專利名稱：：篩選NF-κB途徑活化的選擇性調(diào)節(jié)劑的方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及識別和選擇分子的方法，該分子通過調(diào)節(jié)NEMO和其他蛋白之間的相互作用來調(diào)節(jié)(激活或抑制)NF-κB途徑活化。
背景技術(shù)：
：核因子-κB(NF-kB)信號傳導是一種涉及各種基本細胞代謝過程包括炎癥反應、腫瘤生成、病毒感染、調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡以及B和T淋巴細胞的抗原刺激的信號傳導it(Ghosh,1998,Annu.Rev.Immunol.；Karin,1999,J.Biol.Chem.；Israel,2000,TrendsCellBiol.；Santoro，2003，EMBOJ·)。在哺乳動物細胞中，存在5種二聚體化的NF-κB家族成員:RelA、RelB、c_Rel、NF-κB2/pl00/p52和NF-κBl/pl05/p50。NF-κB的主要的形式是由Ρ50和RelA亞基組成的異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，在靜止細胞中，其仍然通過與蛋白抑制家族成員例如為人們所熟悉的IκB相結(jié)合而被保留在細胞質(zhì)中。一旦受到一些因子包括細胞因子TNF-α和白介素-1、內(nèi)毒素(LPS)、微生物和病毒感染的刺激，促炎癥信號就匯集于經(jīng)典的IκB激酶復合物(IKK)，這是由兩個激酶亞基IKKa/IKK-I和ΙΚΚβ/IKK-2以及一個結(jié)構(gòu)性/調(diào)節(jié)性亞基ΝΕΜΟ/ΙΚΚ-γ組成的蛋白復合物。一旦活化的IKK復合物磷酸化IkB蛋白，會引發(fā)它們的泛素化(ubiquitination，遍在蛋白化)和隨后的被蛋白酶體降解。釋放的NF-KB轉(zhuǎn)錄因子被移位至細胞核中，啟動或上調(diào)基因表達。盡管IKKa和IKKβ呈現(xiàn)出驚人的結(jié)構(gòu)相似性(52%)，但是遺傳學研究已經(jīng)表明它們涉及到激活NF-kB的兩個途徑(Pomerantz，2002，MolCell)。ΙΚΚβ是負責經(jīng)典的NF-κB復合物活化的促炎癥激酶，反之IKKα與NF-κB誘導激酶(NIK)結(jié)合，在非經(jīng)典的NF-κB信號傳導途徑中起著重要的作用(Senftleben，2001，Science)。IKKα也在角質(zhì)細胞分化上起著一定的作用，但是這個過程與其激酶活性無關(guān)(Hu，2001，Nature)。NEMO蛋白(MF-κBessentialmodulator，NF-κB基本的調(diào)節(jié)劑)在NF-κB途徑活化中起著關(guān)鍵的作用。NEMO蛋白與IKK復合物的IKKα和ΙΚΚβ蛋白激酶相結(jié)合。IKK激酶經(jīng)過未知的機制被磷酸化活化，這被認為是NEMO寡聚化的結(jié)果(Agouetal.,2004,J.Biol.Chem.)。NEMO蛋白的存在是IKK活化的基礎，因為NEMO缺陷型細胞不能應答于許多刺激而激活NF-κB。應答于促炎癥刺激而引發(fā)IKK活化的生化機制仍然不清楚。已經(jīng)證明了活化T環(huán)上的兩個絲氨酸殘基的磷酸化引發(fā)了ΙΚΚβ的活化。但是，引起磷酸化的機制仍然是未知的。一個可能的機制包括NEMO寡聚化誘導的激酶的構(gòu)型的改變(Agouetal.,2004,J.Biol.Chem.)。這種寡聚化狀態(tài)的改變可能通過反式-自磷酸化的機制而誘導T環(huán)的活it(Zandi,1997,Cell；Tang，2003，J·Biol·Chem·)。與IKK活化中的NEMO寡聚化的作用相符合的是，在應答于許多刺激物的NEMO缺陷型細胞的活化中，最小的寡聚化結(jié)構(gòu)域的突變不能通過基因互補來解救NF-KB。此外，NEMO的強制的寡聚化導致了IKK復合物的完全活化(Inohara，2000,J.Biol.Chem.；Poyet,2000，J，Biol.Chem.；Poyet,2001，J.Biol.Chem.)。最近，已經(jīng)有報道應答于TNF-α的NEMO的憐酸化禾口泛素化(Carter,2001,J.Biol.Chem.；Trompouky,2003,Nature；Kovalenko,2003,Nature)。但是，還沒有證明這些NEMO的修飾是應答于一些促炎癥刺激物IKK復合物活化的關(guān)鍵步驟。NF-κB活化的抑制組成了開發(fā)抗炎癥和抗癌癥藥物的特別的靶點(May，2000，Science；Poulaki,2002,AmJPathol)。在NF-κB信號傳導途徑的許多蛋白作用劑中，IKK復合物代表著用于發(fā)現(xiàn)新的特異性NF-KB抑制劑的最有希望的分子靶點之一。為了使得體內(nèi)可能的毒性最小化，治療的成功將極大地依賴于NF-κB抑制劑阻斷活化信號而不改變NF-KB活性的基礎水平的能力。May等人描述了細胞滲透性的肽抑制劑，其通過破壞組成性的NEMO與IKK激酶的相互作用來特異性地阻斷促炎癥NF-κB活化(May，2000,Science；May,2002,J.Biol.Chem.)。通過肽的合理的設計改變蛋白的功能而調(diào)節(jié)蛋白與蛋白間的相互作用，為新型的治療性藥物的基礎研究和開發(fā)提供了重要的工具(Souroujon，1998，NatBiotechnol.)，尤其是呈現(xiàn)可變的并且動態(tài)結(jié)合特性的信號傳導蛋白(Pawson，2003,Science)。在文獻中已經(jīng)描述了肽調(diào)節(jié)劑的大量的研究，其中肽通過干擾定位(轉(zhuǎn)移)(Lin,1995,J.Biol.Chem.)、匯集于受體(Chang，2000，J.Biol.Chem.)、分子內(nèi)相互作用(Souroujon,1998,NatBiotechnol.)以及寡聚化(Judice,1997,P.N.Α.S.)來調(diào)節(jié)蛋白的功能。在寡聚化中，用不同的肽抑制HIV-lgp4融合蛋白提供了概念上的明確驗證(對其綜述見Chan,1998，CellandEckert，2001，Ann.Rev.Biochem.)。因此，NEMO蛋白是用于發(fā)展新的抑制NF-κB途徑的藥物的很有希望的靶點，因為它整合和協(xié)同了大多數(shù)NF-KB刺激，并且它不是IKB激酶復合物(IKK)的多余的成分。NEMO蛋白的氨基酸序列表明這個蛋白是由幾個結(jié)構(gòu)域組成(Agouetal.,J.Biol.Chem.，2004b)。簡而言之，多肽的N末端部分包含一個大的卷曲螺旋基序(coiled-coilmotif,CCl)并且所有的殘基都參與了蛋白質(zhì)與IKK激酶的相互作用(IKK結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。C末端部分(殘基250-412)由兩個連續(xù)的卷曲螺旋基序CC2(殘基253-285)和LZ(殘基301-337)、以及蛋白質(zhì)C末端的極遠端的鋅指基序所組成，具有作為蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)部分的作用，已經(jīng)經(jīng)常有報道其作為結(jié)合模板來連接許多上游的信號傳導分子或病毒蛋白(Ghosh,1998，Annu.Rev.Immunol.；Santoro,2003，EMBOJ.)。有趣的是，主要是在分子的這個部分發(fā)現(xiàn)了引起色素失調(diào)癥(IP)和有免疫缺陷的外胚層發(fā)育不良(EDA-ID)的突變(DOffinger52001,NatureGen.；Zonana，2000，Am.J.Hum.Genet)。NEMO的最小的寡聚化結(jié)構(gòu)域(MOD)由CC2和LZ卷曲螺旋基序組成(Agouetal.，J.Biol.Chem.，2004a)。MOD結(jié)構(gòu)域也包含NLM基序(ΝΕΜ0樣基序)(293-322)(Agouetal.，2004b)。上面顯示的殘基編號是相對于序列SEQIDNO:1的小鼠NEMO蛋白而言的。對于人的NEMO蛋白，CC2、LZ和NLM結(jié)構(gòu)域分別對應于序列SEQIDNO2的殘基260-292、殘基301-344和殘基300-329。本發(fā)明人以前合成了來源于NEMO的MOD結(jié)構(gòu)域的肽，其通過抑制NEMO寡聚化能抑制NF-κB途徑(專利申請WO2005/027959)。實際上，序列SEQIDNO:6和SEQIDNO7的spLZ肽分別對應于小鼠和人的NEMO蛋白的LZ結(jié)構(gòu)域，并且序列SEQIDNO8和SEQIDNO9的spCC2肽分別對應于小鼠和人的NEMO蛋白的CC2結(jié)構(gòu)域，spLZ肽和spCC2肽在IC50的μM范圍內(nèi)抑制NF-KB活化(W02005/027959,Agouetal.，2004b)。其他來源于NEMO的LZ基序的N末端序列的肽NLM和DR-NLM，也抑制NF-κB活化。在國際PCT專利申請WO2005/027959中也報道了它們的IC5tl值。DR-NLM肽的長度是LZ肽長度的一半(國際PCT專利申請WO2005/027959)。肽NLM(SEQIDNO10)和DRNLM(SEQIDNO11)對應于序列SEQIDNO1的殘基294-314，它們的不同之處是在DRNLM中序列SEQIDNO1的304位的天冬氨酸Asp殘基被精氨酸Arg殘基取代。來源于人的NEMO蛋白的NLM和DRNLM被分別限定為序列SEQIDNO18和SEQIDNO:12。WO2005/027959和Agou等人(2004b)的方法都使用了體內(nèi)細胞水平分析系統(tǒng)來確定特定的物質(zhì)是否影響核因子-κB途徑。尤其是他們使用內(nèi)源的NF-KB-IacZ報告基因進行NF-κB抑制試驗來確定不同的肽，比如CC2和LZ結(jié)構(gòu)域，對NF-κB途徑的影響。這種體內(nèi)細胞水平分析試驗已知有許多不利因素，尤其是由于需要維持合適的細胞系和確保影響試驗的所有相關(guān)因子保持在必需的參數(shù)之內(nèi)的復雜性。因此，使用這種體內(nèi)分析試驗進行化合物的大規(guī)模篩選與體外篩選技術(shù)相比起來，是既費時、復雜又昂貴的。出乎意料的，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MOD結(jié)構(gòu)域既可以作為寡聚化結(jié)構(gòu)域又可以作為多聚泛蛋白鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述的NEMO結(jié)構(gòu)域的雙重性允許人們搜索一些新的化合物，這些化合物通過調(diào)節(jié)(增強或破壞)NEMO寡聚化或通過調(diào)節(jié)(增強或破壞)ΝΕΜ0和多聚泛蛋白鏈之間的相互作用，特異性地調(diào)節(jié)NF-κB信號傳導途徑。