專利名稱：三維中的亞衍射極限圖像分辨率的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及亞衍射極限圖像分辨率和其它成像技術(shù)，包括三維中的成像。
背景技術(shù)：
在用于非侵入性的時(shí)間分辨的成像的分子和細(xì)胞生物學(xué)以及其它應(yīng)用中廣泛使 用了熒光顯微術(shù)。不管這些優(yōu)點(diǎn)，由于光的衍射所設(shè)置的分辨率極限，標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微術(shù)不 可用于超微結(jié)構(gòu)成像。已使用了幾種方法以試圖越過這種衍射極限，包括近場掃描光學(xué)顯 微術(shù)(NSOM)、受激發(fā)射損耗(STED)、可逆可飽和光學(xué)線性熒光躍遷(RES0LFT)以及飽和的 結(jié)構(gòu)化照明顯微術(shù)(SSIM)，但是每種方法都有某些不令人滿意的限制。電子顯微術(shù)常常用 于生物樣品的高分辨率成像，但是電子顯微術(shù)使用電子而不是光，并且由于其制備需要而 難以與生物樣品一起使用。因此，需要包括非侵入性技術(shù)在內(nèi)的新技術(shù)以利用熒光顯微術(shù) 的益處，以便例如對生物樣品和其它樣品進(jìn)行超分辨率成像，以允許與活體生物樣品的分 子特異性和/或兼容性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一般涉及亞衍射極限圖像分辨率和其它成像技術(shù)，包括三維中的成像。本 發(fā)明的主題在一些情況下涉及互相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)品、對具體問題的替換解決方案和/或一個(gè)或 多個(gè)系統(tǒng)和/或物品的多種不同用途。在一個(gè)方面，本發(fā)明針對的是一種方法。在一組實(shí)施例中，該方法包括以下行動 提供以小于大約IOOOnm的距離分開的第一實(shí)體和第二實(shí)體；確定由所述第一實(shí)體發(fā)射的 光；確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí)體 發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的x、y和ζ位置。該方法在另一組實(shí)施例中 包括以下行動提供以分開的距離分開的第一實(shí)體和第二實(shí)體；確定由所述第一實(shí)體發(fā)射 的光；確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí) 體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的χ、y和ζ位置。根據(jù)還有另一組實(shí)施例，該方法包括以下行動提供以小于大約IOOOnm的距離分 開的第一實(shí)體和第二實(shí)體；激活所述第一實(shí)體但不激活所述第二實(shí)體；確定由所述第一實(shí) 體發(fā)射的光；激活所述第二實(shí)體；確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí)體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的X、y和Z位 置。在還有另一組實(shí)施例中，該方法包括以下行動提供以分開的距離分開的第一實(shí)體和第 二實(shí)體；激活所述第一實(shí)體但不激活所述第二實(shí)體；確定由所述第一實(shí)體發(fā)射的光；激活 所述第二實(shí)體；確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所 述第二實(shí)體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的X、y和Z位置。在一組實(shí)施例中，該方法包括以下行動提供能夠發(fā)射光的多個(gè)實(shí)體(其中的至 少一些以小于大約IOOOnm的距離分開)；激活所述多個(gè)實(shí)體中的一部分以發(fā)射光；確定發(fā) 射的所述光；使所述多個(gè)實(shí)體中的激活部分去激活；以及重復(fù)激活與去激活所述多個(gè)實(shí)體 的行動，以確定所述多個(gè)實(shí)體的χ、y和ζ位置。該方法在還有另一組實(shí)施例中包括以下 行動提供能夠發(fā)射光的多個(gè)實(shí)體；激活所述多個(gè)實(shí)體中的一部分以發(fā)射光；確定發(fā)射的 所述光；使所述多個(gè)實(shí)體中的激活部分去激活；以及重復(fù)激活與去激活所述多個(gè)實(shí)體的行 動，以確定所述多個(gè)實(shí)體的χ、y和ζ位置。在另一個(gè)方面，本發(fā)明針對的是一種實(shí)現(xiàn)在此描述的實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)的方 法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明針對的是一種使用在此描述的實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)的方法。從結(jié)合附圖考慮時(shí)的本發(fā)明的各種非限制性實(shí)施例的以下詳細(xì)描述中，本發(fā)明的 其它優(yōu)點(diǎn)和新穎特征將會變得明顯。在本說明書和通過引用所結(jié)合的文件包括相沖突的和 /或不一致的記載的情況下，以本說明書為準(zhǔn)。如果通過引用所結(jié)合的兩個(gè)或更多文件包括 彼此相沖突的和/或不一致的記載，則以具有較新有效日期的文件為準(zhǔn)。


參考附圖作為例子來描述本發(fā)明的非限制性實(shí)施例，所述附圖是示意性的并且沒 有打算按比例繪制。在附圖中，圖示的每個(gè)等同或近似等同的部件通常用單個(gè)數(shù)字來表示。 為了清楚起見，不是在每個(gè)附圖中都標(biāo)記了每個(gè)部件，而且在不必要進(jìn)行圖示以允許本領(lǐng) 域技術(shù)人員理解本發(fā)明的地方，沒有示出本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施例的每個(gè)部件。在附圖中圖1A-1G圖示了可用于確定實(shí)體在三維中的位置的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例；圖2A-2F圖示了可用于對細(xì)胞進(jìn)行成像的本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例；圖3A-3H圖示了根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例的細(xì)胞的三維成像；圖4A-4D圖示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的各種珠子的三維成像；圖5A-5C圖示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的對細(xì)胞進(jìn)行成像的精確度；以及圖6A-6E圖示了可在本發(fā)明的某些實(shí)施例中使用的各種熒光復(fù)合物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一般涉及亞衍射極限圖像分辨率和其它成像技術(shù)，包括三維中的成像。在 一個(gè)方面，本發(fā)明針對的是對來自以小于入射光的衍射極限的距離分開的兩個(gè)或更多實(shí)體 的光進(jìn)行確定和/或成像。例如，實(shí)體可以以小于大約IOOOnm的距離分開，或者以小于用 于可見光的大約300nm的距離分開。在一些情況下，可以在全部三個(gè)空間維度中(亦即在 x、y和ζ方向上)確定實(shí)體的位置，并且在某些情況下，可以將全部三維中的位置確定到小 于大約IOOOnm的精確度。在一組實(shí)施例中，實(shí)體可以選擇性地激活，亦即可以在不激活其 它實(shí)體的情況下激活一個(gè)實(shí)體以產(chǎn)生光。第一實(shí)體可以被激活并確定(例如通過確定由該
8實(shí)體發(fā)射的光)，然后第二實(shí)體可以被激活并確定。例如通過確定這些實(shí)體的圖像的位置， 并且在一些情況下以亞衍射極限分辨率的方式，可以使用發(fā)射的光來確定第一和第二實(shí)體 的X和y位置。在一些情況下，可以使用多種技術(shù)中的一種來確定Z位置，所述技術(shù)使用強(qiáng) 度信息或聚焦信息(例如缺乏聚焦)來確定Z位置。這樣的技術(shù)的非限制性例子包括像散 成像、失焦成像或多焦平面成像。本發(fā)明的其它方面涉及用于亞衍射極限圖像分辨率的系 統(tǒng)、用于亞衍射極限圖像分辨率的計(jì)算機(jī)程序和技術(shù)以及用于促進(jìn)亞衍射極限圖像分辨率 的方法等。本發(fā)明的一個(gè)方面一般針對的是用于分辨甚至在下述分開距離的兩個(gè)或更多實(shí) 體，所述分開距離小于由實(shí)體發(fā)射的光的波長或者在發(fā)射的光的衍射極限之下。如在此描 述的那樣，實(shí)體的分辨率例如可以在1微米(IOOOnm)或更小的級別上。例如，如果發(fā)射的 光是可見光，則分辨率可以小于大約700nm。在一些情況下，兩個(gè)(或更多)實(shí)體即使以小 于大約500nm、小于大約300nm、小于大約200nm、小于大約lOOnm、小于大約80nm、小于大約 60nm、小于大約50nm或小于大約40nm的距離分開也可以被分辨。在一些情況下，使用本發(fā) 明的實(shí)施例，可以分辨以小于大約20nm或小于IOnm的距離分開的兩個(gè)或更多實(shí)體。實(shí)體可以是能夠發(fā)射光的任何實(shí)體。例如，實(shí)體可以是單個(gè)分子。發(fā)射的實(shí)體的 非限制性例子包括熒光實(shí)體(熒光團(tuán))或磷光實(shí)體，例如花青染料(例如Cy2、Cy3、Cy5、Cy 5. 5、Cy7等)金屬毫微粒子、半導(dǎo)體毫微粒子或“量子點(diǎn)”或者熒光蛋白質(zhì)如綠熒光蛋白質(zhì) (GFP)。其它發(fā)光實(shí)體易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。如在此使用的那樣，術(shù)語“光”一般指的 是具有任何適當(dāng)波長(或者等價(jià)地為頻率)的電磁輻射。例如，在一些實(shí)施例中，光可以包 括光學(xué)或可視范圍內(nèi)的波長(例如具有在大約400nm和大約IOOOnm之間的波長，亦即“可 見光”)、紅外波長(例如具有在大約300微米和700nm之間的波長)或紫外波長(例如具 有在大約400nm和大約IOnm之間的波長)等。在某些情況下，如下面詳細(xì)討論的那樣，可 以使用多于一個(gè)的實(shí)體，亦即(例如在結(jié)構(gòu)方面)在化學(xué)上不同或各別的實(shí)體。然而，在其 它情況下，實(shí)體可以在化學(xué)上等同或者至少基本上在化學(xué)上等同。在一些情況下，實(shí)體中的一個(gè)或多個(gè)是“可切換的”，亦即，實(shí)體可以在兩個(gè)或更多 狀態(tài)之間切換，其中的至少一個(gè)發(fā)射具有期望波長的光。在其它(一個(gè)或多個(gè))狀態(tài)下，實(shí) 體可以不發(fā)射光，或者以不同的波長發(fā)射光。例如，實(shí)體可以被“激活”到能夠產(chǎn)生具有期望 波長的光的第一狀態(tài)，并且被“去激活”到第二狀態(tài)。在一些情況下，這些實(shí)體中的至少一個(gè) 是光可激活的或光可切換的。實(shí)體如果可以由適當(dāng)波長的入射光激活則是“光可激活的”。 實(shí)體如果可以通過不同波長的入射光而在不同的光發(fā)射或非發(fā)射狀態(tài)之間切換則是“光可 切換的”。