專利名稱：腸吸收實(shí)驗(yàn)在識(shí)別中藥注射劑中潛在不安全成分中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸吸收實(shí)驗(yàn)在識(shí)別中藥注射劑指紋圖譜中潛在不安全成分中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)90年代，中藥現(xiàn)代化成為中醫(yī)藥的一個(gè)重要的發(fā)展方向，而包括注射劑在 內(nèi)的中藥新劑型研究也成為中藥現(xiàn)代化的一個(gè)標(biāo)志，各種先進(jìn)的中藥提取技術(shù)、冷凍干燥 技術(shù)都用在中藥注射劑的生產(chǎn)上，使產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性和安全性有了一定程度的提高。最近一些年來(lái)，隨著臨床不良反應(yīng)監(jiān)控體系的完善，中藥注射劑所導(dǎo)致的臨床不 良反應(yīng)報(bào)告逐年增加，并出現(xiàn)多次致人死亡的藥物事故。根據(jù)國(guó)家藥監(jiān)局(SFDA)的數(shù)據(jù)， 2006年全年共收到藥品不良反應(yīng)病例報(bào)告36. 9萬(wàn)份，其中中藥不良反應(yīng)病例報(bào)告占14% 至15%，其中絕大部分來(lái)自與中藥注射劑。中藥注射劑的安全性問(wèn)題受到國(guó)家食品藥品監(jiān) 督管理局和相關(guān)制藥企業(yè)的高度重視。藥品安全保證的一個(gè)是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，如果對(duì)制定的藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺少是否能 夠確保藥品安全的論證，那么通過(guò)按照這種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)藥品的放行前檢測(cè)就不能保證藥品 上市后的安全性。由于歐洲和美國(guó)都沒(méi)有傳統(tǒng)藥物注射劑這類藥品劑型，國(guó)際上沒(méi)有相似 的標(biāo)準(zhǔn)可以借鑒，中藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)都是我國(guó)獨(dú)自開(kāi)發(fā)的，而如何使這些制劑的質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)能夠控制藥品的安全性成為困擾我國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的難題。復(fù)方制劑多、非藥典法定品種作為原料使用多、有效成分含量要求低，是直接威脅 中藥注射劑質(zhì)量穩(wěn)定性和使用安全性的三大突出問(wèn)題。當(dāng)前列入我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的中藥注射 劑有109種，其中復(fù)方制劑有50種，復(fù)方制劑的原料藥材多達(dá)3 12味；單方制劑59種， 非藥典法定品種19種，因藥品標(biāo)準(zhǔn)頒布的時(shí)間不同，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定水準(zhǔn)參差不齊；注射 劑所含有效物質(zhì)不低于總固體的70% (靜脈內(nèi)使用不低于80%)即可達(dá)到審批標(biāo)準(zhǔn)，這和 歐盟等西方國(guó)家植物藥注射劑基本都是單方，有效純度須達(dá)98%，另2%非有效成分也須 明確成分相比，我國(guó)SFDA的審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)和歐洲國(guó)家相去甚遠(yuǎn)。國(guó)內(nèi)對(duì)中藥注射劑的質(zhì)量控制一直存在著兩種不同的理念一種理念是要維護(hù)中 藥的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論，認(rèn)為只有成分復(fù)雜才能夠符合中藥的傳統(tǒng)治療理念；另一種理念是要 按照化學(xué)藥品的控制標(biāo)準(zhǔn)，搞清楚中藥注射劑的每一種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及每一種成分 的安全性，兩種觀點(diǎn)都有著各自的理由。因此，需要開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)中藥注射劑特點(diǎn)的安 全性評(píng)估方法，既能保留中藥注射劑成分復(fù)雜的特點(diǎn)，又能有效地識(shí)別其中哪些成分屬于 需要關(guān)注的潛在不安全成分，并為制定中藥注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)，使得中藥注 射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能夠成為這兩種對(duì)立理念的有機(jī)結(jié)合體既能夠體現(xiàn)出中藥的整體治療理 念，又能夠適應(yīng)高風(fēng)險(xiǎn)注射劑型的質(zhì)量控制要求；既不能用中醫(yī)藥的所謂“安全性”光環(huán)來(lái) 忽視其對(duì)藥品的安全性監(jiān)控，也不能一味追求安全性而否定中醫(yī)藥的整體配方理念。而在 兩者發(fā)生沖突時(shí)，首先要保證人民群眾的用藥安全。