專利名稱：：色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及色譜法，并且更具體的，涉及在連續(xù)色i普法中經(jīng)濟(jì)性的加工和生產(chǎn)量的提高。本發(fā)明包含一種使用半連續(xù)色譜法分離目標(biāo)化合物的方法，以及用于進(jìn)行這樣的方法的系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
：在生物制藥領(lǐng)域中，在遺傳工程和細(xì)胞培養(yǎng)工藝中新近的進(jìn)步已經(jīng)驅(qū)動了比以往更高的表達(dá)度(expressionlevels),這給下游的凈化，特別是俘獲步驟帶來了相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)。雖然引入新的色諳樹脂明顯的提高了基于常規(guī)的固定床色譜法的加工效率，但是通過連續(xù)方式的運(yùn)行能夠獲得另外的益處。當(dāng)使用連續(xù)的生物反應(yīng)器例如這些以灌注方式運(yùn)行的反應(yīng)器時，后者是特別吸引人的。在連續(xù)色譜法中，根據(jù)所述方法的需要，將幾個同樣的色譜柱以這樣的排列連接在一起，該排列允許色語柱串聯(lián)的和/或平行的運(yùn)行。因此，全部的色譜柱可以大體上同時運(yùn)行，但是方法步驟稍有變化。該程序可以重復(fù)，以使得每個色譜柱在該加工中填加、洗提和再生幾次。與"常規(guī)的"色譜法相比(在該常規(guī)色語法中，在基于多個同樣的色譜柱的連續(xù)色譜法中，單個色譜循環(huán)是基于幾個連續(xù)步驟的，例如填加、清洗、洗提和再生的)，全部的這些步驟是同時的、但是每個步驟是在不同的色譜柱上發(fā)生的。連續(xù)色譜法運(yùn)行產(chǎn)生了更佳的色鐠樹脂利用率，降低了加工時間和減少了緩沖液的需要，全部這些都有利于經(jīng)濟(jì)性的進(jìn)行加工。連續(xù)色譜法有時候表示模擬的移動床(SMB)色譜法。Bishop等人("SimulatedMovingBedtechnologyinBiopharmaceuticalProcessing，，，Bischops,M.和Pennings,M.，RecoveryBiologicalProductsXI,(2003)Banff，Alberta,加拿大)公開了一種基于模擬的移動床(SMB)技術(shù)的連續(xù)色譜法，其已經(jīng)成功的用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的使用蛋白質(zhì)A親合性樹脂的IgG的凈化。雖然存在著這樣的事實(shí)，即，SMB所提供的多色譜柱和多區(qū)域連續(xù)方案明顯的提高了加工效率，但是SMB系統(tǒng)到目前為止還沒有用于cGMP生物制藥生產(chǎn)中，這主要是因?yàn)閬碜杂布筒僮饔^點(diǎn)二者的系統(tǒng)的復(fù)雜性。Heeter等人(Heeter，G.A.和Liapis,A.I.，J.ChromA，711(1995))已經(jīng)提出了一種基于三柱周期性逆流色諳法(3C-PCC)原理的方法，來作為典型的四區(qū)域SMB系統(tǒng)的替代。更新的，Lacki等人("ProteinACounter-CurrentChromatographyforContinuousAntibodyPurification",Lacki,K.M.和Bryntesson,L.M.，ACS(2004)Anaheim,CAUSA)描述了將這樣的3C-PCC系統(tǒng)用于IgG在MabSele"TM親合性樹脂上的吸收。這種3C-PCC方法比典型的四區(qū)域SMB系統(tǒng)需要更簡單的硬件，并且更容易操作，直接降低了與固定設(shè)備和系統(tǒng)維護(hù)相關(guān)的成本。實(shí)際上，模擬的移動床技術(shù)已經(jīng)在不同的其他領(lǐng)域中應(yīng)用了幾十年。例如，US3291726(UniversalOilProducts)在1966年就描述了一種連續(xù)的模擬的逆流吸附方法，用于石化工業(yè)。US6325940(Daicel)涉及一種模擬的移動床色語法系統(tǒng)，其包含用分離性填料填充的床，通過該方法能夠評價填充床的分離性能，而不需將該填充床從循環(huán)的流體通過中除去。由于該填充床能夠不需除去其而評價，因此能夠檢查所述系統(tǒng)的系統(tǒng)劣化是否是由于色譜柱引起的，并且如果是，則該色譜柱導(dǎo)致了劣化。該系統(tǒng)包含至少四個串聯(lián)連接的并且彼此循環(huán)的填充床和用于加入和取出流體的端口。US5457260(UOPInc.)涉及一種用于才莫擬的移動吸收床分離的控制方法。更具體的，公開了一種方法，其連續(xù)的控制模擬移動吸收床分離方法的至少一種特征。所控制的特征可以是感興趣成分的凈化或者回收。該方法包括測量泵周圍或者驅(qū)動周圍流體中的成分的濃度，計算所述的特征值，和根據(jù)運(yùn)算法則進(jìn)行所需的操作變量的調(diào)節(jié)，該運(yùn)算法則在特征值的變化與由于操作變量的變化導(dǎo)致的成分濃度變化之間建立了聯(lián)系。因此，快速的產(chǎn)生了控制分離所必需的數(shù)據(jù)量，由此提供效率、精度和準(zhǔn)確度。用于可靠的連續(xù)加工的一個基本的因素是所用的色譜柱的質(zhì)量，并且更具體的，是色譜柱之間的類似性乃至同一性。如果色譜柱不同，則理論計算將是不正確的，并且設(shè)計一個有效和有力的連續(xù)色譜加工將變得很困難。同樣，出于按比例增大的考慮，系統(tǒng)中具有同樣的色譜柱是基本的。