專利名稱：非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡
(一) 技術(shù)領(lǐng)域
本實(shí)用新型屬于生物學(xué)探測(cè)用掃描探針顯微鏡技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種 在生理培養(yǎng)液體中非接觸式實(shí)時(shí)探測(cè)活體生物樣品的掃描納米玻璃探針顯 微鏡技術(shù)，即一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡。
(二) 背景技術(shù)-
隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，高分辨率地實(shí)時(shí)探測(cè)活體生物樣品一直以來(lái) 都是納米生物醫(yī)學(xué)專家，尤其是那些從事納米尺度生物樣品顯微成像的專家 們所必需面對(duì)的技術(shù)挑戰(zhàn)。普通光學(xué)顯微鏡由于受到光學(xué)衍射極限的限制，
其用于生物樣品探測(cè)的最高分辨率很難突破250納米。電鏡盡管具有足夠高 的分辨率，但需要對(duì)生物樣品進(jìn)行固化和特別處理以實(shí)現(xiàn)樣品的導(dǎo)電性，這 勢(shì)必會(huì)改變、甚至破壞樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)，因此不適合活體生物樣品的實(shí) 時(shí)觀測(cè)。
.1981年美國(guó)IBM公司設(shè)在瑞士蘇黎士的實(shí)驗(yàn)室，研制出了世界上第一臺(tái) 具有原子分辨率的掃描隧道顯微鏡(scanning tunnelling microscopy, STM)，并帶來(lái)了納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，成為了人類認(rèn)識(shí)微觀世 界的有力工具。近年來(lái)，在STM的原理與結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，相繼產(chǎn)生了一系列 利用探針與樣品的不同相互作用來(lái)探測(cè)納米尺度下表面或界面性質(zhì)的掃描 探針顯微鏡技術(shù)(scanning probe microscopy, SPM)。為了彌補(bǔ)STM只限 于觀測(cè)導(dǎo)體和半導(dǎo)體表面結(jié)構(gòu)的缺陷，Birmig等人發(fā)明了原子力掃描探針顯 微鏡技術(shù)(atomic force microscopy, AFM) [1〗。AFM是一種專為研究非導(dǎo) 電樣品而設(shè)計(jì)的基于STM控制技術(shù)的SPM，它通過(guò)探測(cè)探針尖端的原子與樣 品表面的原子之間產(chǎn)生極其微弱的相互作用力，并利用該原子之間作用力的 微弱變化來(lái)負(fù)反饋控制探針在樣品表面掃描。AFM因采用輕敲模式(T即ping mode)克服了接觸模式的某些不足，使高分辨率研究活體生物樣品成為可能 [2]。由于AFM顯微鏡技術(shù)利用探針與生物樣品表面間的作用力為負(fù)反饋控制 來(lái)進(jìn)行掃描，AFM掃描過(guò)程中需要探針與生物樣品表面進(jìn)行或多或少的接觸， 即使是探針與生物樣品表面間的輕微接觸也會(huì)對(duì)樣品細(xì)胞活性及表面微結(jié) 構(gòu)產(chǎn)生或多或少的影響[3]。國(guó)內(nèi)一些單位也逐步嘗試用非接觸模式的AFM來(lái)探測(cè)生物樣品，控制探針在樣品表面上方一定距離處掃描且始終不與樣品表 面接觸，因而針尖不會(huì)對(duì)樣品造成污染或產(chǎn)生破壞，避免了輕敲模式中遇到 的一些問(wèn)題。然而，在非接觸模式下，雖然采用針尖振動(dòng)調(diào)制控制可以增加
AFM顯微鏡的靈敏度,但相對(duì)較長(zhǎng)的針尖-樣品間距使得分辨率要低于輕敲模 式。加之在實(shí)際操作中，由于針尖很容易被樣品表面吸附氣體的表面壓吸附 到樣品表面，造成圖像數(shù)據(jù)的不穩(wěn)定和對(duì)樣品的損壞，使非接觸模式的AFM 操作及在液體中成像比較困難，因而不能適應(yīng)柔軟活體細(xì)胞在生理狀態(tài)下進(jìn) 行實(shí)時(shí)探測(cè)的需要。
1989年，加州大學(xué)的Hansma教授利用掃描探針顯微鏡的負(fù)反饋控制技 術(shù)，用玻璃微探針作為掃描探針設(shè)計(jì)出了非接觸式的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技 術(shù)(scanning ion conductance microscopy, SICM) [4]。但是由于當(dāng)時(shí)負(fù)反 饋控制方法及精確定位技術(shù)的局限與不足，纖細(xì)的玻璃微滴管探針在掃描時(shí) 經(jīng)常意外地與樣品表面接觸并導(dǎo)致針尖或樣品的毀損，所以掃描離子電導(dǎo)顯 微鏡技術(shù)在其發(fā)明后的很長(zhǎng)一段時(shí)間僅適用于平坦的PET薄膜的掃描成像。 