典型地，“可切換的”實(shí)體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下來識別確定第一狀態(tài) 下的實(shí)體當(dāng)暴露于激發(fā)波長時(shí)可以發(fā)射光的狀況；例如當(dāng)暴露于切換波長的光時(shí)將實(shí)體從 第一狀態(tài)切換到第二狀態(tài)；然后表明該實(shí)體在第二狀態(tài)下時(shí)當(dāng)暴露于激發(fā)波長時(shí)不再能夠 發(fā)射光(或者以減少的強(qiáng)度發(fā)射光)或者以不同的波長發(fā)射光。可切換實(shí)體的例子在下面 詳細(xì)討論，并且還在2008年7月31日作為國際專利申請公布第W02008/091296號公布的 名禾爾為"Sub—DiffractionLimit Image Resolution and Other Imaging Techniques，，白勺 2007年8月7日申請的國際專利申請第PCT/US2007/017618號中進(jìn)行了討論，該國際專利 申請通過引用結(jié)合于此。在一些方面，光可以被處理以確定兩個(gè)或更多實(shí)體的空間位置。在一些情況下，分布在圖像之內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)體的位置每個(gè)可以單獨(dú)確定，并且在一些情況下，實(shí)體的位 置可以以3維的方式確定(亦即以χ、y和ζ維的方式，其中，ζ維是成像系統(tǒng)的光軸的方 向，并且χ和y維垂直于ζ方向且相互垂直)。在一組實(shí)施例中，可以使用高斯擬合或其它 適當(dāng)技術(shù)來處理發(fā)射的光，以定位發(fā)射實(shí)體中的每一個(gè)的位置。一種適當(dāng)?shù)母咚箶M合技術(shù) 的細(xì)節(jié)在下面的例子中描述；本領(lǐng)域技術(shù)人員將會能夠識別具有本公開所帶來的益處的其 它適當(dāng)?shù)膱D像處理技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，隨后是圖像處理技術(shù)的另一個(gè)例子。以一系列的樣 品圖像(例如電影)開始，識別每個(gè)光發(fā)射峰值(例如通過熒光、磷光等)，并且確定峰值所 在的時(shí)間。例如，峰值可以相對于時(shí)間以近似相同的強(qiáng)度存在于一系列圖像中。峰值在一 些情況下可以擬合到高斯和/或橢圓高斯函數(shù)以確定它們的重心位置、強(qiáng)度、寬度和/或橢 圓率?；谶@些參數(shù)，在某些情況下可以從進(jìn)一步的分析中排除太暗、太寬、太斜等而不能 得到令人滿意的定位精確度的峰值。還可以丟棄零星、移動、不連續(xù)存在等的峰值。例如將 最小二乘擬合用于峰值強(qiáng)度的2維高斯函數(shù)，通過確定峰值的中心位置，可以確定峰值的 源(例如在此討論的能夠發(fā)射光的任何一個(gè)或多個(gè)實(shí)體)的位置。當(dāng)對于樣品之內(nèi)的峰值 中的任何一個(gè)或全部而言必要時(shí)，可以重復(fù)這個(gè)過程。在一組實(shí)施例中，可以以小于入射光的衍射極限的分辨率來確定實(shí)體的ζ位置。 例如，對于可見光而言，可以以小于大約800nm、小于大約500nm、小于大約200nm、小于大約 lOOnm、小于大約50nm、小于大約20nm或小于大約IOnm的分辨率來確定實(shí)體的ζ位置。可 以使用能夠確定實(shí)體ζ位置的任何顯微技術(shù)，例如可以使用像散成像、失焦成像、多焦平面 成像、共焦顯微術(shù)或雙光子顯微術(shù)等。在一些情況下，實(shí)體可以被定位且成像以使得實(shí)體不 表現(xiàn)為單個(gè)光點(diǎn)，而是表現(xiàn)為具有某個(gè)面積的圖像，例如表現(xiàn)為輕微未分辨的或未聚焦的 圖像。作為例子，實(shí)體可以由透鏡或檢測器系統(tǒng)成像，所述透鏡或檢測器系統(tǒng)限定了不包含 該實(shí)體的一個(gè)或多個(gè)聚焦區(qū)(例如一個(gè)或多個(gè)焦平面)，使得實(shí)體在檢測器處的圖像表現(xiàn) 為未聚焦。實(shí)體表現(xiàn)為未聚焦的程度可以用來確定實(shí)體與聚焦區(qū)中之一之間的距離，這然 后可以用來確定實(shí)體的ζ位置。在一個(gè)實(shí)施例中，可以使用像散成像來確定ζ位置。可以使用相對于實(shí)體所發(fā)射 的光穿過透鏡的方向非圓對稱的透鏡。例如，透鏡可以是圓柱形(如圖IA所示)或橢圓形 等。在一些情況下，透鏡可以在不同的平面中具有不同的曲率半徑。由實(shí)體發(fā)射的光在穿 過包括這種非圓對稱透鏡的成像光學(xué)系統(tǒng)之后可以在檢測器處表現(xiàn)為圓形或橢圓形。圖像的尺寸和橢圓率在一些情況下可以用來確定實(shí)體與透鏡或檢測器的聚焦區(qū) 之間的距離，這然后可以用來確定ζ位置。作為非限制性的例子，如圖IB所示，在焦點(diǎn)上 (z = Onm)的圖像表現(xiàn)為圓形，而在焦點(diǎn)外的圖像則日益表現(xiàn)為橢圓形(ζ = 士 200nm或 士400nm)，其中橢圓率的方向指示了實(shí)體是在聚焦區(qū)之上還是之下。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以使用失焦成像來確定ζ位置。未處在由用于對實(shí)體進(jìn)行 成像的透鏡或檢測器系統(tǒng)所限定的聚焦區(qū)之一中的實(shí)體可以表現(xiàn)為未聚焦，并且圖像表現(xiàn) 為未聚焦的程度可以用來確定實(shí)體與透鏡的聚焦區(qū)之間的距離，這然后可以用來確定ζ位 置。在一些情況下，未聚焦實(shí)體的圖像可以表現(xiàn)為一般圓形(其中面積指示實(shí)體與透鏡的 聚焦區(qū)之間的距離)，并且在一些實(shí)例中，未聚焦實(shí)體的圖像可以表現(xiàn)為一系列環(huán)狀結(jié)構(gòu)， 其中更多的環(huán)指示更大的距離。
10
在一些實(shí)施例中，例如使用多焦平面成像，由實(shí)體發(fā)射的光可以由多個(gè)檢測器收 集。在一些情況下，在檢測器中的一個(gè)或多個(gè)處，光可以表現(xiàn)為未聚焦。圖像表現(xiàn)為未聚焦 的程度可以用來確定ζ位置。在本發(fā)明的適當(dāng)?shù)膱D像處理技術(shù)的另一個(gè)非限制性例子中，一系列的樣品圖像 (例如電影)可以包括激活幀(例如其中激活光接通)和成像幀(例如其中成像光接通) 的重復(fù)序列。對于成像幀中的一個(gè)或多個(gè)而言，每個(gè)幀上的熒光峰值可以被確定，以確定它 們的位置、強(qiáng)度、寬度、橢圓率等?；谶@些參數(shù)，可以從進(jìn)一步的分析中排除太暗、太寬、太 斜等而不能得到令人滿意的定位精確度的峰值。在一些情況下還可以丟棄零星、移動、不連 續(xù)存在等的峰值。通過確定峰值的中心位置、形狀和/或尺寸，可以確定峰值的源(例如在 此討論的能夠發(fā)射光的任何一個(gè)或多個(gè)實(shí)體)的位置。在一些情況下，可以以3維的方式 確定位置。當(dāng)對于樣品之內(nèi)的峰值中的任何一個(gè)或全部而言必要時(shí)，還可以重復(fù)這個(gè)過程。其它圖像處理技術(shù)也可以用來便利于實(shí)體的確定，例如可以使用漂移校正或噪聲 濾波器。一般地，在漂移校正中，例如固定點(diǎn)被識別(例如，作為置信標(biāo)志器，例如熒光粒子 可以固定到基片)，并且固定點(diǎn)的移動(亦即由于機(jī)械漂移)被用來校正可切換實(shí)體的確 定位置。在用于漂移校正的另一個(gè)例子中，在不同的成像幀或激活幀中獲取的圖像之間的 相關(guān)函數(shù)可以被計(jì)算并用于漂移校正。在一些實(shí)施例中，漂移可以小于大約lOOOnm/min、 小于大約500nm/min、小于大約300nm/min、小于大約100nm/min、小于大約50nm/min、小于 大約30nm/min、小于大約20nm/min、小于大約10nm/min或小于大約5nm/min。這樣的漂移 例如可以在具有平移臺的顯微鏡中實(shí)現(xiàn)，所述平移臺被安裝用于對樣品載玻片相對于顯微 鏡物鏡進(jìn)行x_y定位。使用適當(dāng)?shù)募s束機(jī)構(gòu)例如彈簧加載夾，可以使載玻片相對于平移臺 固定。另外，可以在臺子和顯微鏡載玻片之間安裝緩沖層。例如通過防止載玻片以某種方 式滑動，緩沖層可以進(jìn)一步約束載玻片相對于平移臺漂移。在一個(gè)實(shí)施例中，緩沖層是橡膠 或聚合物膜例如硅橡膠膜。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例針對的是一種裝置，該裝置包括平 移臺；約束機(jī)構(gòu)(例如彈簧加載夾)，其附接到所述平移臺，能夠使載玻片固定；以及可選地 緩沖層(例如硅橡膠膜)，其定位成使得通過所述約束機(jī)構(gòu)約束的載玻片接觸所述緩沖層。 為了使顯微鏡聚焦在數(shù)據(jù)獲取期間穩(wěn)定，在一些情況下可以使用“聚焦鎖定”裝置。作為非 限制性的例子，為了實(shí)現(xiàn)聚焦鎖定，可以從保持樣品的基片反射激光束，并且可以將反射的 光引導(dǎo)到位置感測檢測器例如象限光電二極管上。在一些情況下，反射的激光的位置(其 可以對基片和物鏡之間的距離敏感)可以被反饋到ζ定位級例如壓電級，以便對聚焦漂移 進(jìn)行校正。在一組實(shí)施例中，可以使用可切換的實(shí)體。可切換的實(shí)體的非限制性例子在2008 年7月31日作為國際專利申請公布第W02008/091296號公布的名稱為“Sub-Diffraction Limit Image Resolution andOther ImagingTechniques" ^ 2007 ^Ξ 8 ^ 7 H ^itWH^ 專利申請第PCT/US2007/017618號中進(jìn)行了討論，該國際專利申請通過引用結(jié)合于此。作 為可切換的實(shí)體的非限制性例子，Cy5可以通過不同波長的光以受控和可逆的方式在熒光 和黑暗狀態(tài)之間切換，例如633nm或657nm的紅光可以將Cy5切換或去激活至穩(wěn)定的黑暗 狀態(tài)，而532nm的綠光則可以將Cy5切換或激活返回到熒光狀態(tài)?？汕袚Q的實(shí)體的其它非 限制性例子包括光可激活的或光可切換的熒光蛋白質(zhì)或者光可激活的或光可切換的無機(jī) 粒子，如在此討論的那樣。在一些情況下，例如當(dāng)暴露于適當(dāng)?shù)拇碳ぴ磿r(shí)，實(shí)體可以可逆地在兩個(gè)或更多狀態(tài)之間切換。例如，第一刺激源(例如第一波長的光)可以用來激活可切 換的實(shí)體，而第二刺激源(例如第二波長的光)可以用來將可切換的實(shí)體例如去激活至非 發(fā)射的狀態(tài)。任何適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎梢杂脕砑せ顚?shí)體。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，適當(dāng)波長的入 射光可以用來激活實(shí)體以發(fā)射光，亦即實(shí)體是光可切換的。這樣一來，光可切換的實(shí)體就可 以例如通過不同波長的入射光而在不同的光發(fā)射或非發(fā)射狀態(tài)之間切換。光可以是單色的 (例如使用激光產(chǎn)生)或多色的。在另一個(gè)實(shí)施例中，實(shí)體可以在受到電場和/或磁場刺 激時(shí)被激活。在其它實(shí)施例中，實(shí)體可以在暴露于適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)環(huán)境時(shí)被激活，例如通過調(diào)整 PH或者引發(fā)涉及實(shí)體的可逆化學(xué)反應(yīng)等來激活。類似地，任何適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎梢杂脕砣ゼ?活實(shí)體，并且激活和去激活實(shí)體的方法不需要相同。例如，實(shí)體可以在暴露于適當(dāng)波長的入 射光時(shí)被去激活，或者實(shí)體可以通過等待足夠時(shí)間來去激活。在一些實(shí)施例中，可切換的實(shí)體包括第一光發(fā)射部分(例如熒光團(tuán))和對第 一部分進(jìn)行激活或“切換”的第二部分。