來(lái)自中醫(yī)藥學(xué)專家和部分制藥企業(yè)的觀點(diǎn)認(rèn)為，中藥屬于傳統(tǒng)藥物，其組分都來(lái) 自于植物、動(dòng)物或礦物，其成分本身與化學(xué)藥物相比具有較高的安全性；而且中藥配方具有悠久的臨床醫(yī)療實(shí)踐基礎(chǔ)和中醫(yī)理論基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)幾百年甚至幾千年的臨床應(yīng)用證明中藥對(duì) 人體是安全的。對(duì)《國(guó)家基本藥物目錄》中中藥注射劑類藥品及其同品種不同劑型產(chǎn)品的不良事 件/不良反應(yīng)報(bào)告進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(參見(jiàn)《2002年版〈國(guó)家基本藥物目錄〉中藥注射劑類藥品不 良反應(yīng)文獻(xiàn)調(diào)查分析》，王奇等著，《藥物警戒》，2007年5月，第4卷第3期總第15期)能 夠證明上述觀點(diǎn)的前提是正確的，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全部72個(gè)中藥品種中共有34個(gè)藥品報(bào)告 出現(xiàn)了不良事件/不良反應(yīng)，共報(bào)告不良事件/不良反應(yīng)4156例，其中注射劑4046例占 99. 76% ；而與這些中藥注射劑配方相同的其他中藥劑型僅發(fā)生10例不良反應(yīng)，占0. 24%。 由此可見(jiàn)，大多數(shù)不良反應(yīng)高發(fā)的中藥注射劑，其配方的口服制劑是安全的。然而，這個(gè)統(tǒng)計(jì)資料恰恰證明了給藥方式不同可能引起的差異，傳統(tǒng)中藥一般都 是口服或外用，古人從沒(méi)有采用注射器直接注入人體的給藥方式。因此，“中藥注射劑”這種 藥品類別屬于基于口服的中藥傳統(tǒng)配方與西藥無(wú)菌制劑技術(shù)和非腸道給藥方式的結(jié)合。由 于中藥注射劑采用了非腸道給藥方式，即經(jīng)注射直接進(jìn)入人體，靜脈注射自不必說(shuō)，即使是 肌肉或皮下注射，在注射局部中藥注射劑中所含的小分子成分都可以透過(guò)注射局部的毛細(xì) 血管直接吸收入血，不存在類似腸粘膜的選擇性吸收屏障，一些口服給藥時(shí)腸道不吸收的 成分就會(huì)直接進(jìn)入人體，這些成分可能對(duì)人體產(chǎn)生毒性作用。因此，對(duì)于那些不能被人體吸 收的有機(jī)雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)按照化學(xué)藥物中含有的雜質(zhì)限度進(jìn)行控制，因?yàn)檫@些成分不能代表中 藥的安全性。按照美國(guó)、歐盟和日本三方共同制定的針對(duì)化學(xué)藥物的雜質(zhì)控制標(biāo)準(zhǔn) (ICHQ3A(R2)和ICH Q3B (R2)，見(jiàn)周海鈞主譯《藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求——2007質(zhì)量部 分》，人民衛(wèi)生出版社，2006年，第99-111頁(yè))，我國(guó)在此指導(dǎo)原則基礎(chǔ)上制定的《化學(xué)藥 物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》(2005年，SFDA藥品評(píng)審中心發(fā)布的指導(dǎo)文件，見(jiàn)http:// www. cde. org. cn/zdyz. do ？ method = largePage&id = 2060)，要求每一個(gè)藥物都要建 立起雜質(zhì)檔案(Impurity prof ile)，對(duì)藥品中含有的雜質(zhì)進(jìn)行深入研究，該指導(dǎo)文件對(duì)化 學(xué)藥品中含有的有機(jī)雜質(zhì)的提出了明確的限度要求對(duì)于日攝入量小于2克的藥品，如含 有超過(guò)0.05%的未知雜質(zhì)必須報(bào)告，稱為“報(bào)告限度(Reporting Threshold) ” ；如含有 超過(guò)0. 的未知雜質(zhì)，必須要對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)做出鑒定，稱為“鑒定限度(Identification Threshold)”;如未知雜質(zhì)含量超過(guò)0. 15%，必須通過(guò)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明其安全性，稱為“質(zhì)控 限度(Qualification Threshold) ”。由于目前很難證明中藥注射劑所含的成分中那些成分 屬于有效成分，那些成分屬于雜質(zhì)，因此如果按照上述指導(dǎo)文件對(duì)中藥注射劑進(jìn)行雜質(zhì)論 證和質(zhì)量研究，就需要對(duì)所有超過(guò)上述限度的成分進(jìn)行研究和鑒定，對(duì)于通常含有幾十種 成分的中藥注射劑來(lái)說(shuō)，這是一件非常艱巨的工作，嚴(yán)重地制約了為建立安全可靠的中藥 注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而開(kāi)展的研究工作。由于中藥注射劑存在上述安全隱患，SFDA將中藥注射劑列為高風(fēng)險(xiǎn)制劑，加大了 監(jiān)管力度。為了控制中藥注射劑質(zhì)量的一致性，SFDA在2000年發(fā)布了《中藥注射劑的指 紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》(國(guó)藥管注[2000] 348號(hào)文件，2000年08月15日發(fā)布， 見(jiàn) SFDA 網(wǎng)站http://www. sda. gov. cn/WS01/CL0237/15768. html)，要求所有中藥注射劑 品種必須建立起指紋圖譜的控制方法，明確要求對(duì)新申報(bào)的中藥注射劑和已上市的中藥注 射劑實(shí)行指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。