但是，為了獲得可重復(fù)的結(jié)果，用色譜介質(zhì)填充色譜柱是非常復(fù)雜的。甚至板數(shù)或者其他填充性能小的差異都會對最終的結(jié)果產(chǎn)生巨大的影響。用于大規(guī)模色譜法的預(yù)填充色譜柱是市售的。預(yù)填充色譜柱的優(yōu)點(diǎn)在于供應(yīng)商將已經(jīng)用樹脂填充的色譜柱提供給終端用戶，由此所述的用戶可以將該色譜柱包括到加工中，而不必經(jīng)歷相當(dāng)復(fù)雜的色譜柱填充程序。但是，對于這樣的在連續(xù)色譜法中有用的色譜柱而言；它們需要以非?？量痰囊?guī)格進(jìn)行填充。這樣類似的色譜柱被用于分析等級色譜法，和用于小規(guī)模制備色語法。但是，對于大規(guī)模運(yùn)行來說，這里仍然需要預(yù)填充色譜柱，其具有合適的裝置來連接到這樣的系統(tǒng)，該色譜柱是用苛刻規(guī)格進(jìn)行填充的。在制藥工業(yè)中，生物分子例如蛋白質(zhì)、核酸等通常是通過使用單個色譜柱的常規(guī)色譜法進(jìn)行分離的。但是，即使在單個色譜柱中的安全性和質(zhì)量問題比多個復(fù)雜的構(gòu)造更容易控制，但是人們通常關(guān)注的是使用這樣的常規(guī)色語法所獲得的生產(chǎn)能力。因此，這里在該領(lǐng)域中需要改進(jìn)的色譜法，其提高了目前用單個柱色譜法所獲得的整個的效率和經(jīng)濟(jì)性。
發(fā)明內(nèi)容在一方面，本發(fā)明提供了一種用于半連續(xù)液體色譜法系統(tǒng)的新穎的運(yùn)行原理。更具的，本發(fā)明提供了一種來自流體混合物例如發(fā)酵液的成分中所期望成分的提高的產(chǎn)量。這可以如附加的權(quán)利要求所述來實(shí)現(xiàn)。在具體的一方面，本發(fā)明在液體色譜法中提供了改進(jìn)的色譜性能，該方法包含在洗提(e1uUon)步驟之前，清洗(wash)至少一種目標(biāo)物已經(jīng)結(jié)合到其上的樹脂。在另一方面，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的半連續(xù)色譜法中使用一組至少三個基本相同填充的色譜柱。本發(fā)明另外的方面和優(yōu)點(diǎn)將乂人下面的詳細(xì)i兌明和實(shí)施例中變得顯而易見。圖1表示了根據(jù)本發(fā)明的三個色譜柱周期性逆流(3C-PCC)系統(tǒng)的圖示。圖2表示了在本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)中，在填加色語柱1和2的過程中供料溶液的流程。圖3表示了在本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)運(yùn)行過程中，供料和緩沖液清洗的流程。7圖4表示了在本發(fā)明的3C-PCC運(yùn)行過程中，在一個階段中供料和再生流的流程。圖5表示了根據(jù)本發(fā)明，基于AKTA探測器平臺(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典烏普薩拉)的本發(fā)明目前的3C-PCC圖。圖6表示了在本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)的啟動循環(huán)過程中，來自全部三個色譜柱的流出物流中的記錄信號。圖7表示了在本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)的4.66個完全循環(huán)過程中，來自全部三個色譜柱的流出物流中的記錄信號。圖8表示了如實(shí)施例2所述獲得的色語圖中的記錄信號。定義術(shù)語"供料"指的是一種液體，其包含兩種或者多種待分離的化合物。在本文的上下文中，術(shù)語"化合物"以廣泛的含義用于任何的實(shí)體例如分子，化學(xué)化合物，細(xì)胞等等。術(shù)語"目標(biāo)化合物，，在此表示任何的化合物，其被期望從包含一種或多種另外的化合物的液體中進(jìn)行分離。因此，"目標(biāo)化合物"可以是所期望的化合物例如藥物、診斷劑或者疫苗；或者，可選擇的，污染性或者不期望的化合物，該化合物應(yīng)當(dāng)從一種或多種期望的化合物中除去。術(shù)語"突《皮點(diǎn)"(break-through)表示在供料加入到吸附劑例如填充的色譜柱過程中，流出物中首先出現(xiàn)吸收的化合物的時間點(diǎn)。換句話說，"突破點(diǎn)"是當(dāng)目標(biāo)化合物開始損失時的時間點(diǎn)。術(shù)語"飽和程度，，表示當(dāng)吸附劑例如填充的色譜柱僅僅保持了一部分它的初始吸收具體目標(biāo)化合物的能力的時間點(diǎn)。術(shù)語"完全飽和，，表示當(dāng)吸附劑例如填充的色譜柱不再吸收任何的具體目標(biāo)化合物時的時間點(diǎn)。術(shù)語"再生"在此表示一種處理吸附劑來使它重新用于色譜法中的方法。因此，"再生"將包括結(jié)合的化合物的釋放(也稱作化合物的洗提)，以及用適當(dāng)?shù)奈站彌_液的再平衡。如下面所討論的，"再生"還可以包括在適當(dāng)位置的清洗(CIP)。術(shù)語"清洗"在此表示這樣一種方法，其用合適的液體處理吸附劑例如色譜柱，來洗出例如一種或多種未結(jié)合的目標(biāo)化合物，或者洗出在它飽和到期望的飽和度之后，弱到足以從吸附劑上釋放的目標(biāo)化合物。