實際上，在LZ通過破壞NEMO寡聚化來抑制NF-KB活化的同時，DRNLM通過阻斷多聚泛蛋白鏈與NEMO蛋白之間的相互作用而起到NF-κB抑制劑的作用。這些結(jié)果也對NEMO的NLM結(jié)構(gòu)域提供了新的視野，NLM結(jié)構(gòu)域?qū)鳱EMO功能所必需的新的和關(guān)鍵的泛素(遍在蛋白)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。更加重要的是，這些結(jié)果使人們可以限定NEMO的“熱點”區(qū)域，其可以被使用為病毒篩選的靶點。以前描述過NEMO-多聚泛蛋白之間的相互作用；Godha等人(2007)描述過人T細胞白血病病毒類型l(HumanI-cellLeukaemiaVirustype1，HTLV-1)激活NF-κB途徑的機制的體內(nèi)研究。作者的研究表明，MAP激酶TAKl誘導NEMO的K63多聚泛蛋白化，他們相信這至少是HTLV-I影響NF-κB途徑的機制之一。同樣，周等人(2004)也描述了BcllO過量表達對NF-κB途徑的影響的研究。尤其是，他們的研究顯示了BcllO過量表達使得NEMO成為K63多聚泛蛋白化的靶點，并且使用了體外泛素化測試來證明了這一點。Godha等人(2007)和周等人(2004)都使用了全長的NEMO作為多聚泛蛋白的靶點ο但是，本發(fā)明人在他們的工作中發(fā)現(xiàn)，只包含NEMO的基本的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的肽可以被用在方法中來識別NEMO活性的調(diào)節(jié)劑。通過只使用NEMO的基本部分，這就允許進行更靈敏的測試來發(fā)現(xiàn)可與這些NEMO最重要部分和遍在蛋白相互作用的調(diào)節(jié)劑，而不是與NEMO其他的或許沒有特定功能的部分之間的普通的相互作用?？紤]到NEMO在炎癥反應、腫瘤發(fā)生和病毒感染以及NF-KB信號途徑的復雜性上的作用，這就需要初步篩選能通過破壞任何NEMO與其他蛋白之間相互作用(即寡聚化或NEMO與多聚泛蛋白鏈之間的相互作用)而起作用的物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于選擇特異性地調(diào)節(jié)(活化或抑制)NEMO與其他蛋白相互作用的分子的篩選測試方法。更具體地說，所述的篩選測試方法使用NEMO的MOD結(jié)構(gòu)域來檢測新的有效的和特異性的NF-κB途徑活化的調(diào)節(jié)劑。因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種初步篩選NF-κB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的體外方法，其特征在于，其包括下列的步驟(a)在不存在被測試的物質(zhì)S的情況下，將(i)由NEMO的CC2和LZ區(qū)域組成的肽Pl與(ii)被標記的或沒有被標記的肽P2相接觸，所述的肽Pl是被標記的或沒有被標記的，所述肽P2選自下組含有NEMO的LZ區(qū)域中至少10個氨基酸殘基、優(yōu)選NEMO的LZ區(qū)域中至少36個氨基酸殘基的肽，含有NEMO的NLM區(qū)域中至少10個氨基酸殘基、優(yōu)選NEMO的NLM區(qū)域中至少21個氨基酸殘基的肽，含有DR-NLM的肽，含有NEMO的CC2和LZ區(qū)域的肽，含有NEMO的CC2區(qū)域中至少10個氨基酸殘基的肽，以及含有由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白化鏈的肽；(b)在有被測定的物質(zhì)S存在的情況下，將被標記的或沒有被標記的所述肽Pl與被標記的或沒有被標記的所述肽P2相接觸；(c)通過測定合適的信號來檢測步驟(a)中得到的Pl與P2之間形成的復合物；(d)通過測定合適的信號來檢測步驟(b)中得到的Pl與P2之間形成的復合物；(e)比較(C)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，并且選擇(C)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“區(qū)域”和“結(jié)構(gòu)域”是可互換的。NEMO的CC2和LZ區(qū)域(或結(jié)構(gòu)域)如上所述。優(yōu)選地，Pl選自下組序歹丨JSEQIDNO17的肽spCC2-LZ、序列SEQIDNO19的肽spCC2-LZ、序列SEQIDNO1的小鼠NEMO蛋白、序列SEQIDNO2的人NEMO蛋白、序列SEQIDNO28的生物素標記的CC2-LZ肽、序列SEQIDNO29的生物素標記的人源化CC2-LZ肽、序列SEQIDNO:30的六聚組氨酸標記的(sixhis-tagged)CC2-LZ肽以及序列SEQIDNO31的六聚組氨酸標記的人源化CC2-LZ肽。優(yōu)選地，P2選自由序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO6至12、SEQIDNO17至19、SEQIDNO28至31的肽所組成的組。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的肽可以如同在專利申請WO2005/027959中和Agou等人(2004b)所描述的那樣被合成。前綴“sp”(syntheticpolyp印tide，合成的多肽)指的是上述肽是合成的，并且可被用來舉例區(qū)分肽(例如spCC2)和NEMO蛋白中相應的區(qū)域(例如CC2區(qū)域)。然而，肽和sp肽指的都是相同的產(chǎn)物。此外，在不精確地說明的情況下，不同的肽，小鼠的NEMO蛋白和人的NEMO蛋白沒什么不同。優(yōu)選地，所述由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白化分子選自下組由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈，例如K63Ub2-7(BostonBiochem,Inc)；與由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈相連接的蛋白，例如多聚泛蛋白化蛋白RIPl(受體相互作用蛋白激酶1)(Eaetal.,2006)；以及包含由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白化蛋白的細胞提取物，例如來源于在前被TNF-α刺激的JM4.5.2細胞的細胞提取物。在所述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述肽Pl被固定在固相載體上。優(yōu)選地，所述固相載體由磁性小珠組成。優(yōu)選地，肽Pi連接至生物素基團并且被固定在鏈親和素磁性小珠上。優(yōu)選地，通過蛋白質(zhì)印跡、熒光各向異性、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或者均相時間分辨熒光(HTRF)來檢測步驟(c)和(d)中的信號。在所述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述肽Pl沒有被標記，并且所述肽P2被熒光標記物Ml標記。優(yōu)選地，所述標記物Ml選自由綠色熒光蛋白(GFP)、青色熒光蛋白、黃色熒光蛋白以及包含馬來酰亞胺基團的熒光團所組成的組。在Shaner等人(Nat.Biotech.，2004，22，1567)中的文獻描述過其他的熒光標記物的例子。其他可以被使用的熒光團包括CFP/ds紅禾口/或GFP/ds紅(Ericksonetal.，BiophysJ.，2003，85，599-611)以及橙色類型的青色變體(Karawawaetal.，BiochemJ.，2004，381(Ptl)，307-12)。包含馬來酰亞胺基團的熒光標記物的例子是BodipyFLN-(2-氨乙基)馬來酰亞胺熒光團(分子探針)。優(yōu)選地，所述被標記的肽P2選自由序列SEQIDNO:4、5和13至16的肽所組成的組。在所述方法另一個優(yōu)選的實施方式中，所述肽P1被標記物M2標記，并且所述肽P2被標記物M3標記，M2和M3是一對熒光團供體和熒光團受體。熒光團供體-熒光發(fā)生團受體對的例子是銪穴狀化合物-XL665(Cis-Bio)對和Cy5/5(GEHealthcare)-BHQ3(BiosearchTechnologies)對。優(yōu)選地，使用的雜合蛋白構(gòu)建體以便將肽Pl和/或P2或直接連接至、或通過連接分子(例如短肽)連接至熒光蛋白。連接可以發(fā)生在肽的N末端和C末端，優(yōu)選的情況是增加的連接并不妨礙Pl和P2之間的結(jié)合。例如使用FRET方法，能夠通過直接檢測由于兩個不同的標記物(熒光團供體和熒光團受體)的靠近而產(chǎn)生的熒光團受體的熒光發(fā)射，來檢測Pi與調(diào)節(jié)(活化或抑制)其結(jié)合至P2的物質(zhì)之間的相互作用。在物質(zhì)S存在的情況下熒光團受體的熒光發(fā)射的減少，與在不存在所述物質(zhì)S的情況下所述熒光團受體的熒光發(fā)射相比較表明，所述物質(zhì)S妨礙了Pl和P2之間的結(jié)合。因此，熒光發(fā)射的減少表明所述的物質(zhì)S妨礙了Pl和P2的結(jié)合，同時所述熒光發(fā)射的增加表明所述的物質(zhì)S增強了Pl和P2的結(jié)合。優(yōu)選地，M2由第一標簽和抗所述第一標簽并且被熒光團供體標記的抗體所組成，而M3由第二標簽和抗所述第二標簽并且被熒光團受體標記的抗體所組成，所述的兩個標簽是互不相同的。優(yōu)選地，標記物M2的所述標簽是聚His序列，并且標記物M3的所述標簽是生物素。在所述方法的進一步優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化劑，并且步驟(e)包括比較(C)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、并且選擇(C)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。在所述方法的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、并且選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S。在其中肽P2表示包含由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈的肽的情況中，肽Pl優(yōu)選自由包含NEMO的NLM區(qū)域中至少10個氨基酸(優(yōu)選至少21個氨基酸)的肽、以及包含DRNLM的肽所組成的組。