而指紋圖譜的首選是采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)中藥注射劑成分進(jìn)行分離、檢測(cè)和描繪出來(lái)的色譜圖，再通過(guò)數(shù)據(jù)處理儀器自動(dòng)計(jì)算出色譜圖上各種成分峰高、峰面積和相對(duì)含量。最近10年來(lái)，我國(guó)相關(guān)制藥企業(yè)在中藥注射劑的成分分離檢 測(cè)上做出很大努力，大多數(shù)品種已經(jīng)建立起指紋圖譜的控制手段。然而，盡管我國(guó)中藥注射劑的生產(chǎn)企業(yè)在用“指紋圖譜”控制產(chǎn)品質(zhì)量，一些企業(yè) 的QC實(shí)驗(yàn)室不乏各種紫外、HPLC、GC等現(xiàn)代化檢測(cè)儀器，但是這些企業(yè)都不能解釋其“指紋 圖譜”制訂的安全性依據(jù)，不能說(shuō)明圖譜中大量色譜峰所代表的化學(xué)成分中哪些成分是安 全的，哪些成分是不安全的，不能對(duì)產(chǎn)品的成分進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)管理，或者說(shuō)不能識(shí)別哪些成分具 有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，而如果對(duì)哪些成分可能導(dǎo)致不良反應(yīng)缺少科學(xué)依據(jù)，中藥注射劑的安全性 仍然是難以保證的。2009年1月13日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《關(guān)于開(kāi)展中藥注射劑安 全性再評(píng)價(jià)工作的通知》，同時(shí)發(fā)布了“中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)工作方案”(國(guó)食藥監(jiān) 辦[200928 號(hào)，2009 年 1 月 13 日發(fā)布，見(jiàn) SFDA 網(wǎng)站:http //www. sda. gov. cn/WSOl/ CL0055/35332. html)，對(duì)中藥注射劑的安全性評(píng)估提出了一些具體的技術(shù)要求。強(qiáng)調(diào)要加 強(qiáng)中藥注射劑再注冊(cè)管理，“重點(diǎn)是對(duì)處方、生產(chǎn)工藝、藥品標(biāo)準(zhǔn)和說(shuō)明書(shū)中存在問(wèn)題的審 查和評(píng)估”。在上述背景下，本發(fā)明提出了一種中藥注射劑HPLC指紋圖譜中潛在不安全成分 的識(shí)別方法，而大多數(shù)能夠被腸吸收的成分則可作為安全成分不需要進(jìn)行額外的化學(xué)結(jié)構(gòu) 鑒定和安全性試驗(yàn)研究，從而大大簡(jiǎn)化了這類高風(fēng)險(xiǎn)藥品的安全性評(píng)估程序。此外，需要說(shuō)明的是，造成中藥注射劑臨床不良反應(yīng)事故的原因是多種多樣的，除 了藥品本身的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不嚴(yán)格，沒(méi)有對(duì)可能含有的潛在不安全成分進(jìn)行識(shí)別和鑒定之外， 中藥注射劑的生產(chǎn)工藝控制條件、滅菌方法、關(guān)鍵生產(chǎn)環(huán)節(jié)的無(wú)菌環(huán)境、包裝材料的密閉 性、原材料控制和生產(chǎn)質(zhì)量管理中存在的很多方面問(wèn)題都可以導(dǎo)致藥品受到細(xì)菌污染、混 淆或質(zhì)量失控。這些問(wèn)題引起的藥品不合格或質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)不在本發(fā)明的討論范圍之內(nèi)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種識(shí)別中藥注射劑指紋圖譜中潛在不安全成分的簡(jiǎn)便 方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案腸吸收實(shí)驗(yàn)在識(shí)別已建立液相色譜HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法的中藥注射劑所含有 的潛在不安全成分中的應(yīng)用。一種利用腸吸收實(shí)驗(yàn)識(shí)別中藥注射劑含有的潛在不安全成分的方法，其特征在 于，包括以下步驟1)測(cè)定待測(cè)中藥注射劑原液的HPLC指紋圖譜；2)通過(guò)導(dǎo)管與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的離體腸管相連接，將其浸沒(méi)在通有氧氣并維持37攝氏 度恒溫的一定量的培養(yǎng)液中，用蠕動(dòng)泵將純水或生理鹽水通過(guò)導(dǎo)管注入腸管，對(duì)腸內(nèi)壁進(jìn) 行清洗，同時(shí)對(duì)腸外壁也進(jìn)行適當(dāng)清洗；3)將循環(huán)導(dǎo)管中的液體排出，用純水或生理鹽水注入導(dǎo)管和腸管中，用蠕動(dòng)泵使 其維持循環(huán)灌流，分別從灌流液和培養(yǎng)液中取樣、過(guò)濾，作為樣品A和M ；4)用一定量的待測(cè)中藥注射劑原液置換循環(huán)導(dǎo)管中的溶液，在與步驟3)相同的條件進(jìn)行循環(huán)灌流，維持灌流的時(shí)間應(yīng)足以使中藥注射劑被腸管吸收，分別從灌流液和培 養(yǎng)液中取樣，過(guò)濾，作為樣品B和N ；5)用步驟1)的檢測(cè)方法對(duì)樣品A、B、M和N進(jìn)行檢測(cè)，得到圖譜A、B、M和N。