術(shù)語"親合性樹脂"在此表示一種樹脂，其中配位體的官能團(tuán)能夠8通過"鎖/鑰匙"機(jī)理來結(jié)合目標(biāo)化合物，例如已知的是抗體/抗原；酶/受體；生物素./抗生物素蛋白；蛋白質(zhì)A/抗體等等親合性樹脂以高特異性來結(jié)合目標(biāo)化合物，并且所述的結(jié)合通?；诖笥谝环N的相互作用。公知的親合性樹脂是例如偶合到粒子的蛋白質(zhì)A,例如蛋白質(zhì)ASepharose或者ProsepA。術(shù)語"半連續(xù)"色諳法系統(tǒng)在此表示一種用于連續(xù)吸收但是不連續(xù)洗提的系統(tǒng)。術(shù)語"流動程序化，，表示在將供料施用到色譜柱的過程中，供料流速有意的變化。術(shù)語"俘獲"在上下文中表示第一色譜步驟的色譜方法，其中俘獲了大量的目標(biāo)化合物。具體實(shí)施例方式因此，在第一方面，本發(fā)明涉及一種從供料中分離至少一種目標(biāo)化合物的方法，該方法是一種模擬的移動床方法，其中在至少一個吸附劑與目標(biāo)化合物結(jié)合之后，清洗所述至少一個吸附劑，并且在其中將來自所述吸附劑的出口的清洗液體隨后通到另外一個吸附劑上，來結(jié)合通過所述的清洗所除去的目標(biāo)化合物。清洗液體導(dǎo)入其中的吸附劑有利的是新鮮的吸附劑，目標(biāo)化合物還沒有結(jié)合到其上。因此，每次將供料重新導(dǎo)入系統(tǒng)中的另夕i、一個吸附劑中時，所述的吸附劑將具有少量的已經(jīng)結(jié)合的目標(biāo)化合物。因此，本發(fā)明能夠有效的回收目標(biāo)化合物。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是一種從供料中分離至少一種目標(biāo)化合物的方法，該方法包含將至少一種目標(biāo)化合物連續(xù)的結(jié)合到三個或多個串聯(lián)連接的吸附劑中的一個或多個上，和從所述的三個吸附劑中不連續(xù)的洗提目標(biāo)化合物；其中在結(jié)合之后，將清洗液體通過每個吸附劑，來回收解吸的和/或未結(jié)合的目標(biāo)化合物，和將出口的這樣的清洗液體導(dǎo)入到在所述串聯(lián)中的下一個吸附劑，其中所述的目標(biāo)化合物是通過從清洗過的吸附劑中洗提目標(biāo)化合物來進(jìn)行回收。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的那樣，串聯(lián)中最后的吸附劑被連接到第一個吸附劑上，目的是產(chǎn)生一種循環(huán)的加工。從上可見，本發(fā)明的系統(tǒng)將是串聯(lián)運(yùn)行的，由于吸附劑彼此連接來串聯(lián)連通，因此雖然色譜柱的再生最有利的是與供料填加基本上同時進(jìn)行，但是在一個吸附劑中，其已經(jīng)臨時的與所述串聯(lián)相分離了。本發(fā)明方法所用的吸附劑可以是填充的床，例如填充在色鐠柱中的色譜樹脂，隔膜，整料，中空纖維或者任何其他合適的形式。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的方法對于任何這樣的吸附劑是有用的，在其中突破點(diǎn)曲線出現(xiàn)在施用供料的過程中。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員將要理解的那樣，為了充分的利用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，吸附劑應(yīng)當(dāng)是相同種類的，例如包含相同種類填充材料的色譜柱。色譜樹脂可以例如是親合性樹脂，例如蛋白質(zhì)A-基樹脂；稱作IMAC樹脂的螯合樹脂；疏水相互作用色譜(HIC)樹脂；嗜硫樹脂；離子交換樹脂，和多形態(tài)樹脂，在其中配位體包含了兩個或者多個官能度，例如多形態(tài)離子交換劑。色譜樹脂的配位體例如在包含非常小的基本球形粒子的樹脂中，可以偶合到粒子上。隔膜可以是任何的厚度，并且包括結(jié)合基團(tuán)已經(jīng)偶合到其上的過濾器，過濾器堆棧體，和其他變體。整料是色譜領(lǐng)域中公知的，并且通常是合成聚合物塞，其可以如隔膜一樣薄，或者厚到填充了部分或者全部的色譜柱。更具體的，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包含(a)將包含至少一種目標(biāo)化合物的供料通過第l吸附劑，并且將來自該第1吸附劑的流出物導(dǎo)入到第2吸附劑中；(b)將所述供料重新導(dǎo)入到第2吸附劑，并將清洗液體通過目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的第1吸附劑；(c)將該清洗液體流出物導(dǎo)入到第3吸附劑，并隨后將來自第2吸附劑的流出物導(dǎo)入到第3吸附劑；(d)再生該第1吸附劑；(e)將所述的供料重新導(dǎo)入所述的第3吸附劑，并將清洗液體通過目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的第2吸附劑；(f)將該清洗液體流出物導(dǎo)入到第l吸附劑，并隨后將來自第3吸附劑的流出物導(dǎo)入到第1吸附劑；(g)再生第2吸附劑；(h)將所述的供料重新導(dǎo)入所述的第l吸附劑，并將清洗液體通過目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的第3吸附劑；(i)將該清洗液體流出物導(dǎo)入到第2吸附劑，并隨后將來自第1吸附劑的流出物導(dǎo)入到第2吸附劑；(j)再生第3吸附劑；和(k)重復(fù)步驟(b)-(j);其中至少一種目標(biāo)化合物是在步驟(d)、(g)和/或(j)中進(jìn)行收集的。物，有利的是包含通過細(xì)胞表達(dá)的生物分子的發(fā)酵液。