優(yōu)選地，所述肽Pl選自由序列SEQIDN0:l、2、10、17至19以及28至31的肽所組成的組。因此，在這種情況下，一種初步篩選NF-κB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于，其包括下列的步驟(a)在不存在測定的物質(zhì)S的情況下，將(i)選自由包含NEMO的NLM區(qū)域中至少10個氨基酸的肽(優(yōu)選至少21個氨基酸)、包含DRNLM的肽所組成的組的肽P1，與(ii)包含由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈的肽P2相接觸，所述肽Pl是被標記的或是沒有被標記的，所述P2是被標記的或是沒有被標記的；(b)在有被測定的物質(zhì)S存在的情況下，將被標記的或沒有被標記的所述肽P1，與被標記的或沒有被標記的所述肽P2相接觸；(c)通過測定合適的信號來檢測步驟(a)中得到的Pl與P2之間形成的復合物；(d)通過測定合適的信號來檢測步驟(b)中得到的Pl與P2之間形成的復合物；(e)比較(C)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，并且選擇(C)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。優(yōu)選地，所述肽Pl選自由序列SEQIDNO:1、2、10、17至19以及28至31的肽所組成的組。優(yōu)選地，所述包含由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白化鏈的肽P2，被固定在固相載體上，如上所述。優(yōu)選地，用熒光標記物Ml標記所述肽P2，如上所述，并且檢測步驟(c)和(d)中的信號，如上所述。在所述方法的優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化劑，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號、并且選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。在所述方法的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、并且選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S?？晒┻x擇地，用于初步篩選NF-κB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的方法，包括下列的步驟(a)將包含NEMO的CC2和LZ區(qū)域的肽Pl和要測定的物質(zhì)S相接觸，所述的肽Pl用標記物熒光團供體M2和熒光團受體標記M3，即既連接熒光團供體又連接熒光團受體；(b)在不存在被測試的物質(zhì)S的情況下測定熒光發(fā)射；(c)在有被測試的物質(zhì)S存在的情況下測定熒光發(fā)射；(d)比較(b)中檢測的信號與(C)中檢測的信號，并且選擇(b)中檢測的信號/(c)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。優(yōu)選地，步驟(c)和(d)中的所述的信號如上所述用FRET或者HTRF來檢測。優(yōu)選地，所述熒光團供體連接至CC2區(qū)域的N末端，并且所述熒光團受體連接至LZ區(qū)域的C末端。在所述可供選擇的方法的優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化齊U，并且步驟(d)包括比較(b)中檢測的信號與(C)中檢測的信號、并且選擇(b)中檢測的信號/(c)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。在所述可供選擇的方法的的優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，并且步驟(d)包括比較(b)中檢測的信號與(C)中檢測的信號、并且選擇(b)中檢測的信號/(c)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S?？晒┻x擇地，用于初步篩選NF-KB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于，其包括下列的步驟a)提供至少一種內(nèi)源NEMO不足的細胞，其被一個或多個多聚核苷酸轉(zhuǎn)化，該多聚核苷酸表達至少如本發(fā)明第一個目的所限定的肽Pl和肽P2；b)將物質(zhì)S施加于所述的至少一種細胞；c)通過測定合適的信號，檢測在不存在物質(zhì)S的情況下Pl和P2之間復合物的形成；d)通過測定合適的信號，檢測在存在物質(zhì)S的情況下Pl和P2之間復合物的形成；e)比較(C)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，并且選擇(C)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。在該可供選擇的方法的優(yōu)選的實施方式中，Pl是融合蛋白GFP-NEMO并且P2是融合蛋白Flag-NEMO，F(xiàn)lag是親水的8個氨基酸殘基的肽(SEQIDNO23)。優(yōu)選地，Pl被限定為序歹IjSEQIDNO:27，并且P2被限定為序列SEQIDNO:25。在該可供選擇的方法的另一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(c)和(d)包括Cl)(或dl)細胞裂解，c2)(或d2)使用抗Flag-NEMO中Flag部分的抗體，免疫沉淀結(jié)合于或沒有結(jié)合于GFP-NEMO的Flag-NEMO，以及c3)(或d3)檢測結(jié)合于被免疫沉淀的Flag-NEMO的GFP-NEMO中GFP部分的熒光發(fā)射。在所述可供選擇的方法的優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化齊U，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號、并且選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。在所述可供選擇的方法的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、并且選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種第二次篩選NF-κB途徑活化的抑制劑的方法，包括a)通過按如上本發(fā)明所述的任何用于初步篩選潛在的抑制劑的方法，選擇可能抑制NF-κB途徑活化的物質(zhì)S，b)在不存在或存在(a)中被選擇的物質(zhì)S的情況下，將NF-κB途徑的活化劑施加于包含處于NF-κB誘導的啟動子控制之下的報告基因的細胞；c)在不存在物質(zhì)S的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；d)在有物質(zhì)S存在的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；以及e)比較(C)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，并且選擇(C)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)。優(yōu)選地，步驟c)中使用的NF-κB途徑的所述活化劑選自下組TNF_α、IL-Iβ、ΡΜΑ、離子霉素以及來自于流產(chǎn)沙門氏菌(Salmonellaabortus)的LPS。報告基因優(yōu)選自由編碼β-半乳糖苷酶的IacZ基因、以及編碼熒光素酶的Iuc基因所組成的組。報告基因優(yōu)選處于包含SRE序列(SerumResponseElement，血清效應元件)的啟動子的控制之下。在專利申請WO2005/027959和在agou等人2004b中描述過這種構(gòu)建體。在用于第二次篩選的該方法的優(yōu)選實施方式中，所述的細胞是70Z/3-C3細胞，于2003年4月1日以保藏號1-3004保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes,(C.N.C.M·))。在另一個優(yōu)選的實施方式中，所述細胞是T淋巴細胞或者MEF細胞(小鼠胚胎纖維原細胞)，其包括NF-κB途徑的報告系統(tǒng)。優(yōu)選地，經(jīng)過如同本發(fā)明所述方法選擇的NF-KB途徑活化的所述抑制劑，是NF-κB途徑的特異性抑制劑，其并不抑制ERK和p38途徑活化、NF-AT途徑活化、以及APl途徑活化。因此，用于篩選的第二個方法優(yōu)選地包括附加的步驟來確定被選擇的抑制劑是否作用于ERK和p38途徑、NF-AT途徑以及APl途徑。通過所述方法選擇的抑制劑是那些不抑制ERK、p38、NF-AT以及APl途徑活化的抑制劑。例如使用處于相應的途徑誘導的啟動子控制之下的報告基因，可以進行ERK和P38途徑、NF-AT途徑以及APl途徑的抑制測試。報告基因的例子如上所述。被ERK和p38途徑、NFAT途徑、以及APl途徑誘導的構(gòu)建體的例子分別是SRE-Iuc(Courtoisetal.，1997，Mol.Cell.Biol,171441-1449)、NF_AT_luc以及APl-luc(Northropetal.,1993,J.Biol.Cell.，268=2917-2923)。例如通過使用轉(zhuǎn)化細胞，比如包含相應的構(gòu)建體的、用PMA和離子霉素刺激的細胞，進行報告基因的表達測試。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于第二次篩選NF-κB途徑活化的活化劑的方法，包括a)通過按如上本發(fā)明所述用于初步篩選潛在的活化劑的方法，選擇可能激活NF-κB途徑活化的物質(zhì)S，b)提供包含處于NF-κB誘導的啟動子控制之下的報告基因的細胞；c)在不存在物質(zhì)S的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；d)在有物質(zhì)S存在的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；以及e)比較(C)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，并且選擇(C)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)。