專利名稱：：篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：1本發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)的Bc卜2家族。具體地，本發(fā)明涉及篩選調(diào)控細(xì)胞存活和/或細(xì)胞凋亡和/或蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性的分子的方法。
背景技術(shù)：
：2本說明書中作者引用的出版物的參考書目集中于說明書的末尾。3本說明書對任何之前出版物(或從其衍生的信息)，或任何已知的事物的引用，不是并且也不應(yīng)該看作是之前出版物(或從其衍生的信息)，或公知常識(shí)的已知事物形式為本說明書所涉及到的努力方面的承認(rèn)或供認(rèn)或任何形式的暗示。4多細(xì)胞有機(jī)體的存活依賴于各種細(xì)胞類型的正確和協(xié)調(diào)功能。發(fā)育的起始階段，有機(jī)體的活力依賴于細(xì)胞在各種組織中的選擇和分化。在后來的階段，有機(jī)體的維持需要特定的細(xì)胞適應(yīng)性。例如，血液細(xì)胞不斷地從血液前體(hematologicprecursor)更新。'淋巴細(xì)胞或生殖細(xì)胞應(yīng)答于即時(shí)需要顯示快速的增殖。另一方面，神經(jīng)細(xì)胞顯示受限的更新能力，許多神經(jīng)元在個(gè)體的一生中存活和持續(xù)。對于各種細(xì)胞類型，細(xì)胞數(shù)量的控制為細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡間平衡的結(jié)果。5細(xì)胞死亡的一種過程為細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡，或程序化細(xì)胞死亡，為有機(jī)體處置受損的、不想要的氨不需要的細(xì)胞的正常方法。然而有時(shí)，例如當(dāng)有機(jī)體患病時(shí)，身體一種或更多細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡速率受影響。例如，導(dǎo)致過多或過少細(xì)胞自殺的細(xì)胞凋亡的異常調(diào)節(jié)，可能是人類中此類各種疾病例如癌癥、AIDS、阿耳茨海默氏病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的原因。6在過去的20年里細(xì)胞凋亡的分子調(diào)節(jié)已被詳細(xì)地表征并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases))來實(shí)施。調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一種主要途徑為Bcl-2蛋白家族途徑，其在調(diào)節(jié)發(fā)育上的程序化和脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡上發(fā)揮中心作用。該家族的一個(gè)亞類，包括蛋白質(zhì)Bcl-2，Bcl-、，Bcl-w，Mc卜l，Al和Bcl-B，促進(jìn)細(xì)胞存活。這些蛋白維持細(xì)胞的存活直到它們的活性通過直接結(jié)合促凋亡家族成員，例如蛋白Bim，Bad或Bid來降低或中和。促存活蛋白的該精密生化作用是有爭議的，盡管它們可能控制第二類促凋亡家族成員(多結(jié)構(gòu)域蛋白Bax和Bak)的作用。這些蛋白在可能通過破壞細(xì)胞內(nèi)膜例如線粒體外膜來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡上，發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而參與促凋亡(pro-apoptogenic)因子例如細(xì)胞色素c釋放入細(xì)胞質(zhì)以促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，所述細(xì)胞色素c正常的被隔離在細(xì)胞器內(nèi)。7由于過量和受損的細(xì)胞凋亡表征許多疾病或不需要的狀況，存在對于調(diào)控細(xì)胞凋亡和/或蛋白質(zhì)的Bc,l-2家族成員的分子的需要。
發(fā)明內(nèi)容8本說明書中的各實(shí)施方式加以必要的修正后適用于每一其它實(shí)施方式，除非另外指出。9因此，在一個(gè)方面本發(fā)明提供篩選調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的分子的方法，包括i)將所述分子與所述細(xì)胞《且合(combining);ii)鑒定所述細(xì)胞的Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)；其中Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)指示所述分子調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述分子降低細(xì)胞凋亡。10在另一方面本發(fā)明提供篩選調(diào)節(jié)細(xì)胞的Bcl-2家族蛋白的分子的方法，包括i)將所述分子與所述細(xì)胞組合；ii)鑒定所述細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是否受調(diào)節(jié)；其中所述細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)指示所述分子調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述分子降低細(xì)胞凋亡。11在又一方面，本發(fā)明提供篩選降低細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的分子的方法，包括i)將候選分子與檢測細(xì)胞組合；和ii)確定相對于對照在所述分子的存在下所述檢測細(xì)胞的存活上的變化。12在某些實(shí)施方式中本發(fā)明的方法在步驟i)和ii)之前或之間還包括處理細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的步驟。所述細(xì)胞可以用降低Bc卜2蛋白家族的促存活(pro-survival)成員，例如Bcl-xL和/或Mcl-l的水平和/或活性的試劑來處理。在某些實(shí)施方式中所述細(xì)胞用降低或增強(qiáng)Bc卜2家族的促凋亡活(pro-apopto"c)成員，例如Bak和/或Bax的水平和/或活性的試劑來處理。13在某些實(shí)施方式中，Bcl-2家族的至少一種促存活成員的水平和/或活性在步驟i)的細(xì)胞中降低。選自Bc1-Xl，Bcl-2，Bcl-w，Mcl-l，Al和Bcl-B的Bcl-2家族的l至6個(gè)成員的水平和/或活性可以在步驟i)的細(xì)胞中降低。Bcl-Xt和/或Mc1-1的水平和/或活性可以被降低。在某些實(shí)施方式中Bcl-2蛋白家族的至少一種促凋亡成員的水平和/或活性在步驟i)的細(xì)胞中降低，例斧Bak和/或Bax的水平和/或活性可以降低。在某些實(shí)施方式中細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑使用本領(lǐng)域已知的方法靶向Bcl-2家族成員的基因、RNA或蛋白質(zhì)。14在某些實(shí)施方式中Mcl-l和Bak的水平和/或活性降低。在其它實(shí)施方式中Mcl-l和Bax的水平和/或活性降低。在某些實(shí)施方式中Mcl-l和Bak的水平和/或活性增強(qiáng)。在其它實(shí)施方式中Mcl-l和Bax的水平和/或活性增強(qiáng)。這樣，所蟓細(xì)胞可以用試劑遺傳上改性或處理，由此至少一種促存活或促凋亡分子的水平和/或活性不依賴于候選分子或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的作用被改性。在某些實(shí)施方式中，該步驟增強(qiáng)所述檢測細(xì)胞的敏感性，以用于鑒定細(xì)胞存活劑(cellsurvivalagent)。15在某些實(shí)施方式中，所述分子,為激動(dòng)劑。在其它實(shí)施方式中所迷分子為拮抗劑。在某些實(shí)施方式中，所述分子為Bak或Bax，或Bak以及Bax的拮抗劑。16在某些實(shí)施方式中細(xì)胞凋亡增加。在其它實(shí)施方式中細(xì)胞凋亡降低。17在某些實(shí)施方式中所述方法發(fā)生于體外。在其它實(shí)施方式中所述方法發(fā)生于體內(nèi)。18在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、髓樣細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞。19在某些實(shí)施方式中，所述方法包括篩選增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活、壽命或活力(viability)的分子。在示例性的實(shí)施方式中所述方法包括(i)將所述分子與細(xì)胞組合；(ii)使所述細(xì)胞與在所述細(xì)胞中拮抗促存活的Bel-2家族分子和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種或多種試劑接觸；(iii)確定相對于對照在所述分子的存在下細(xì)胞的存活(活力、壽命、半衰期)上的變化；和(iv)選擇增強(qiáng)細(xì)胞存活(活力、半衰期)的分子。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括將來自(iv)的所選分子與靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞組合，來確定相對于對照在所述分子的存在下所述細(xì)胞的細(xì)胞存活(活力、半衰期)上的變化。