在一種可選擇的實(shí)施方案中，該供料包含血液或者血漿，或者一些其他的生物流體。該供料有利的是與合適的緩沖液相結(jié)合。這樣的緩沖液將根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)、色譜樹脂和其他參數(shù)進(jìn)行選擇，并且將其調(diào)整到適于結(jié)合(即，目標(biāo)化合物的吸收)的條件。在本發(fā)明方法的一種實(shí)施方案中，供料是上述的發(fā)酵液或者生物流體，其已經(jīng)進(jìn)4亍了一個或多個步驟或者預(yù)處理例如過濾(例如用來除去細(xì)胞片段)，絮凝，沉積或者色譜法。在本發(fā)明一種有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法被用于處理大體積液體的加工中，例如用于如下所述的用于凈化生物分子的大規(guī)模生物制藥方法的第一步中。即使本發(fā)明可以同等的用于小規(guī)?；蛘叻治鲆?guī)模，但是在加工生產(chǎn)量方面來說，體積越大，它的優(yōu)點(diǎn)越顯著。在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明方法所用的每個吸附劑的體積至少是l升，例如1-100升的范圍。在另外一種實(shí)施方案中，每個吸附劑的范圍是l-60升，例如大約56升，在另外一種實(shí)施方案中是1-40升，并且在進(jìn)一步的實(shí)施方案中是1-30升。在一種具體的實(shí)施方案中，每個吸附劑的體積范圍是10-20升。目標(biāo)化合物可以例如選自蛋白質(zhì)，例如隔膜蛋白質(zhì)或者抗體，例如單克隆抗體，包含抗體或者抗體片段的融合蛋白質(zhì)，例如Fab片段，和重組細(xì)胞蛋白質(zhì)；肽；核酸，例如DNA或者RNA，例如低聚核苷酸，質(zhì)粒，或者染色體組的DNA;細(xì)胞，例如原核或者真核細(xì)胞或者細(xì)胞片,殳；病毒；朊蛋白(prions);糖類；脂質(zhì)等等。在一種實(shí)施方案中，至少一種目標(biāo)化合物是期望的實(shí)體，例如生物制藥的或者藥物的候選物(candidate),診斷分子或者疫苗。在這種實(shí)施方案中，污染物將通過本發(fā)明系統(tǒng)的吸在二種可選^的實(shí)施方案中，、至少一種目標(biāo)化合物是殘留在流過吸附劑的液體中的污染物，和期望的生物制藥或者藥物的候選物(candidate),診斷分子或者疫苗。這種最后提到的實(shí)施方案被稱作"流過"模式的色譜法。在一種具體的流過模式的實(shí)施方案中，在將本發(fā)明的方法重復(fù)某些次數(shù)之后，將污染物已經(jīng)結(jié)合到其上的吸附劑丟棄掉。這種吸附劑被稱為一次性的，或者單次使用的產(chǎn)品，并且特別有利的是在高純度要求的方法中用于高風(fēng)險污染物例如朊蛋白或者病毒，例如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。在一種有利的本發(fā)明方法的實(shí)施方案中，一旦供料已經(jīng)供給到具體的吸附劑，則有利的是將來自所述的吸附劑的流出物丟棄，直到大約目標(biāo)化合物開始從吸附劑中出來的時間(也稱作目標(biāo)的突破點(diǎn))為止，在合適的時間期間之后，將該流出物導(dǎo)入所述串聯(lián)中的下一個吸附劑，由于目標(biāo)化合物被俘獲在該下一個吸附劑上，由此避免了該化合物的實(shí)質(zhì)性損失。但是，如同本領(lǐng)域技術(shù)人員將要理解的那樣，丟棄任何的流出物并非本發(fā)明的本質(zhì)所需。如果期望的，例如由于可利用的裝置的限制，本發(fā)明方法可以包括從開始時就將流出物導(dǎo)入到所述的色譜柱中，即，不丟棄任何的流出物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易的判定突破點(diǎn)出現(xiàn)的時間，以及決定在該突破點(diǎn)之前、之中或者之后，是否將將流體導(dǎo)入到下一個吸附劑中。由于流出物的這種重新導(dǎo)入將在接近于突破點(diǎn)時進(jìn)行，因此我們有時候在此將它稱作"突破重新導(dǎo)入點(diǎn)"。目標(biāo)化合物的檢測可以通過任何通常使用的檢測方法例如uv來獲得。檢測器將在下面更詳細(xì)的討論。容易理解，突破點(diǎn)的檢測不需要在每個色譜法循環(huán)中進(jìn)行。更合適的，一旦過程已經(jīng)被優(yōu)化，則通過流出物的體積；或者通過簡單的測量從所述供料供給開始后過去的時間，就很容易確定該時間點(diǎn)。但是，作為公知的，在突破點(diǎn)之后，在吸附劑完全被目標(biāo)化合物飽和之前通常需要經(jīng)過更多的時間。出于加工經(jīng)濟(jì)性的原因，最普遍期望的是將每個吸附劑用到它飽和為止。因此，上述的突破重新導(dǎo)入點(diǎn)與供料實(shí)際上重新導(dǎo)入串聯(lián)中下一個吸附劑的時間之間有利的是經(jīng)過一定的時間期間。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于目標(biāo)化合物的突破點(diǎn)曲線，能夠容易的決定何時將供料重新導(dǎo)入下一個色譜柱，和決定在完全飽和之前、之中或之后，這個預(yù)定的時間點(diǎn)(其有時候在此稱作"包含重新導(dǎo)入點(diǎn)")是否會發(fā)生。因此，提到本發(fā)明方法具體實(shí)施方案的重復(fù)循環(huán)時，突破重新導(dǎo)入點(diǎn)將出現(xiàn)在步驟(b),(e)和(h)中，而飽和重新導(dǎo)入點(diǎn)將出現(xiàn)在步驟(c)，(f)和(i)中。