報告基因優(yōu)選自由編碼β-半乳糖苷酶的IacZ基因、以及編碼熒光素酶的Iuc基因所組成的組。報告基因優(yōu)選處于包含SRE序列(血清效應元件)的啟動子的控制之下，如上所述。在用于第二次篩選方法的優(yōu)選實施方式中，所述的細胞是70Z/3-C3細胞，于2003年4月1日以保藏號1-3004保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(C.N.C.Μ.)。當通過參照以下的附圖連同下面的詳細說明更好地理解本發(fā)明時，可以容易地獲得對本發(fā)明和其伴隨的許多優(yōu)點的更加完整的認識。圖1肽DR^11對順-1^8活化的抑制1^，經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的702/3義3細胞在用15μg/mlLPS活化4小時之前，與bodipy標記的觸角(Antennapedia)(BA)(黑三角形)、BA_NLM(實心的圓形)以及BA-DRNLM(實心的方形)(0-10μM)—起孵育2小時。用β-半乳糖苷酶(β-Gal)測試來檢測NF-κB活性。插圖，與或沒有與(w/o)10μMBA-NLM或BA-DRNLM肽孵育、有(+)或沒有(_)LPS活化之后的NF-κB活性。B，70Z/C3細胞和10μMBA-NLM或BA-DRNLM肽一起孵育2小時。細胞用⑴或不用㈠PMA或IL-I處理5小時。用β-半乳糖苷酶測試來檢測NF-κB活性。圖2肽BA-DRNLM與肽spCC2_LZ的體外結(jié)合。A，使用熒光各向異性分析BA-DRNLM:spCC2_LZ復合物的形成。插圖使用熒光各向異性分析BR7-DRNLM和spCC2_LZ復合物的形成。B，通過使用熒光各向異性的競爭性測試確定BA-DRNLM結(jié)合于spCC2-LZ的結(jié)合位點。熒光性BA-DRNLM(IOyM)與spCC2-LZ(30μM)—起孵育形成BA-DRNLMspCC2-LZ復合物。然后加入增加濃度的A-NLM(空心圓形)和融合于觸角(antermapedia)序列的LZ的C末端部分(A-Cterm-LZ)(實心方形)，來取代結(jié)合于spCC2_LZ的BA-DRNLM。陰影線代表游離的BA-DRNLM的各向異性水平。圖3肽DRNLM并不影響其他信號傳導途徑。BA-NLM和BA-DRNLM對APl、Erk禾口P38MAPK途徑以及NFAT途徑的抑制影響。經(jīng)不同的報告質(zhì)粒(SRE-luc、APl-luc、NFAT_luc)瞬時轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞與或沒有與(w/o)5μMBA-NLM或BA-DRNLM一起孵育2小時，然后用PMA(100ng/ml)和離子霉素(1μg/ml)模擬刺激㈠或刺激(+)5小時。圖4肽DRNLM與內(nèi)源的NEMO相互作用。A，識別DRNLM肽的蛋白靶點的方法的總覽。B，熒光測定Flag-Nemo覆蓋的小珠。用Flag-NEMO(JM4.5.2/Flag-NEM0)重組的T淋巴細胞不用(w/o)或用顯示的熒光肽處理2小時來使得肽內(nèi)在化。對照肽(BA-LZL322P/L329P)包含野生型NLM序列。接著幾次洗滌細胞以除去多余的肽之后，細胞被裂解并且內(nèi)源的Flag-NEMO經(jīng)使用抗Flag的抗體分離出來。結(jié)合于NEMO的肽的量用熒光檢測(上方左側(cè))。為了歸一化所有的樣品，覆蓋在小珠上的NEMO的量通過使用抗NEMO的抗體的蛋白質(zhì)印跡法來確定(上方右側(cè))，并被用來歸一化所有的樣品(下方)。圖5基于細胞的測試(cell-basedassay)探測不同的肽對NEMO寡聚化的影響的示意圖。圖6:DRNLM肽并不抑制細胞中的NEMO寡聚化。A，GFP-NEMO和FLAG-NEM0形成異寡聚體。B、C，經(jīng)GFP-NEMO和Flag-NEMO共轉(zhuǎn)染的293T細胞用20μM的肽A_LZ、A-LZL322P/L329P(B)、A-NLM或A-DRNLM(C)處理2小時。然后NEMO異寡聚體被免疫純化，并且結(jié)合于異寡聚體的熒光NEMO亞基的量按實施例1.I中所描述的方法通過熒光來檢測。圖7=DRNLM阻礙了細胞多聚泛蛋白化蛋白與包含NEMO的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的肽CC2-LZ之間的相互作用。A，探測多聚泛蛋白化蛋白與肽spCC2-LZ之間的相互作用的方法的總覽。B，結(jié)合于有或者沒有被TNF-α刺激、以及有(+)或者沒有(_)肽BA-NLM或BA-DRNLM的肽spCC2-LZ的多聚泛蛋白化蛋白的蛋白質(zhì)印跡測試。圖8=HTRF測試的優(yōu)化。Α，確定GST_Ub4最優(yōu)化的量。Biot-CC2_LZ和His-CC2-LZ(每個50nM)互相混合在結(jié)合緩沖溶液(20mMKPO4UOOmMKF和0.1%BSA,pH7)中，然后與Anti-His-XL665(7nM)和Str印tavidin_EuK(2nM)—起孵育。接著5分鐘孵化之后，加入不同濃度的GST-Ub4。1小時孵化之后監(jiān)控FRET的信號。B，確定His-CC2_LZ和Biot-CC2-LZ最優(yōu)化的量。Biot-CC2-LZ和His-CC2_LZ的總濃度通過化學計量比1比1在結(jié)合緩沖溶液中一起孵育，然后與Anti-His-XL665(7nM)、Streptavidin-EuK(2nM)禾口GST-Ub4(250nM)混合。1小時的孵化之后記錄FRET的信號。C，DMSO對熒光信號的影響。類似于A的測試，使用濃度是250nM的GST-UB4,不同的是在結(jié)合緩沖溶液中使用了不同濃度的DMSO。具體實施例方式以下將如同發(fā)明人所預期的那樣通過舉例特定的實施方式來描述。在下文的描述中，許多細節(jié)的陳述是為了提供一個深入的了解。但是很明顯，對于本領域的技術(shù)人員，本發(fā)明可以不受這些特定的細節(jié)的限制而進行實施。在其他的情況下，沒有描述那些為人們熟知的方法和結(jié)構(gòu)，免得不必要地使說明書變得不清楚。實施例實施例1-材料和方法A.-細胞培養(yǎng)、生物試劑和抗體檢測細胞培養(yǎng)中使用的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen)和胎牛血清(Biowest)中沒有內(nèi)毒素污染物。Jurkat(克隆20)細胞維持在添加了10%的胎牛血清的RPMI中。如Agou等人2004b所描述的那樣，穩(wěn)定的細胞系(70Z/3-C3，C.N.C.Μ.1-3004)是在70Ζ/3細胞存在Cxl21aCZ-KB質(zhì)粒的情況下經(jīng)電穿孔之后獲得的，該質(zhì)粒在IacZ報告基因上游起的白介素-2啟動子中含有三個串聯(lián)拷貝的NF-KB結(jié)合位點。它們維持在添加了10%胎牛血清、50μΜβ-巰基乙醇(Sigma)的RPMI1640中。穩(wěn)定的細胞系(JM4.5.2/Flag-NEM0)是NEMO缺陷型T淋巴細胞(JM4.5.2，Harhajetal.2000)在pcDNA3質(zhì)粒存在的情況下經(jīng)電穿孔后獲得的，此質(zhì)粒含有小鼠Flag-NEMO序列(Flag是Sigma提供的序列SEQIDNO23的親水性的8個氨基酸的肽)。人的Jurkat白血病T細胞維持在添加了10%的胎牛血清的RPMI中。人胚胎腎細胞系293T(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；Manassas，弗吉尼亞州)在添加了100個單位/ml的青霉素和鏈霉素(Invitrogen)以及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)。來源于流產(chǎn)沙門氏菌的LPS、佛波醇12-十四酸鹽13-醋酸鹽(PMA)和離子霉素購自Sigma公司，并且重組的小鼠IL-Iβ購自BDPharmingen公司。多克隆的兔抗NEMO血清是來自于R.Weil的禮物，并且特異性抗體經(jīng)免疫親和被純化?？笹FP的多克隆抗體來自于致癌基因?？笷lagM2單克隆抗體以及抗泛素抗體來自Sigma公司。B.-肽合成和純化如以前所描述的那樣合成肽(Agouetal.,2004b)0已經(jīng)在國際專利申請W02005027959報道了肽的序列，并且它們中的一些表示在下面的表I中。91"ΗΗννΛΙσνν^τΗΗΗΗΗΙηΙυSO-/+0981—ι寸S·-工^ν^ΛΙαναν^ΙΗΗΗΗΗΜυ^aHvcwavcyJSV^AI3￥VHH3vaJSVXAIav0v^HQVo'V^THMAVMWHHZo'.iMrsIfmu-mvofs.0-+8f.9lcs000.:。2τ^^α^^ζο'ΜπΗυSTN"aa-v03"<N一3Hvira3vcyHS\rsAIav0vxliro-/+ooz-or-sfN吝0卜幻一3wmI3v0.JSV:iAIav0vlnWTNoia0013Ην3νΛαν^ΑΙαν\τπOl3νΗΗ3νΗανΜΑΙανδν:οSTNAESH03V3STS9>lrsH03VHSTSan30:sv6AaaHvATvuavosooMlaSaMXSlSεΓ0-/+98·5>Γ1ι寸o.sOoATVH3V8I-Iooo!!lasas03sυT3SA3rasoso30TI3^jsojosohsahxshailXaavTaawaaavOdaV^AIaVOYMl"00屮ιΓβοιεεοοο.βοικVoWa^vHHavojayXAIaVbVXlτιTSSAaHSOTXNbssoanoaoTAHXHaAsoaoTlnoaYTSMVoaYoilavJiAIΗνΗανοαν^ΑΙανν^^ανανχτχΜΛΟΙΜΗΗζ.ΛνΙΙο'Ηυ8，0+l6T9083908寸!SSi^iZaISaSmΖ-ν(Va)zso+i9soo<ns.sgfN^ον-Λιαορο:ONQ:OK6aws(Λα)(Sa)aHsSssfOswz_±φ劁洱ΦΙ尿IfcSs蘅雙njO2-01<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>P.-NF-κB抑制測試在450μ110%FCS-RPMI(Invitrogen)中4.5x10s個70Z/3-C3細胞與0-20μM肽BA-DRNLM或BA-NLM—起孵育。在37°C下2小時后，200μ1的細胞樣品被一式兩份地轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板上。一個孔用lyg/mlLPS、20ng/mlILl-β或100ng/mlPMA處理4小時。對照孔不被處理。在37°C下4小時后，細胞在室溫下以400xg離心5分鐘，沉淀物用冷的PBS(200μ1)洗滌三次，并且細胞在100μ1的裂解緩沖液(25mMTris-磷酸鹽緩沖溶液，pH7.8，含有8mMMgCl2、ImM二硫赤蘚糖醇、1%TritonX-100、15%甘油和蛋白酶抑制劑混合物(RocheAppliedScience,ref.1836145))中被裂解。