐病菌M. fructicola菌株，10921為核果褐腐病菌M. Iaxa菌 株，10922為歐洲種仁果褐腐病菌M. fructigena菌株，Pd-I為棕櫚疫霉病菌Phytophthora palmivora
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。實(shí)例例1美澳型核果褐腐病菌TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)及試劑盒一種用于美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引 物、寡核苷酸探針及試劑盒，用于美澳型核果褐腐病菌的特異性檢測(cè)。所述引物具有如下的核酸序列SZMfc-F :5，-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3，SEQ ID NO 1SZMfc-R :5，-CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3，SEQ ID NO :2，所述寡核苷酸探針具有如下的核酸序列SZMfc-Pb :5，-FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDNO :3。所述試劑盒為應(yīng)用上述引物和寡核苷酸探針制成的用于美澳型核果褐腐病菌檢 測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒。實(shí)施例2利用美澳型核果褐腐病菌TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)進(jìn) 口鮮李中美澳型核果褐腐病菌的檢疫鑒定所用引物和寡核苷酸探針是實(shí)施例1中的引物和寡核苷酸探針。其檢測(cè)反應(yīng)的體系總體積為IOyL,各成分為實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)混合液TaqMan Universal PCR Master Mix 5 μ L (ABI 公司，產(chǎn)品型號(hào) 4304437)，引物0. 9 μ M，探針0. 2 μ M， DNA 模板 1 μ L (模板濃度 IO-IOOng/ μ L)。其檢測(cè)反應(yīng)條件見表1。 表 1從進(jìn)口美國(guó)鮮李中發(fā)現(xiàn)可疑病果，按照上述的方法和條件進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果為以美澳型核果褐腐病菌DNA為模板的陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)?bào)告熒光有明顯信號(hào)增長(zhǎng)，陰 性對(duì)照和空白對(duì)照的報(bào)告熒光沒有熒光信號(hào)增長(zhǎng)，而來自進(jìn)口鮮李中DNA模板的檢測(cè)結(jié)果 為陽(yáng)性(檢測(cè)結(jié)果如圖1所示)。表明所檢測(cè)的進(jìn)口鮮李攜帶美澳型核果褐腐病菌。采用本發(fā)明的方法檢測(cè)美澳型核果褐腐病菌比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法更加快速、準(zhǔn)確， 且易于推廣應(yīng)用。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一條引物，其序列為SEQ ID NO15’-CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’。
2.一條引物，其序列為SEQ ID NO 2 5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’。
3.一對(duì)引物，其序列為SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2。
4.一條寡核苷酸探針，其序列為SEQ ID NO 3 5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3’。
5.一對(duì)引物和一條寡核苷酸探針，所述一對(duì)引物的序列為 SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2， 所述一條寡核苷酸探針的序列為SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDN0 :3。
6.用于美澳型核果褐腐病菌檢測(cè)的一對(duì)引物和一條寡核苷酸探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用于美澳型核果褐腐病菌檢測(cè)的一對(duì)引物和一條寡核苷酸探針， 所述引物序列為SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的用于美澳型核果褐腐病菌檢測(cè)的一對(duì)引物和一條寡核苷酸探針， 所述寡核苷酸探針序列為SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDN0 :3。
9.一種用于美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含一對(duì)引 物和一條寡核苷酸探針，所述一對(duì)引物的序列為SZMfc-F :5’ -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2， 所述一條寡核苷酸探針的序列為SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3，SEQ IDN0 :3。
10.一種大豆真菌病害實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)先對(duì)美澳型核果褐腐病菌、核果褐腐病菌和歐洲種仁果褐腐病菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn) 行序列測(cè)定及比較分析，分別找出美澳型核果褐腐病菌不同于其它近似種的獨(dú)有的堿基位占.(2)設(shè)計(jì)美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物和寡核苷酸探針，所述一對(duì)引 物的序列為SZMfc-F 5' -CCTTCGGGCCTTGTATGCT-3’ SEQ ID NO 1 SZMfc-R :5’ -CCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGT-3’ SEQ ID NO :2， 所述一條寡核苷酸探針的序列為SZMfc-Pb :5’ -FAM-CCAGAGGATAATTAAAC-MGB-3’ SEQ IDN0 3 ；(3)加入上述的引物、探針進(jìn)行美澳型核果褐腐病菌實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola (Winter)Honey)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物、寡核苷酸探針、試劑盒及檢測(cè)方法。所述引物含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列，所述寡核苷酸探針含有SEQ ID NO3的序列，所述檢測(cè)方法使用所述引物和寡核苷酸探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR來檢測(cè)美澳型核果褐腐病菌。采用本發(fā)明能對(duì)實(shí)際檢疫和田間調(diào)查過程中所發(fā)現(xiàn)的病組織進(jìn)行美澳型核果褐腐病菌的簡(jiǎn)單、快速、特異、靈敏地鑒定或檢測(cè)，適合于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等部門使用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101857894SQ20091010653
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者王穎, 程穎慧, 章桂明, 陳枝楠 申請(qǐng)人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心