作為本領(lǐng)域公知的，通常是這樣的情況，即，并且全部的目標(biāo)化合物實(shí)際上都結(jié)合到所述的樹脂上，相反，一些目標(biāo)化合物通常從該樹脂上解吸。在色鐠法中最普遍的是簡單的沖洗目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的樹脂，然后將該沖洗液體丟棄。因此，通過這樣的常規(guī)操作，一定量的目標(biāo)化合物將會損失，并且沒有回收。但是，在本發(fā)明的方法中，一旦供料被轉(zhuǎn)移到串聯(lián)中的下一個吸附劑，則前面的吸附劑將可用于清洗和再生。當(dāng)清洗該吸附劑時，將使用這樣的條件，該條件使得大部分目標(biāo)化合物得以保持結(jié)合，而解吸的和/或未結(jié)合的目標(biāo)化合物將出現(xiàn)在清洗液體流出物中。根據(jù)本發(fā)明，將該清洗液體流出物導(dǎo)入到串聯(lián)中的下一個吸附劑，來俘獲目標(biāo)化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易選擇合適的清洗液體例如緩沖液。在一種實(shí)施方案中，在給定的時刻，清洗液體流出物和來自接收供料的吸附劑的流出物在該時刻可以先后施用，或者或多或少的同時施用。這很容易通過調(diào)節(jié)各個流速的流速和通過使用適當(dāng)?shù)拈y來選擇。流速的調(diào)節(jié)將在下面更詳細(xì)的討論。從上可見，一旦具體的吸附劑已經(jīng)與該連續(xù)的加工循環(huán)相脫離，貝'J可以方便的進(jìn)行再生。清洗過的吸附劑的再生可以通過公知的方法來完成，并且可以包括通常使用的程序，例如洗提；再平衡和在該洗提和再平衡之間任選的更有力的(aggressive)的清洗。因此，為了洗^是所結(jié)合的目標(biāo)化合物，將一種能夠釋放所述目標(biāo)化合物的液體(稱作洗提液)加入到吸附劑中。這可以通過泵驅(qū)動該洗4是液通過吸附劑來完成，或者，可選擇的，作為一個程序來完成，在這里首先加入洗^提液，然后使其起作用，并且最終除去。在一種有利的實(shí)施方案中，使用入口和出口端口來將洗提液通過吸附劑，所述端口用于加入和取出供料和清洗液體，并且安裝有適當(dāng)?shù)拈y門。結(jié)合的目標(biāo)化合物從吸附劑上的洗提可以是逐步的或者使用稱作梯度的變化的條件，例如導(dǎo)電率和/或pH梯度。合適的洗提緩沖液和混合梯度的方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在目標(biāo)化合物洗提之后，吸附劑通常需要再平衡，這恢復(fù)了施用供料時所用的初始條件，即，這樣的條件，在其中一種或多種目標(biāo)化合物可以結(jié)合。再平衡是通過使合適的緩沖液通過該色譜柱來有利的獲得的。如上所述，吸附劑可以在洗提和再平衡之間進(jìn)行清洗，該方法通常稱作在適當(dāng)位置的清洗(CIP)。這樣的CIP將使用一種比上述的清洗液體更有力的液體，并且可以是例如石咸溶液例如氫氧化鈉。CIP可以在一定次數(shù)的吸收-洗提循環(huán)之后進(jìn)行，或者，可選擇的，如果這里有理由這樣去作，則它可以作為每個再生的一個要素來進(jìn)行。吸附劑需要CIP的頻率是多少可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易的確定。因此，再生應(yīng)當(dāng)包含洗提和隨后的再平衡。在一種實(shí)施方案中，在每個第二、第三、第五、第十或者第二十個循環(huán)中，再生還包含在洗提之后，在適當(dāng)位置的清洗。在一種具體的實(shí)施方案中，每個色"i普循環(huán)包含再生，該再生除了洗提和再平衡之外，還包括適當(dāng)位置的清洗。本發(fā)明方法的步驟(b)-(j)的循環(huán)可以重復(fù)任意的次數(shù)，例如兩次、五次、十次或者二十次，全部取決于具體加工的參數(shù)。本領(lǐng)域:汰術(shù)人員能夠容易的建立起合適的重復(fù)循環(huán)的方案，包括合適數(shù)目的CIP步驟，來分離給定的目標(biāo)化合物。在第二方面，本發(fā)明涉及一種液體色譜法系統(tǒng)，用于從供料中分離至少一種成分，該系統(tǒng)包含至少三個串聯(lián)連接的吸附劑，其中向每個吸附劑提供這樣的裝置，該裝置用于液體的入口和出口。在一種有利的實(shí)施方案中，所述的分別用于入口和出口的裝置具有閥裝置來允許加入兩個、三個或多個入口流以及兩個、三個或多個出口流。吸附劑可以通過常規(guī)的管線或者管道相連接。因此，在本發(fā)明系統(tǒng)的一種實(shí)施方案中，每個吸附劑在入口和/或出口處具有多端口裝置。這樣的閥裝置可以是例如回轉(zhuǎn)閥、開關(guān)閥、隔膜閥例如隔膜隔斷閥、AKTAPilot閥(GEHealthcare,瑞典烏普薩拉)。適用于模擬的移動床色鐠法和連續(xù)色譜法的閥門是本領(lǐng)域公知的，對其的廣泛討論參見例如US7141172。在一種具體的實(shí)施方案中，在它的出口，每個吸附劑具有用于檢測目標(biāo)化合物的裝置。適于這個目的檢測器和傳感器是本領(lǐng)域公知的，例如諸如UV吸收度、光散射、折射率等的檢測器。本發(fā)明的系統(tǒng)還可以具有吸附劑性能評價裝置。從本發(fā)明的第一方面可見，根據(jù)本發(fā)明，許多的液體流可以加入到每個色譜柱中；即，供料和來自加入到吸附劑的供料的出口料、清洗液體、用于再生和洗提的液體等。本發(fā)明的系統(tǒng)可以具有任何用于處理液體流的常規(guī)裝置。