除 了圖譜A中含有的峰之外，圖譜B中的峰應(yīng)在保留時(shí)間上與圖譜C相一致；除了圖譜M中含 有的峰之外，圖譜N中的峰應(yīng)在保留時(shí)間上與圖譜C相一致；6)根據(jù)腸灌流試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)灌流液和培養(yǎng)液的容積比和圖譜B、N和C的峰 面積，折算出圖譜C中所有峰面積比超過(guò)0. 15%的峰在圖譜N和圖譜C中的峰面積比，得出 上述每一個(gè)峰所代表成分的腸吸收率； 7)比較圖譜C中含量大于的各個(gè)成分的吸收率，將吸收率最大的成分作為參 照，計(jì)算其它每一個(gè)成分的吸收率相對(duì)于此參照成分吸收率的相對(duì)吸收率。以相對(duì)吸收率 作為依據(jù)，評(píng)判每一個(gè)成分的安全性a)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率等于零(不存在于圖譜N中)，表明這個(gè)成分不能被 腸管吸收，屬于此中藥注射劑中潛在的不安全成分，需要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估，包括進(jìn)行化 學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定和毒理學(xué)試驗(yàn)，以證明其安全性；。b)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率小于20%，應(yīng)對(duì)此成分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，并納入雜 質(zhì)控制檔案；c)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率超過(guò)20%，表明這個(gè)成分可以被腸管有效吸收，屬于 該中藥配方中的安全成分，不需要對(duì)該成分進(jìn)行安全性評(píng)估。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明將藥代動(dòng)力學(xué)方法用于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和中藥注射劑成分的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，要求 對(duì)腸吸收實(shí)驗(yàn)中不能被吸收的成分進(jìn)行安全性論證，能夠?qū)⒋蟛糠挚梢员晃盏某煞终J(rèn)定 為安全成分而確認(rèn)不需要進(jìn)行安全性論證，從而大大簡(jiǎn)化了安全論證的工作量。利用本發(fā) 明對(duì)中藥注射劑進(jìn)行安全性論證，可以建立起每一種中藥注射劑的雜質(zhì)檔案，最終建立起 科學(xué)的、能夠保證中藥注射劑安全的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。因此對(duì)于促進(jìn)我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥和制藥行 業(yè)的發(fā)展，保證用藥安全具有積極的促進(jìn)作用。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 更清楚的得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對(duì)本發(fā)明的限制。


圖1為離體腸道灌流實(shí)驗(yàn)裝置示意圖
具體實(shí)施例方式本專利可用于任何一種具有復(fù)雜成分、并已建立液相色譜(HPLC)指紋圖譜檢測(cè) 方法的中藥注射劑，通常中藥注射劑的指紋圖譜中會(huì)有多個(gè)未知峰，這些峰所代表的成分 的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物安全性均不清楚。本發(fā)明的思路為由于中藥配方的安全性建立在長(zhǎng)期口服給藥的實(shí)踐基礎(chǔ)上，因此不能被腸道吸收 的中藥配方成分就應(yīng)當(dāng)屬于中藥注射劑中存在“潛在的不安全成分”，這種成分也就可以視 同于藥物的“潛在雜質(zhì)”。如果潛在雜質(zhì)峰的相對(duì)含量超過(guò)可以被忽略的限度，就應(yīng)當(dāng)對(duì)此成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和安全性論證。1.首先，應(yīng)按照“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)”的要求建立起被 測(cè)藥品的中藥注射劑色譜學(xué)指紋圖譜檢測(cè)方法。2.在小鼠、大鼠、家兔或其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的離體(in vitro)或在體(in situ)腸道 灌流實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，在腸粘膜側(cè)加入某中藥注射劑的原液，腸漿膜側(cè)加入培養(yǎng)液，在接近生理 條件下進(jìn)行該中藥注射劑的腸吸收實(shí)驗(yàn)。3.