例如，當(dāng)暴露于光時(shí)，可切換的實(shí)體的第二部分 可以激活第一部分，使第一部分發(fā)射光。激活器部分的例子包括但不限于Alexa Fluor 405 (Invitrogen) > Alexa 488 (Invitrogen) > Cy2 (GE Healthcare)、Cy3 (GE Healthcare)、 Cy3. 5 (GEHealthcare)或Cy5 (GE Healthcare)或其它適當(dāng)?shù)娜玖?。光發(fā)射部分的例 子包括但不限于 Cy5、Cy5. 5 (GE Healthcare)或 Cy7 (GE Healthcare)、Alexa Fluor 647 (Invitrogen)或其它適當(dāng)?shù)娜玖?。這些可以例如直接地或者通過鏈接器例如共價(jià)地 鏈接在一起，例如形成復(fù)合物，諸如但不限于Cy5-Alexa Fluor 405、Cy5_Alexa Fluor 488、Cy5-Cy2、Cy5_Cy3、Cy5-Cy3. 5、Cy5. 5-Alexa Fluor 405、Cy5. 5-Alexa Fluor 488、 Cy5. 5_Cy2、Cy5. 5_Cy3、Cy5. 5_Cy3. 5、Cy7_Alexa Fluor 405、Cy7_Alexa Fluor 488、 Cy7-Cy2、Cy7-Cy3、Cy7_Cy3. 5 或 Cy7_Cy5。Cy3、Cy5、Cy5. 5 和 Cy 7 的結(jié)構(gòu)示出在圖 6 中， 其中Cy3-Cy5的鏈接版本的非限制性例子示出在圖6E中；本領(lǐng)域技術(shù)人員將會明白這些以 及其它復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，其中的許多種都是商業(yè)上可得的。任何適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎梢杂脕礞溄拥谝还獍l(fā)射部分和第二激活部分。在一些情況 下，鏈接器可以被選擇成使得第一和第二部分之間的距離足夠近，以允許例如無論何時(shí)光 發(fā)射部分已以某種方式被去激活，激活器部分都可以如期望的那樣激活光發(fā)射部分。典型 地，這些部分將會以500nm或以下的數(shù)量級的距離被分開，例如小于大約300nm、小于大約 lOOnm、小于大約50nm、小于大約20nm、小于大約10nm、小于大約5nm、小于大約2nm、小于大 約Inm等。鏈接器的例子包括但不限于碳鏈(例如鏈烷或鏈烯)或聚合物單元等。在某些情況下，光發(fā)射部分和激活器部分在彼此隔離時(shí)每個(gè)都可以是熒光團(tuán)，亦 即當(dāng)暴露于刺激源例如激發(fā)波長時(shí)可以發(fā)射某種發(fā)射波長的光的實(shí)體。然而，當(dāng)可切換的 實(shí)體被形成為包括第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)時(shí)，第一熒光團(tuán)形成第一光發(fā)射部分，并且第 二熒光團(tuán)形成激活器部分，該激活器部分響應(yīng)于刺激源而對第一部分進(jìn)行激活或“切換”。 例如，可切換的實(shí)體可以包括直接鍵合到第二熒光團(tuán)的第一熒光團(tuán)，或者第一和第二實(shí)體 可以經(jīng)由鏈接器或公共實(shí)體連接?？梢酝ㄟ^對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知的方法來測 試一對光發(fā)射部分和激活器部分是否產(chǎn)生了適當(dāng)?shù)目汕袚Q的實(shí)體。例如，各種波長的光可 以用來刺激這一對，并且可以測量來自光發(fā)射部分的發(fā)射光以確定這一對是否進(jìn)行了適當(dāng) 的切換。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種光發(fā)射可切換的實(shí)體，該實(shí)體包括第一光發(fā)射部分和第二激活部分。該實(shí)體具有由第一光發(fā)射部分確定的最大發(fā)射波長和由第 二激活部分確定的最大激活波長。值得注意地，這兩個(gè)波長不是由同一分子實(shí)體控制，并且 被有效地去耦。在一些情況下，同一波長的光既可以用于將發(fā)射部分激活到熒光狀態(tài)，又可 以用于從發(fā)射部分激發(fā)發(fā)射并去激活發(fā)射部分。進(jìn)一步，可以獨(dú)立地確定樣品之內(nèi)的多種 類型的可切換的實(shí)體。例如，具有相同激活器部分但是不同光發(fā)射部分的兩種可切換的實(shí) 體可以由施加到樣品的同一波長的光激活，但是由于不同的光發(fā)射部分而以不同的波長發(fā) 射，并且即使處在小于亞衍射極限分辨率的分開距離也可以容易地區(qū)別。這可以有效地在 圖像中得到兩種顏色。類似地，具有相同光發(fā)射部分但是不同激活器部分的兩種可切換的 實(shí)體由于不同的激活器部分而可以由施加到樣品的不同波長的光激活，并且光發(fā)射部分可 以以相同的波長發(fā)射，而且這樣一來即使處在小于亞衍射極限分辨率的分開距離也可以進(jìn) 行區(qū)分。這也可以有效地在圖像中得到兩種顏色。當(dāng)這些方法進(jìn)行結(jié)合時(shí)，可以容易地產(chǎn) 生四種(或更多)顏色的圖像。使用這個(gè)原理，取決于可切換的和/或激活器實(shí)體，多種顏 色成像可以攀升至6種顏色、9種顏色等。這個(gè)多種顏色成像的原理還可以與在此描述的成 像方法一起使用以得到亞衍射極限分辨率(在一些情況下是在全部三維中)，并且/或者用 來使用不限于亞衍射極限分辨率的其它成像方法來獲得多種顏色的圖像。在一些實(shí)施例中，如上所述的第一光發(fā)射部分和第二激活部分可以不直接共價(jià)鍵 合或經(jīng)由鏈接器鏈接，而是相對于公共實(shí)體每個(gè)固定不動。在其它實(shí)施例中，在本發(fā)明的一 些方面，可切換的實(shí)體(其中的一些在某些情況下可以包括直接鏈接在一起或者通過鏈接 器鏈接在一起的第一光發(fā)射部分和第二激活部分)中的兩個(gè)或更多可以相對于公共實(shí)體 固定不動。這些實(shí)施例中的任何一個(gè)中的公共實(shí)體可以是任何的非生物實(shí)體或生物實(shí)體例 如細(xì)胞、組織、基片、表面、聚合物、生物分子如核酸(DNA、RNA、PNA或LNA等)、脂質(zhì)分子、蛋 白質(zhì)或多肽或類似物、生物分子配合物或生物結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞器、微管、內(nèi)涵蛋白涂敷的凹陷寸。在一組實(shí)施例中，可切換的實(shí)體可以相對于綁定伙伴(亦即可以經(jīng)歷與特定分析 物綁定的分子)例如共價(jià)地固定不動。綁定伙伴包括如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的專用、半專 用或非專用的綁定伙伴。術(shù)語“特定綁定”當(dāng)指稱綁定伙伴(例如蛋白質(zhì)、核酸、抗體等)時(shí) 指的是下述反應(yīng)，該反應(yīng)確定了異質(zhì)分子(例如蛋白質(zhì)和其它生物制品)混合物中的綁定 對中的一個(gè)或另一個(gè)成員存在與否和/或其身份。這樣一來，例如，在受體/配體綁定對的 情況下，配體會特定地和/或優(yōu)選地從分子的復(fù)雜混合物中選擇它的受體，反之亦然。其它 例子包括但不限于酶會特定地綁定到它的基片；核酸會特定地綁定到它的補(bǔ)體；以及抗 體會特定地綁定到它的抗原。綁定可以通過多種機(jī)制中的一種或多種而包括但不限于離子 相互作用和/或共價(jià)相互作用和/或疏水性相互作用和/或范德瓦爾斯相互作用等。通過 使可切換的實(shí)體相對于目標(biāo)分子或結(jié)構(gòu)(例如細(xì)胞之內(nèi)的蛋白質(zhì)或DNA)的綁定伙伴固定 不動，可切換的實(shí)體可以用于各種確定或成像目的。例如，具有胺反應(yīng)基的可切換的實(shí)體可 以與包括胺例如抗體、蛋白質(zhì)或酶的綁定伙伴起反應(yīng)。在一些實(shí)施例中，可以使用多于一種的可切換的實(shí)體，并且實(shí)體可以相同或不同。 在一些情況下，由第一實(shí)體發(fā)射的光和由第二實(shí)體發(fā)射的光具有相同波長。實(shí)體可以在不 同的時(shí)間激活，并且可以分開確定來自每個(gè)實(shí)體的光。這允許兩個(gè)實(shí)體的位置被分開確定， 并且在一些情況下，如下面詳細(xì)討論的那樣，甚至可以以小于由實(shí)體發(fā)射的光的波長的分開距離或者在發(fā)射的光的衍射極限之下的分開距離(亦即“亞衍射極限”分辨率)來對兩 個(gè)實(shí)體進(jìn)行空間分辨。在某些實(shí)例中，由第一實(shí)體發(fā)射的光和由第二實(shí)體發(fā)射的光具有不 同的波長(例如，如果第一實(shí)體和第二實(shí)體在化學(xué)上不同，并且/或者位于不同的環(huán)境下)。 即使處在小于由實(shí)體發(fā)射的光的波長的分開距離或者在發(fā)射的光的衍射極限之下的分開 距離，也可以對實(shí)體進(jìn)行空間分辨。在某些實(shí)例中，由第一實(shí)體發(fā)射的光和由第二實(shí)體發(fā)射 的光具有基本上相同的波長，但這兩個(gè)實(shí)體可以由不同波長的光激活，并且可以分開確定 來自每個(gè)實(shí)體的光。即使處在小于由實(shí)體發(fā)射的光的波長的分開距離或者在發(fā)射的光的衍 射極限之下的分開距離，也可以對實(shí)體進(jìn)行空間分辨。在一些情況下，實(shí)體可以獨(dú)立地可切換，亦即，可以在不激活第二實(shí)體的情況下激 活第一實(shí)體以發(fā)射光。例如，如果實(shí)體不同，則對第一和第二實(shí)體中的每一個(gè)進(jìn)行激活的方 法可以不同(例如，實(shí)體每個(gè)可以使用不同波長的入射光來進(jìn)行激活)。作為另一個(gè)非限制 性的例子，如果實(shí)體基本上相同，則可以將足夠弱的強(qiáng)度施加到實(shí)體，以使得只有入射光之 內(nèi)的實(shí)體的子集或一部分被激活(亦即在隨機(jī)的基礎(chǔ)上)。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)技 巧就可以確定用于激活的特定強(qiáng)度。通過適當(dāng)選擇入射光的強(qiáng)度，可以在不激活第二實(shí)體 的情況下激活第一實(shí)體。作為另一個(gè)非限制性的例子，將要成像的樣品可以包括多個(gè)實(shí)體， 其中的一些基本上等同而其中的一些基本上不同。在這種情況下，可以將上述方法中的一 種或多種應(yīng)用于對實(shí)體進(jìn)行獨(dú)立切換。由實(shí)體中的每一個(gè)發(fā)射的光例如可以被確定為圖像或矩陣。例如，第一實(shí)體可以 被激活且由第一實(shí)體發(fā)射的光被確定，并且第二實(shí)體可以被激活(在去激活或者不去激活 第一實(shí)體的情況下)且由第二實(shí)體發(fā)射的光可以被確定。由多個(gè)實(shí)體中的每一個(gè)發(fā)射的光 可以處在相同或不同的波長。任何適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎梢杂脕泶_定發(fā)射的光。例如，光的檢測器 例如可以是攝影機(jī)如CCD攝影機(jī)、光電二極管、光電二極管陣列、光電倍增器、光電倍增器 陣列或分光計(jì)等；本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)。在一些情況下，可以使用多于一 個(gè)的檢測器，并且檢測器每個(gè)可以獨(dú)立地相同或不同。在一些情況下，例如可以使用多個(gè)圖 像(或其它確定)以提高分辨率和/或減少噪聲。例如，取決于應(yīng)用，可以確定至少兩個(gè)、 至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少75個(gè)、至少100個(gè)等圖像。