20為了促進(jìn)篩選，在某些實(shí)施方式中，將細(xì)胞例如通過降低一種或多種促存活Bel-2家族成員的水平或活性來改性以增強(qiáng)其對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性。在其它實(shí)施方^中，將細(xì)胞通過基因阻斷來改性以缺乏一種或多種促存活Bcl-2家族韋員。在示例性的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為來自多細(xì)胞生物的Mcl-l缺陷細(xì)胞，所述試劑為Bc1-Xl拮抗劑。在又一實(shí)施方式中，所述方法包括鑒定細(xì)胞中Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)。21在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞檢測用于鑒定保持血小板活力的化合物。22該主題方法包括在要測試的化合物存在下使對細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑敏感的細(xì)胞孵育，然后使所述細(xì)胞與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑接觸，并確定未經(jīng)受細(xì)胞凋亡的活細(xì)胞的存在。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞對Bcl-2家族的一個(gè)或多個(gè)成員(包括，例如Bc卜2，Bc1-Xl，Bc卜w，Mcl-l和Al)的拮抗劑敏感，所述拮抗劑例如BH3結(jié)構(gòu)域模擬試劑(BH3domainmimickingagents)。在其它實(shí)施方式中，所述細(xì)胞對Bc卜Xl或Mc卜l拮抗劑敏感。在另一實(shí)施方式中所述Bcl-XL拮抗劑為ABT-737。23在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、間皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞、肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞例如鼠胚成纖維細(xì)胞(MEFs)。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為髓樣細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞或祖細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成骨'細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、間皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、轉(zhuǎn)化和細(xì)胞、癌細(xì)胞。24在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為其中Mcl-l或Bel-Xl的水平或活性部分或全部下調(diào)的，通過本^域已知方法產(chǎn)生的細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，Mcl-l或Bcl-Xt水平4吏用化學(xué)、遺傳或基因沉默(RNAi)方法下調(diào)。例如，Mcl-1水平可以使用CDK抑制劑(例如R-roscovitine)或蛋白質(zhì)合成抑制劑(例如環(huán)己酰胺)。遺傳策略包括形成功能等位基因的損失，其通過全部或部分基因的缺失或通過將外源DNA插入基因或通過來自外源啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致。還可以使用條件突變技術(shù)?；虺聊峁┯糜谝种苹蚬δ艿姆奖惴椒ācl-l反義寡核苷酸描述于例如國際/>開No.W02006/099667，在此將其全文引入。Bc1-Xl水平或活性使用ABT-737或等效的BH3結(jié)構(gòu)域模擬試劑方便地降低。25這樣，在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供鑒定維持細(xì)胞活力的化合物的方法，包括使在要測試的化合物存在下孵育對Bel-Xl或Mcl-l拮抗劑敏感的細(xì)胞，然后^f吏所述,胞與Bcl-x,或Mcl-l拮抗劑接觸，并確定指示該化合物能夠阻斷Bcl-Xt或Mcl-l拮抗劑-誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和保持細(xì)胞活力的活細(xì)胞的存在。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式描述于實(shí)施例2。在另一實(shí)施方式中，Bel-^拮抗劑為ABT-737或其類似物。在某些實(shí)施方式中，對Bc1-Xl拮抗刑敏感的細(xì)胞是Mc1-1缺陷的。在其它實(shí)施方式中，對Mcl-1拮抗劑敏感的細(xì)胞是Bcl-Xt缺陷的。然后測試通過起始篩選鑒定的化合物來確定它們作用于哪種目標(biāo)。例如，在Mcl-l空、Bax-空的細(xì)胞和Mcl-l空、Bak-空的細(xì)胞中測試化合物以確定化合物通過Bax或Bak，或其它促凋亡分子或另外的下游目標(biāo)起作用。如果需要，然后以此方式測試進(jìn)一步的下游目標(biāo)。26因此，在某些實(shí)施方式中，該主題方法包括將所述分子與在一種或多種Bcl-2家族成員上缺陷的細(xì)胞組合，所述Bcl-2家族成員選自Bc卜Xl,Bc卜2，Bc卜w,Mcl-l，Al(Bf卜l),Bcl-B，Bak,Bax,Bok(Mtd)，Bad，Bid，Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，P觀，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。27在某些實(shí)施方式中，該方法還包括將所述分子與細(xì)胞組合，并確定相對于對照在所述分子的存在下所述細(xì)胞的存活上的變化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在示例性的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞選自髓樣細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞或祖細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、黑素細(xì)胞、間皮細(xì)胞、生殖細(xì)胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和癌細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為在細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病或狀況中遭受增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。28在示例性但非限制性的實(shí)施方式中，抗細(xì)胞凋亡劑為在本文公開的細(xì)胞篩選中鑒定的試劑。本發(fā)明提供了本文鑒定的抗細(xì)胞凋亡分子在制備治療特征在于削弱的或不想要的細(xì)胞凋亡的包括本文所示的疾病和狀況的藥物中的用途。在示例性但非限制性的實(shí)施方式中，該試劑選自圖4中所示的皮質(zhì)類固醇分子之一或包括圖4中所示的通式結(jié)構(gòu)。如本文所述，在實(shí)施例3和圖4中，這些試劑在暴露到細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)量的Bc卜xl拮抗劑下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞方面強(qiáng)烈地抑制殺死。29圖1顯示通過Bcl-2蛋白家族控制細(xì)胞存活的圖。Bax和Bak為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)。在健康細(xì)胞中，它們被促存活Bcl-2蛋白，即Bcl-2，Bc卜Xl，Bcl-w，Mcl-1和A1限制。受損信號(hào)使促存活蛋白失活從而釋》文Bax和Bak引起細(xì)胞死亡。30圖2顯示在成纖維細(xì)胞中細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的圖。(A)在野生型鼠胚成纖維細(xì)胞(MEFs)中，促凋亡Bak正常地被Bel-A和Mcl-l限制。用BH3模擬化合物ABT-737使Bcl-、失活不引起細(xì)胞死亡，除非Mcl-l也失活。(B)在Mcl-l的組成性缺失的情況下MEFs將對ABT-737高度敏感。31圖3顯示篩選策略。在Mcl-l-缺陷性細(xì)胞中，ABT-737有效地殺死。通過將此類細(xì)胞與多樣性文庫分子一起預(yù)孵育，就能夠抑制ABT-737誘導(dǎo)的殺死的分子進(jìn)行篩選。此類分子還可用于阻斷ABT-737的作用或直接阻斷細(xì)胞死亡介質(zhì)，Bax和Bak的作用。32圖4為在受試的細(xì)胞篩選中就增強(qiáng)細(xì)胞活力、存活或壽命的試劑鑒定出的試劑的結(jié)構(gòu)表示。具體實(shí)施例方式33詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，將理解這不是將其限定到特定的示例性方法、制劑或組分，并當(dāng)然可以變化。還理解本文所用的術(shù)語僅旨在描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，不旨在受限制，其將僅受附帶的權(quán)利要求限制。34本文引用的所有出版物、專利和專利申請，無論在上文或是下文，將通過引用將其全文引入。然而，引用本文提及的出版物旨在描述和公開在出版物中報(bào)道并可能與本發(fā)明一同使用的策略和試劑。