腸灌流一定時(shí)間后，采用與中藥注射劑指紋圖譜相同的檢測(cè)方法分別測(cè)定腸粘 膜側(cè)和腸漿膜側(cè)樣品的指紋圖譜，并與該中藥注射劑原液指紋圖譜進(jìn)行比較，考察腸灌流 實(shí)驗(yàn)后中藥注射劑被腸段吸收的情況，其中未被腸管吸收的物質(zhì)成分屬于中藥注射劑中存 在的潛在不安全成分。4.指紋圖譜中潛在不安全成分的識(shí)別如果中藥注射劑原液經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的腸 灌流后，如果注射劑原液指紋圖譜中的某個(gè)成分未在腸漿膜側(cè)的樣品圖譜中發(fā)現(xiàn)，不論腸 粘膜側(cè)的樣品圖譜中該成分是否消失或減少，都應(yīng)認(rèn)為該成分未被腸管吸收，屬于潛在不 安全成分，需要對(duì)其進(jìn)行重點(diǎn)的安全性評(píng)估。而如果某個(gè)成分在腸粘膜側(cè)的樣品圖譜中大 量減少，且明顯存在于腸漿膜側(cè)的樣品圖譜中，則可以認(rèn)定為中藥配方中的安全成分，不需 要進(jìn)行安全性評(píng)估。對(duì)于中藥注射劑中可被腸道吸收的物質(zhì)的安全性判定基于以下原理(1)如果我們把傳統(tǒng)的中藥煎煮液中所含有的成分作為最復(fù)雜的成分集合々，那 么經(jīng)過(guò)提取的口服中成藥所含有的成分集合B必然都小于并從屬于集合A，而經(jīng)過(guò)更進(jìn)一 步提取的中藥注射劑所含有的成分集合C應(yīng)小于并從屬于集合A和B。因此，如果中藥方劑 或口服中成藥是安全的，那么其對(duì)應(yīng)的中藥注射劑經(jīng)口服給藥也必定是安全的。(2)如果一種中藥方劑或口服中成藥是安全的，證明這種中藥配方經(jīng)胃腸道吸收 后進(jìn)入血液的成分集合N是安全的，如果將動(dòng)物離體腸吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛻?yīng)用于相同此種中藥 方劑或口服中成藥的吸收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中被吸收的成分集合M應(yīng)小于并從屬于成分集合N，因 此，成分集合M是安全的。(3)由于中藥注射劑的成分集合C屬于中藥方劑的成分集合A或口服中成藥的成 分集合B，所以該劑型經(jīng)動(dòng)物離體腸吸收實(shí)驗(yàn)被吸收的成分也必然是安全的。反之，中藥注 射劑中未被動(dòng)物離體腸管吸收的成分不屬于集合M，如果這些成分直接通過(guò)注射的給藥方 式進(jìn)入人體，則無(wú)法保證其安全性，必須對(duì)這些成分進(jìn)行安全性論證。這樣，大部分能夠被動(dòng)物離體腸管吸收的成分可以認(rèn)定為安全成分而確認(rèn)不需要 進(jìn)行安全性論證，從而大大簡(jiǎn)化了安全論證的工作量，同時(shí)將不被吸收的少數(shù)成分凸現(xiàn)出 來(lái)，作為潛在的不安全成分而被要求進(jìn)行評(píng)估和論證。5.對(duì)潛在雜質(zhì)的安全性論證方法雖然國(guó)際藥品注冊(cè)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)天然藥物 存在的雜質(zhì)控制限度要低于化學(xué)藥物中雜質(zhì)的控制限度，但出于對(duì)患者用藥安全的考慮， 對(duì)于那些不能夠被腸道吸收的物質(zhì)應(yīng)采用更為嚴(yán)格的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)。因此，本發(fā)明推薦采用 我國(guó)2005年制定的化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則，并安全該原則提出的鑒定限度 (Identification threshold)和質(zhì)控限度(Qualification threshold)對(duì)中藥注射劑中存 在的潛在不安全成分進(jìn)行安全性論證。(1)首先本發(fā)明提出需要對(duì)圖譜C中所 有峰面積比超過(guò)0. 15%的峰進(jìn)行安全性評(píng)估，所參照的就是上述指導(dǎo)原則提出的質(zhì)控限度，如果任何含量超過(guò)0. 15%的成分在本發(fā) 明推薦的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕献C明不能被腸吸收時(shí)，這種成分就屬于潛在的不安全成分，表明該成 分不屬于中藥組方中口服可吸收的成分，而且這種含量超過(guò)0. 15%的成分將會(huì)以注射的方 式進(jìn)入人體，對(duì)人體導(dǎo)致不確定的影響，因此必須要對(duì)這種成分按照化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的 技術(shù)指導(dǎo)原則中規(guī)定的超過(guò)“質(zhì)控限度”的未知雜質(zhì)進(jìn)行安全性評(píng)估，這與化學(xué)藥品中未知雜質(zhì)的控制理念是一致的。(2)由于被評(píng)估的中藥注射劑是從具有口服安全性的中藥組方提取制備的，所以 在中藥注射劑中能夠經(jīng)腸吸收的成分都被判定為安全性成分，這些成分都不需要再按照化 學(xué)藥物的雜質(zhì)控制要求進(jìn)行額外的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定和安全性評(píng)估，這種判定方法充分考慮到 了中醫(yī)藥專家們強(qiáng)調(diào)的中藥配方的安全性理念，使符合這一理念的成分得到了驗(yàn)證。