在一些情況下，可以將具有足夠弱的強(qiáng)度的入射光施加到多個(gè)實(shí)體，以使得例如 在隨機(jī)的基礎(chǔ)上只有入射光之內(nèi)的實(shí)體的子集或一部分被激活。激活的量可以是任何適 當(dāng)?shù)囊徊糠?，例如取決于應(yīng)用，大約0. 1%、大約0. 3%、大約0. 5%、大約1%、大約3%、大 約5%、大約10%、大約15%、大約20%、大約25%、大約30%、大約35%、大約40%、大約 45%、大約50%、大約55%、大約60%、大約65%、大約70%、大約75%、大約80%、大約 85%、大約90%或大約95%的實(shí)體可以被激活。例如，通過適當(dāng)選擇入射光的強(qiáng)度，實(shí)體的 稀疏子集可以被激活，以使得它們中的至少一些彼此在光學(xué)上可分辨，并且它們的位置可 以被確定。在一些實(shí)施例中，通過施加持續(xù)時(shí)間短的入射光，可以使實(shí)體子集激活同步化。 重復(fù)激活循環(huán)可以允許實(shí)體中的全部的位置或者實(shí)體的基本部分的位置被確定。在一些情 況下，可以使用這個(gè)信息來構(gòu)造具有亞衍射極限分辨率的圖像。樣品上的多個(gè)位置每個(gè)都可以被分析以確定那些位置之內(nèi)的實(shí)體。例如，樣品可 能包含多個(gè)不同實(shí)體，其中的一些處在小于由實(shí)體發(fā)射的光的波長的分開距離或者在發(fā)射 的光的衍射極限之下的分開距離。樣品之內(nèi)的不同位置可以被確定(例如作為圖像之內(nèi)的不同像素)，并且那些位置中的每一個(gè)被獨(dú)立地分析以確定那些位置之內(nèi)存在的一個(gè)或多 個(gè)實(shí)體。在一些情況下，如前面討論的那樣，每個(gè)位置之內(nèi)的實(shí)體可以被確定至小于由實(shí)體 發(fā)射的光的波長或者在發(fā)射的光的衍射極限之下的分辨率。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，還可以作為時(shí)間的函數(shù)來對實(shí)體進(jìn)行分辨。例如，可以 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察兩個(gè)或更多實(shí)體以確定時(shí)變過程例如化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞行為、蛋白質(zhì)或酶 的綁定等。這樣一來，在一個(gè)實(shí)施例中，就可以在第一時(shí)間點(diǎn)(例如在此描述的那樣)以及 在任何數(shù)目的隨后時(shí)間點(diǎn)確定兩個(gè)或更多實(shí)體的位置。作為特定的例子，如果兩個(gè)或更多 實(shí)體相對于公共實(shí)體被固定不動，那么公共實(shí)體就可以被確定作為時(shí)間的函數(shù)，例如時(shí)變 過程如公共實(shí)體的移動、公共實(shí)體的結(jié)構(gòu)和/或配置變化或者涉及公共實(shí)體的反應(yīng)等。由 于可切換的實(shí)體可以針對多個(gè)循環(huán)被切換，每個(gè)循環(huán)給出實(shí)體位置的一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，所以在 一些情況下時(shí)間分辨的成像可能是便利的。本發(fā)明的另一個(gè)方面針對的是計(jì)算機(jī)實(shí)施的方法。例如，可以提供計(jì)算機(jī)和/或 自動化系統(tǒng)，其能夠自動地和/或重復(fù)地執(zhí)行在此描述的方法中的任何一種。如在此使用 的那樣，“自動化”裝置指的是能夠在無人指引的情況下進(jìn)行操作的裝置，亦即，例如通過 將指令輸入到計(jì)算機(jī)中，在任何人已完成采取任何行動以對功能進(jìn)行促進(jìn)之后的時(shí)間段期 間，自動化裝置可以執(zhí)行該功能。典型地，自動化設(shè)備在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后可以執(zhí)行重復(fù)的功 能。在一些情況下處理步驟也可以記錄到機(jī)器可讀的介質(zhì)上。本發(fā)明的還有另一個(gè)方面一般針對的是能夠執(zhí)行在此描述的實(shí)施例中的一個(gè)或 多個(gè)的系統(tǒng)。例如，該系統(tǒng)可以包括顯微鏡；用于對實(shí)體進(jìn)行激活和/或切換以產(chǎn)生具有 期望波長的光(例如激光或其它光源)的裝置；用于確定由實(shí)體發(fā)射的光的裝置(例如攝 影機(jī)，其可以包括顏色過濾裝置如濾光器)；以及計(jì)算機(jī)，用于確定兩個(gè)或更多實(shí)體的空間 位置。在一些情況下，反射鏡(諸如二向色鏡或多向色鏡)、棱鏡、透鏡或衍射光柵等可以被 定位以引導(dǎo)來自光源的光。在一些情況下，光源可以是時(shí)間調(diào)制的(例如通過快門或聲光 調(diào)制器等)。這樣一來，光源就可以是以編程或周期的方式可激活和可去激活的光源。在一 個(gè)實(shí)施例中，例如可以使用多于一個(gè)的光源，其可以用來以不同的波長或顏色照射樣品。例 如，光源可以以不同的頻率發(fā)出光，并且/或者顏色過濾裝置如濾光器等可以用來修改來 自光源的光，使得不同的波長或顏色照射樣品。在一些實(shí)施例中，顯微鏡可以配置成收集由可切換的實(shí)體發(fā)射的光，同時(shí)使來自 其它熒光源的光(例如“背景噪聲”)最小化。在某些情況下，成像幾何形狀諸如但不限于 全內(nèi)反射幾何形狀、旋轉(zhuǎn)盤共焦幾何形狀、掃描共焦幾何形狀、落射熒光幾何形狀等可以用 于樣品激發(fā)。在一些實(shí)施例中，將樣品的薄層或平面暴露于激發(fā)光，這可以減少樣品平面之 外的熒光的激發(fā)。高數(shù)值孔徑的透鏡可以用來收集由樣品發(fā)射的光。例如可以使用過濾器 來對光進(jìn)行處理以去除激發(fā)光，得到對來自樣品的發(fā)射光的收集。在一些情況下，例如當(dāng)圖 像的每個(gè)像素的邊緣長度對應(yīng)于圖像中的衍射極限斑點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的長度時(shí)，可以優(yōu)化收 集圖像的放大倍數(shù)。在一些情況下，計(jì)算機(jī)可以用來控制可切換的實(shí)體的激發(fā)以及可切換的實(shí)體的圖 像獲取。在一組實(shí)施例中，可以使用具有各種波長和/或強(qiáng)度的光來激發(fā)樣品，并且可以使 用計(jì)算機(jī)將用于激發(fā)樣品的光的波長的序列與包含可切換的實(shí)體的樣品的獲取圖像相關(guān) 聯(lián)。例如，計(jì)算機(jī)可以將具有各種波長和/或強(qiáng)度的光施加到樣品，以得到所關(guān)心的每個(gè)區(qū)域中的不同平均數(shù)的被激活的可切換要素(例如每個(gè)位置一個(gè)被激活的實(shí)體、每個(gè)位置兩 個(gè)被激活的實(shí)體等)。在一些情況下，如上面提到的那樣，這個(gè)信息可以用于在一些情況下 以亞衍射極限分辨率來構(gòu)造可切換的實(shí)體的圖像。在本發(fā)明的其它方面，在此描述的系統(tǒng)和方法還可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的其 它成像技術(shù)相結(jié)合，比如高分辨率熒光原位混合(FISH)或免疫熒光成像、活體細(xì)胞成像、 共焦成像、落射熒光成像、全內(nèi)反射熒光成像等。以下文件通過引用結(jié)合于此在2008年7月31日作為美國專利申請公布第 2008/0182336"Sub-Diffraction Image Resolutionand Other Imaging Techniques”的2008年2月1日申請的美國專利申請序列第12/012，524號；在2008年7月 31日作為國際專利申請公布第W02008/091296號公布的名稱為‘‘Sub-Diffraction Limit ImageResolution and Other Imaging Techniques"^ 2007 ^ 8 7 日串i青白勺fflP示 禾 串 請第PCT/US2007/017618號；在2008年2月7日作為美國專利申請公布第2008/0032414 號公布的名禾爾為"Sub-Diffraction ImageResolution and Other Imaging Techniques，，的 2006年11月29日申請的美國專利申請序列第11/605,842號；名稱為‘‘Sub-Diffraction ImageResolution”的2006年8月7日申請的美國臨時(shí)專利申請序列第60/836，167號；名 稱為‘‘Sub-Diffraction Image Resolution”的2006年8月8日申請的美國臨時(shí)專利申請 序列第 60/836，170 號；以及名稱為"Sub-DiffractionLimit Image Resolution in Three Dimensions”的2007年12月21日申請的美國臨時(shí)專利申請序列第61/008，661號。以下例子旨在示意本發(fā)明的某些實(shí)施例，而不是示范本發(fā)明的全部范圍。例子 1這個(gè)例子展示了在不發(fā)動樣品或光束掃描的情況下具有在全部三維中都比衍射 極限好大約10倍的空間分辨率的3維成像。在通過引用結(jié)合于此的2008年7月31日作 為國際專利申請公布第W02008/091296號公布的名稱為‘‘Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other ImagingTechniques”的2007年8月7日申請的國際專利申請第 PCT/US2007/017618號中，某些熒光團(tuán)的光可切換性質(zhì)被用來分開眾多分子的空間重疊的 圖像，并且在針對單獨(dú)熒光染料的橫向維度中實(shí)現(xiàn)了高程度的定位。然而，這個(gè)例子以及隨后的例子示意了通過以下進(jìn)行的全部三維中的成像對光 可切換探測劑的光學(xué)可分辨子集進(jìn)行隨機(jī)激活；以高精確度確定每個(gè)探測劑的坐標(biāo)；以及 通過多重激活循環(huán)來構(gòu)造三維高分辨率圖像。在一些情況下，當(dāng)粒子(或其它適當(dāng)對象)的 橫向位置可以根據(jù)其圖像的重心來確定時(shí)，圖像的形狀也可以包含關(guān)于粒子的軸向或ζ位 置的信息。這個(gè)例子使用像散成像來實(shí)現(xiàn)三維成像，然而在其它情況下可以使用包括但不限 于失焦成像和多焦平面成像等的其它技術(shù)。為此目的，弱圓柱形透鏡被引入到成像路徑中， 以產(chǎn)生用于χ和y方向的兩個(gè)略微不同的焦平面(圖1A)。這個(gè)附圖示出了單獨(dú)熒光團(tuán)的 三維定位。簡化的光學(xué)示示了通過將圓柱形透鏡引入到成像路徑中根據(jù)其圖像的橢圓 率來確定熒光對象的ζ坐標(biāo)的原理。右邊的面板示出了處在各種ζ位置的熒光團(tuán)的圖像。結(jié)果，熒光團(tuán)的圖像的橢圓率和取向隨著它在ζ方面的位置變化而改變當(dāng)熒光 團(tuán)處在平均焦平面(近似在χ和y焦平面之間的半途，其中點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)在χ和y方 向上具有基本上相等的寬度)中時(shí)，圖像表現(xiàn)為圓形；當(dāng)熒光團(tuán)處在平均焦平面之上時(shí)，它