絕不是將其看作是本發(fā)明不早于借助于在先發(fā)明的此類公開的供認(rèn)。35此外，除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施使用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)，本領(lǐng)域技能肖的技術(shù)。此類技術(shù)對技術(shù)工作者而言是已知的，并在文獻(xiàn)中充分地解釋。參見，例如SambrookWa/.(eds)，#o/ecw/ar6Vo/2'wJZa6c>r"oiy#a/7i/<s/〃，2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress.，1989'，Hames"(eds)，#wc/e/cJc/V〃/6rWza〃叫^尸rac〃ca7^/7_roac/,IRLPress,1985;Gait(ed)，加^eWs，OxfordIRLPress,1984;Remington'sPharmaceuticalSciences,17thEdition,MackPublishingCompany,Easton，Pennsylvania,USA;Albertse"/.，A/o/o^fo尸Me4thed.，NewYorkandLondon:GarlandScience,c2002;Lodishe"/"#o/ecW<3rCe"A/o/oW，4thed.，NewYork:W.H.Freeman&Co.,c2000。36必須指出，如在該說明書中所用，單數(shù)形式"a"，"an"和"the"包括復(fù)數(shù)方面，除非上下文明確地指出例外。這樣，例如，提到"a分子"包括單個(gè)分子，以及兩個(gè)或多個(gè)分子，提到"a細(xì)胞"包括單個(gè)細(xì)胞以及兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。"a蛋白質(zhì)"包括單一蛋白，或兩種或多種蛋白，等等。37貫穿說明書，單詞"包括(comprise)"及該單詞的變體，例如"包括(comprising)"和"包括(comprises)"是指"包括但不限于"，并且不旨在排除其它添加物、組分、^分或步驟。"由……組成"是指包括并限制到短語"由……組成"后的^;有事物。這樣，短語"由……組成"表示所列要素是必需的或強(qiáng)制性的，,并且不可以存在其它要素。"基本上由……組成"是指包括該短語后列舉的每一要素，但限制到不影響或有助于所列舉要素的描述中指出的活性或作用的其它要素。這樣，短語"基本上由......組成"是指所列要素是必需的或強(qiáng)制性的，但是其它組分是任選的，并且依賴于它們影響所列要素的活性或作用可以存在或不存在。38除非另外定義，本文所用所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同意義。盡管所有與本文所述類似或等效的任何材料和方法可用于實(shí)施或測試本發(fā)明，現(xiàn)在描述優(yōu)選的材料和方法。39本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)篩選調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的分子可以鑒定調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性的分子。相反地，篩選調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性的分子可以鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的分子。40在某些實(shí)施方式中本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的Bcl-2家族。Bcl-2為它們產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物基因和蛋白質(zhì)的家族的原型。Bcl-2家族控制線粒體外膜滲透(MOMP),并且可以是促凋亡(Bax，Bak和Bok等等)或促存活(包括Bcl-2，Bcl-^和Bc卜w)。Bcl-2家族中存在超過20種蛋白，將其分為三組。通常，組l成員為促存活的，而組2和3是促凋亡的。Bcl-2家族的成員共有四個(gè)同源性特征結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)，名稱為Bc卜2同源(BH)結(jié)構(gòu)域，命名為BH1，BH2，BH3和BH4。Bcl-2家族具有由被兩性螺旋環(huán)繞的中心疏水性螺旋組成的通式結(jié)構(gòu)。該家族的許多成員具有跨膜結(jié)構(gòu)域。Bcl-2家族的作用位點(diǎn)大都位于線粒體外膜。線粒體內(nèi)是如果釋放則激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)的凋亡形成因子(apoptogenicfactors)(細(xì)胞色素c,Smac/DIABL0，0mi)。依賴于其功能，一旦激活，Bcl-2蛋白促進(jìn)這些因子的釋放，或保持它們隱蔽于線粒體。Bc卜2調(diào)節(jié)M0MP的確切機(jī)理尚未闡明，但相信多結(jié)構(gòu)域的促凋亡Bc卜2蛋白可以直接激活MOMP，這是個(gè)被抗凋亡Bcl-2蛋白的結(jié)合抑制的過程。相反，僅含BH3區(qū)域的促凋亡Bcl-2蛋白加3-onlypro-apoptoticBc卜2protein)通過抗凋亡Bc卜2蛋白的結(jié)合間接激活M0MP,釋放多結(jié)構(gòu)域的促凋亡Bcl-2蛋白來激活M0MP。41Bcl-2家族的促凋亡成員包括Bak，Bok(Mtd)，Bax，Bad,Bid,Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，P畫，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。促存活成員包括Bcl-2，Bc卜Xl，Mc卜1，Bc卜w,Bc卜B和Al(在人類中為Bfl-l)。Bel-2能夠以.Bcl-2oc或Bcl-2p兩種可選的剪切形式(他們的區(qū)別僅在于羧基末端的不同)出現(xiàn)。42在某些實(shí)施方式中本發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡。"細(xì)胞凋亡"，也被稱為程序化細(xì)胞死亡，其是以有組織的方式導(dǎo)致細(xì)胞自殺的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。幾種因子和受體對細(xì)胞凋亡途徑是特異的。最終結(jié)果是細(xì)胞收縮、在其表面產(chǎn)生氣泡，以及其核酸遭受斷裂。在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞凋亡受半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介導(dǎo)i，其通過裂解在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的特定蛋白觸發(fā)細(xì)胞死亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以失活前體或前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的形式存在于所有細(xì)胞，所迷失活前體或前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶通常通過其它半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，產(chǎn)生蛋白裂解性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)(caspasecascade)。43在某些實(shí)施方式中細(xì)胞凋亡為Bak和/或Bax介導(dǎo)的。44通過本發(fā)明方法篩選的分子可以為包括由化學(xué)鍵保持在一起的兩個(gè)或更多原子的任何分子。該分子可為藥物、小或大的化學(xué)分子、蛋白質(zhì)(例如抗體)或其衍生物、包括改性肽例如限制性肽(constrainedpeptide)或折疊體(foldamer)的肽、脂質(zhì)、碳水化合物、或核酸分子，包括反義或其它基因沉默分子、或其模擬物(mimetic)。該分子可為天然發(fā)生或非天然發(fā)生的分子，并且可以位于天然產(chǎn)生的文庫、化學(xué)產(chǎn)生的文庫、組合文庫、噬菌體展示文庫、或基于體外翻譯的文庫。45當(dāng)該分子為"藥物"時(shí)，是指誘導(dǎo)所需的藥理學(xué)效應(yīng)的化學(xué)分子，并且包括活性劑本身以及活性劑的藥學(xué)上可接受的和藥學(xué)上活性的鹽、酯、酰胺、前藥、對應(yīng)異構(gòu)體、代謝物和類似物。46當(dāng)該分子為"小或大的化學(xué)分子"時(shí)，是指小或大的天然或合成源的有機(jī)或無機(jī)分子。"小分子"具有約500道爾頓以下的分子量。大分子具有500道爾頓以上的分子量。47當(dāng)該分子為"蛋白質(zhì)"時(shí)，是指通過肽鍵連接的氨基酸的聚合物，其可由兩條或多條肽鏈組成。術(shù)譯."，生物"包括具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被天然發(fā)生的20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸或其合成氨基酸同系物取代的蛋白質(zhì)或肽。合成氨基酸同系物包括任何其它氨基酸殘基的D-和L-型兩種，無論在蛋白中發(fā)現(xiàn)、在天然或合成產(chǎn)生的中發(fā)現(xiàn)。此類同系物的實(shí)例包括4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、P-丙氨酸和4氨基丁酸、p-丙氨酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、甲狀腺素、Y-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等。