裂解液在4°C下以IOOOxg離心20分鐘，并且在進行β-半乳糖苷酶測試之前上清液被保存在冰上。用50μ1的上清液在含有4μ1的Galacton-star化學發(fā)光的底物和196μ1的反應緩沖溶液(Clonetech)的測試混合物中進行半乳糖苷酶測試。用平板發(fā)光計(Berthold)來測定活性。Ε.-其他信號傳導涂徑的抑制測試通過DEAE-葡聚糖方法用含有熒光素酶的報告質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染JurkatT細胞(克隆20)，熒光素酶處于ERK和ρ38途徑(SRE-Iuc；Courtoisetal.,1997,Mol.Cell.Biol,171441-1449)、NF-AT途徑或API途徑(分別是NF-AT-luc和APl-Iuc；Northropetal.，1993,J.Biol.Cell.，268=2917-2923)誘導的啟動子的控制之下。簡而言之，細胞被洗滌并且以IO7個細胞/ml再懸浮在含有0.5mg/mlDEAE-葡聚糖(Pharmacia)的TBS中。加入1^8每2·IO6個細胞的報告質(zhì)粒。在室溫下45分鐘后，用10個體積的TBS稀釋細胞、離心、并且將細胞以IO6個細胞/ml再懸浮在10%FCS-RPMI中。24小時后，細胞與或沒有與5μMNEMO衍生肽(BA-NLM或BA-DRNLM)f桴育2小時。它們用100ng/mlPMA禾口1μg/ml離子霉素刺激或模擬刺激5小時，最后在熒光素酶緩沖溶液(25mMTris-磷酸鹽，pH7.8，含有8mMMgCl2UmM二硫赤蘚糖醇、TritonX100、15%甘油)中裂解。用Berthold發(fā)光計進行熒光素酶的測定。F.-熒光各向異性用裝配了用于激發(fā)和發(fā)射的偏振濾光鏡的QuantaMaster熒光計(PTI)，并使用L構(gòu)型的光電倍增管進行各向異性測定。所有的測試在22°C下微量比色池(60μ1)中，激發(fā)和發(fā)射波長在495和513nm處進行。激發(fā)和發(fā)射波長的帶通分別是2和4nm。如Agou人2004a所描述的那樣測定表示為毫各向異性單位的穩(wěn)定狀態(tài)的熒光各向異性。在含有20mMKCl的pH8的等離子緩沖溶液(IOmM乙酸、IOmMMES、20mMTris)進行測定。每個數(shù)據(jù)點是2分鐘內(nèi)采集的20個記錄的結(jié)果。G.~圓二餼譜學用Aviv215分光偏振計對稀釋在pH7的IOmMNaPO4中的樣品進行遠紫外圓二色性(CD)測定。H-識別結(jié)合于Bodipy連接的肽的蛋白5·IO6個JM4.5.2/Flag-NEM0細胞接種于6孔板上(3ml/孔)并且在37°C下與20μMBodipy連接的肽(BA-NLM或BA-DRNLM)一起孵育4小時。細胞以400xg離心5分鐘，再懸浮在低滲緩沖溶液(IOmMTrisHClpH7.9、1.5mMMgCl2UOmMKCl)中，放置在冰上20分鐘，并且通過26G針的幾個通道來裂解細胞。裂解液以15000xg離心20分鐘來澄清，并且80μg的總蛋白與40μ1瓊膠糖抗FlagM2小珠在4°C下一起孵育1小時。Flag-NEMO蛋白用瓊膠糖抗FlagM2小珠通過離心1分鐘被分離下來。小珠再懸浮在100μ1低滲緩沖溶液中，并且NEMO連接的肽的熒光在SAFAS的酶標儀上進行讀數(shù)。NEMO覆蓋的小珠使用抗FlagM2單克隆抗體通過蛋白質(zhì)印跡法進行分析，使用UN-SCAN-IT軟件對樣品進行歸一化。I.-細胞中NEMO寡聚化的抑制通過鈣-磷酸鹽-DNA沉淀法用2μg含有FLAG-NEMO序列(序列SEQIDNO24的pcDNA3-Flag-NEM0)的質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen)和0.7μg含有GFP-NEM0序列(序列SEQIDNO26的pcDNA3-GFP_NEM0)的質(zhì)粒pcDNA3瞬時共轉(zhuǎn)染293T細胞。每個6cm平皿加入空載體直至DNA的總量為4μg。轉(zhuǎn)染后24小時，細胞再懸浮，并且在37°C下與或沒有與20μM的肽(A-NLM或A-DRNLM)一起孵育7小時。細胞再懸浮，并且用PBS洗滌兩次來去除多余的肽，并且如上所述(實施例1.D)在含有蛋白酶抑制劑混合物的150μ1的裂解緩沖溶液中裂解細胞。裂解液在4°C下以15000xg離心20分鐘來澄清。通過Bradford方法用DCBiorad試劑盒來測定澄清的裂解液中的蛋白的量。將IOOyg的總蛋白稀釋于200μ1相互作用緩沖溶液(50mMTrisHClpH7.5,1%tritonXlOOUmMDTE、300mMNaCl)中，并且在4°C下與40μ1瓊膠糖抗FlagM2小珠(Sigma)—起孵育1個小時。用抗FlagM2小珠將寡聚體Flag-NEMO/GFP-NEMO分離下來，并且用相互作用緩沖溶液洗滌兩次。GFP-NEMO的熒光用熒光酶標儀SAFAS在小珠上直接讀數(shù)，并且使用抗Flag、抗GFP和抗NDPK-B的抗體(Kraeftetal.，1996；ExpCellRes；227:63_69)通過蛋白質(zhì)印跡法對澄清的裂解液進行分析來使得結(jié)果歸一化。J.-iR另I丨結(jié)合干句,含NEMO的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的fltCC2-LZ的多聚泛蛋白化蛋白。24·IO7個JM4.5.2細胞在37°C下用或不用10ng/mlTNFa刺激10分鐘，用冷的PBS洗滌兩次，并且按照在實施例1.D中所描述的方法在含有蛋白酶抑制劑混合物的900μ1裂解緩沖溶液中裂解細胞。裂解液在4°C下以15000xg離心30分鐘來澄清。150μ1蛋白在4°C下與150μ1的鏈親和素磁性小珠(MagPrep,Novagen)孵育2小時，此鏈親和素磁性小珠已經(jīng)在4°C下與10μg生物素化的CC2-LZ在有或沒有20μM肽(BA-NLM或BA-DRNLM)的情況下預孵育過1小時。小珠在緩沖溶液A(IOmMHepespH7.5、150mMNaCl,8mM1%(12、10%甘油、0.ImMDDM和ImMDTE)中洗滌4次，并且再懸浮在30μ1含有6M尿素的Iaemmli緩沖溶液中。樣品用抗泛素抗體(Sigma)通過蛋白質(zhì)印跡法進行分析，并且用抗NDPK-B抗體作為加樣對照。κ.-^mM^^m&mmwmnAmimmcc2-lz二聚體化競φ的化合奪勿。均相時間分辨熒光(HTRF)測試試劑，用XL665(MABHis6-XL)標記的抗(His)6單克隆抗體和鏈親和素_銪穴狀化合物(鏈親和素-銪K)購自CIS-Bio。His-CC2-LZ肽(SEQIDNO30和31)如Agou等人2004a所描述的那樣被純化，并且生物素標記的CC2-LZ肽(SEQIDNO28和29)如Wyler等人2007所描述的那樣被化學合成。單遍在蛋白和由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白購自BostonBiochem0編碼在其末端與GST蛋白融合的線性四聚遍在蛋白的cDNA是Y.Dikic的禮物。按照廠商(GEHealthcare)的產(chǎn)品說明，使用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4高流速(GlutathioneSepharose4FastFlow)來純化GST-Ub4。使用酶標儀MithrasLB940(BertholdTechnologies)進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的所有測定。HTRF原理在HTRF測試中，純的His-CC2-LZ蛋白被抗His_XL665的單克隆抗體標記，并且biot-CC2-LZ被鏈親和素-銪K標記。His-CC2_LZ和Biot_CC2_LZ的二聚化導致了供體(鏈親和素-銪K)和受體(抗His-XL665)很接近。一旦銪穴狀化合物在230nm處被激發(fā)之后，在這兩個熒光團之間發(fā)生FRET，并且XL665在665nm處又發(fā)射出特定的長壽命的熒光。所有的測試在25°C下黑色微量培養(yǎng)板Greiner(200yl)上進行。激發(fā)波長是320nm,并且熒光發(fā)射是在620nm處和665nm處進行測定以便對特定的信號歸一化。熒光發(fā)射在50μs延遲之后在兩個波長處記錄下來，這會減少由培養(yǎng)基和游離的受體分子引起的背景噪音。FRET信號使用下面的公式進行計算(1)AF=[(R-Rneg)/Rneg]*100其中R是每個測試中計算的比值([在665nm處的發(fā)射/在620nm處的發(fā)射]*10000)，并且Rneg是陰性對照(即沒有His-CC2-LZ)中相同的比值。簡而言之，His-CC2-LZ和biot_CC2_LZ(每個50nM)蛋白在含有IOOnM氟化鉀和0.1%BSA的結(jié)合緩沖溶液pH7.0的20mM磷酸鉀溶液中互相混合。孵育之后，將鏈親和素-銪K(供體)和抗體抗-His-XL665(受體)分別以濃度2nM和7nM加入至混合物中。對于陰性對照，上面描述的所有的成分都存在于混合物中，除了His-CC2-LZ被結(jié)合緩沖溶液代替之外。在這些條件之下，沒有檢測到超過背景的FRET信號。實施例2-DRNLM肽體外結(jié)合NEMO寡聚化結(jié)構(gòu)域以前的圓二色性和凝膠過濾研究表明，NLM和DRNLM肽沒有形成寡聚化的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，并且在肽的濃度最高達到100μM時仍表現(xiàn)為單體(數(shù)據(jù)沒有顯示)。那么，不像LZ肽，DRNLM肽以及NLM肽是不能自締合的。LZ肽的自締合如Agou等人2004b所描述的那樣。這里，本發(fā)明人確證了在用佛波酯(PMA)、促炎癥細胞因子(IL-I)和內(nèi)毒素(LPS)活化前B-70Z淋巴細胞之后，DRNLM抑制了NF-κB途徑(圖IA和1Β)。對應于不同的刺激測定的IC5tl是相似的(0.9μΜ+/-0.1)。此外，使用各種內(nèi)在化的肽(Tat、觸角Antennapedia、R7、R9)產(chǎn)生了相似的IC5tl值，表明內(nèi)在化不是限制步驟。為了分析DRNLM是否與NEMO的MOD結(jié)合，熒光標記的BA-DRNLM(10μM)與增加濃度的spCC2-LZ孵育，并且用熒光偏振(P)來監(jiān)控復合物的形成，結(jié)果根據(jù)公式A=2Ρ/(3-Ρ)用各向異性(A)表示。SpCC2-LZ的濃度用氨基酸分析來確定(Vinoloetal；2006)。用等溫結(jié)合方程來整合數(shù)據(jù)點，給出的解離常數(shù)是17μM。插圖中，用BR7-DRNLM(IOyM)進行相同的試驗，給出相似的解離常數(shù)(Kd=21μΜ)。