16的圖像與在χ方向上相比更加聚焦在y方向上，并從而表現(xiàn)為其長軸沿著χ的橢圓形；相反 地，當(dāng)熒光團(tuán)處在焦平面之下時(shí)，圖像表現(xiàn)為其長軸沿著y的橢圓形。通過將圖像與二維橢 圓高斯函數(shù)擬合，可以獲得峰值位置的χ和y坐標(biāo)以及峰值寬度和 ，它們又允許熒光 團(tuán)的ζ坐標(biāo)被確定。為了在實(shí)驗(yàn)上生成作為ζ的函數(shù)的Wx和Wy的校準(zhǔn)曲線，Alexa 647標(biāo)記的抗生蛋 白鏈菌素分子被固定在玻璃表面上，并且單獨(dú)的分子被成像以確定當(dāng)樣品在ζ上掃描時(shí)的 Wx和Wy的值(圖1C)。圖IC是在這個(gè)例子中從單個(gè)Alexa 647分子獲得的作為ζ的函數(shù) 的圖像寬度Wx和Wy的校準(zhǔn)曲線。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表從6個(gè)分子獲得的平均值。如下所述，數(shù) 據(jù)被擬合到散焦函數(shù)(紅色曲線)。在這個(gè)圖像分析中，每個(gè)光激活的熒光團(tuán)的ζ坐標(biāo)通過將測量的其圖像的Wx和Wy 值與校準(zhǔn)曲線相比較來確定。另外，對于浸入玻璃基片上的水溶液中的樣品，所有的X定位 都以0. 79的因數(shù)重新定標(biāo)，以計(jì)入玻璃和水之間的折射率失配(另外的細(xì)節(jié)可參見下文)。在一些情況下，這個(gè)例子中的技術(shù)的三維分辨率由下述精確度限制，使用所述 精確度，可以在切換循環(huán)期間在全部三維中定位單獨(dú)的光可切換的熒光團(tuán)。通過引用結(jié) 合于此的2008年7月31日作為國際專利申請公布第W02008/091296號公布的名稱為 “Sub-Diffraction Limit ImageResolution and Other Imaging Techniques，，白勺 2007 年 8月7日申請的國際專利申請第PCT/US2007/017618號公開了一族光可切換的花青染料 (Cy5、Cy5. 5、Cy7和Alexa Fluor 647)，它們可以通過不同波長的光在熒光和黑暗狀態(tài)之 間可逆地循環(huán)。這些光可切換的“指示器”的再激活效率關(guān)鍵取決于“激活器”染料的接近 程度，所述“激活器”染料可以是多種染料分子(例如Cy3、Cy2、Alexa Fluor 405)中的任 何一種。在這個(gè)具體的例子中，Cy3和Alexa 647用作激活器和指示器對以執(zhí)行成像。紅 色激光(657nm)被用來對Alexa 647分子進(jìn)行成像并將它們?nèi)ゼせ钪梁诎禒顟B(tài)，而綠色激 光(532nm)則被用來再激活熒光團(tuán)。在持久光致退色發(fā)生之前，每個(gè)激活器-指示器對可 以循環(huán)接通和斷開成百次，并且使用物鏡類型的全內(nèi)反射熒光(TIRF)或落射熒光成像幾 何形狀在每個(gè)切換循環(huán)檢測平均6000個(gè)光子。這個(gè)可逆的切換行為提供了內(nèi)部控制以測 量定位精確度。在一些實(shí)驗(yàn)中，成雙地標(biāo)記有Cy3和Alexa 647的抗生蛋白鏈菌素分子被固定在 玻璃表面上。然后將分子切換接通和斷開多個(gè)循環(huán)，并且針對每個(gè)切換循環(huán)確定它們的X、 y和ζ坐標(biāo)。這個(gè)過程導(dǎo)致針對每個(gè)分子的一簇定位(圖1D)。在這個(gè)附圖中，每個(gè)分子由 于同一分子的重復(fù)激活而給出了一簇定位。來自145簇的定位與它們的質(zhì)心對準(zhǔn)，以生成 定位分布的總體3D表達(dá)(左邊的面板)。x、y和ζ中的分布的直方圖(右邊的面板)被 擬合到高斯函數(shù)，得到χ中9nm、y中Ilnm和ζ中22nm的標(biāo)準(zhǔn)偏差。定位分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差 (SD :χ 中 9nm、y 中 Ilnm 禾口 ζ 中 22nm)或半高寬(FWHM :x 中 21nm、y 中 26nm 和 ζ 中 52nm) 提供了 3維中的定位精確度的定量測量(圖1E-1G)。兩個(gè)橫向維度中的定位精確度類似于 以前在沒有圓柱形透鏡的情況下獲得的分辨率。ζ中的定位精確度在這些實(shí)驗(yàn)中近似兩倍 于χ和y中的定位精確度。因?yàn)閳D像寬度隨著熒光團(tuán)從焦平面移開而增加，所以定位精確 度隨著ζ值增加而下降，尤其是在橫向維度上。這樣一來，在一些實(shí)驗(yàn)中，就選擇了焦平面 附近大約600nm的ζ成像深度，在這個(gè)ζ成像深度之內(nèi)，與在平均焦平面處獲得的值相比， 橫向和軸向定位精確度變化分別小于1. 6倍和1. 3倍。然而，例如通過在將來的實(shí)驗(yàn)中使用ζ掃描，可以增加成像深度。作為初始測試，對模型珠子樣品進(jìn)行成像。模型珠子樣品通過以下來制備將 200nm的生物素化聚苯乙烯珠子固定在玻璃表面上，然后用Cy3-AleXa 647標(biāo)記的抗生蛋 白鏈菌素對樣品進(jìn)行培育，以便用光可切換的探測劑涂敷珠子。通過對光學(xué)可分辨的Alexa 647分子的稀疏子集進(jìn)行重復(fù)的隨機(jī)激活來獲得珠子的三維圖像，以便允許單獨(dú)分子的χ、 y和ζ坐標(biāo)被確定。在多個(gè)激活循環(huán)期間，眾多熒光團(tuán)的位置被確定并被用來構(gòu)造全三維 圖像。當(dāng)沿著全部三個(gè)方向觀看時(shí)，珠子圖像的投影表現(xiàn)為近似球形，其中分別在x、y和ζ 中具有210 士 16、225 士 25和228 士 25nm的平均直徑(圖4)，這指示了全部三維中的精確定 位。因?yàn)槊總€(gè)熒光團(tuán)的圖像同時(shí)對其x、y和ζ坐標(biāo)進(jìn)行編碼，所以與三維成像相比，不需要 額外的時(shí)間在三維中定位每個(gè)分子。圖4示出了用Cy3-AleXa 647標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素涂敷的200nm直徑的珠子 的三維圖像。圖4A示出了玻璃表面上的1.7微米(x)X 10微米(y)的面積之內(nèi)的兩個(gè)珠 子的x-z投影。表面由珠子下面的定位線限定，該定位線源自于非特定地吸附于玻璃表面 的抗生蛋白鏈菌素分子。盡管非特定吸附的抗生蛋白鏈菌素只是稀疏地分布在表面上，但 是大面積的投影導(dǎo)致幾乎連續(xù)的定位線。圖4A中的插圖示出了包圍右邊珠子的小體積 (400nmX400nmX400nm)的x_z投影，其中存在幾個(gè)非特定吸附的抗生蛋白鏈菌素分子。圖 4B和4C示出了兩個(gè)珠子的χ-y投影。從圓形形狀的輕微偏差可能部分是由于不完全的抗 生蛋白鏈菌素涂敷和/或固有不理想的珠子形狀。圖4D圖示了珠子直徑在x、y和ζ方向上的分布。為了以非主觀的方式確定直徑， 抗生蛋白鏈菌素分子假定均勻地涂敷在珠子表面上。這樣的球形表面上的3D均勻分布當(dāng) 投影到χ、y和ζ軸中的任何一個(gè)上時(shí)都應(yīng)當(dāng)遵循ID均勻分布。χ、y或ζ方向上的ID分 布的寬度提供了珠子分別沿著χ、y或ζ軸的直徑的測量。另外，在一些情況下可以使用寬
度⑷和均勻分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SDmifmi)之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，亦即5Diifonn = d2/l2,以及考慮 有限定位精確度(SDltxalizatiJ的測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差和真正均勻分布的SDunitom之間的 關(guān)系，亦即=SDiiforai +^2ocalization。從如圖IE-IF所示的獨(dú)立測量的定位精確度以及 3D珠子圖像在χ、y和ζ方向上的投影分布的SDmeasure中，沿著x、y和ζ軸推導(dǎo)出珠子的直 徑(d)。這里示出了 53個(gè)測量的珠子的直徑分布，并且平均直徑在x、y和ζ方向上分別為 210士16歷、226士2511111和228 士 25nm。測量的直徑在數(shù)量上類似于制造商對珠子的建議直 徑(200nm)。略微的增加可能部分是由于抗生蛋白鏈菌素涂敷的有限厚度。作為另一個(gè)例子來描述細(xì)胞成像。在這個(gè)例子中，對青猴腎上皮(BS-C-I)細(xì)胞中 的微管網(wǎng)絡(luò)執(zhí)行間接免疫熒光成像。細(xì)胞用原發(fā)抗體進(jìn)行免疫染色，然后用Cy3和Alexa 647成雙地標(biāo)記的次級抗體進(jìn)行免疫染色。獲得的三維圖像不僅示出了與傳統(tǒng)廣視野熒光 圖像相比在分辨率方面的顯著提高(圖2A-2B)，而且還提供了在傳統(tǒng)圖像(圖2A)中不可 得的ζ維度信息(圖2B)。圖2A是BS-C-I細(xì)胞的大區(qū)域中的微管的傳統(tǒng)間接免疫熒光圖 像；圖2B是使用在此描述的技術(shù)進(jìn)行成像并根據(jù)ζ位置信息進(jìn)行陰影化的同一區(qū)域。多層 微管細(xì)絲在細(xì)胞的x-y、x-Z或y-z橫截面中清晰可見(圖2C-2E)。這個(gè)區(qū)域是由圖2B中 的白框列舉的區(qū)域，示出了 5個(gè)微管細(xì)絲。為了更加定量地表征細(xì)胞成像分辨率，在細(xì)胞中識別點(diǎn)狀對象，其表現(xiàn)為遠(yuǎn)離任何可辨別微管細(xì)絲的小簇定位。這些簇可能表示非特定地附接到細(xì)胞的單獨(dú)抗體。在整個(gè) 測量的細(xì)胞的ζ范圍之上隨機(jī)選擇的這些簇的FWHM為χ中22nm、y中28nm和ζ中55nm(圖 5)，數(shù)量上類似于針對固定到玻璃表面上的單獨(dú)分子確定的那些(將圖5與圖1E-3G相比 較)。在ζ中以102nm分開的兩個(gè)微管細(xì)絲在三維圖像中表現(xiàn)為很好地分開(圖2F)，這表 明了在x_y投影中交叉的兩個(gè)微管的ζ輪廓。這個(gè)直方圖示出了定位的ζ坐標(biāo)的分布，其 擬合到具有相等寬度的雙高斯(曲線)。微管細(xì)絲在ζ維度中的視在寬度為66nm，略微大 于ζ中的固有成像分辨率，并且在數(shù)量上符合成像分辨率與獨(dú)立測量的抗體涂敷的微管的 寬度的卷積(圖2F)。因?yàn)橥ㄟ^固有成像分辨率和標(biāo)記(諸如抗體)尺寸的組合來確定有 效分辨率，所以分辨率方面的提高可以通過以下來實(shí)現(xiàn)使用直接而不是間接免疫熒光來 去除一層抗體標(biāo)記，如下一個(gè)例子中示出的那樣，或者使用Fab片段或遺傳編碼肽標(biāo)簽來 替換抗體。在圖5中，根據(jù)細(xì)胞中的點(diǎn)狀對象來確定定位精確度，所述點(diǎn)狀對象表現(xiàn)為遠(yuǎn)離 任何可辨別微管細(xì)絲的小簇定位。這里示出的是x、y和ζ維度中的這些點(diǎn)狀簇之內(nèi)的定位 的空間分布。通過用它們的質(zhì)心對準(zhǔn)202個(gè)簇來生成定位的直方圖，其中每個(gè)簇包含不小 于8個(gè)定位。用高斯函數(shù)擬合直方圖給出分別在x、y和ζ方向上的9nm、12nm和23nm的標(biāo) 準(zhǔn)偏差。相應(yīng)的FWHM值為22nm、28nm和55nm。最后，為了展示細(xì)胞中的納米級結(jié)構(gòu)的三維形態(tài)可以被分辨，在BS-C-I細(xì)胞中對 內(nèi)涵蛋白涂敷的凹陷(CCP)進(jìn)行成像。CCP是從細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)的內(nèi)涵蛋白、銜接蛋白和 其它輔助因子裝配的用于便利于胞吞作用的150nm至200nm的球形籠狀結(jié)構(gòu)。為了對CCP 進(jìn)行成像，使用了直接免疫熒光方案，其使用Cy3和Alexa 647成雙地標(biāo)記的次級抗體用于 內(nèi)涵蛋白。當(dāng)通過傳統(tǒng)熒光顯微術(shù)進(jìn)行成像時(shí)，所有的CCP都表現(xiàn)為沒有可辨別結(jié)構(gòu)的近 似衍射極限的斑點(diǎn)(圖3A，其為BS-C-I細(xì)胞的區(qū)域的傳統(tǒng)直接免疫熒光圖像)。在其中ζ 維信息被丟棄的使用在此描述的技術(shù)的二維圖像中，CCP的圓形形狀可觀察(圖3B和3D)。 根據(jù)2D投影圖像測量的CCP的尺寸分布180士40nm在數(shù)量上符合使用電子顯微術(shù)確定的 尺寸分布。包括ζ維信息允許凹陷的3D結(jié)構(gòu)的可視化(圖3C和3E-3H)。圖3C和3E示出 了從細(xì)胞表面處的凹陷的開口附近區(qū)域獲取的圖像的x-y橫截面。圖3C是與如圖3A-3B 所示相同區(qū)域的50nm厚的x-y橫截面，示出了原生質(zhì)膜處的CCP的開口的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而圖 3E則是兩個(gè)附近CCP的IOOnm厚的x-y橫截面的放大圖。凹陷外圍的圓形環(huán)狀結(jié)構(gòu)被毫無疑義地分辨。凹陷的連續(xù)X-y和X-Z橫截面(圖 3F-3H)揭示了在二維圖像中不可觀察的這些納米級結(jié)構(gòu)的三維半球形籠狀形態(tài)。這些附圖 示出了 CCP的x-y橫截面(每個(gè)在ζ中為50nm厚)(圖3F)和系列χ-z橫截面(每個(gè)在y 中為50nm厚)(圖3G)，并且在3D透視圖(圖3H)中表示的χ-y和χ-z橫截面示出了凹陷 的半球形籠狀結(jié)構(gòu)?？偠灾?，這些例子圖示了具有IOOnm或以下數(shù)量級的分辨率的三維高分辨率成 像。細(xì)胞結(jié)構(gòu)的納米級特征以下述分辨率被分辨，所述分辨率以前只有用電子顯微術(shù)才能 觀看，而現(xiàn)在用光學(xué)就能看到環(huán)境條件下的分子特異性。這種改進(jìn)可以顯著增強(qiáng)使細(xì)胞中 的分子組織和相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化的能力。例子2這個(gè)例子描述了相對于例子1可用的某些技術(shù)。為了表征例子1的光可切換探測