48如本文所用，天然氨基酸殘基為在蛋白質(zhì)中通常發(fā)現(xiàn)的20種氨基酸殘基(即丙氨酸、天冬氨酸、關(guān)冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸和纈氨酸)，并且包括此類氨基酸的D-和L-型兩種。49蛋白質(zhì)可以為抗體，因?yàn)楸绢I(lǐng)域已知特異結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的抗體可以充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或肽的拮抗劑或激動(dòng)劑。這樣，與蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員特異結(jié)合的抗體可以調(diào)節(jié)鈿胞凋亡。術(shù)語"抗體"以最廣義使用，并且特別但不限制的包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們與蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員特異性結(jié)合。一些抗體具有細(xì)胞內(nèi)傳遞的能力，例如軟骨魚衍生的抗體。這些描述于例如國際專利申請No.W02005/118629。50與特定蛋白或肽或在特定蛋白或肽上的表位"特異性結(jié)合"或"對其特異"的抗體是指與該特定蛋白、肽、或在特定蛋白或肽上的表位結(jié)合，而基本上不與任何其它蛋白、肽或表位結(jié)合的抗體。51當(dāng)該分子為"脂質(zhì)"時(shí)，是指任何組的脂肪或脂肪類化合物，包括甾醇類、脂肪酸和許多其它物質(zhì)、蠟、磷脂、腦苷脂，相關(guān)和衍生的化合物。52當(dāng)該分子為"碳水化合物"時(shí)，是指由其上連接有規(guī)定比(2:1)的氫和氧原子的成鏈或成環(huán)的碳原子紐成的有機(jī)化合物。碳水化合物從包含3至7個(gè)碳原子的簡單糖至非常復(fù)雜的聚合物而變化。53當(dāng)該分子為"核酸分子"時(shí)，是措雙鏈或單鏈核酸分子，包括例如以下的核酸分子正義和反義DNA(gDNA，cDM)、RNA(正義RM，反義RM，mRNA，tRNA，rRNA，小干擾MAs(siRNAs)、微RNAs(miRMs)、核仁小分子RNAs(snRNAs)、核酶、適配子、DNA酶，或其它核糖核酸酶型復(fù)合物。54反義核酸分子已經(jīng)顯示為基因或其相關(guān)的基因產(chǎn)物功能的有效和特異的抑制劑。這樣，反義分子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性。反義分子具有與另一核酸分子(例如編碼Bcl-2蛋白家族成員的核酸分子)的序列互補(bǔ)的序列。55還涉及適配子。DNA和RNA適配子可以在各種應(yīng)用中取代單克隆抗體。它們?yōu)橥ㄟ^除了經(jīng)典的Watson-Crick堿基配對之外的相互作用，對非核酸或核酸分子具有特異結(jié)合親和性的核酸分子。適配子描述于例如美國專利Nos.5475096，5270163，5589332，5589332和5741679。56當(dāng)該分子為"模擬物"時(shí)，其包括碳水化合物、核酸或蛋白質(zhì)或肽模擬物，并且旨在指具有允許該物質(zhì)充當(dāng)功能類似物的構(gòu)型特征的物質(zhì)。肽模擬物可以為包含模擬蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的要素的分子的肽(Johnsonefa人,戶e/〃f/e1//z/e〃c51inBiotechnologyandPharmacy,Pezzutoe"/"edsChapmanandHal1,NewYork,1993)。肽模擬物可以通過篩選隨機(jī)肽文卑例.如用于模擬Bc卜2多肽的功能活性的肽分子的噬菌體展示或組合文,來鑒定。作為選擇，可以使用模擬設(shè)計(jì)、合成和測試。通過蛋白質(zhì)的碳水化合物和脂質(zhì)的識(shí)別在許多生物系統(tǒng)是重要的事件，基于能夠干擾特異的識(shí)別過程的碳水化合物和/或脂質(zhì)模擬物的化學(xué)治療開發(fā)是快速發(fā)展的新興領(lǐng)域。核酸模擬物包括例如包含N3'—P5'氨基磷酸酯核香酸間鍵合的RNA類似物，其取代天然發(fā)生的RM03'--P5'磷酸二酯。酶模擬物包括催化性的抗體或其編碼序列，其可以也是人源化的。57通過本發(fā)明鑒定的分子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。如本文所用術(shù)語"調(diào)節(jié)"是指改變或調(diào)整。這樣細(xì)胞的細(xì)胞凋亡速率可以改變或調(diào)整。細(xì)胞凋亡的速率可以增加或降低。即，細(xì)胞的壽命可以增大或減少。作為選擇或另外，蛋白質(zhì)的Bcl-2家姨^員的水平和/或活性可以受調(diào)節(jié)，并且可以增加或降低。即，Bcl-2聿族成員的水平和/或活性可以增大或減少。58該分子可以直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和/或Bc卜2家族成員的水平和/或活性。例如，該分子可以與Bcl-2蛋白家族的成員結(jié)合。作為選擇，該分子可以與另一分子結(jié)合，所述另一分子反過來與Bc卜2蛋白家族的成員結(jié)合。例如，該分子可以通過與ABT-737結(jié)合間接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和/或Bcl-2蛋白家族成員的水平和/或活性。小分子ABT-737為拮抗促存活Bc卜Xl的BH3模擬藥物。其選擇性地靶向Bcl-2，Bc1-Xl和Bel-w,但不靶向其它促存活蛋白Mc卜l或Al。作為選擇，該分子可以通過與來自Bcl-2蛋白家族的另一下游分子，例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。59該分子可為Bc卜2蛋白家族成員的激動(dòng)劑或拮抗劑。如本文所用術(shù)語"激動(dòng)劑"是指提高不同分子的活性的分子。術(shù)語"拮抗劑"是指抵制另一分子作用的分子。這樣，該分子可以上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞凋亡和/或蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性。60通過本發(fā)明方法鑒定出的分子可以通常在保持或維持細(xì)胞活力、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞活力，例如在治療或預(yù)防細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病或不想要的狀況上具有用途，所述細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病或不想要的狀況包括血細(xì)胞減少癥、炎性疾病、自體免疫疾病、破壞性骨障礙(destructivebonedisorder)、增殖障礙、感染疾病、變性疾病、與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病、食用酒;精;過量4聶入疾病(excessdietaryalcoholintakedisease)、病毒介導(dǎo)的疾病、葡萄膜炎、炎性腹膜炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、慢性曱狀腺炎、葛瑞夫茲氏病(Grave'sdisease)、自體免疫性胃炎、糖尿病、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性中性粒細(xì)胞減少、血小板減少癥、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無力、發(fā)炎性腸道疾病、克羅恩氏病、牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、疤痕、移植物抗宿主病、器官移植排斥、骨質(zhì)疏松癥、白血病和相關(guān)疾病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)骨疾病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、出血性休克、敗血癥、敗血性休克、灼傷、志賀氏菌病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓病(Huntington'sdisease)、朊病毒疾病、腦缺血、癲癇癥、心肌病、局部缺血、急性和慢性心臟病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、動(dòng)脈硬化癥、冠狀動(dòng)脈旁路移植、脊髓性肌萎縮癥、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、HIV-相關(guān)腦炎、老化、禿頭癥、中風(fēng)引起的神經(jīng)損傷、潰瘍性結(jié)腸炎、外傷性腦損傷、脊髓損傷、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、其它形式的病毒性肝炎、藥物(例如樸熱息痛)誘導(dǎo)的肝疾病、黃熱病、登革熱、日本腦炎、肝疾病、酒精性肝炎、腎病、多嚢腎疾病、幽門螺桿菌相關(guān)的胃和十二指腸潰瘍疾病、HIV感染、肺結(jié)核、腦膜炎、以及與冠狀動(dòng)脈旁路移植相關(guān)的治療并發(fā)癥。本發(fā)明的一種實(shí)施方式涉及其中測試的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞受試者的方法，以增強(qiáng)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病例如上文所述的那些中的細(xì)胞凋亡。