1997年英國(guó)倫敦帝國(guó)理工學(xué)院的Korchev教授對(duì)掃描離子電導(dǎo)探針顯微鏡 的負(fù)反饋控制等技術(shù)進(jìn)行重大改進(jìn)后，使該顯微鏡技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)活體生物樣 品表面結(jié)構(gòu)的非接觸三維實(shí)時(shí)探測(cè)[5]，并逐步成為納米生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具 有發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景的一種掃描探針顯微鏡技術(shù)[6]。掃描離子電導(dǎo)顯微鏡 技術(shù)與目前使用的用于生物樣品探測(cè)的其它顯微鏡技術(shù)相比，具有以下特 點(diǎn)非接觸式探測(cè)，樣品制備簡(jiǎn)單，可以直接用于生理液態(tài)培養(yǎng)環(huán)境下活體 生物樣品表面微觀結(jié)構(gòu)的高分辨率實(shí)時(shí)探測(cè)。
掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)的基本操作原理如文獻(xiàn)報(bào)道[7' 8]。具體來(lái)說(shuō)， 如圖l所示:將Ag/AgCl電極置于充滿電解液的玻璃微探針中作為掃描探針，
內(nèi)含生物樣品與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的樣品掃描 臺(tái)上，參比電極置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中，并通過(guò)負(fù)反饋電路實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)探 針內(nèi)電極與參比電極之間電導(dǎo)的變化。當(dāng)探針接近生物樣品表面時(shí)，由于允 許離子流入玻璃微探針針尖自由空間的減小，離子電導(dǎo)也隨之減小。在掃描 過(guò)程中，掃描離子電導(dǎo)顯微鏡控制電路通過(guò)壓電陶瓷來(lái)操控玻璃微探針上下 移動(dòng)以保持電導(dǎo)守恒，從而保持玻璃微探針以接近針尖尖端內(nèi)半徑r的距離 d在生物樣品表面非接觸地掃過(guò)，圖中帶箭頭的虛線代表了玻璃微探針在樣 品表面掃描的軌跡，通過(guò)電腦記錄掃描范圍內(nèi)的玻璃微探針的位置及掃描軌跡便可獲得該生物樣品掃描范圍表面的三維拓?fù)湫蚊病?br> 目前普遍采用交流調(diào)制(AC)負(fù)反饋控制模式并以經(jīng)調(diào)制的流入玻璃 微探針的離子電流(ZJ作為負(fù)反饋信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)探針與樣品之間的距離[9]。 在AC模式下，為了保持穩(wěn)定的負(fù)反饋控制，玻璃微探針與細(xì)胞表面間保持 的恒定距離"應(yīng)接近于玻璃微探針的內(nèi)半徑r，更重要的是隨著探針與樣品 間的距離越來(lái)越近時(shí)，4的變化對(duì)針尖-樣品距離的變化越來(lái)越敏感，微小 距離的改變便可引起厶c產(chǎn)生很大的改變，這種AC負(fù)反饋控制模式使我們?cè)?實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以對(duì)因直流漂移、電極堵塞、溶液離子強(qiáng)度變化和電壓變化造 成的離子電流變化進(jìn)行有效的補(bǔ)償[11]，從而保證了掃描過(guò)程中玻璃微探針與 平整的活體生物樣品之間的非接觸。然而，因?yàn)閽呙桦x子電導(dǎo)顯微鏡的分辨 率與玻璃微探針尖端內(nèi)半徑尺寸的數(shù)量級(jí)相同，隨著對(duì)掃描離子電導(dǎo)顯微鏡 的納米尺度分辨率要求的提高，掃描用玻璃微探針越來(lái)越細(xì)、尖端內(nèi)半徑尺 寸越來(lái)越小，導(dǎo)致負(fù)反饋控制下的掃描納米玻璃微探針離生物樣品越來(lái)越 近。如要達(dá)到50納米的高分辨率，探針在負(fù)反饋控制下距生物樣品50納米 左右的高度掃過(guò)生物樣品表面。由于探針離生物樣品太近，在掃描高度差異 很大的形態(tài)復(fù)雜的生物樣品時(shí)，目前的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡探針的掃描軌跡 不能很好地跟隨生物樣品表面形貌的復(fù)雜高度變化，甚至?xí)趻呙钑r(shí)意外地 與高度急劇變化的生物樣品表面接觸并導(dǎo)致針尖或樣品的毀損使其研究領(lǐng) 域和掃描速度受到了很大限制。如呈三角形或多角形的神經(jīng)細(xì)胞，可以分 為胞體、樹(shù)突和軸突這三個(gè)區(qū)域，胞體的大小差異很大，直徑從5 6trm 到100um以上；突起的形態(tài)、數(shù)量和長(zhǎng)短也大不相同，其中軸突直徑約 15-25微米；樹(shù)突直徑0.5-l微米。由于這三個(gè)區(qū)域的高度差異大于數(shù)十 微米，在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡用納米尺度的玻璃微探針進(jìn)行的神經(jīng)細(xì)胞形 態(tài)觀察中，若想在同一次掃描中同時(shí)得到三個(gè)區(qū)域的納米尺度的高分辨率 成像，顯微鏡負(fù)反饋控制系統(tǒng)必需控制玻璃微探針在距離樣品表面納米尺 度的距離的同時(shí)，并頻繁進(jìn)行數(shù)十微米高度的快速位置變化，這在目前的 掃描離子電導(dǎo)顯微鏡掃描控制模式下難以迅速實(shí)現(xiàn)。