19劑的3D定位精確度，通過遵循來自制造商的建議協(xié)議用胺基反應(yīng)性染料培育蛋白質(zhì)，用光 可切換的Alexa 647熒光團(tuán)(Invitrogen)和激活器染料Cy3 (GE Healthcare)來標(biāo)記抗生 蛋白鏈菌素分子(Invitrogen)。使用Nap-5列(GE Healthcare)通過凝膠過濾去除未反應(yīng) 的染料分子。標(biāo)記比率通過UV-Vi s分光光度計(jì)來表征，并且吸收光譜指示了每個(gè)抗生蛋白 鏈菌素分子 2Cy3和 0. 1 Alexa 647的標(biāo)記比率。標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素然后被固定 到從載玻片和#1. 5蓋玻片裝配的玻璃流動室的表面上。載玻片和蓋玻片通過以下清洗在 IM氫氧化鉀中超聲處理15分鐘，繼之以用超純(MilliQ)水大規(guī)模清洗并用壓縮的氮?dú)飧?燥。標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素樣品被注入到流動室中，以允許抗生蛋白鏈菌素非特定地直接 吸附在表面上，或者通過生物素化牛血清清蛋白(BSA)涂敷的表面上的生物素-抗生蛋白 鏈接來吸附在表面上。為了生成用于ζ定位測量的校準(zhǔn)曲線，還使用了 Alexa 647標(biāo)記的 抗生蛋白鏈菌素或量子點(diǎn)(蛋白質(zhì)A涂敷的Qd0t655，lnvitr0gen)。單一標(biāo)記的抗生蛋白 鏈菌素以與Cy3和Alexa 647成雙地標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素類似的方式固定到室表面，并 且量子點(diǎn)通過非特定的綁定直接固定到表面。為了使200nm的聚苯乙烯珠子用光可切換的熒光團(tuán)涂敷，蓋玻片表面首先如上所 述通過使0. 25mg/mL的未標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素溶液流入到流動室中而涂敷以抗生蛋白 鏈菌素，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗。下一步，200nm直徑的生物素化聚苯乙烯珠子 (Invitrogen)被添加到室以允許在表面上固定不動。最后使3微克/mL的Cy3和Alexa 647成雙地標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素流入以涂敷生物素化的珠子的表面。在這個(gè)過程期間，某 種熒光抗生蛋白鏈菌素也非特定地吸附到蓋玻片表面上。流動室然后用PBS漂洗以去除溶 液中的自由抗生蛋白鏈菌素分子。BS-C-I細(xì)胞以每阱40k個(gè)細(xì)胞的密度覆蓋在8阱隔室的蓋玻片(LabTek-II， Nalgene Nunc)中。在16至24個(gè)小時(shí)之后，細(xì)胞使用PBS中的3%的多聚甲醛和0. 1 %的 戊二醛固定10分鐘，然后用0. 的氫硼化鈉處理7分鐘以減少未反應(yīng)的醛基和在固定期 間形成的熒光產(chǎn)物。緊接著在使用之前來制備氫硼化鈉溶液以避免水解。固定的樣品然后 用PBS清洗三次，并且在封閉緩沖液(PBS中的3% w/v的BSA、0. 5% ν/ν的Triton X-100) 中滲透化處理15分鐘。微管用老鼠單細(xì)胞系β微管蛋白抗體(ATNOLCytoskeleton)著色30分鐘，然后 用山羊抗老鼠次級抗體著色30分鐘。次級抗體標(biāo)記有胺基反應(yīng)性Alexa 647和Cy3，并且 標(biāo)記的化學(xué)計(jì)算法被表征至平均每抗體 4. 0Cy3和 0. 4Alexa 647。在每個(gè)著色步驟之 后都執(zhí)行使用PBS中的0. 2% w/v的BSA和0. ν/ν的Triton X-100進(jìn)行的三個(gè)清洗步
馬聚ο為了通過直接免疫熒光對內(nèi)涵蛋白進(jìn)行著色，同時(shí)使用了老鼠單細(xì)胞系抗 內(nèi)涵蛋白重鏈(clone X22, ab2731, Abeam)和抗內(nèi)涵蛋白輕鏈(cloneCON. 1，C1985, Sigma-Aldrich)。兩種抗體都用每抗體 1. 0 Cy3和 1. OAlexa 647來標(biāo)記。樣品著色 30分鐘，用PBS清洗三次，并立即使用以便進(jìn)行成像。應(yīng)當(dāng)注意的是，免疫熒光成像可以在寬范圍的染料標(biāo)記比率下很好地工作。通常 每抗體不小于1個(gè)激活器(在這種情況下為Cy3)的標(biāo)記比率被選擇以確保大多數(shù)的抗體 都具有激活器。另一方面，當(dāng)多于一個(gè)的光可切換指示器(在這種情況下為Alexa 647)附 接到同一抗體上的附近范圍之內(nèi)的氨基酸殘基時(shí)，指示器-指示器相互作用在一些情況下可以導(dǎo)致顯著降低的切換斷開速率。以前的特性已指出，兩個(gè)分開2nm的指示器的斷開速 率 5倍慢于單個(gè)指示器的斷開速率，而兩個(gè)分開7nm的指示器則具有可與孤立指示器的 斷開速率相比較的斷開速率。因此，對于指示器選擇不大于1的染料/蛋白質(zhì)比率，以使這 種效應(yīng)最小化。樣品中的緩沖溶液緊接著在數(shù)據(jù)獲取之前用成像緩沖液替換。成像緩沖液包含 50mM 的 Tris、pH 為 7. 5、IOmM 的 NaCl、0. 5mg/mL 的葡萄糖氧化酶(G2133，Sigma-Aldrich)、 40 微克/mL 的過氧化氫酶(106810,Roche Applied Science) ,10% (w/v)的葡萄糖和 (ν/ν)的β-巰基乙醇。已發(fā)現(xiàn)β-巰基乙醇(或其它含硫醇的試劑如巰基丙氨酸)對于 花青染料的光切換而言是重要的。成像也可以在較低的β-巰基乙醇濃度(例如0.1% ν/ ν)下進(jìn)行，這與活體細(xì)胞成像兼容。在這個(gè)工作中，上述所有成像實(shí)驗(yàn)都是針對固定細(xì)胞進(jìn) 行的。在例子1中描述的所有成像實(shí)驗(yàn)都在倒置光學(xué)顯微鏡(OlympusIX-71)上進(jìn)行。兩 個(gè)固態(tài)激光器用作激發(fā)源657nm的激光器(RCL-200-656，Crystalaser)，用于激發(fā)光可切 換的指示器熒光團(tuán)(Alexa647)并將其切換至黑暗狀態(tài)；以及532nm的激光器(GCL-200-L， Crystalaser)，用于以Cy3便利化的方式再激活A(yù)lexa 647。這兩個(gè)激光束被組合并耦合 到光纖(P3-630A-FC-5，Thorlabs)中。光纖輸出通過顯微鏡的后端口被校準(zhǔn)并聚焦到高 數(shù)值孔徑油浸物鏡(IOOx UPlanSApo, NA 1.4，Olympus)的后焦平面上。平移臺允許兩個(gè) 激光器朝向物鏡的邊緣轉(zhuǎn)移，以便從物鏡出現(xiàn)的光以接近但不超過玻璃-水界面的臨界角 的高入射角到達(dá)樣品。這個(gè)激發(fā)方案允許來自表面的幾個(gè)微米之內(nèi)的熒光團(tuán)被激發(fā)，并且 減少了來自溶液的背景熒光。熒光發(fā)射由同一物鏡收集并由多色鏡(z458/514/647rpC， Chroma)、帶通濾波器(HQ710/70m，Chroma)和長通濾波器(HQ665LP，Chroma)過濾。過濾的 發(fā)射然后通過具有插在其中的弱圓柱形透鏡(Im焦距)的一對中繼透鏡成像到EMC⑶攝影 機(jī)(IxonDV897DCS-BV, Andor)上。為了使顯微鏡聚焦在數(shù)據(jù)獲取期間穩(wěn)定，通過顯微鏡的后端口處的反射棱鏡將從 玻璃-水界面反射的紅激發(fā)激光引導(dǎo)到象限光電二極管上。象限光電二極管讀取反射激光 的位置，該位置對蓋玻片表面與物鏡之間的距離敏感。然后通過軟件將這個(gè)信息反饋到ζ 定位壓電級(NanoView-M，MadCity Labs)，以對顯微鏡聚焦中的ζ漂移進(jìn)行校正。這個(gè)“聚 焦鎖定”系統(tǒng)能夠在STORM數(shù)據(jù)獲取期間將聚焦位置維持在40nm之內(nèi)。如下所述，在數(shù)據(jù) 分析期間對ζ中的剩余漂移進(jìn)行校正。在數(shù)據(jù)獲取期間，相對強(qiáng)的成像/去激活激光(在657nm的 40mW)和相對弱的激 活激光(在532nm的小于2微瓦)被同時(shí)施加到樣品。用激活和去激活激光兩者同時(shí)照射 導(dǎo)致指示器熒光團(tuán)在熒光和黑暗狀態(tài)之間的隨機(jī)切換。相對強(qiáng)的成像/去激活激光功率被 選擇以確保高發(fā)射強(qiáng)度和快速切換斷開速率，并且相對弱的激活激光被選擇以確保在任何 給定時(shí)刻的被激活熒光團(tuán)的部分足夠低，以便它們在光學(xué)上可分辨。EMCCD攝影機(jī)以20Hz 的幀速率連續(xù)地獲取圖像，以獲得“電影”。為了從單個(gè)分子圖像的寬度中得出ζ坐標(biāo)，如圖IC所示生成校準(zhǔn)曲線。以三種方 式在例子1中進(jìn)行校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)=LAlexa 647標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素以低密度吸附于蓋玻片 表面上，使得單獨(dú)的抗生蛋白鏈菌素分子彼此可分辨。成像緩沖液中的β _巰基乙醇用2mM 的水溶性維生素E(Trolox)替換，以便抑制熒光團(tuán)的閃爍。在用壓電級以恒定速率在ζ中
21對樣品臺進(jìn)行掃描的同時(shí)，記錄單獨(dú)的抗生蛋白鏈菌素分子的熒光圖像。2.將量子點(diǎn)吸附 到蓋玻片上。PBS中的的β-巰基乙醇溶液用作成像緩沖液以抑制量子點(diǎn)的閃爍。在 以恒定速率在ζ中對樣品臺進(jìn)行掃描的同時(shí)，獲取單獨(dú)的量子點(diǎn)的熒光圖像。3. Cye-Alexa 647標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素以高密度吸附于蓋玻片表面上。除了以恒定速率在ζ中對樣品 進(jìn)行緩慢掃描之外，以與在數(shù)據(jù)獲取期間相同的方式執(zhí)行測量。視場之內(nèi)的小面積(通常 為8微米Χ4微米)中的光激活事件被用來測量校準(zhǔn)曲線。全部三個(gè)測量產(chǎn)生了類似的校 準(zhǔn)曲線。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)圖像幀中的熒光峰值用以下橢圓高斯函數(shù)擬合 其中，h是峰值高度，b是背景，(x0, y0)是峰值的中心位置，并且Wx和Wy分別代表 圖像(點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，PSF)在χ和y方向上的寬度。與此同時(shí)，根據(jù)壓電級的ζ軌跡來確定 相應(yīng)分子的ζ位置。作為ζ的函數(shù)的Wx和Wy值然后被擬合到修改形式的典型散焦曲線