61更具體地，通過本發(fā)明方法鑒定出的分子可以用于保持器官活力，例如腎、心臟瓣膜、肺、肝、皮膚、角膜、靜脈和其它血管、骨、腱和肌肉骨骼組織、胰臟、腸等。在某些實(shí)施方式中，如此鑒定的分子用于延長患者中或血庫貯存中的血小板存活，以及治療或預(yù)防心肌梗塞、再灌注損傷、栓塞性中風(fēng)以最小化神經(jīng)組織的損失，防止高劑量的化療和全身輻射后的內(nèi)臟毒性(粘膜炎)、肝炎和其它形式的肝衰竭、導(dǎo)致組織損失的炎性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、貧血、中性粒細(xì)胞減少、由于生殖活力損失引起的不育、由于黑素細(xì)胞(用于頭發(fā)著色的細(xì)胞)的損失引起的早熟。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式涉及其中測試的細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞受試者的方法，以增強(qiáng)細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病例如上文所述的那些中的細(xì)胞凋亡。62用于鑒定蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性和/或細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)的細(xì)胞，以及要處理或其壽命保持或增強(qiáng)的細(xì)胞，可以為包括Bcl-2蛋白家族的一種或多種成員的任何細(xì)胞，即多細(xì)胞生物的任何細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該細(xì)胞可以來自任何多細(xì)胞生物，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)Bcl-2家族成員或其同源物發(fā)現(xiàn)于例如線蟲(C.elegans)、小鼠和人類的有機(jī)體中。這樣，所述細(xì)胞可以來自人類或?qū)τ谌祟愑薪?jīng)濟(jì)重要性和/或社會(huì)重要性的哺乳動(dòng)物，例如除了人類之外的肉食動(dòng)物(例如貓和狗)、豬(swine)(豬(pigs)，肉豬(hogs)和野豬)、反芻動(dòng)物(例如牛，公牛，羊，長頸鹿，鹿，山羊，野牛和駱駝)、馬和鳥，包括瀕危的、保持在動(dòng)物園的各種鳥、和家禽，更具體地，馴養(yǎng)的家禽(fowl)例如家禽(poultry)，例如火雞、小雞、鴨、鷸、珍珠雞等，因?yàn)樗鼈儗θ祟愐灿薪?jīng)濟(jì)學(xué)重要性。該術(shù)語不表示特定的年齡。這樣，來自成熟和新生有機(jī)體的細(xì)胞都包括。63該細(xì)胞可以為具有細(xì)胞核的任何細(xì)胞，包括但不限于成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、間皮細(xì)胞和肌細(xì)胞。作為選擇，該細(xì)胞可以是無核的，即沒有細(xì)胞核，因此沒有DNA。無核細(xì)胞的實(shí)例為血小板(凝血細(xì)胞)。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞不是血小板細(xì)胞。64在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在Bcl-2蛋白家族的一種或多種促存活成員上有缺陷。在其它實(shí)施方式中所述細(xì)胞在Bcl-2蛋白家族的一種或多種促凋亡成員上有缺陷。在某些實(shí)施方式中所述細(xì)胞為Mcl-l缺陷性細(xì)胞。65在本文公開方法的某些實(shí)施方式中所用的"檢測"細(xì)胞可為與用該方法鑒定出的分子治療學(xué)上或預(yù)防學(xué)上處理的細(xì)胞相同的細(xì)胞或不同的細(xì)胞。細(xì)胞包括提到多種細(xì)胞，例如在組織或器官或其部分中發(fā)現(xiàn)的那些。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為在細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病或狀況中遭受增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡的細(xì)胞，所述細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的疾病或狀況例如血細(xì)胞減少癥、炎性疾病、自體免疫疾病、破壞性骨障礙、增殖障礙、感染疾病、變性疾病、與細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病、食用酒精過量攝入疾病、病毒介導(dǎo)的疾病、葡萄膜炎、炎性腹膜炎、骨關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、硬皮病、慢性甲狀腺炎、葛瑞夫茲氏病(Gravesdisease)、自體免疫性胃炎、糖尿病、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性中性粒細(xì)胞減少、血小板減少癥、慢性活動(dòng)性肝炎、重癥肌無力、發(fā)炎性腸道疾病、克羅恩氏病、牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、疤痕、移植物抗宿主病、器官移植排斥、骨質(zhì)疏松癥、白血病和相關(guān)疾病、骨髓增生異常綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)骨疾病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、出血性休克、敗血癥、敗血性休克、灼傷、志賀氏菌病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓病(Huntington'sdisease)、肌病毒疾病、腦缺血、癩癇癥、心肌病、局部缺血、急性和慢性心臟病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、動(dòng)脈硬化癥、冠狀動(dòng)脈旁路移植、脊髓性肌萎縮癥、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、HIV-相關(guān)腦炎、老化、禿頭癥、中風(fēng)引起的神經(jīng)損傷、潰瘍性結(jié)腸炎、外傷性腦損傷、脊髓損傷、曱型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、其它形式的病毒性肝炎、藥物(例如樸熱息痛)誘導(dǎo)的肝疾病、黃熱病、登革熱、日本腦炎、肝疾病、酒精性肝炎、腎病、多嚢腎疾病、幽門螺桿菌相關(guān)的胃和十二指腸潰瘍疾病、HIV感染、肺結(jié)核、腦膜炎、以及與冠狀動(dòng)脈旁路移植相關(guān)的治療并發(fā)癥。在這些疾病中受影響的細(xì)胞也在該方法中測試。66在蛋白質(zhì)上缺陷的細(xì)胞可以由本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。例如稱為"基因阻斷"的技術(shù)通過用突變的等位基因取代該基因來選擇性地使另外正常細(xì)胞中的基因失活。已經(jīng)開發(fā)出有力的方法用于實(shí)現(xiàn)在有機(jī)體例如酵母和小鼠的細(xì)胞中的基因阻斷(也被稱為基因敲除)。這些方法依賴于同源性重組的過程，其中序列相似性的區(qū)域交換DNA片段。"同源性重組"是指兩個(gè)核酸分子在同源核酸序列的位點(diǎn)處的核酸區(qū)域的交換。插入細(xì)胞的外源DNA能夠通過交換片段阻斷任何與其具有至少部分同源性的基因。如果已知其核苷酸序列，可以靶向特定的基因。67在某些實(shí)施方式中，外源DM可以位于靶構(gòu)建體。靶構(gòu)建體為人工構(gòu)建的基因材料的片段，其可轉(zhuǎn)移到所選細(xì)胞。靶構(gòu)建體可以與宿主細(xì)胞的基因組在增強(qiáng)或抑制(部分或全部地)特定基因的表達(dá)的位置處整合。68靶構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生。例如，如SambrookandRussell,#o/ecw/arC7o/72./f爿丄a6orafor/#a/7w"3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2001;Ausubel(ed),Cwrre/^戶ro/oco/51Wecw/ar^0/0^7，5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002中所述。69靶構(gòu)建體的開發(fā)便于將其導(dǎo)乂要用于本發(fā)明方法的細(xì)胞。用于將靶構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，無論體內(nèi)或體外，在本領(lǐng)域是已知的，并且包括但不限于顯微注射、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和電穿孔。70為了調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和/或蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性，將所述分子與細(xì)胞在體外或在體內(nèi)組合。所述分子與所述細(xì)胞的組合可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方式中所述細(xì)胞已經(jīng)從有機(jī)體中分離，并且所述分子與所述細(xì)胞的組合發(fā)生于體外。在其它實(shí)施方式中，所述細(xì)胞尚.未從有機(jī)體中分離，所述分子與所述細(xì)胞的組合發(fā)生于體內(nèi)。