在一種有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用液體流速程序化以期望的方式來調(diào)整液體流彼此的流速。在一種實(shí)施方案中，對液體流例如供料或者清洗液體的流速進(jìn)行調(diào)整，來使得能夠在供料重新導(dǎo)入到所述的給定吸附劑之前，完成清洗液體出口到該給定吸附劑的加入。因此，在第一實(shí)施方案中，提高清洗液體出口到吸附劑的流速。在該實(shí)施方案中，供料的流速可以保持不變。在第二實(shí)施方案中，供料的流速降低。在該實(shí)14施方案，清洗液體出口的流速可以保持不變。流動程序化的一個優(yōu)點(diǎn)是每個色譜柱的生產(chǎn)率可以顯著的提高。在第三方面，本發(fā)明涉及一種計算機(jī)程序，其提供了對本發(fā)明的半連續(xù)色譜法的流速控制。該程序?qū)⑻峁┫嗷フ{(diào)整的液體流，產(chǎn)生提高的加工生產(chǎn)率。這樣的程序可以例如用于抗體或者Fab片段的凈化方法中，其中吸附劑包含蛋白質(zhì)A或者其他親合性配體。該程序可以提供到合適的載體上，例如CD或者DVD盤，內(nèi)存條或者任何其他常規(guī)使用的形式格式化^茲盤。本發(fā)明一個具體的方面是一種上述的系統(tǒng)，其具有本發(fā)明的計算機(jī)程序，來提供用于具有流速程序化的半連續(xù)運(yùn)行的自動系統(tǒng)。在第四方面，本發(fā)明涉及色譜柱在半連續(xù)色語法例如流速程序化的半連續(xù)色譜法中的用途，該色譜柱是由供應(yīng)商用色譜樹脂填充來提供的。在一種有利的實(shí)施方案中，用于本方面的色譜柱具有基本上相同的填充性能。在一種具體的實(shí)施方案中，該預(yù)填充的色譜柱是消過毒的，這允許將其用于醫(yī)藥和診斷產(chǎn)品的制備中。在另外一種實(shí)施方案中，該預(yù)填充的色譜柱已經(jīng)根據(jù)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了規(guī)格化。用于這個方面的色譜柱可以用任何的色譜樹脂，合成基樹脂例如苯乙烯-DVB,有機(jī)聚合物基樹脂例如瓊脂糖或者葡聚糖，或者無機(jī)樹脂例如二氧化硅來填充。有利的是將下面的常規(guī)配位體偶合到所述的樹脂上例如親合性配位體，離子交換配位體，疏水相互作用色譜法(HIC)配位體，螯合配位體，嗜好u配位體或者多形態(tài)配位體。該配位體可以4艮據(jù)它們與期望的目標(biāo)相結(jié)合的能力來進(jìn)行選擇，例如蛋白質(zhì)A配位體，其結(jié)合抗體，抗體片段等等；或者根據(jù)它們與一種或多種污染物相結(jié)合的能力來進(jìn)行選擇，例如DNA結(jié)合性配位體例如離子交換配位體。色謙柱可以是玻璃或者塑料的，并且優(yōu)選采取路厄(luers)和/或接管來連接到本發(fā)明的系統(tǒng)上。本發(fā)明還涉及一組的至少三個色譜柱，其是用上述的色譜樹脂填充附圖詳細(xì)說明圖1表示了本發(fā)明的一種使用三個色譜柱周期性逆流(3C-PCC)系統(tǒng)的實(shí)施方案的圖示。圖2表示了在圖1的系統(tǒng)中，在用供料填加色語柱1和2的過程中供料溶液的流程。圖3表示了在圖1的系統(tǒng)中，在3C-PCC系統(tǒng)運(yùn)行過程中，在一個階段中的供料和緩沖液清洗的流程。圖4表示了在圖1的系統(tǒng)中，在3C-PCC運(yùn)行過程中，在一個階段中的供料和再生流的流程。圖5表示了在圖1的系統(tǒng)中，基于AKTA探測器平臺(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典)的本發(fā)明目前的3C-PCC圖。圖6表示了在圖1的系統(tǒng)中，在本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)的啟動循環(huán)過程中，來自全部三個色"^普柱的流出物流中的記錄信號。圖7表示了在圖1的系統(tǒng)中，在本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)的4.66個完全循環(huán)過程中，來自全部三個色譜柱的流出物流中的記錄信號。圖8表示了如實(shí)施例2所述獲得的色譜圖中的記錄信號。更具體的，這個圖表示了使用本發(fā)明的3C-PCC系統(tǒng)凈化來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液的單克隆抗體的結(jié)果。出現(xiàn)在該色譜圖中的第一曲線(最初的藍(lán)色曲線)-色譜柱l，出現(xiàn)的第三曲線(紅色曲線)_色譜柱2，和出現(xiàn)的第二曲線(綠色曲線)-色譜柱3。試-瞼部分提供了本發(fā)明的實(shí)施例僅僅用于示例性目的，并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對附加的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的限制。實(shí)施例1該實(shí)施例說明了一種使用本發(fā)明的三個色譜柱周期性逆流(3C-PCC)系統(tǒng)的連續(xù)的初級俘獲步驟，其用于凈化在蛋白質(zhì)A色語樹脂上的人類多克隆IgG。更具體的，三個1毫升色譜柱(HiTrapTM)是用蛋白質(zhì)A色譜樹脂MabSelect(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典烏普薩拉)填充的。