(三)實(shí)用新型內(nèi)容
本實(shí)用新型的發(fā)明目的在于設(shè)計(jì)一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探 針顯微鏡，它針對(duì)現(xiàn)有掃描離子電導(dǎo)顯微鏡掃描控制技術(shù)中的不足，提供一 種既能夠有效防止與生物樣品接觸的高分辨率的快速掃描控制方法，又能保證掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)可以完成活體生物樣品表面復(fù)雜形貌的快速非 接觸掃描探測(cè)。
本實(shí)用新型的技術(shù)方案 一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微 鏡，其特征在于它包括納米玻璃探針、兩個(gè)電極、高速Z向平板壓電陶瓷、 前置電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ 三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)及計(jì)算機(jī)；其中一個(gè)電極置于固定于高速Z向上下
運(yùn)動(dòng)的平板壓電陶上的納米玻璃探針中，另一電極置于細(xì)胞培養(yǎng)液中作為參 比電極，兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的離子電流信號(hào)經(jīng)前置電流放
大器放大后輸入鎖相放大器；所說(shuō)的鎖相放大器的輸出端連接數(shù)據(jù)采集模塊 的輸入端；所說(shuō)的數(shù)據(jù)采集模塊的輸出端連接DSP控制模塊的輸入端；所說(shuō) 的DSP控制模塊與計(jì)算機(jī)呈雙向連接；所說(shuō)的DSP控制模塊包括調(diào)制控制單 元和負(fù)反饋控制單元，其中調(diào)制控制單元的輸出端連接高速Z向平板壓電陶 瓷的輸入端，負(fù)反饋控制單元的輸出端連接高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃 描臺(tái)；所說(shuō)的高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)的輸出端連接計(jì)算機(jī)的輸 入端。
上述所說(shuō)的電極為Ag/AgCl電極。
上述所說(shuō)的計(jì)算機(jī)包括信號(hào)處理分析單元及圖像生成單元。 本實(shí)用新型的工作過(guò)程為(1)兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的 離子電流信號(hào)經(jīng)前置電流放大器放大后輸入鎖相放大器；再經(jīng)數(shù)據(jù)采集模塊 進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換后，輸入給DSP控制模塊；(2) DSP控制模塊保持與計(jì)算機(jī)的 實(shí)時(shí)通訊，通過(guò)調(diào)制控制單元調(diào)制控制固定有納米玻璃探針的獨(dú)立Z向平板 壓電陶瓷的上下高速運(yùn)動(dòng)，完成納米玻璃探針針尖對(duì)生物樣品表面形貌的感 知；(3) DSP控制模塊保持與計(jì)算機(jī)的實(shí)時(shí)通訊，對(duì)流入納米玻璃探針的離 子電流信號(hào)進(jìn)行處理分析，再通過(guò)實(shí)時(shí)DSP負(fù)反饋控制單元來(lái)控制高精度 XYZ一三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)上生物樣品與高速Z向運(yùn)動(dòng)的納米玻璃探針的 非接觸狀態(tài)；(4)通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行信號(hào)處理分析得到高精度XYZ三維平板壓 電陶瓷掃描臺(tái)在不同掃描點(diǎn)的空間位置并生成生物樣品的三維拓?fù)鋱D。
本實(shí)用新型的優(yōu)越性在于本實(shí)用新型中納米玻璃探針不必緊貼細(xì)胞樣 品表面掃描，從而在生物樣品的高分辨率探測(cè)中，既有效防止了探針與生物 樣品表面的接觸，又因?yàn)椴Ａ⑻结樣凶銐虻倪\(yùn)動(dòng)幅度和運(yùn)動(dòng)速度，進(jìn)而彌 補(bǔ)了傳統(tǒng)掃描控制方法掃描高度差異大的形態(tài)復(fù)雜的生物樣品時(shí)的不足。(四)

圖1為現(xiàn)有技術(shù)中掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的工作原理圖(其中，帶箭頭的 虛線代表了玻璃微探針在樣品表面接觸掃描的相對(duì)運(yùn)動(dòng)軌跡)。
圖2為本實(shí)用新型所涉一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡的 工作原理的結(jié)構(gòu)示意圖(其中，帶箭頭的虛線為納米玻璃探針在樣品表面非 接觸掃描的相對(duì)運(yùn)動(dòng)軌跡)。