DRNLM形成了親合力是17μM并且化學計量是31的穩(wěn)定的MOD/肽復合物(圖2)。這表明DRNLM肽優(yōu)先地與MOD三聚體相互作用。這個相互作用并不依賴于細胞可滲透序列，因為與觸角(肽(BA-DRNLM)或者多聚R7肽(BR7-DRNLM)融合于其N末端的DRNLM表現(xiàn)出相似的解離常數(shù)(圖2A中插圖)。使用模擬MOD數(shù)個區(qū)域的不同的肽通過熒光偏振來定位結(jié)合位點(圖2B)。這個位點對應于NEMO的LZ亞結(jié)構(gòu)域的C末端部分(殘基315-336)。這個位點以前通過點突變分析被確定對于NEMO功能是必需的(Agouetal.,2004a)。在不同的細胞類型中探測DRNLM誘導的NF-κB抑制的選擇性的研究抓住了肽的最吸引人的性質(zhì)。在實施例1.E中描述的抑制測試的結(jié)果在圖3中被描述。它們證明了NLM-DR并沒有取消至少4個其他的途徑，包括在T淋巴細胞中應答于PMA和離子霉素的API、ERK、p38和NF-AT途徑，表明是DRNLM肽不是NLM肽特異性地抑制了NF-κ途徑(圖3)。實施例3-DRNLM在細胞中與NEMO直接相互作用。為了說明觀察到的被DRNLM抑制是否是由于與NEMO的直接相互作用這個問題，我們使用了NEMO缺陷型T淋巴細胞(JM4.5.2細胞系)，其用Flag-NEMO蛋白基因(JM4.5.2/Flag-ΝΕΜΟ)穩(wěn)定重組，如實施例1.A中描述的那樣。在將細胞與BA-NLM-DR熒光標記的肽(20μΜ)或熒光標記的NLM對照(BA-LZL322P/L329P)孵育4小時之后，細胞被裂解并且粗提取物與共價連接于瓊脂糖小珠的抗Flag抗體一起孵育，如實施例1.H所描述的那樣(見圖4A方法的總覽)。接著小珠的分離之后，檢測附著于小珠的熒光，(實施例1.H)，用于分析結(jié)合于NEMO的肽的量(圖4A和4B)。相對于每個樣品中Flag-ΝΕΜΟ蛋白的表達水平，該測試通過蛋白質(zhì)印跡法使用抗FlagM2單克隆抗體歸一化。圖4B顯示，DRNLM特異性地結(jié)合于ΝΕΜ0，表明給定的肽在抑制途徑活化上的作用與它能與NEMO相互作用是完全相關(guān)的。實施例4-DRNLM并不妨礙NEMO的寡聚化。為了更好地分析DRNLM肽對NF-κB途徑的抑制作用機理，本發(fā)明人開發(fā)了一種測試方法來探測細胞中NEMO的寡聚化，如實施例1.I所描述的那樣(見圖5基于細胞的測試的總覽)。為此，使用了兩個分別表達GFP-NEMO和FLAG-NEMO融合蛋白的質(zhì)粒。該質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于人293T細胞中來過量表達外源的GFP-NEMO和Flag-ΝΕΜΟ融合蛋白，并且強化NEMO的寡聚化。細胞然后被送至去污劑裂解，并且如實施例1.I所描述的那樣使用抗Flag瓊脂糖小珠和Flag肽來免疫純化Flag-ΝΕΜΟ蛋白。與小珠相關(guān)的熒光，其來源于異寡聚體中的Flag-ΝΕΜΟ和GFP-NEMO亞基的結(jié)合，可以估計細胞提取物中存在的寡聚物的量。對照物包括GFP-NEMO單獨表達或Flag-ΝΕΜΟ和GFP蛋白的共表達，并不顯示出任何與抗Flag小珠相關(guān)的熒光(圖6A)。BA-LZ肽在體外抑制NEMO的寡聚化(Agouetal.，2004b)。于是，BA-LZ被用作陽性對照來驗證上述熒光細胞基測試。在這些測試條件下，Bodipy的熒光發(fā)射并沒有干擾GFP的熒光發(fā)射的測定。如同圖6B所示，與BA-LZ肽(20μΜ)一起孵育造成了熒光性NEMO亞基的量的急劇下降，表明BA-LZ肽抑制了細胞中的NEMO的寡聚化。相反的是，當使用在卷曲螺旋界面上含有雙突變的同源的肽(BA-LZL322P/L329P)時，或當沒有用肽來處理細胞時，熒光性NEMO亞基的較高含量恢復了。有趣的是，NEMO寡聚物的形成在沒有或有突變的肽(BA-LZL322P/L329P)存在的情況下是一樣的，表明使用該突變的肽沒有觀察到NEMO寡聚物的解離。通過使用細胞水平測試，發(fā)明人檢測了肽BA-DRNLM改變NEMO寡聚化的能力。圖6C顯示了在沒有或有BA-DRNLM肽(20μΜ)的情況下相同的NEMO寡聚物的量，盡管BA-DRNLM能結(jié)合NEMO蛋白。總之，細胞中的試驗指向了不依賴于其寡聚狀態(tài)的NEMO抑制的一個新機制。實施例5-DRNLM在細胞中抑制CC2-LZ與多聚泛蛋白化蛋白之間的相互作用。最近的報告顯示，NEMO也可以作為賴氨酸63聯(lián)接的多聚泛蛋白化的傳感蛋白(Eaetal.2006；Wuetal.，2006)。于是，本發(fā)明人研究了DRNLM是否阻礙了NEMO和K63多聚泛蛋白鏈之間的相互作用。為此目的，他們開發(fā)了一種分離測試方法，使用包含NEMO的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的肽作為誘餌來分離出多聚泛蛋白化的蛋白，如實施例1.J所描繪的和圖7A描繪的那樣。覆蓋在磁性小珠上的生物素化的CC2-LZ(Bio-CC2-LZ)在有或沒有A-NLM或A-DRNLM肽的情況下與來自于被TNF-α刺激的或沒有被刺激的NEMO缺陷型的T淋巴細胞(JM4.5.2細胞系)的粗提取物共孵育。在長時間洗滌小珠之后，所有的結(jié)合于CC2-LZ的單遍在蛋白化和多聚泛蛋白化的蛋白通過蛋白質(zhì)印跡法使用抗遍在蛋白的抗體(Sigma)進行分析。如圖7B所示，DRNLM肽在依賴于TNF-α的情況□下廢除了CC2-LZ與細胞的多聚泛蛋白化的蛋白之間的相互作用，同時在沒有或有NLM肽的情況下，沒有觀察到抑制。這些結(jié)果顯示了多聚泛蛋白化的蛋白與CC2-LZ之間相互作用的大量減少，表明DRNLM肽通過阻斷NEMO和多聚泛蛋白化蛋白之間的相互作用，來抑制NF-κB途徑。相應地，使用熒光偏振的體外結(jié)合測試表明無標記的DRNLM對于Lys63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈的解離常數(shù)和協(xié)同性指數(shù)(希爾系數(shù))(Kd=250μM，n=1)比無標記的NLM(Kd=180μM，n=8)要低。這表明NEMO的NLM肽代表新的遍在蛋白結(jié)合基序，并且在此基序中的簡單的突變D—R導致了NEMO和多聚泛蛋白鏈之間相互作用的完全喪失。以上概括的并結(jié)合于以前在國際專利申請W02005027959中報道的那些結(jié)果表明，包含CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的NEMO區(qū)域可作為寡聚化結(jié)構(gòu)域以及多聚泛蛋白鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域。NEMO結(jié)構(gòu)域的這些雙重特性使得通過使用如實施例1.11a)、b)和c)中所描述的篩選測試方法來破壞NEMO寡聚化，或者通過使用如實施例1.12中所描述的篩選測試方法來破壞NEMO與多聚泛蛋白鏈之間的相互作用，可以搜索新的抑制NF-KB信號傳導途徑的化合物。實施例6-以CC2-LZ寡聚化為基礎的篩選測試A.-搜索為LZ肽結(jié)合于包含NEMO的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的肽CC2-LZ競爭的化合物用SAFASXenius熒光計進行各向異性的測定。所有的測試在20°C下黑色微量培養(yǎng)板Greiner(IOOyl)上于激發(fā)和發(fā)射波長在495和515nm處進行。激發(fā)和發(fā)射波長的帶通是8nm。Bodipy標記的R7-LZ(BR7-LZ)和R7-LZ肽顯示在表I中，并且重組的His-CC2_LZ蛋白如Agou等人2004b所描述的那樣被純化。BR7-LZ(5μΜ)禾口R7-LZ(20μΜ)在25°C下在含有50mMKC1、pH值是8的100μ1Tris/MES緩沖溶液(IOmM乙酸，IOmMMES)中與靶目標His-CC2_LZ(10μM)—起孵育，誘導形成穩(wěn)定的復合物。非熒光肽顯示出與熒光肽一樣的親合力，使得可以增加連接于靶目標的肽的量。在這些測試條件下，His-CC2-LZ的添加導致了各向異性相對于游離的R7-NLM-LZ*BR7-LZ肽(77mA)的各向異性的信號增加了20%，表明了復合物HiS-CC2-LZ:BR7-LZ的形成。His-CC2_LZ/R7-LZ/BR7-LZ混合物然后放置于含有候選藥物化合物的96孔塑料板上。那些能減少熒光各向異性、反應了肽從His標記的CC2-LZ靶目標上解離的化合物被選中。B-搜索誘導含有NEMO的CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的肽CC2-LZ的構(gòu)象轉(zhuǎn)換至無活性的構(gòu)象的化合物為了開發(fā)該篩選測試方法，使用了熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法(FRET)。CC2-LZ肽在其N末端連接了熒光團供體例如Cy5/5(GEHealthcare)并且在其C末端連接了熒光團受體比如BHQ3(BiosearchTechnologies)。使該雙重連接的CC2-LZ與要被測試的分子相接觸，并且測定熒光。那些引起熒光發(fā)射增強的化合物將被選中。C.-捭索抑制CC2-LZ寡聚化的化合物為了更高的通量，也可以建立依賴于均相時間分辨熒光(HTRF)的篩選測試方法。可分別識別生物素和(His)6標記的與銪-穴狀化合物(熒光供體)和XL665(熒光受體)連接的抗體是可以從市場上買到的(Cis-Bioinc.)。His標記的CC2-LZ肽的純化如Agou等人2004b所描述的那樣。生物素標記的CC2-LZ肽是化學合成的或是從重組的大腸桿菌例如AviTag中純化的(Avidity，inc)。此方法的主要的好處是可以支付得起，并且減少了假陽性的風險。實施例7-以多聚泛蛋白結(jié)合CC2和LZ結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)為基礎的篩選測試A.~初步篩詵測試第一步，由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈(K63Ub2_7，BostonBiochem,Inc.)被固定在Ni-NTAHisSord板上(96孔板，Qiagen,Inc)。添加熒光標記的CC2-LZ(例如B-CC2-LZ)或熒光性NLM肽(例如B-DRNLM)，與K63多聚泛蛋白鏈形成熒光性蛋白復合物。那些為CC2-LZ或NLM結(jié)合K63多聚泛蛋白鏈競爭的化合物被認為是陽性的并且被選中。B.-第二次篩詵測試第二步，上述的來源于初步篩選的所有的陽性化合物被送至第二次篩選，如W02005027959專利所描述的那樣使用基于細胞的測試來研究它們對NF-κB抑制的影響。