將該色譜柱連接到一個定制改進(jìn)的AKTA探測器tm(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典烏普薩拉)色譜法系統(tǒng)(圖5)上，該系統(tǒng)被配置到三個色譜柱周期性逆流系統(tǒng)3C-PCC中。該系統(tǒng)包含兩個獨(dú)立的泵，3個UV檢測器，pH和導(dǎo)電率計，幾個回轉(zhuǎn)閥和分流機(jī)。對UV檢測器這樣布置，以使得來自每個色譜柱的流出物通過UV檢測器。使用UNICORNTM軟件(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典烏普薩拉)記錄在廢棄物管線上所測量的每個UV檢測器的吸光率以及pH和導(dǎo)電率水平。將從蛋白質(zhì)A色譜柱16上洗提的hlgG收集在單個池中。下面的單柱色謙法循環(huán)被用作以連續(xù)的方式運(yùn)行3C-PCC系統(tǒng)的基礎(chǔ)l)用3色譜柱體積(CV)的緩沖液對色譜柱進(jìn)行平衡；2)用在緩沖液A中的hlgG填加色譜柱；3)用4CV的緩沖液A清洗色譜柱；4)用4CV的緩沖液B清洗色譜柱；5)用4CV的緩沖液C的CIP色譜柱；和6)3CV的緩沖液A用再生色譜柱。全部的步驟是在0.5mL/min的給定流速進(jìn)行的。所用的溶液的組成在下面給出緩沖液A:50mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH7緩沖液B:0.1M檸檬酸鈉，pH=3.5緩沖液C:50mMNaOH供料1.65g/L的溶解在緩沖液A中的PolynormhlgG(Octopharm)將含有1.6g/L的PolynormhlgG的400毫升溶液連續(xù)的供給到上述的試驗(yàn)3C-PCC裝置中。通過將緩沖液B施用到該飽和的色譜柱來將凈化的hlgG從該系統(tǒng)中以不連續(xù)的方式進(jìn)行洗提。在圖6中表示了在第一的、啟動的3C-PCC循環(huán)過程中，來自每個色語柱的流出物中所記錄的信號，所述的循環(huán)的組成為l)將供料填加到第一色譜柱中；2)將第1和第2色譜柱串聯(lián)連接；3)將供料導(dǎo)入第2色譜柱，同時將第l色譜柱清洗到第3色譜柱中；4)將第2和第3色譜柱串聯(lián)連接，同時施加供料；5)再生第1色譜柱；6)將供料導(dǎo)入到第3色譜柱，并將第2色譜柱清洗到第1色譜柱中；7)將第3和第1色譜柱串聯(lián)連接，同時連續(xù)的施加供料；8)洗提第2色譜柱；9)再生該第2色譜柱；IO)將供料導(dǎo)入到第1色譜柱，同時將第3色譜柱清洗到第2色譜柱。圖6所示的圖案的再現(xiàn)性表示在圖7中，這里表示了在14個單個的填加過程中，具有4.7個3C-PCC循環(huán)所記錄的UV信號。該色譜圖表示了如圖6和圖7所示的來自每個色譜柱的流出物中的IgG濃度，其不是直接的與使用不同的UV檢測器所記錄的它們相比的。在該試驗(yàn)中所獲得的結(jié)果匯總在下表1中。將這些數(shù)據(jù)與在單個色謙柱上進(jìn)行運(yùn)行的參考物所獲的結(jié)果進(jìn)行比較，該單個色譜柱的體積等價于3C-PCC系統(tǒng)中所用樹脂總體積。表13C-PCC和參考的單色譜柱運(yùn)行的匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>該實(shí)施例說明了一種使用本發(fā)明的三個色諳柱周期性逆流(3C-PCC)系統(tǒng)的連續(xù)的初級俘獲步驟，其用于凈化來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)上清液的單克隆抗體(MAb)。更具體的，三個1毫升色譜柱(HiTrapTM)是用MabSelectSuRe(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典烏普薩拉)填充的，并且將該色譜柱連接到一個基本上如上面的實(shí)施例1所述的定制改進(jìn)的AKTA沖笨測器(GEHealthcareBio-Sciences,瑞典烏普薩拉)色語法系統(tǒng)上。簡單來說，該單柱色譜法循環(huán)用作以連續(xù)的方式運(yùn)行冗-PCC系統(tǒng)的基礎(chǔ)，其由下面的步驟組成1)色譜柱平衡；2)用包含mAb的細(xì)胞培養(yǎng)上清液填加色謙柱；3)色譜柱清洗；4)色譜柱洗提；5)色譜柱CIP;和6)色謙柱的再生。圖8表示了來自該3C-PCC運(yùn)行的色譜圖。測量洗提部分中的MAb的濃度，并且用于評估產(chǎn)率和生產(chǎn)率，見下表2。表2:3C-PCC和單色語柱運(yùn)行的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*基于lmL色i普柱的數(shù)據(jù)重新計算的結(jié)果權(quán)利要求1.一種從供料中分離至少一種目標(biāo)化合物的方法，該方法是模擬的移動床方法，其中在至少一個吸附劑與目標(biāo)化合物結(jié)合之后，清洗所述至少一個吸附劑，并且在其中將來自所述吸附劑的出口的清洗液體隨后通到另外的吸附劑上，來結(jié)合通過所述的清洗所除去的目標(biāo)化合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法包含將至少一種目標(biāo)化合物連續(xù)地結(jié)合到三個或多個串聯(lián)連接的吸附劑中的一個或多個上，和從所述的三個吸附劑中不連續(xù)地洗提目標(biāo)化合物；其中在結(jié)合之后，將清洗液體通過每個吸附劑，來回收解吸的和/或未結(jié)合的目標(biāo)化合物，和將出口的這樣的清洗液體導(dǎo)入到在所述串聯(lián)中的下一個吸附劑，其中所述的目標(biāo)化合物是通過從清洗過的吸附劑中洗提目標(biāo)化合物來進(jìn)行回收的。