(3)對(duì)于哪些腸吸收率明顯偏低的成分，本發(fā)明參照化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指 導(dǎo)原則的基本評(píng)判方式，提出了一個(gè)相對(duì)吸收率低于20%的鑒定限度，如果一種成分的腸 吸收不足吸收最多的成分的20 %，說(shuō)明此種成分經(jīng)過(guò)注射進(jìn)入人體可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體攝入過(guò) 量，因此應(yīng)對(duì)這些成分進(jìn)行定性分析，確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。由于本發(fā)明提出的鑒定限度無(wú)法與 化學(xué)藥物未知雜質(zhì)的鑒定限度直接換算，因此可以根據(jù)中藥注射劑的每日最大給藥量、不 良反應(yīng)情況和藥材種類等因素進(jìn)行調(diào)整。中藥注射劑的生產(chǎn)企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)可以在上述安全性研究的基礎(chǔ)上建立起中藥 注射劑產(chǎn)品的雜質(zhì)檔案(Impurity Profile)，并按照風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法制定出嚴(yán)格的質(zhì)量控 制標(biāo)準(zhǔn)和控制方法。上述評(píng)估方式即采用了化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則中未知雜質(zhì)的控制原 貝U，同時(shí)也兼顧了中藥的成分復(fù)雜，但由于其天然藥物屬性，口服給藥相對(duì)安全的特點(diǎn)。通 過(guò)上述方法，可以在安全性評(píng)估中最大程度地排除掉絕大多數(shù)可以被腸道吸收的安全成 分，快速地篩選出需要進(jìn)行安全性論證的潛在不安全成分，對(duì)于制訂具有安全保證的中藥 注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。除了上述推薦的離體腸灌流方法之外，在體(in situ)腸灌流吸收實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵部?以用于同樣的目的，但與離體實(shí)驗(yàn)相比，在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽浜蜅l件控制比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)條 件比較難以控制。國(guó)外學(xué)者曾用64種藥物對(duì)大鼠的腸吸收模型與人的劑量吸收分?jǐn)?shù)進(jìn)行了分析和 統(tǒng)計(jì)比較，認(rèn)為人和大鼠吸收百分率之比非常接近于1，其相關(guān)系數(shù)為0. 97(何仲貴，鐘大 放等譯.《藥物生物利用度》，沃特貝恩德(美)，倫納奈斯(瑞士)，阿圖松(瑞士)編.北 京，化學(xué)工業(yè)出版社，2006年)。因此本發(fā)明采用大鼠的腸道灌流模型進(jìn)行腸吸收實(shí)驗(yàn)來(lái)檢 測(cè)中藥注射劑中對(duì)人的潛在不安全物質(zhì)是有效的。實(shí)施例1 腸吸收實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)中藥注射劑中潛在不安全成分中的應(yīng)用1)測(cè)定待測(cè)中藥注射劑原液的HPLC指紋圖譜。2)如圖1所示，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的離體腸管1置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液4中，本實(shí)驗(yàn)采用 Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液(pH7. 4)。將導(dǎo)管2與該離體腸管1兩端分別連接并結(jié)扎腸 管，通過(guò)氧氣管7向培養(yǎng)液中持續(xù)通以氧氣(圖1中氧氣管口附近的圓圈示氣泡)，將培養(yǎng) 液容器置于恒溫水浴槽5中，攝氏37度水浴以維持其恒溫，使離體腸管處于接近生理?xiàng)l件 的環(huán)境中。用蠕動(dòng)泵3將純水或生理鹽水通過(guò)導(dǎo)管不斷注入腸管，以對(duì)腸內(nèi)壁進(jìn)行充分的清洗。3)將循環(huán)導(dǎo)管中的液體排出，將純水或生理鹽水注入導(dǎo)管和腸管中，用蠕動(dòng)泵維 持循環(huán)灌流，并持續(xù)或階段性補(bǔ)充純水或生理鹽水至灌流液儲(chǔ)備容器6 (可以是燒杯或量 筒)中以維持灌流液的體積恒定，灌流約半小時(shí)，分別從灌流液和培養(yǎng)液中取樣、過(guò)濾，作 為空白對(duì)照樣品A和M。4)更換新鮮的培養(yǎng)液并測(cè)量其容量(如50毫升)，用一定容量(如50毫升)待 測(cè)中藥注射劑原 液在相同的條件下循環(huán)灌流，維持灌流約2小時(shí)，使中藥注射液被腸管充 分吸收，分別從灌流液和培養(yǎng)液中取樣，過(guò)濾，作為樣品B和N。5)用步驟1)的檢測(cè)方法對(duì)樣品A、B、M和N進(jìn)行檢測(cè)，得到圖譜A、B、M和N，并將 其與步驟1)所測(cè)定的中藥注射劑原液的HPLC指紋圖譜C進(jìn)行對(duì)比。除了圖譜A中含有的 峰之外，圖譜B中的峰應(yīng)在時(shí)間上與圖譜C相一致，除了圖譜M中含有的峰之外，圖譜N中 的峰應(yīng)在時(shí)間上與圖譜C相一致。6)根據(jù)腸灌流試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)灌流液和培養(yǎng)液的容積比和圖譜B、N和C的峰 面積，折算出圖譜C中所有峰面積比超過(guò)0. 