‘、 fz-c)2 /z-c)3 Dfz-c)4 其中，W(1是當(dāng)分子處在焦平面時(shí)的PSF寬度，c是χ或y焦平面從平均焦平面的偏 移量，d是顯微鏡的聚焦深度，并且A和B是用于對成像光學(xué)的不理想性進(jìn)行校正的高階項(xiàng) 系數(shù)。平均焦平面被定義成使得在這個(gè)平面中定位的熒光團(tuán)具有下述圖像PSF，該圖像PSF 在χ和y方向上具有相等的寬度，這樣一來就生成了球形圖像。應(yīng)當(dāng)注意的是，這些擬合曲 線被生成以有利于在測量的Wx和Wy值與校準(zhǔn)曲線相比較時(shí)進(jìn)行的自動ζ定位，以搜索相應(yīng) 的ζ位置。只要曲線用足夠的精確度擬合測量的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，用于擬合曲線的確切函數(shù)并不 重要。數(shù)據(jù)以與以前描述的類似的方式進(jìn)行分析(參見通過引用結(jié)合于此的2008年 7月31日作為國際專利申請公布第W02008/091296號公布的名稱為“Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other ImagingTechniques" ^ 2007^itWH 際專利申請第PCT/US2007/017618號)，但是現(xiàn)在具有了根據(jù)單獨(dú)的被激活熒光團(tuán)的圖像 形狀得出的另外的ζ維度信息。STORM電影的每個(gè)圖像幀中的熒光峰值通過用橢圓高斯函 數(shù)來擬合局部最大值而被識別，以便推導(dǎo)出峰值高度h'、兩個(gè)橫向維度中的中心位置Wt/ 和y/以及兩個(gè)橫向維度中的峰值寬度Wx'和。將閾值應(yīng)用于峰值高度(h')、寬度
( v/^)和橢圓率(I' Ay')，被丟棄的峰值太弱、太寬或太斜而不能得到令人滿意的定
位精確度。還有被丟棄的是會導(dǎo)致多個(gè)熒光團(tuán)的重疊圖像的某些峰值。如果連續(xù)幀中的被 識別峰值的中心位置在空間上分開小于一個(gè)像素，則它們被認(rèn)為是源自一個(gè)光激活事件期 間的同一分子。來自不同幀中的同一熒光團(tuán)的同一光激活事件的全部圖像被平均化，并且 執(zhí)行向橢圓高斯函數(shù)的二次擬合，以推導(dǎo)出精確的中心位置Xtl和y。以及寬度wx和\。通 過在初始擬合中獲得的峰值寬度來確定用于二次擬合的圖像區(qū)域。在二次擬合之后，對校準(zhǔn)曲線進(jìn)行搜索以求出最佳匹配從擬合中獲得的測量寬度 ^和Wy的Ztl點(diǎn)。通過使Wx"2i/2空間中的下述距離最小化來自動執(zhí)行這個(gè)搜索0090] 通過仿真并且通過分析處理可以表明，與直接使用寬度相比，使用寬度的平方根 提高了搜索過程中在ζ中的定位的精確度。具有大于預(yù)置閾值的最小距離D的激活事件 表明圖像失真，這很可能是由位于附近且在同一圖像幀中被光激活的多于一個(gè)的分子造成 的。從進(jìn)一步的分析中丟棄這些事件。這個(gè)過程允許獲得每個(gè)被激活熒光團(tuán)的3D位置(X(l， Y0和zQ)，并且以這種方式構(gòu)造三維圖像。當(dāng)使用油浸物鏡對玻璃基片所支撐的水溶液中的生物樣品執(zhí)行3DST0RM測量時(shí)， 可以考慮玻璃(η = 1. 515)和成像緩沖液(對于10%的葡萄糖溶液而言η = 1. 35)之間的 折射率失配。這個(gè)折射率失配有效地將對象的視在ζ位置從玻璃表面移開。在從表面的幾 個(gè)微米之內(nèi)，可以表明的是，這種折射率失配引起的ζ距離的放大率可以被視為常數(shù)，并且 對于在這些成像條件下使用的物鏡和折射率(物鏡ΝΑ= 1.4，玻璃η= 1.515，并且緩沖 液η = 1. 35)而言，放大倍數(shù)等于1. 26。通過用1/1. 26 = 0. 79的因數(shù)對根據(jù)與校準(zhǔn)曲線 直接比較而獲得的全部ζ值進(jìn)行重新定標(biāo)，相應(yīng)地在ζ定位分析中對這種小的放大效應(yīng)進(jìn) 行校正。由于成像光學(xué)中的像差，當(dāng)熒光團(tuán)散焦時(shí)PSF可能變得不對稱，結(jié)果，其圖像的中 心可能從熒光團(tuán)的實(shí)際橫向位置略微偏離。這造成了 3D圖像中的視在傾斜失真。平均傾 斜在這些實(shí)驗(yàn)中通常不大于4度，并且可以通過傾斜輪廓的預(yù)先校準(zhǔn)來校正。影響定位精確度的重要因素是圖像獲取時(shí)間期間的樣品臺漂移，既包括x-y平面 中的漂移，又包括ζ方向上的漂移。在例子1使用的設(shè)立中，安裝了聚焦鎖定以使ζ漂移最 小化，但是存在 40nm的剩余漂移。在這些例子中使用兩種方法對漂移進(jìn)行校正。一種方 法涉及添加置信標(biāo)志器(熒光珠子)以跟蹤樣品的漂移，并且在圖像分析期間減去標(biāo)志器 的移動。另一種方法使用用于漂移校正的圖像的相關(guān)函數(shù)。第二種方法被用來對上述例子 中的χ、y和ζ漂移進(jìn)行校正。將電影按時(shí)間分成相等時(shí)段的片段，并且根據(jù)每個(gè)電影片段 來構(gòu)造圖像。然后計(jì)算第一個(gè)片段和所有隨后片段中的圖像之間的相關(guān)函數(shù)，并且確定相 關(guān)函數(shù)的重心位置?；谶@些重心位置的插值法被用來生成用于每個(gè)成像幀的作為時(shí)間函 數(shù)的重心位置的曲線。然后從定位中減去這個(gè)漂移，并且在不同時(shí)間點(diǎn)的全部定位都被包 括以生成漂移被校正的圖像。雖然在此已描述并圖示了本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地設(shè) 想多種其它裝置和/或結(jié)構(gòu)，用于執(zhí)行在此描述的功能和/或獲得在此描述的結(jié)果和/或 優(yōu)點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)，并且這樣的改變和/或修改中的每一個(gè)都被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。一般地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會容易地意識到的是，在此描述的所有參數(shù)、維度、材料 和配置都是示例性的，并且實(shí)際的參數(shù)、維度、材料和/或配置將會取決于使用本發(fā)明教導(dǎo) 的一個(gè)或多個(gè)特定應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到或者能夠僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來查明針 對在此描述的本發(fā)明的特定實(shí)施例的許多等價(jià)物。因此可以理解的是，前述實(shí)施例僅僅是 作為例子提供的，并且在所附權(quán)利要求及其等價(jià)物的范圍之內(nèi)，可以與特定描述和聲明不 同地實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明針對的是在此描述的每個(gè)單獨(dú)的特征、系統(tǒng)、物品、材料、器材和/ 或方法。另外，兩個(gè)或更多這樣的特征、系統(tǒng)、物品、材料、器材和/或方法的任意組合(如 果這樣的特征、系統(tǒng)、物品、材料、器材和/或方法沒有相互不一致)都包括在本發(fā)明的范圍
23之內(nèi)。如在此定義和使用的所有定義都應(yīng)當(dāng)理解為在詞典定義、通過引用結(jié)合于此的文 件中的定義和/或被定義術(shù)語的普通含義之上加以控制。如本說明書和權(quán)利要求中在此使用的不定冠詞“一個(gè)”，除非明確地有相反指示， 否則都應(yīng)當(dāng)理解為指的是“至少一個(gè)”。如本說明書和權(quán)利要求中在此使用的措辭“和/或”應(yīng)當(dāng)理解為如此聯(lián)合的要素 中的“任何一個(gè)或兩者”，亦即要素在一些情況下聯(lián)合出現(xiàn)，而在其它情況下則分開出現(xiàn)。用 “和/或”列舉的多個(gè)要素應(yīng)當(dāng)以相同的方式來闡釋，亦即如此聯(lián)合的要素中的“一個(gè)或多 個(gè)”。除了用“和/或”語句特定識別的要素之外，其它要素可以可選地存在，所述其它要素 或者與特定識別的那些要素相關(guān)，或者不相關(guān)。因此，作為非限制性的例子，對“A和/或B” 的引用當(dāng)結(jié)合開放式語句如“包括”一起使用時(shí)可以在一個(gè)實(shí)施例中僅指的是A(可選地包 括除了 B之外的要素)，在另一個(gè)實(shí)施例中僅指的是B (可選地包括除了 A之外的要素)，在 還有另一個(gè)實(shí)施例中指的是A和B兩者(可選地包括其它要素)，等等。如本說明書和權(quán)利要求在此使用的那樣，“或者”應(yīng)當(dāng)理解為具有與如上面定義的 “和/或”相同的含義。例如，當(dāng)分開列表中的項(xiàng)目時(shí)，“或者”或“和/或”應(yīng)當(dāng)解釋為包 括，亦即包括若干或列舉的要素中的至少一個(gè)，而且還包括多于一個(gè)，并且可選地包括另外
未列舉的項(xiàng)目。只有明確地有相反指示的項(xiàng)目，諸如“......中的僅一個(gè)”或“......中的
確切地一個(gè)”或者當(dāng)在權(quán)利要求中使用時(shí)的“由......組成”，指的是包括若干或列舉的要
素中的確切地一個(gè)要素。一般而言，如在此使用的術(shù)語“或者”當(dāng)結(jié)合獨(dú)占性術(shù)語如“任何
一個(gè)”、“......中的一個(gè)”、“......中的僅一個(gè)”或“......中的確切地一個(gè)”一起使用時(shí)
應(yīng)當(dāng)僅解釋為指示獨(dú)占性選擇(亦即“一個(gè)或另一個(gè)但不是兩者”)。“基本上由......組
成”當(dāng)在權(quán)利要求中使用時(shí)應(yīng)當(dāng)具有如在專利法律領(lǐng)域中使用的普通含義。如本說明書和權(quán)利要求在此使用的那樣，關(guān)于列舉的一個(gè)或多個(gè)要素，措辭“至少 一個(gè)”應(yīng)當(dāng)理解為從列舉的要素中的任何一個(gè)或多個(gè)要素中選擇的至少一個(gè)要素，但不一 定包括列舉的要素之內(nèi)特定列舉的各個(gè)和每一個(gè)要素中的至少一個(gè)，并且不排除列舉的要 素中的要素的任何組合。這個(gè)定義還允許除了措辭“至少一個(gè)”所指的列舉的要素之內(nèi)特 定識別的要素之外，其它要素可以可選地存在，所述其它要素或者與特定識別的那些要素 相關(guān)，或者不相關(guān)。因此，作為非限制性的例子，“A和B中的至少一個(gè)”(或者等價(jià)地，“A或 B中的至少一個(gè)”，或者等價(jià)地，“A和/或B中的至少一個(gè)”)可以在一個(gè)實(shí)施例中指的是至 少一個(gè)、可選地包括多于一個(gè)A而沒有B存在(并且可選地包括除了 B之外的要素)，在另 一個(gè)實(shí)施例中指的是至少一個(gè)、可選地包括多于一個(gè)B而沒有A存在(并且可選地包括除 了 A之外的要素)，在還有另一個(gè)實(shí)施例中指的是至少一個(gè)、可選地包括多于一個(gè)A和至少 一個(gè)、可選地包括多于一個(gè)B (并且可選地包括其它要素)，等等。還應(yīng)當(dāng)理解的是，除了明確地有相反指示，否則在包括多于一個(gè)的步驟或行動的 在此聲明的任何方法中，該方法的步驟或行動的順序不一定限于對方法的步驟或行動進(jìn)行 陳述的順序。在權(quán)利要求以及上述說明書中，所有的連接詞如“包括”、“攜帶”、“具有”、“包 含”、“涉及”和“持有”等都要理解為開放式的，亦即指的是包括但不限于。如美國專利局 專利審查過程手冊2111. 03部分中闡釋的那樣，只有連接詞“由......組成”和“基本上由......組成”才應(yīng)當(dāng)分別是封閉式或半封閉式連接詞.