其中，l為納米玻璃探針，2為高速Z向平板壓電陶瓷，3為電極，4為 細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例 一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡(見(jiàn)圖2)，其特
征在于它包括納米玻璃探針1、兩個(gè)電極3、高速Z向平板壓電陶瓷2、前置 電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維 平板壓電陶瓷掃描臺(tái)及計(jì)算機(jī)；其中一個(gè)電極置于固定于高速Z向上下運(yùn)動(dòng) 的平板壓電陶2上的納米玻璃探針中，另一電極置于細(xì)胞4培養(yǎng)液中作為參 比電極，兩電極3之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針玻璃微探針1的離子電流信 號(hào)經(jīng)前置電流放大器放大后輸入鎖相放大器；所說(shuō)的鎖相放大器的輸出端連 接數(shù)據(jù)采集模塊的輸入端；所說(shuō)的數(shù)據(jù)采集模塊的輸出端連接DSP控制模塊 的輸入端；所說(shuō)的DSP控制模塊與計(jì)算機(jī)呈雙向連接；所說(shuō)的DSP控制模塊 包括調(diào)制控制單元和負(fù)反饋控制單元，其中調(diào)制控制單元的輸出端連接高速 Z向平板壓電陶瓷2的輸入端，負(fù)反饋控制單元的輸出端連接高精度XYZ三 維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說(shuō)的高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)的輸出 端連接計(jì)算機(jī)的輸入端。
上述所說(shuō)的電極3為Ag/AgCl電極。
上述所說(shuō)的計(jì)算機(jī)包括信號(hào)處理分析單元及圖像生成單元。 以上所述僅為本實(shí)用新型用于復(fù)雜形貌的活體生物樣品的高分辨率非 接觸快速探測(cè)方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依據(jù)本實(shí)用新 型的原理，還可以將該技術(shù)直接用于導(dǎo)電樣品、半導(dǎo)體樣品的探測(cè)，這些均 落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求1、一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡，其特征在于它包括納米玻璃探針、兩個(gè)電極、高速Z向平板壓電陶瓷、前置電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)及計(jì)算機(jī)；其中一個(gè)電極置于固定于高速Z向上下運(yùn)動(dòng)的平板壓電陶上的納米玻璃探針中，另一電極置于細(xì)胞培養(yǎng)液中作為參比電極，兩電極之間產(chǎn)生的流入納米玻璃探針的離子電流信號(hào)經(jīng)前置電流放大器放大后輸入鎖相放大器；所說(shuō)的鎖相放大器的輸出端連接數(shù)據(jù)采集模塊的輸入端；所說(shuō)的數(shù)據(jù)采集模塊的輸出端連接DSP控制模塊的輸入端；所說(shuō)的DSP控制模塊與計(jì)算機(jī)呈雙向連接；所說(shuō)的DSP控制模塊包括調(diào)制控制單元和負(fù)反饋控制單元，其中調(diào)制控制單元的輸出端連接高速Z向平板壓電陶瓷的輸入端，負(fù)反饋控制單元的輸出端連接高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)；所說(shuō)的高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)的輸出端連接計(jì)算機(jī)的輸入端。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探 針顯微鏡，其特征在于所說(shuō)的電極為Ag/AgCl電極。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探 針顯微鏡，其特征在于所說(shuō)的計(jì)算機(jī)包括信號(hào)處理分析單元及圖像生 成單元。
專利摘要一種非接觸生物探測(cè)掃描納米玻璃探針顯微鏡，其特征在于它包括納米玻璃探針、兩個(gè)電極、高速Z向平板壓電陶瓷、前置電流放大器、鎖相放大器、數(shù)據(jù)采集模塊、DSP控制模塊、高精度XYZ三維平板壓電陶瓷掃描臺(tái)及計(jì)算機(jī)；優(yōu)越性在于本實(shí)用新型中納米玻璃探針不必緊貼細(xì)胞樣品表面掃描，從而在生物樣品的高分辨率探測(cè)中，既有效防止了探針與生物樣品表面的接觸，又因?yàn)椴Ａ⑻结樣凶銐虻倪\(yùn)動(dòng)幅度和運(yùn)動(dòng)速度，進(jìn)而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)掃描控制方法掃描高度差異大的形態(tài)復(fù)雜的生物樣品時(shí)的不足。
文檔編號(hào)G01N13/10GK201311386SQ20082014441
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者張彥軍 申請(qǐng)人:國(guó)家納米技術(shù)與工程研究院