3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2的方法，該方法包含(a)將包含至少一種目標(biāo)化合物的供料通過第l吸附劑，并且將來自該第1吸附劑的流出物導(dǎo)入到第2吸附劑中；(b)將所述供料重新導(dǎo)入到第2吸附劑，并將清洗液體通過目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的第1吸附劑；(c)將該清洗液體流出物導(dǎo)入到第3吸附劑，并隨后將來自第2吸附劑的流出物導(dǎo)入到第3吸附劑；(d)再生該第1吸附劑；(e)將所述的供料重新導(dǎo)入所述的第3吸附劑，并將清洗液體通過目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的第2吸附劑；(f)將該清洗液體流出物導(dǎo)入到第l吸附劑，并隨后將來自第3吸附劑的流出物導(dǎo)入到第1吸附劑；(g)再生第2吸附劑；(h)將所述的供料重新導(dǎo)入所述的第l吸附劑，并將清洗液體通過目標(biāo)化合物已經(jīng)結(jié)合到其上的第3吸附劑；(i)將該清洗液體流出物導(dǎo)入到第2吸附劑，并隨后將來自第l吸附劑的流出物導(dǎo)入到第2吸附劑；(j)再生第3吸附劑；和(k)重復(fù)步驟(b)-(j);其中至少一種目標(biāo)化合物是在步驟(d)、(g)和/或(j)中進(jìn)行收集的。4.根據(jù)任何一個前述權(quán)利要求的方法，其中供料的重新導(dǎo)入是通過閥裝置來提供的。5.根據(jù)任何一個前述權(quán)利要求的方法，其中至少一個吸附劑是用色譜樹脂填充的柱，并且該柱在入口和/或出口處具有多端口裝置。6.根據(jù)任何一個前述權(quán)利要求的方法，其中控制供料的流速，來提高每個柱的生產(chǎn)率。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中對一個或多個另外的液體流的流速進(jìn)行控制。8.根據(jù)任何一個前述權(quán)利要求的方法，其中清洗步驟是用不同的緩沖液來進(jìn)行的。9.根據(jù)任何一個前述權(quán)利要求的方法，其中將每個吸附劑通過多個清洗步驟進(jìn)行清洗。10.—種用于從供料中分離至少一種成分的液體色譜法系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含至少三個串聯(lián)連接的吸附劑，每個吸附劑是填充在柱中的色譜樹脂，其中向每個吸附劑上提供了用于液體入口和出口的裝置，并且其中所述的入口和出口裝置具有閥裝置來允許加入至少三個入口流以及至少三個出口流。11.根據(jù)權(quán)利要求10的系統(tǒng)，其中每個吸附劑具有用于檢測目標(biāo)化合物的裝置。12.根據(jù)權(quán)利要求IO或者11的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含3個吸附劑，例如三個色語柱。13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任何一個的系統(tǒng)，其中該吸附劑是相同種類的，例如填充有相同種類的色語樹脂的色鐠柱。14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任何一個的系統(tǒng)，其中每個吸附劑的體積>1升。15.—種計算機(jī)程序，其用于控制權(quán)利要求1-6中任何一個所述的方法，該程序控制每個吸附劑的入口流之間的閥的切換、在每個吸附劑的出口流之間的閥的切換、和/或用于調(diào)節(jié)至少一個液體流的流速的泵。16.至少三個預(yù)填充的色譜柱的用途，該色譜柱是用權(quán)利要求1-6任何一個所述的方法中的色譜樹脂填充的。17.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中該色鐠柱是用免疫球蛋白結(jié)合性樹脂，例如蛋白質(zhì)A樹脂填充的。18.根據(jù)權(quán)利要求16的用途，其中該色譜柱是用污染物結(jié)合性樹脂填充的。19.才艮據(jù)權(quán)利要求16-18中任何一個的用途，其中該預(yù)填充的色譜柱是消過毒的。全文摘要本發(fā)明涉及一種模擬的移動床方法，其中在至少一個吸附劑與目標(biāo)化合物結(jié)合之后，清洗所述至少一個吸附劑，并且在其中將來自所述吸附劑的出口的清洗液體隨后通到另外一個吸附劑上，來結(jié)合通過所述的清洗所除去的目標(biāo)化合物。在一種實(shí)施方案中，該方法包含使用三個或多個串聯(lián)連接的吸附劑來結(jié)合至少一種目標(biāo)化合物，和從所述的三個吸附劑中來洗提目標(biāo)化合物。在結(jié)合到吸附劑之后，將清洗液體通過所述的吸附劑，來回收解吸的和/或未結(jié)合的目標(biāo)化合物，和將出口的這樣的清洗液體導(dǎo)入到在所述串聯(lián)中的下一個吸附劑，還沒有供料加入到該下一個吸附劑中。目標(biāo)化合物通過從清洗過的吸附劑中洗提目標(biāo)化合物來進(jìn)行回收。文檔編號G01N30/46GK101687119SQ200880020436公開日2010年3月31日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者K·拉基,M·布賴恩特松,M·霍爾申請人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司