所述分子可以與所述細(xì)胞直接組合，即直接應(yīng)用于所述細(xì)胞。作為選擇，所述分子可以與所述細(xì)胞間接組合，例如通過將所述分子注射入有機(jī)體的血流，然后其將所述分子運(yùn)載到所述細(xì)胞。71細(xì)胞檢測可以用于鑒定調(diào)節(jié)細(xì)^<凋亡和/或蛋白質(zhì)的Bel-2家族成員的水平和/或活性的分子。此類方法包括將在測試分子的存在下對細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)分子敏感的細(xì)胞孵育，確定未經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的活細(xì)胞的存在。如果所述分子調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族成員的水平和/或活性，這可以通過確定細(xì)胞是否經(jīng)歷細(xì)胞凋亡來鑒定。作為選擇，如果所述分子調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這可以通過確定蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性來鑒定。72已經(jīng)"i殳計(jì)許多不同方法來檢測細(xì)胞凋亡，例如活細(xì)胞染料(vitalcellulardyes)(曙紅，臺(tái)盼藍(lán)，AlamarBlue)、TUNEL(末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling))分析、ISEL(原位末端標(biāo)記)、用于在細(xì)胞群或在個(gè)體細(xì)胞中檢測DNA片段化的DpA梯度分析、測定原生質(zhì)質(zhì)膜改變的膜聯(lián)蛋白-V染色、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(通過測定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性或激活)、Bcl-2家族蛋白、p53、Fas和FADD的檢測。這些對本領(lǐng)域才支術(shù)人員而言是已知的沖支術(shù)。73類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多方法用于檢測Bcl-2蛋白家族成員的水平和/或活性。例如，蛋白質(zhì)可以通過例如色譜技術(shù)從細(xì)胞中純化，并且與從未經(jīng)過本發(fā)明方法的細(xì)胞中純化的蛋白比較。74在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑為化療劑。在其它實(shí)施方式中，試劑為BH3模擬試劑，包括肽(參見例如，Cosulichetal，CurrentBiology,7:913-920，1997;Diazetal，J.Biol.Chem.，272:11350-11355，1997;Holingeretal，J.Biol.Chem.，274:13298-13304，1999;Ottilieetal,JournalofBiologicalChemistry,272:30866-30872，1997;Schimmeretal.，CellDeathDiffer.，8:725-733，2001;Shangary,Biochemistry,41:9485-9495，2002;Wangetal，CancerResearch,60:1498-1502，2000b);限制性肽(參見例如，Walenskyetal，Science,305:1466-1470，2004&WO2004/058804，通過參考將其全文引入)；折疊體(參見例如Sadowsky，J.Am.Chem.Soc，127(34):11966-11968，2005);小有機(jī)化合物例如抗霉素A(例如Tzungetal，Nat,Cell.Biol.，3:183—191，2001);BH3I(例如Degterevetal，Nat.Cell.Biol.，3:173-182，2001);替曲卡星(Tetrocarcin)A(例如Nakashimaetal,CancerResearch,60:1229-1235，2000);多酚包括棉子酚(例如Kitadaetal，J.Med.Che叫.，46:4259—4264，2003);阿樸棉子酚(例如Becattini，2004);HA14:1(例如Wangetal，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97:7124-7129，2000a);化合物6(例如Enyedyetal，J.Med.Chem.，44:4313-4324，2001);ABT—737(例如Oltersdorfetal，Nature,435:677-681，2005);三聯(lián)苯類化合物(例如Yin，J.Am.Chem.Soc，127(15):5463-5468，2005);7〉開于WO2006/002474充當(dāng)a螺旋才莫擬物的苯甲酰脲(Benzoylurea)化合物，在此通過參考將其全文引入；和苯并噢喳衍生物，如例如公開于2006年4月6日提交的USSN60/789982，在此通過參考將其全文引入。75現(xiàn)在僅通過參考以下的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。然而應(yīng)該理解，以下實(shí)施例僅是示例性的，不應(yīng)該以任何方式看作是上述本發(fā)明的普遍性的限制。實(shí)施例1篩選細(xì)胞凋亡和/或蛋白質(zhì)的Bcl-2家族成員的水平和/或活性的調(diào)節(jié)劑76蛋白質(zhì)的Bcl-2家族在確定細(xì)胞活或死上起重要作用。盡管關(guān)于該系統(tǒng)的某些具體方面存在爭議，關(guān)鍵的細(xì)胞死亡介質(zhì)Bax和Bak(圖l)一直受促存活蛋白(Bcl-2，Bc卜Xl，Bcl-w，Mcl-l，Al)控制，直到它們的活性通常通過拮抗性的僅含BH3區(qū)域的蛋白(BH3-onlyprotein),或在血小板的情況下通過降解和破壞Bcl-xj皮損害(compromised)。在該情況下，Bax/Bak自由地起作用除非受促存活Bcl-2類蛋白限制。77在一個(gè)實(shí)施方式中，如圖2所示，選擇或產(chǎn)生其中Bel-XL對于Bak是關(guān)鍵控制的細(xì)胞。這樣，就甚至當(dāng)Bcl-XL失活時(shí)也抑制細(xì)胞死亡的那些篩選小分子。該情況使用缺乏Mcl-l的鼠胚成纖維細(xì)胞，Mcl-l為Bak的其它控制。在Mcl-l-空的細(xì)胞中，在Bak上唯一的制動(dòng)(brake)是Bc卜x,，其可被充當(dāng)Bcl-Xt的有效抑制劑的化合物ABT-737廢止。就能夠阻斷Mcl-1缺陷性鼠胚成纖維細(xì)胞(MEF)的ABT-737誘導(dǎo)的殺死而篩選化合物文庫(圖3)。78在一非限制性實(shí)施例中，將Mcl-l-空的MEFs在平底96-孔板上鋪平板。12-24h后，將文庫化合物以0.1，1和lOjnM的終濃度加入，并孵育2h，然后添加ABT-737(100nM)或載體(carriervehicle)。24h后使用AlamarBlue染料給細(xì)胞活力打分，并在4h讀取。如以下表1所示，在不存在文庫化合物,或ABT-737下的細(xì)胞活力充當(dāng)陽性對照。在無文庫化合物和ABT-737存在下的細(xì)胞活力的缺失充當(dāng)陰性對照。惰性化合物顯示ABT-737不存在下的正常細(xì)胞活力。細(xì)胞毒性化合物顯示存在文庫化合物但不存在ABT-737下的降低的細(xì)胞活力。陽性命中(Positivehits)顯示ABT-737和文庫化合物存在下的細(xì)胞活力，而陰性化合物顯示文庫化合物和ABT-737存在下的降低的細(xì)胞活力。陽性命中在幾種獨(dú)立的細(xì)胞系和在培養(yǎng)物中的血小板上測試。在某些實(shí)施方式中，該化合物通過阻斷細(xì)胞攝入ABT-737或抑制細(xì)胞中ABT-737的作用起作用。在其它實(shí)施方式中，該化合物通過直接抑制Bak，Bax，Bak和Bax，或間接抑制這些分子或細(xì)胞凋亡效應(yīng)子分子起作用，所述細(xì)胞凋亡效應(yīng)子分子在Bak或Bax的下游起作用。該方法還實(shí)施在改性的具有Bel-2家族基因的小鼠上，所述Bcl-2家族基因改性以進(jìn)一步使篩選敏感和檢測各陽性試劑的分子目標(biāo)。實(shí)施例2Mcl-l空的MEF細(xì)胞的檢測1.導(dǎo)入79在Mcl-l(+)細(xì)胞中通過化合物ABT-737誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該細(xì)胞可以通過通常的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑qVD-OPH從該效應(yīng)中獲救。該檢測旨在發(fā)現(xiàn)與qVD-OPH具有可比較效應(yīng)的其它化合物。80Rinkenberger等(GenesandDevelopment,",'U7,2000)描述了Mcl-l缺陷性小鼠的產(chǎn)生。0pferman等(Nature,426:671-676，2003)描述了Mcl-1條件性敲除小鼠的產(chǎn)生，以及0pferman等(Science,307:1101-1104，2005)描述了它們的進(jìn)一步特征。這里產(chǎn)生的小鼠類似地條件性靶向mc卜l基因，vanDelft等(CancerCell,10:389-399，2006)和Lin等(Qncogene，26:3972-3979，2007)描述了Mcl-1缺陷的細(xì)胞如何對ABT-737非常敏感。Chen等(CancerResearch,67(2):782-791,2007)顯示Mc卜l-空的成纖維細(xì)胞對ABT-737,細(xì)胞篩選的基礎(chǔ)非常敏感。81總之，細(xì)胞在第1天分開以使它們在第2天具有60-80%的匯合(confluency)。在第2天，將細(xì)胞以確保它們在檢測的第4天不匯合的密度接種到檢測板。