使用的縮寫體ΒΑ-肽，用細胞滲透性序列觸角(antermapedia)融合于其N末端并與bodipy熒光團聯(lián)接的肽；A-肽，觸角(Antermapedia)標記的肽；R7-肽，用細胞滲透性聚陽離子肽RRRRRRR融合于其末端的肽；Tat，含有序列YGRKKRRQRRR的細胞滲透性肽；R9，含有九個精氨酸殘基的細胞滲透性陽離子型肽；spCC-LZ，合成的多肽亞結(jié)構(gòu)域CC2-LZ；DDM,十二烷基麥芽糖苷；MES，嗎啉代乙磺酸；DTE，二硫蘇糖醇。實施例8-搜索與多聚泛蛋白鏈相互作用誘導的CC2-LZ二聚體化競爭的化合物。本發(fā)明人還使用了與設計的錨蛋白錨蛋白重復序列蛋白ResignedAnkyrinRepeatProteins,DARPins)(ffyleretal.,2007)結(jié)合的CC2-LZ二聚體的很好表征的復合物。這些復合物對于CC2-LZ顯示了nM的親合力，并且被用作陽性對照。在這個測試中，His標記的蛋白CC2-LZ被His標記的DARPin1D5(KD=22nM)或His標記的DARPin2F6(Kd=8nM)取代。如同表II所示，可以觀察到FRET信號，具有1D5(290%)和2F6(2749%)DARPins，表明FRET用于識別nM蛋白復合物的作用。表II在HTRF測試中使用的陰性和陽性對照<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>測試中不同的蛋白樣品組合用(+)和(_)表示，被用來測定熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。FRET百分比的計算如上面實施例1中所描述的那樣。因為CC2-LZ二聚體的親合力與DARPin:CC2_LZ復合物的親合力相比較低(Kd=22μM)，所以當CC2-LZ的每個亞基以nM的濃度孵育時沒有觀察到FRET信號(見表II)。但是，當相同的混合物在GST-四聚體遍在蛋白存在的情況下孵育時，就能監(jiān)控到特定的FRET信號，表明與四聚遍在蛋白的結(jié)合誘導了CC2-LZ二聚體的形成。用單遍在蛋白或只用GST來進行同樣的測試。但是，只使用GST或單遍在蛋白沒有檢測到FRET信號(圖8和表III)，表明FRET信號來自于CC2-LZ二聚體和GST-四聚遍在蛋白鏈的特定的相互作用。表III=GST-Ub4的結(jié)合在CC2-LZ二聚體的形成上的作用。鏈親和素-銪I抗His-XL(7nM)|生物素-CC2-LZHis-CC2-LZ|單遍在蛋白|多聚遍在蛋白|GST-Ub4(12.5μM)|FRET(AF%)(2nM)__(50nM)_(50nM)_(1μM)_(12.5μΜ)___+++++一一彡0++++一+一彡0++++~-+373%—為了優(yōu)化HTRF測試，本發(fā)明人還使用了不同濃度的His-CC2_LZ、Biot-CC2_LZ和GST-Ub40圖8A和8B顯示的結(jié)果表明，HTRF試驗中強烈的顯著的FRET信號的最佳條件是40nM生物素-CC2-LZ、40nMHis_CC2_LZ和250nMGST-Ub40此外，本發(fā)明人還顯示了存在高達5%的DMSO最時也不破壞熒光信號(圖8C)?？傊景l(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了強大的和耐用的FRET測試，其使得可以搜索那些為CC2-LZ二聚化和/或為CC2-LZ二聚體特異性結(jié)合多聚泛蛋白鏈競爭的小化合物。參考文獻-Agou,F.,Ye,F.,Goffinont,S.,Courtois,G.,Yamaoka,S.,Israel,A.andVeron,Μ.(2002)NEMOtrimerizesthroughitscoiled-coilC-terminaldomain.J.Biol.Chem.，20，17464-17465.-Agou,F.,Traincard,F.,Vinolo,Ε.,Courtois,G.,Yamaoka,S.,Israel,A.andVeron,M.(2004a)ThetrimerizationdomainofNEMOiscomposedoftheinteractingC-terminalCC2andLZcoiled-coilsubdomains.JBiolChem,279,27861-27869.-Agou,F.,Courtois,G.,Chiaravalli,J.,Baleux,F.,Coic,Y.Μ.,Traincard,F.,Israel,A.andVeron,M.(2004b)InhibitionofNF-kappaBactivationbypeptidestargetingNF-kappaBessentialmodulator(nemo)oligomerization.JBiolChem,279,54248-54257.-CarterRS,GeyerBC,XieM,Acevedo-SuarezCA,BallardDff.(2001)PersistentactivationofNF-kappaBbythetaxtransformingproteininvolveschronicphosphorylationofIkappaBkinasesubunitsIKKbetaandIKKgamma.JBiolChem.Jul6；276(27):24445_8·Epub200IApr26.-ChanDCandKimPS.(1998)HIVentryanditsinhibition.Cell.1998May29；93(5):681-4.Review.Noabstractavailable.-CourtoisG,WhitesideST,SibleyCH,IsraelA.(1996)JBiolCell2682917-2923.-MikeChang,LianshanZhang,JamesP.Tam,andElaineSanders-Bush(2000)DissectingGProtein—coupledReceptorSignalingPathwayswithMembrane-permeableBlockingPeptides.J.Biol.Chem.，Mar2000；2757021-7029.-DOfflnger,R.,Smahi,Α.,Bessia,C.,Geissman,F.,Feinberg,J.,Durandy,Α.,Bodemer,C.,Kenwrick,S.,Dupuis-Girod,S.,Blanche,S.,Wood,P.,Rabia,S.H.,Headon,D.J.，Overbeek，P.Α.，LeDeist，F(xiàn).，Holland，S.，Belani，K.，Kumararatne,D.S.，F(xiàn)isher，Α.，Shapiro，R.，Conley,Μ.Ε.，Reimund，Ε.，Kalhoff，H.，Abinun,Μ.，Munnich，Α.，IsraSl，A.,Courtois,G.andCasanova，J·-L(2001)X-IinkedanhidroticectodermaldysplasiawithimmunodeficiencyiscausedbyimpairedNF-κBsignaling.NatureGenet·，27，277-285.-Ea,C.K.，Deng，L，Xia，Z.P.，Pineda，G.andChen，Z.J.(2006)ActivationofIKKbyTNFalpharequiressite-specificubiquitinationofRIPlandpolyubiquitinbindingbyNEMO.MolCell，22，245-257.-Eckert,D.M.,andKim,P.S.(2001)Mechanismsofviralmembranefusionanditsinhibition.Ann.Rev.Biochem.，70，777—810-Ericksonetal.，BiophysJ.，2003，85，599—611-Ghosh,S.,May,M.J.andKopp,E.B.(1998)NF-kBandRelproteinsevolutionarilyconservedmediatorsofimmuneresponses.Annu.Rev.Immunol.，16，225-260.-JinGohda,MasatoIrisawa，YuetsuTanaka，ShintaroSato,KiyoshiOhtani,Jun-ichiFujisawaandJun-ichiroInoue(2007)HTLV-lTax-inducedNFκBactivationisindependentofLys_63_linked-typepolyubiquitination.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,357:1，225-230.-HarhajiE.W.，Good，L，Xiao，G.,UhlikiM.，Cvijic，M.E.，Rivera—Walsh，I.andSun，S.C.(2000)SomaticmutagenesisstudiesofNF-kappaBsignalinginhumanTcells:evidenceforanessentialroleofIKKgammainNF-kappaBactivationbyT-cellcostim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沒有被標記的所述肽P1與被標記的或沒有被標記的所述肽P2相接觸；(c)通過測定合適的信號來檢測步驟(a)中得到的P1與P2之間形成的復合物；(d)通過測定合適的信號來檢測步驟(b)中得到的P1與P2之間形成的復合物；(e)比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，并且選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，Pl選自由序列SEQIDN0:l、2、17、19、28、29、30、31的肽所組成的組。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，P2選自由序列SEQIDNO=USEQIDNO2、SEQIDNO6至12、SEQIDNO17至19、SEQIDNO28至31的肽所組成的組。4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述肽Pl被固定在固相載體上。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述肽Pl連接至生物素基團上，并且所述固相載體由鏈親和素小珠組成。6.如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)和(d)中的信號通過蛋白質(zhì)印跡、通過熒光各向異性、通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)或者通過均相時間分辨熒光(HTRF)來檢測。