權(quán)利要求
一種方法，包括提供以小于大約1000nm的距離分開的第一實(shí)體和第二實(shí)體；確定由所述第一實(shí)體發(fā)射的光；確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí)體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的x、y和z位置。
2.一種方法，包括提供以分開的距離分開的第一實(shí)體和第二實(shí)體； 確定由所述第一實(shí)體發(fā)射的光； 確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí)體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所 述第二實(shí)體的X、y和Z位置。
3.一種方法，包括提供以小于大約IOOOnm的距離分開的第一實(shí)體和第二實(shí)體； 激活所述第一實(shí)體但不激活所述第二實(shí)體； 確定由所述第一實(shí)體發(fā)射的光； 激活所述第二實(shí)體； 確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí)體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所 述第二實(shí)體的x、y和ζ位置。
4.一種方法，包括提供以分開的距離分開的第一實(shí)體和第二實(shí)體； 激活所述第一實(shí)體但不激活所述第二實(shí)體； 確定由所述第一實(shí)體發(fā)射的光； 激活所述第二實(shí)體； 確定由所述第二實(shí)體發(fā)射的光；以及使用由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和由所述第二實(shí)體發(fā)射的光來確定所述第一實(shí)體和所 述第二實(shí)體的X、y和Z位置。
5.如權(quán)利要求2或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，由所述第一實(shí)體發(fā)射的光具有大于 所述分開的距離的波長。
6.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用它們各自的χ、y 和ζ位置來構(gòu)造所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的圖像。
7.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)它們的圖像在檢 測器處的形狀來確定所述第一實(shí)體和/或所述第二實(shí)體的ζ位置。
8.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)它們的圖像在檢 測器處的強(qiáng)度來確定所述第一實(shí)體和/或所述第二實(shí)體的ζ位置。
9.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，包括使由所述第一實(shí)體發(fā)射的光 穿過透鏡，所述透鏡相對于由所述第一實(shí)體發(fā)射的光穿過所述透鏡的方向非圓對稱。
10.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使由所述第一實(shí)體發(fā)射的光穿過圓柱形透鏡。
11.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用檢測器收集由所 述第一實(shí)體發(fā)射的光，其中由所述第一實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述檢測器處。
12.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用檢測器收集由所 述第一實(shí)體發(fā)射的光，其中所述第一實(shí)體沒有處在所述檢測器的共軛平面內(nèi)。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述檢測器收集由所述第二實(shí)體發(fā) 射的光，其中通過所述檢測器收集的由所述第二實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述檢測器的檢 測區(qū)域中。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述檢測器收集由所述第二實(shí)體發(fā) 射的光，其中通過所述檢測器收集的由所述第二實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述檢測器的共 軛平面內(nèi)。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，包括使由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過透鏡，所述透鏡 限定了不包含所述第二實(shí)體的聚焦區(qū)域。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，包括使由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過透鏡，所述透鏡 相對于由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過所述透鏡的方向非圓對稱。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，包括使由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過圓柱形透鏡。
18.如權(quán)利要求9所述的方法，進(jìn)一步包括通過檢測器收集由所述第二實(shí)體發(fā)射的 光，其中通過所述檢測器收集的由所述第二實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述檢測器的檢測區(qū) 域中。
19.如權(quán)利要求9所述的方法，進(jìn)一步包括通過檢測器收集由所述第二實(shí)體發(fā)射的 光，其中通過所述檢測器收集的由所述第二實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述檢測器的共軛平 面內(nèi)。
20.如權(quán)利要求9所述的方法，包括使由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過透鏡，所述透鏡 限定了不包含所述第二實(shí)體的聚焦區(qū)域。
21.如權(quán)利要求9所述的方法，包括使由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過透鏡，所述透鏡 相對于由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過所述透鏡的方向非圓對稱。
22.如權(quán)利要求9所述的方法，包括使由所述第二實(shí)體發(fā)射的光穿過圓柱形透鏡。
23.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括通過多個(gè)檢測器收集 由所述第一實(shí)體發(fā)射的光，其中由所述第一實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在由所述多個(gè)檢測器中 的至少一個(gè)所限定的聚焦區(qū)域中。
24.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括通過多個(gè)檢測器收集 由所述第一實(shí)體發(fā)射的光，其中在所述多個(gè)檢測器中的一個(gè)或多個(gè)處，由所述第一實(shí)體發(fā) 射的光未被聚焦。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述多個(gè)檢測器收集由所述第二實(shí) 體發(fā)射的光，其中通過所述檢測器收集的由所述第二實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述多個(gè)檢 測器中的至少一個(gè)的檢測區(qū)域中。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述多個(gè)檢測器收集由所述第二實(shí) 體發(fā)射的光，其中通過所述檢測器收集的由所述第二實(shí)體發(fā)射的光沒有聚焦在所述多個(gè)檢 測器中的至少一個(gè)的共軛平面內(nèi)。
27.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和 由所述第二實(shí)體發(fā)射的光具有不同的波長。
28.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，由所述第一實(shí)體發(fā)射的光和 由所述第二實(shí)體發(fā)射的光具有基本上相同的波長。
29.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體通過不同的波長激活。
30.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體通過基本上相同的波長激活。
31.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體在化學(xué)上不同 于所述第二實(shí)體。
32.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體在化學(xué)上基本 等同于所述第二實(shí)體。
33.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體是光可激活或 光可切換的探測劑，或者所述第一實(shí)體是光可激活或光可切換的。
34.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體包括第一光 發(fā)射部分；以及第二激活部分，其在暴露于外部刺激源時(shí)激活所述第一部分。
35.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第二實(shí)體是光可激活或 光可切換的探測劑，或者所述第二實(shí)體是光可激活或光可切換的。
36.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第二實(shí)體包括第一光 發(fā)射部分；以及第二激活部分，其在暴露于外部刺激源時(shí)激活所述第一部分。
37.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，由所述第一實(shí)體發(fā)射的光具 有在大約400nm和大約IOOOnm之間的波長。
38.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體相對于公共實(shí)體固定不動。
39.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體的位置被確定到至少大約300nm的精確度。
40.如權(quán)利要求2或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和第二實(shí)體以小于 大約IOOOnm的距離分開。
41.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體的位置被確定到至少大約IOOnm的精確度。
42.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體的位置被確定到至少大約50nm的精確度。
43.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體的位置被確定到至少大約20nm的精確度。
44.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體的位置被確定到至少大約IOnm的精確度。
45.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一實(shí)體和所述第二實(shí) 體的位置被確定到下述精確度，所述精確度小于由所述第一實(shí)體和/或所述第二實(shí)體發(fā)射 的光的波長。
46.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，包括在第一時(shí)間點(diǎn)確定所述第 一實(shí)體和所述第二實(shí)體的位置，并且在第二時(shí)間點(diǎn)確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的位置。
47.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，包括在多于一個(gè)的時(shí)間點(diǎn)處和/ 或作為時(shí)間的函數(shù)來確定所述第一實(shí)體和所述第二實(shí)體的位置。
48.如權(quán)利要求1、2、3或4中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，按照陳述的順序來執(zhí)行行動。
49.一種方法，包括提供能夠發(fā)射光的多個(gè)實(shí)體，其中的至少一些以小于大約IOOOnm的距離分開；激活所述多個(gè)實(shí)體中的一部分以發(fā)射光；確定發(fā)射的所述光；使所述多個(gè)實(shí)體中的激活部分去激活；以及重復(fù)激活與去激活所述多個(gè)實(shí)體的行動，以確定所述多個(gè)實(shí)體的χ、y和ζ位置。
50.一種方法，包括提供能夠發(fā)射光的多個(gè)實(shí)體；激活所述多個(gè)實(shí)體中的一部分以發(fā)射光；確定發(fā)射的所述光；使所述多個(gè)實(shí)體中的激活部分去激活；以及重復(fù)激活與去激活所述多個(gè)實(shí)體的行動，以確定所述多個(gè)實(shí)體的χ、y和ζ位置。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體中的至少一些以小于發(fā)射的所述 光的波長的分開距離分開。
52.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用它們各自的x、y和 ζ位置來構(gòu)造所述多個(gè)實(shí)體的圖像。
53.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)它們的圖像在檢測 器處的形狀來確定所述多個(gè)實(shí)體的ζ位置。
54.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)它們的圖像在檢測 器處的強(qiáng)度來確定所述多個(gè)實(shí)體的ζ位置。
55.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，包括使由所述多個(gè)實(shí)體中的所述部 分發(fā)射的光穿過透鏡，所述透鏡相對于由所述多個(gè)實(shí)體中的一些發(fā)射的光穿過所述透鏡的 方向非圓對稱。
56.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使由所述多個(gè)實(shí)體中的 所述部分發(fā)射的光穿過圓柱形透鏡。
57.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用檢測器收集由所述 多個(gè)實(shí)體中的所述部分發(fā)射的光，其中由所述多個(gè)實(shí)體中的所述部分中的一些發(fā)射的光沒 有聚焦在所述檢測器處。
58.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括通過多個(gè)檢測器收集由 所述多個(gè)實(shí)體中的所述部分發(fā)射的光，其中所述多個(gè)實(shí)體中的所述部分中的一些沒有處在 所述多個(gè)檢測器中的至少一個(gè)的聚焦區(qū)域中。
59.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，包括使由所述多個(gè)實(shí)體中的所述部 分發(fā)射的光穿過透鏡，所述透鏡限定了不包含所述多個(gè)實(shí)體中的所述部分中的至少一部分的聚焦區(qū)域。
60.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括使用檢測器收集由所述 多個(gè)實(shí)體中的所述部分發(fā)射的光，其中由所述多個(gè)實(shí)體中的所述部分中的至少一部分發(fā)射 的光沒有處在所述檢測器的共軛平面內(nèi)。
61.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括通過多個(gè)檢測器收集由 所述多個(gè)實(shí)體中的所述部分發(fā)射的光，其中在所述多個(gè)檢測器中的一個(gè)或多個(gè)處，由所述 多個(gè)實(shí)體中的所述部分中的至少一部分發(fā)射的光未被聚焦。
62.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體中的至少一些以 不同的波長發(fā)射光。
63.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體每個(gè)以基本上相 同的波長發(fā)射光。
64.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體中的至少一些由 不同波長的光激活。
65.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體每個(gè)由基本上相 同的波長的光激活。
66.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體中的至少一些是 光可激活或光可切換的探測劑。
67.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，由所述多個(gè)實(shí)體中的至少一些 發(fā)射的光具有在大約490nm和大約IOOOnm之間的波長。
68.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 至少大約IOOOnm的精確度。
69.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 至少大約300nm的精確度。
70.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 至少大約IOOnm的精確度。
71.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 至少大約50nm的精確度。
72.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 至少大約20nm的精確度。
73.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 至少大約IOnm的精確度。
74.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，所述多個(gè)實(shí)體的位置被確定到 下述精確度，所述精確度小于由所述多個(gè)實(shí)體發(fā)射的光的波長。
75.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，包括在第一時(shí)間點(diǎn)確定所述多個(gè)實(shí) 體的位置，并且在第二時(shí)間點(diǎn)確定所述多個(gè)實(shí)體的位置。
76.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，包括在多于一個(gè)的時(shí)間點(diǎn)處和/或 作為時(shí)間的函數(shù)來確定所述多個(gè)實(shí)體的位置。
77.如權(quán)利要求49或50中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，按照陳述的順序來執(zhí)行行動。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及亞衍射極限圖像分辨率和其它成像技術(shù)，包括三維中的成像。在一個(gè)方面，本發(fā)明針對的是對來自以小于入射光的衍射極限的距離分開的兩個(gè)或更多實(shí)體的光進(jìn)行確定和/或成像。例如，實(shí)體可以以小于大約1000nm的距離分開，或者以小于用于可見光的大約300nm的距離分開。在一些情況下，可以在全部三個(gè)空間維度中(亦即在x、y和z方向上)確定實(shí)體的位置，并且在某些情況下，可以將全部三維中的位置確定到小于大約1000nm的精確度。在一組實(shí)施例中，實(shí)體可以選擇性地激活，亦即可以在不激活其它實(shí)體的情況下激活一個(gè)實(shí)體以產(chǎn)生光。第一實(shí)體可以被激活并確定(例如通過確定由該實(shí)體發(fā)射的光)，然后第二實(shí)體可以被激活并確定。例如通過確定這些實(shí)體的圖像的位置，并且在一些情況下以亞衍射極限分辨率的方式，可以使用發(fā)射的光來確定第一和第二實(shí)體的x和y位置。在一些情況下，可以使用多種技術(shù)中的一種來確定z位置，所述技術(shù)使用強(qiáng)度信息或聚焦信息(例如缺乏聚焦)來確定z位置。這樣的技術(shù)的非限制性例子包括像散成像、失焦成像或多焦平面成像。
文檔編號G01N21/64GK101918816SQ200880121492
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者莊小威, 王文芹, 維爾弗雷德·M·巴泰斯, 黃波 申請人:哈佛大學(xué)