在轉(zhuǎn)移到，37C之前將檢測板在室溫下孵育20-60分鐘，以使邊緣效應(yīng)最小化。處出于同樣的理由，在孵育器中檢測板不在相互的頂部堆疊。在第三天將細(xì)胞首先用qVD或用WEHI文庫化合物處理。在文庫化合物的存在下將細(xì)胞孵育2小時(shí)，然后用ABT-737處理。在第4天，將細(xì)胞在CelITitre-BlueCel1ViabilityAssay的存在下孵育4小時(shí)。該產(chǎn)抻包含刃天青(resaruzin),其由活細(xì)胞代謝成試卣靈(resorufin)。4小時(shí)后，測定試卣靈的水平。作為選擇，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞在CellTitre-GloCellViabilityAssay的存在下孵育4小時(shí)。該產(chǎn)物通過熒光素酶依賴性發(fā)光輸出測定在細(xì)胞培養(yǎng)物中的ATP水平作為細(xì)胞活力的直接相關(guān)(directcorrelate)。2.試劑、消耗品和儀器82Mcl-1(—"鼠胚成纖維細(xì)胞(MEFs)生長于Iwaki75cm2組織培養(yǎng)瓶(cat#3123-075)中。MEFs生長于由以下構(gòu)成的培養(yǎng)基中89%聽Kelso10。/。熱滅活的胎牛血清(FCS)(Hyclonecat#SH30396.03)1%lOmM天冬酰胺(Flukacat#11149)將275in11:2000的2-巰基乙醇的稀釋液添加到500ml終體積的培養(yǎng)基(Sigmacat#M7522;稀,于磷酸鹽緩沖生理鹽水)83培養(yǎng)基貯存在4。C下，在37。C下使用。84使用培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖生理鹽水和胰島素(Sigma)培養(yǎng)和收獲MEFs。所有試劑貯存在4。C下，在37。C下使用。85對于檢測，將細(xì)胞接種在僅包含1%FCS的培養(yǎng)基中。其由以下構(gòu)成98%廳10。/。熱滅活的胎牛血清(FCS)(Hyclonecat#SH30396.03)1%10mM天冬酰胺(Flukacat#11149).將275iu11:2000的2-巰基乙醇的稀釋液添加到500ml終體積(Sigmacat#M7522;稀釋于磷酸鹽緩沖生理鹽水)86Assays在具有平的透明底部的Corning384孔組織培養(yǎng)級(jí)黑色板(DKSHAustraliaP/Lcat#371'2)上接種(seededout)。化合物在Matrical384-孔50jalV型底部的板(cat#MP101-2-PP)上補(bǔ)充。使用來自Beck,Coulter的箔密封(foilseals)(cat#538619)來將化合物板密封過夜貯存。87分才斤級(jí)DMSO用于化合物制備和滴定(Merckcat#1.02952.2500)。臺(tái)盼藍(lán)溶液(O.4。/。)用于細(xì)胞計(jì)數(shù)(SigmaT8154)。CelITitre-BlueCellViabilityAssay源自Promega(cat#G8081)，在-20。CI&存，25在37。C下使用。商業(yè)上獲自Promega(cat#G7572WCeimtre-Glo,在-20。C貯存，在37。C下使用。qVD-OPH通用的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑用作陽性對照(MPBiomedicalscat.#OPH109)。88Multidrop384(ThermoLabsystems)用于將細(xì)胞接種檢測板，添加CellTitre-BlueTM活力試劑至細(xì)胞。ZymarkScicloneALH3000系統(tǒng)用于控制和化合物添加。WallacEnVision板讀出器(PerkinElmer)用于測定入"535nm/入^590認(rèn)的熒光。L方法3.1第一天-分開(s口litting)89將培養(yǎng)基吸除細(xì)胞，然后將它們用10mls溫的磷酸鹽緩沖生理鹽水洗滌。吸除該磷酸鹽緩沖生理鹽水，將2ml胰蛋白酶添加至瓶。將該瓶置于37。C下直到細(xì)胞解離。培養(yǎng)基(6ml)用于將胰蛋白酶和細(xì)胞洗滌到瓶的底部。全部體積轉(zhuǎn)移到50ml離心管，在250xg下離心3分鐘。吸除上清液，使團(tuán)(pellet)再懸浮于4ml包含10。/。FCS的培養(yǎng)基。將1毫升該細(xì)胞懸浮液添加到干凈的包含19ml含有10%FCS的培養(yǎng)基的75cm'瓶，從而進(jìn)行1:4的分開。依賴于接下來幾天檢測所需的細(xì)胞數(shù)目，使剩下的細(xì)胞懸浮液斧其它75ci^瓶中。90用于第2天的檢測板用條形，標(biāo)記。3.2第2天-接種檢測板和制備對照板91重復(fù)第1天的策略直到細(xì)胞成團(tuán)時(shí)，吸除上清液。將團(tuán)再懸浮于10ffllsP/。FCS培養(yǎng)基。使用800m1水、100jil細(xì)胞懸浮液和100jLil臺(tái)盼藍(lán)溶液在1.5ml管中制備1:10稀釋液。將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)，然后使用血球計(jì)計(jì)數(shù)。計(jì)算在所需體積中需要達(dá)到2x104細(xì)胞011—、1000細(xì)胞每孔每50ji1培養(yǎng)基)密度的稀幹液，并且稀釋在包含1%FCS的培養(yǎng)基中進(jìn)行。92Multidrop系統(tǒng)用于將細(xì)胞接種到檢測板的所有384個(gè)孔。*沒立該系統(tǒng)以將50ja1細(xì)胞懸浮液遞送到各孔。j吏用無菌盒式頭(cassettehead),并且使用前將其用無菌蒸餾水徹底地沖洗。檢測板置于室溫下60分鐘，然后在37°C/5%C02下放!:i,過夜。板是不堆疊的。93將qVD-0PH和ABT-737板放置在基質(zhì)化合物(Matricalcompound)板中。qVD以12.5mM的原液濃度下使用(細(xì)胞中的終濃度25jaM)。10ju1該原液置于柱23和24的孔I-P。在所有剩下的孔中，分配10p1的DMSO。ABT-737以lOmM的原液濃度下使用，并且在化合物板中以lOuM使用(細(xì)胞中終濃度20nM)。'這樣進(jìn)行1:1000的稀釋，然后將10p1分配入384孔基質(zhì)板的所有孑L，除了孔23A-D，24A-D，23I-L和24I-L。DMSO(10jul)分配到這16個(gè)孔。另外，將10ja1該原液置于柱20，21和22的孔I-N。在所有剩下的孔中，分配lOju1的DMSO。WEHI-0113992以lOmM的原液濃度下使用，并且在化合物板中以5|liM使用(細(xì)胞中終濃度10nM)。這樣進(jìn)行1:1000的稀釋，然后將lOjal分配入384孔基質(zhì)板的所有孔，除了孔C20，D20，E20，120，J20，K20，C21，D21，E21，121，J21，K21，C22，D22，E22，122，J22，K22。DMSO(10jal)分配到這16個(gè)孔。將兩塊板用箔密封，在12r下JJ&存過夜。3.3第3天-處理細(xì)胞941.將文庫板從冷藏拒移出，使用前使其在室溫下解凍30-60分鐘。952.設(shè)立Zymark系統(tǒng)。打開HEPA過濾單元，檢查pintool(攪拌頭)以確保其是干凈和未加載的，用吸墨紙、乙醇和DMSO如下所示建立平臺(tái)(deck):計(jì)算機(jī)<image>imageseeoriginaldocumentpage27</image>963.將qVD-0PH添加至細(xì)胞。為此，將PVD-0PH板置于平臺(tái)(參見簡圖1)上，使板的Al角面向EnVision計(jì)算機(jī)位于的空間的角。使檢測板置于FT(frontTwister)的堆棧(stack)1中。97在Zymark桌面PC上打開ClaraExecutionManager。通過點(diǎn)擊"Initia1ize"按鈕將所有組分初始化。一旦初始化完成，從ApplicationsChain窗口移除所有舊應(yīng)用，以指定的順序添加以下應(yīng)用(對于每一應(yīng)用您需要輸入運(yùn)行的數(shù)目，即要處理的檢測板的數(shù)目)1.ControlAddition2.ControlAdditionRestack3.PintoolUnload98—旦這些就位，并確定(Okayed),出現(xiàn)MaterialInitialization屏幕，并且確定。然后引出ZymarkStackStorage系統(tǒng)窗口之一，訪問configuration菜單。選擇"New"、，然后選擇"ControlAddition"并確定。再次訪問configuration菜單，對于"ControlAdditionRestack"程序重復(fù)該過程。99一旦這完成，點(diǎn)擊Clara上的"Run"按鈕來開始運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束時(shí)在堆棧中剩下檢測板，從Zyraark平臺(tái)中除去qVD-0PH板。1004.然后開始文庫化合物添加?；衔锇逯糜贐T(BackTwister)的堆棧1中，使Al面向MiniTrak。從Clara中的ApplicationsChain中移除舊應(yīng)用，以以下順序添加新應(yīng)用，就各應(yīng)用輸入運(yùn)行的數(shù)目1.PintoolAdditionCorning2.PintoolUnload101—旦這完成，將其確定(Okayed)，檢查和確定MaterialInitialization窗口。然后引出gymarkStackStorage窗口之一，訪問configuration菜單。選擇"New"，然后選擇"PintoolAdditionCorning"和確定。102—旦這完成，點(diǎn)擊Clara上的"Run"按鈕來開始運(yùn)4亍。103運(yùn)行結(jié)束時(shí)將檢測板再次蓋住，返回37°C/5%C022小時(shí)的剩余時(shí)間(從向第一塊檢測板添加化合物開始計(jì)時(shí)-通常對于20板運(yùn)行約30分鐘)。