15%的峰在圖譜N和圖譜C中峰面積比，得出上 述每一個(gè)峰所代表成分的腸吸收率；7)比較圖譜C中含量大于的各個(gè)成分的吸收率，將吸收率最大的成分作為參 照，計(jì)算其它每一個(gè)成分的吸收率相對(duì)于此參照成分吸收率的相對(duì)吸收率。以相對(duì)吸收率 作為依據(jù)，評(píng)判每一個(gè)成分的安全性a)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率等于零(不存在于圖譜N中)，表明這個(gè)成分不能被 腸管吸收，屬于此中藥注射劑中潛在的不安全成分，需要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估，包括進(jìn)行化 學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定和毒理學(xué)試驗(yàn)，以證明其安全性；。b)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率小于20%，應(yīng)對(duì)此成分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，并納入雜 質(zhì)控制檔案；c)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率超過(guò)20%，表明這個(gè)成分可以被腸管有效吸收，屬于 該中藥配方中的安全成分，不需要對(duì)該成分進(jìn)行安全性評(píng)估。相似地，采用離體外翻腸管的灌流試驗(yàn)也可以實(shí)現(xiàn)同樣的目的。表1.舉例說(shuō)明指紋圖譜中潛在不安全成分的識(shí)別方法 每一個(gè)中藥注射劑的HPLC指紋圖譜中都包含多達(dá)十幾個(gè)至幾十個(gè)成分，這些成 分的保留時(shí)間不同，一般用紫外檢測(cè)器對(duì)流出液進(jìn)行檢測(cè)，在色譜圖上表現(xiàn)為很多相互分 離的吸收峰。表1舉例說(shuō)明如何對(duì)中藥注射劑原液的指紋圖譜(圖譜C)和經(jīng)過(guò)腸吸收液 指紋圖譜(圖譜N)中對(duì)應(yīng)成分的吸收峰進(jìn)行安全性評(píng)估。首先計(jì)算出圖譜C中所有含量 大于0. 15%的成分的吸收率，比較所有含量大于1 %的成分的吸收率之后，成分C的吸收率 最大，被定為參照成分，并將其吸收率作為100%。計(jì)算所有其他每一個(gè)成分相對(duì)于參照成 分的相對(duì)吸收率。成分E的相對(duì)吸收率為5. 5%，小于20%，需要進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，成分 D沒(méi)有在圖譜N中沒(méi)有檢出，故作為潛在不安全成分，需要進(jìn)行安全性論證；成分B和成分A 的相對(duì)吸收率都大于20%，屬于安全成分，不需要進(jìn)行安全性論證；而成分F在圖譜C中的 含量小于0. 15%，不需要進(jìn)行評(píng)估。
權(quán)利要求
腸吸收實(shí)驗(yàn)在識(shí)別中藥注射劑所含有的潛在不安全成分中的應(yīng)用，所述的中藥注射劑已建立液相色譜HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，且其中藥組方經(jīng)口服給藥已知具有安全性。
2.一種利用腸吸收實(shí)驗(yàn)識(shí)別中藥注射劑含有的潛在不安全成分的方法，所述的中藥注 射劑已建立液相色譜HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，且其中藥組方經(jīng)口服給藥已知具有安全性， 其特征在于，包括以下步驟1)測(cè)定待測(cè)中藥注射劑原液的HPLC指紋圖譜，作為圖譜C；2)通過(guò)導(dǎo)管與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的離體腸管相連接，將其浸沒(méi)在通有氧氣并維持37攝氏度恒 溫的定量的培養(yǎng)液中，用蠕動(dòng)泵將純水或生理鹽水通過(guò)導(dǎo)管注入腸管，對(duì)腸粘膜側(cè)進(jìn)行清 洗，同時(shí)對(duì)腸漿膜側(cè)也進(jìn)行清洗；3)將循環(huán)導(dǎo)管中的液體排出，用純水或生理鹽水注入導(dǎo)管和腸管中，用蠕動(dòng)泵使其維 持循環(huán)灌流，分別從灌流液和培養(yǎng)液中取樣、過(guò)濾，作為樣品A和M ；4)用定量的待測(cè)中藥注射劑原液置換循環(huán)導(dǎo)管中的溶液，在與步驟3)相同的條件進(jìn) 行循環(huán)灌流，維持灌流的時(shí)間應(yīng)足以使中藥注射劑被腸管吸收，分別從灌流液和培養(yǎng)液中 取樣，過(guò)濾，作為樣品B和N;5)用步驟1)的檢測(cè)方法對(duì)樣品A、B、M和N進(jìn)行檢測(cè)，得到圖譜A、B、M和N。除了圖 譜A中含有的峰之外，圖譜B中的峰應(yīng)在保留時(shí)間上與圖譜C相一致；除了圖譜M中含有的 峰之外，圖譜N中的峰應(yīng)在保留時(shí)間上與圖譜C相一致；6)根據(jù)腸灌流試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)灌流液和培養(yǎng)液的容積比和圖譜B、N和C的峰面積， 折算出圖譜C中所有峰面積比超過(guò)0. 15%的峰在圖譜N和圖譜C中的峰面積比，得出上述 每一個(gè)峰所代表成分的腸吸收率；7)比較圖譜C中含量大于的各個(gè)成分的吸收率，將吸收率最大的成分作為參照，計(jì) 算其它每一個(gè)成分的吸收率相對(duì)于此參照成分吸收率的相對(duì)吸收率。