7.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述肽Pl沒有被標記，所述肽P2被熒光標記物Ml標記。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述標記物Ml選自由綠色熒光蛋白(GFP)、青色熒光蛋白、黃色熒光蛋白以及包含馬來酰亞胺基團的熒光團所組成的組。9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，被所述標記物Ml標記的所述肽P2選自由序列SEQIDNO:4、5和13至16的肽所組成的組。10.如權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述肽Pl被標記物M2標記，所述肽P2被標記物M3標記，M2和M3是一對熒光團供體和熒光團受體。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，標記物M2由第一標簽和抗所述第一標簽且被熒光團供體標記的抗體組成，標記物M3由第二標簽和抗所述第二標簽且被熒光團受體標記的抗體組成，所述的兩個標簽互不相同。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，標記物M2的所述標簽是聚His序列，所述標記物M3的所述標簽是生物素。13.如權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化劑，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。14.如權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，并且步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S。15.一種初步篩選NF-κB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于，其包括下列的步驟(a)在不存在要測定的物質(zhì)S的情況下，將⑴肽Pl與(ii)包含由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白鏈的肽P2相接觸，所述肽Pl選自由包含NEMO的NLM區(qū)域中至少10個氨基酸的肽、包含DRNLM的肽所組成的組，所述肽Pl是被標記的或是沒有被標記的；所述P2是被標記的或是沒有被標記的；(b)在有被測定的物質(zhì)S存在的情況下，將被標記的或沒有被標記的所述肽P1，與被標記的或沒有被標記的所述肽P2相接觸；(c)通過測定合適的信號來檢測步驟(a)中得到的Pl與P2之間形成的復合物；(d)通過測定合適的信號來檢測步驟(b)中得到的Pl與P2之間形成的復合物；(e)比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述肽Pl選自由序列SEQIDN0:l、2、10和17至19的肽所組成的組。17.如權(quán)利要求1、15和16中任一項所述的方法，其特征在于，所述包含由K63聯(lián)接的多聚泛蛋白化鏈的肽P2被固定在固相載體上。18.如權(quán)利要求15至17中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化劑，步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。19.如權(quán)利要求15至17中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S。20.一種初步篩選NF-κB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的方法，包括下列步驟(a)將包含NEMO的CC2和LZ區(qū)域的肽Pl與要測定的物質(zhì)S相接觸，所述肽Pl被標記物熒光團供體M2和熒光團受體M3標記；(b)在不存在被測試的物質(zhì)S的情況下測定熒光發(fā)射；(c)在有被測試的物質(zhì)S存在的情況下測定熒光發(fā)射；(d)比較(b)中檢測的信號與(c)中檢測的信號，選擇(b)中檢測的信號/(c)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述Pl選自由序列SEQIDN0:l、2、17、19、28、29、30、31的肽所組成的組。22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述熒光團供體M2連接至CC2結(jié)構(gòu)域的N末端，所述熒光團受體M3連接至LZ結(jié)構(gòu)域的C末端。23.如權(quán)利要求20至22中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化劑，步驟(d)包括比較(b)中檢測的信號與(C)中檢測的信號、以及選擇(b)中檢測的信號/(C)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。24.如權(quán)利要求20至22中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，步驟⑷包括比較(b)中檢測的信號與(c)中檢測的信號、以及選擇(b)中檢測的信號/(c)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S。25.一種初步篩選NF-κB途徑活化的潛在的調(diào)節(jié)劑的方法，其特征在于，其包括下列的步驟a)提供至少一種內(nèi)源NEMO缺乏的細胞，其被一個或多個多聚核苷酸轉(zhuǎn)化，該多聚核苷酸至少表達如權(quán)利要求1至3中任一項所述的肽Pl和肽P2；b)將物質(zhì)S施加于所述的至少一種細胞；c)檢測在沒有物質(zhì)S存在的情況下Pl和P2之間復合物的形成；d)檢測在有物質(zhì)S存在的情況下Pl和P2之間復合物的形成；e)比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值不等于1的物質(zhì)S。26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述肽Pl是融合蛋白GFP-NEM0，所述肽P2是融合蛋白Flag-NEMO。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，步驟(c)和(d)包括cl)(或dl)細胞裂解，c2)(或d2)使用抗Flag-NEMO的Flag部分的抗體，使結(jié)合于或沒有結(jié)合于GFP-NEMO的Flag-NEMO免疫沉淀，以及c3)(或d3)檢測結(jié)合于被免疫沉淀的Flag-NEMO的GFP-NEMO中GFP部分的熒光發(fā)射。28.如權(quán)利要求25至27中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的活化劑，步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號，以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)S。29.如權(quán)利要求25至27中任一項所述的方法，其特征在于，所述潛在的調(diào)節(jié)劑是潛在的抑制劑，步驟(e)包括比較(c)中檢測的信號與⑷中檢測的信號、以及選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)S。30.一種第二次篩選NF-κB途徑活化的抑制劑的方法，包括a)通過如權(quán)利要求14、19、24和29中任一項所述的方法，選擇可能抑制NF-κB途徑活化的物質(zhì)S，b)在(a)中被選擇的物質(zhì)S不存在或存在的情況下，將NF-κB途徑的活化劑施加于包含處于NF-κB誘導的啟動子控制之下的報告基因的細胞；c)在沒有物質(zhì)S存在的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；d)在有物質(zhì)S存在的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；以及e)比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值大于1的物質(zhì)。31.一種第二次篩選NF-κB途徑活化的活化劑的方法，包括a)通過如權(quán)利要求13、18、23和28中任一項所述的方法，選擇可能激活NF-κB途徑活化的物質(zhì)S；b)提供包含處于NF-κΒ誘導的啟動子控制之下的報告基因的細胞；c)在物質(zhì)S不存在的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；d)在有物質(zhì)S存在的情況下通過測定合適的信號來檢測報告基因的表達；以及e)比較(c)中檢測的信號與(d)中檢測的信號，選擇(c)中檢測的信號/(d)中檢測的信號的比值小于1的物質(zhì)。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述的NF-KB活化劑選自由TNF-α、IL-Iβ、ΡΜΑ、離子霉素、以及來自于流產(chǎn)沙門氏菌的LPS所組成的組。33.如權(quán)利要求30至32中任一項所述的方法，其特征在于，所述的報告基因是編碼β-半乳糖苷酶的基因IacZ或者編碼熒光素酶的基因luc。34.如權(quán)利要求30至33中任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞是70Z/3-C3細胞，其于2003年4月1日以保藏號1-3004保藏在法國培養(yǎng)物和微生物國家保藏中心(C.N.C.M.)。全文摘要本發(fā)明涉及篩選NF-κB途徑活化的選擇性調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明涉及到通過識別和選擇調(diào)節(jié)NEMO和其他蛋白之間相互作用的分子來初步篩選有可能調(diào)節(jié)(激活或抑制)NF-κB途徑活化分子的方法。本發(fā)明同樣也涉及到第二次篩選NF-κB途徑活化的調(diào)節(jié)劑(活化劑或抑制劑)的方法。文檔編號G01N33/68GK101802619SQ200880104245公開日2010年8月11日申請日期2008年6月20日優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日發(fā)明者伊夫-瑪麗·夸克,弗朗索瓦·巴勒克斯,法布里斯·阿古,米歇爾·韋龍,讓娜·基亞拉瓦利,阿蘭·伊斯拉埃爾申請人:巴斯德研究所;法國國家科學研究中心