將文庫板再次蓋住，返回冷凍貯存。1047.2小時(shí)醉育結(jié)束時(shí)，進(jìn)行ABT-737添加。將qVD板置于平臺(tái)上，使板的Al角面向EnVision計(jì)算機(jī)位于的空間的角。使檢測板置于FT(frontTwister)的堆棧1中。105在Zyraark桌面PC上打開ClaraExecutionManager。通過點(diǎn)擊"Initialize"按鈕將所有組分初始化。一旦初始化完成，從ApplicationsChain窗口移除所有舊應(yīng)用，以指定的順序添加以下應(yīng)用(對于每一應(yīng)用輸入運(yùn)行的數(shù)目，即要處理的檢測板的數(shù)目)1.ControlAddition2.ControlAdditionRestack3.PintoolUnload106—旦這些就位，并確定(Okayed)，出現(xiàn)MaterialInitialization屏幕，并且確定。然后引出ZymarkStackStorage系統(tǒng)窗口之一，訪問configuration菜單。選擇"New"，然后選擇"ControlAddition"并確定。再次訪問configuration菜單，對于"ControlAdditionRestack"程序重復(fù)該過程。107—旦這完成'，點(diǎn)擊Clara上^j"Run"按鈕來開始運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)束時(shí)將檢測板再次蓋住，返回37X:/^C02，將ABT-737板從Zymark平臺(tái)中移除。1088.關(guān)閉HEPA過濾器，將DMSO和乙醇貯液器排空，洗滌，按照以下策略清潔Pintool(攪拌頭)-浸入10xVP洗滌液，在VP洗滌液中靜置5分鐘；吸干(blot)-浸入10xMQ水；吸干-浸入10x100%乙醇；吸干，3.4第4天-活力分析109根據(jù)制造商說明書通過使CellTitre-GloSubstrate與CellTitre-GloBuffer重組來制備CelITitre-GloTM溶液，并在使用后將其貯存在-80X:下。將板從孵育器移除，使其在室溫下平衡15分鐘。使用Multidrop在使用MiniTr，k每孔除去25ja1細(xì)胞培養(yǎng)基后，將25ja1稀釋的CellTitre-GloT"添加到檢測板各孔。在Envision上使用發(fā)光策略讀數(shù)前，將板在板振蕩器上混合15分鐘。110將CellTitre-Blue"^加熱到37。C，然后使用Multidrop將10ju1添加到檢測板的各孔。加載到EnVision板讀出器前使板返回37°C4小時(shí)。進(jìn)行活力測定，然后將數(shù)據(jù)輸入ACTIVITYbase(IDBS)用于分析。111對于CellTitre-Glo，使用以下公式計(jì)算抑制百分比%.抑制=100*(1C"+一;O.^=樣品化合物處理后獲得的CPSA—-陰性對照獲得的CPS(柱24)〃+-陽性對照獲得的CPS(柱23)112使用四參數(shù)邏輯擬合法(XLFit4eqn#205)，通過數(shù)據(jù)的非線性最小二乘擬合獲得ICs。值。y=A+((B-A)/(l+((C/x)AD)))。113檢測結(jié)果的質(zhì)量通過確定各檢測板的Z'因子來監(jiān)測，其中對于結(jié)果Z'>0.5認(rèn)為是可靠的(robust)(ZhangWa/.,J.Biomol.Screening,《.($7-1999)預(yù)期的EC50s在1%FCS中ABT-737EC50~0.004-0.008"M114如果對于在1%FCS條件下生長的ABT-737-處理的Mcl(-/-)細(xì)胞，計(jì)算的ECs。右移至〉0.04JliM，丟棄MEFs，用低傳代數(shù)的新解凍的細(xì)胞補(bǔ)充。實(shí)施例3在受試者篩選中鑒定皮質(zhì)類固醇115使用在實(shí)施例2中所述的策略篩選已知化合物的文庫。初步分析30的結(jié)果指示幾種符合以下結(jié)構(gòu)式的為皮質(zhì)類固醇類的活性分子:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>=可以為單鍵或雙鍵A=H或F，B=H，CH3，F(xiàn)或OHR=H或C廣C6?；鵕=H，OH或0C廣C6?；鵕2=H，Me或R!和R2形成二氧戊環(huán)116具體地，這些試劑(參見圖4)能夠通過ABT-737顯著地抑制Mcl-l空的MEF細(xì)胞的殺死。因此，這些試劑適于在增強(qiáng)或延長血小板活力、壽命或存活的本發(fā)明中使用。此外，該試劑在延長或保存細(xì)胞壽命的治療干擾上找到廣闊應(yīng)用。實(shí)施例4用于測試新的抗細(xì)胞凋亡化合物的策略殺死檢測(NB:所有試驗(yàn)在10%FCS存在下完成)死亡刺,激物ABT-737或依托泊武(Etoposide)對于所有粘附細(xì)胞(adherentcells)(例如mcl-廠'"MEFs)117第l天在500mL培養(yǎng)基(FMA)中接種(Plateout)12，000細(xì)胞/24孔。118第2天除去培養(yǎng)基。一式三份地添加WEHI抗細(xì)胞凋亡化合物(4倍連續(xù)稀釋液-最高終濃度40mM每500mL)。孵育2小時(shí)。向各孔添加50mLABT-737至終濃度40nM或50mL依托泊戒至終濃度2mM。孵育24小時(shí)。119第3天收獲細(xì)胞，用在FACS緩沖液中5mg/mL的碘化丙啶染色。通過FACs分析-FLH-3通道確定細(xì)胞活力。對于懸浮細(xì)胞(例如Jurkats，F(xiàn)DC-Pls)120第1天在100niL培養(yǎng)基(對于Jurkats為HT-RPMI;對于FDC-Pls為DME+10%FCS+IL3)中接種(Plateout)20,000細(xì)胞/96孔。121第2天一式三份地添加WEHI抗細(xì)胞凋亡化合物(4倍連續(xù)稀釋液-最高終濃度40mM每100mL)。孵育2小時(shí)。向各孔添加20mL依托泊戒，^于FDC-Pls至終濃度2mM，對于Jurkats至10mM。孵育24小時(shí)。122第3天收獲細(xì)胞，用在FACS緩沖液中5mg/mL的碘化丙啶染色。通過FACs分析-FLH-3通道確定細(xì)胞活力。死亡刺激物生長因子撤回對于生長因子依賴性懸浮細(xì)胞(例如FDC-Pls)123第l天在100mL培養(yǎng)基(DME+10%FCS)中接種20,000細(xì)胞/96孔。接種前，首先用DME+10%FCS洗滌細(xì)胞2次以除去IL-3。124第2天一式三份地添加WEHI抗細(xì)胞凋亡化合物(4倍連續(xù)稀釋液-最高終濃度40mM每100mL)。孵育2小時(shí)。孵育24小時(shí)。125第3天收獲細(xì)胞，用在FACS緩沖液中5mg/niL的碘化丙啶染色。通過FACs分析-FLH-3通道確定細(xì)胞活力。126本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到除了具體描述的那些外本文描述的本發(fā)明容許變化和改進(jìn)。應(yīng)該理解本發(fā)明包括所有此類變化和改進(jìn)。本發(fā)明還包括所有在說明書中參考或指出的步驟、特征、組合物和化合物，無論單獨(dú)或全體，以及任何和所有任何兩種或多種所述步驟或特征的組合。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>參考文獻(xiàn)Albertse"/,#o/ecw/arA/'o/og/o尸f力eCe//,4thed.，NewYorkandLondon:GarlandScience,c2002.Ausubel(ed)，C"7ve/7f戶rWoco/51A2'o/0^7，5thEdition,JohnWiley&Sons，Inc，NY，2002.Chen"<s/,CancerResearch,67(2):782-791，2007.Cosulicha/.，CurrentBiology,7:913-920，1997.Degtereve"/，Nat.Cell.Biol.，3:173-182，2001.Diaza/，J.Biol.Chem.，272:11350-11355，1997.Enyedy"a/,J.Med.Chem.，44:4313-4324，2001.Gait(ed)，(？//>o/i/c/eo〃cfe5>/7*",OxfordIRLPress,1984.Hames"a厶(eds)，A7/c/e2'c爿c/d好6"/za〃。/7，J尸rac〃ca/IRLPress,1985.HolingerWa/,J.Biol.Chem.，274:13298—13304，1999.Johnsons入戶e/7〃de7kr/7///歷e〃c5"inBiotechnologyandPharmacy,Pezzutoa/,edsChapmanandHall,NewYork,1993.Kitada"a/,J.Med.Chem.，46:4259-4264,2003.Lin"s/,Oncogene,26:3972-3979,2007.Lodisha/,#o/eci//arCe//A/0/0g7〃,4thed.，NewYork:W.H.Freeman&Co.，c2000.Nakashima"a/,CancerResearch,60:1229-1235,2000.OUersdorfe"/,Nature,435:677-681，2005.Opferman"a/,Nature,426:671-676，2003.Opfermane"/，Science,307:1101-1104,2005.0Uiliee"/，JournalofBiologicalChemistry,272:30866-30872:1997.Remington'sPharmaceuticalSciences,17thEdition,MackPublishingCompany,Easton，Permsylvania，USA.Rinkenbergerefa/,GenesandDevelopment,14:23-27，2000.Sadowsky，J.Am.Chem.Soc，127(34):11966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