以相對(duì)吸收率作為依 據(jù)，評(píng)判每一個(gè)成分的安全性a)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率等于零(不存在于圖譜N中)，表明這個(gè)成分不能被腸管 吸收，屬于此中藥注射劑中潛在的不安全成分，需要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估，包括進(jìn)行化學(xué)結(jié) 構(gòu)鑒定和毒理學(xué)試驗(yàn)，以證明其安全性；b)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率小于20%，應(yīng)對(duì)此成分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，并納入雜質(zhì)控 制檔案；c)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率超過(guò)20%，表明這個(gè)成分可以被腸管有效吸收，屬于該中 藥配方中的安全成分，不需要對(duì)該成分進(jìn)行安全性評(píng)估。
3.一種利用腸吸收實(shí)驗(yàn)識(shí)別中藥注射劑含有的潛在不安全成分的方法，所述的中藥注 射劑已建立液相色譜HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，且其中藥組方經(jīng)口服給藥已知具有安全性， 其特征在于，包括以下步驟1)測(cè)定待測(cè)中藥注射劑原液的HPLC指紋圖譜，作為圖譜C；2)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的離體腸管內(nèi)外翻轉(zhuǎn)，腸粘膜側(cè)朝外，與導(dǎo)管相連接，用純水或生理鹽水 對(duì)腸粘膜側(cè)多次進(jìn)行換液清洗，并用蠕動(dòng)泵將培養(yǎng)液通過(guò)導(dǎo)管注入腸管，對(duì)腸漿膜側(cè)進(jìn)行 清洗，然后將腸管浸沒(méi)在通有氧氣并維持37攝氏度恒溫的一定容量的純水中；3)用蠕動(dòng)泵將新鮮的培養(yǎng)液通過(guò)導(dǎo)管注入腸管，使其維持循環(huán)灌流，分別從灌流液和 純水中取樣、過(guò)濾，作為樣品M和A ；4)用待測(cè)中藥注射劑原液置換純水，使腸管的腸粘膜側(cè)浸沒(méi)在定量的中藥注射劑原液 中，同時(shí)用定量的培養(yǎng)液在與步驟2)相同的條件進(jìn)行循環(huán)灌流，維持灌流的時(shí)間應(yīng)足以使 中藥注射劑被腸管吸收，分別從灌流液和中藥注射劑中取樣，過(guò)濾，作為樣品N和B ；5)用步驟1)的檢測(cè)方法對(duì)樣品A、B、M和N進(jìn)行檢測(cè)，得到圖譜A、B、M和N。除了圖 譜A中含有的峰之外，圖譜B中的峰應(yīng)在保留時(shí)間上與圖譜C相一致，除了圖譜M中含有的 峰之外，圖譜N中的峰應(yīng)在保留時(shí)間上與圖譜C相一致；6)根據(jù)腸灌流試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)灌流液和培養(yǎng)液的容積比和圖譜B、N和C的峰面積， 折算出圖譜C中所有峰面積比超過(guò)0. 15%的峰在圖譜N和圖譜C中的峰面積比，得出上述 每一個(gè)峰所代表成分的腸吸收率；7)比較圖譜C中含量大于的各個(gè)成分的吸收率，將吸收率最大的成分作為參照，計(jì) 算其它每一個(gè)成分的吸收率相對(duì)于此參照成分吸收率的相對(duì)吸收率。以相對(duì)吸收率作為依 據(jù)，評(píng)判每一個(gè)成分的安全性a)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率等于零(不存在于圖譜N中)，表明這個(gè)成分不能被腸管 吸收，屬于此中藥注射劑中潛在的不安全成分，需要對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)估，包括進(jìn)行化學(xué)結(jié) 構(gòu)鑒定和毒理學(xué)試驗(yàn)，以證明其安全性；b)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率小于20%，應(yīng)對(duì)此成分進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，并納入雜質(zhì)控 制檔案；c)若某個(gè)成分的相對(duì)吸收率超過(guò)20%，表明這個(gè)成分可以被腸管有效吸收，屬于該中 藥配方中的安全成分，不需要對(duì)該成分進(jìn)行安全性評(píng)估。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了腸吸收實(shí)驗(yàn)在識(shí)別中藥注射劑所含有的潛在不安全成分中的應(yīng)用。本發(fā)明是將腸吸收實(shí)驗(yàn)方法與液相色譜HPLC指紋圖譜相結(jié)合，首次將藥代動(dòng)力學(xué)方法用于藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。將本發(fā)明應(yīng)用于中藥注射劑的安全性評(píng)估，有助于建立起科學(xué)的、能夠保證中藥注射劑安全的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，解決中藥注射劑產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性和安全性問(wèn)題。
文檔編號(hào)G01N33/15GK101839902SQ20091008039
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者孫悅平 申請(qǐng)人:孫悅平