專利名稱：：抑制結(jié)腸癌生長的抗體及其用于制備腺癌診斷劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言本發(fā)明提供特異識別結(jié)直腸腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌以及胰腺癌細(xì)胞糖鏈抗原，并能抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞生長的單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞，以及所述抗體在制備用于早期診斷結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及胰腺癌的診斷劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌指大腸內(nèi)膜上皮細(xì)胞的惡性改變，包括異常分化，異常增殖以及細(xì)胞代謝和分泌異常等。臨床上結(jié)直腸癌的絕大多數(shù)(>95%)為腺癌，其它類型的結(jié)直腸癌很少，包括淋巴瘤，良性瘤，惡性肉瘤等。結(jié)直腸腺癌的發(fā)生原因，診斷治療和預(yù)防一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究重點。結(jié)直腸癌的死亡率居腫瘤死亡的第二位。美國每年診斷為結(jié)直腸癌的病例超過13萬，死亡大于5萬，死亡率約40%。結(jié)直腸癌在我國是第三位常見消化道腫瘤，位于食管癌和胃癌之后，但每年死于結(jié)直腸癌的病例估計超過4萬人，約占腫瘤5.8%。我國結(jié)直腸癌發(fā)病一個明顯特點是平均發(fā)病年齡45歲左右，比歐美等國提前12-18年，其中直腸癌較多，約占60%。近二十年，隨著我國經(jīng)濟增長和人們生活水平的逐步提高，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病人數(shù)逐年增加，發(fā)病更趨于年輕化。多年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，如果能夠早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷，幾乎所有的結(jié)直腸癌都能在一定程度上進(jìn)行治療(SanduleanuandStockbrugger,2003)，因此有效的診治手段對減少結(jié)直腸癌的死亡有重要意義。胰腺癌為惡性程度極高的消化道腫瘤，其死亡率占我國惡性腫瘤的第六位，在美國位于第四位。近年來，胰腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，五年生存率仍很低，在診斷后的中位生存期為46個月(Coppola,2000)。胰腺癌因其獨特的解剖位置，癥狀隱匿，早期診斷非常困難，目前尚無有效的早期診斷方法。目前，用于臨床的腫瘤抗原檢測，均為非特異性的腫瘤相關(guān)抗原，只能通過選擇適當(dāng)?shù)哪[瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，來提高檢測的靈敏性和有效性。子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性的惡性腫瘤，又稱子宮體癌。以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最為常見，稱為子宮內(nèi)膜腺癌。子宮內(nèi)膜癌為女性生殖道常見惡性腫瘤，發(fā)病率占女性生殖道惡性腫瘤20%~30%，且呈不斷上升趨勢，占女性全身腫瘤7%。在子宮內(nèi)膜癌的治療中，手術(shù)作為首選治療己為世界范圍所接受；術(shù)后化療逐漸受到重視；但其早期診治仍為當(dāng)前主要問題。傳統(tǒng)的診斷方法是根據(jù)臨床表現(xiàn)，輔助檢查結(jié)果綜合分析，如內(nèi)膜組織學(xué)的檢査方可確診。糖基化的變更是癌細(xì)胞的普遍特征，并且有一些類型的糖鏈結(jié)構(gòu)被公認(rèn)為腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志物，對特異性的腫瘤標(biāo)志物檢測可以達(dá)到早期診斷腫瘤的目的(Hoetal.，1988;Kim,1990;Kim,1998a)。消化道內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡變時往往引起糖基化改變，主要改變之一是粘蛋白(Mucin)在腫瘤中的過度表達(dá)，另一改變是粘蛋白的不完全糖基化。已有的研究資料表明腫瘤細(xì)胞不完全糖基化的結(jié)果是產(chǎn)生Tn，T和涎酸化Tn(S-Tn)抗原，這些抗原結(jié)構(gòu)在正常情況下很少見(Bolandetal.,1986;Itzkowitzetal.,1989;Bresalieretal"1991;Itzkowitzetal.，1992;Kim,1998b;Haraetal"2000)。盡管糖基化作用以及改變的糖鏈在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的病理作用機制還不清楚，但腫瘤特異的糖鏈結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為腫瘤監(jiān)測的標(biāo)記物，用于發(fā)現(xiàn)腫瘤的早期改變，腫瘤發(fā)展和預(yù)后，腫瘤治療效果評價，甚至可以成為腫瘤治療的靶標(biāo)。盡管結(jié)直腸癌的檢出并不十分困難，但目前對于不同時期的結(jié)直腸癌診斷方法不一(Zhangetal.,2002;Winawer，2005)。傳統(tǒng)的檢査方法有腸鏡，鋇餐透視和腸道內(nèi)容物檢測等，診斷往往依賴臨床醫(yī)生根據(jù)檢查結(jié)果，結(jié)合實踐經(jīng)驗作出的推斷。而對于局限于粘膜的早期腫瘤，傳統(tǒng)檢測方法很難作出準(zhǔn)確的判斷，需要靈敏的檢測手段，現(xiàn)在己經(jīng)建立了多種在分子水平檢測技術(shù)，如RT-PCR，DNA探針檢測以及特異的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物檢測等方法(Finkelsteinetal.，1996a;Finkelsteinetal.，1996b;Hammel禾口Soussi，52000;Lassmanneta1.,2002)，可以靈敏地對結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷。然而，靈敏的分子檢測技術(shù)RT-PCR，DNA探針檢測卻因特異性低在臨床應(yīng)用較少，目前體外診斷主要是依靠對多種腫瘤標(biāo)記物的檢測，再綜合分析結(jié)果進(jìn)行判定。目前結(jié)直腸癌的診斷仍采用傳統(tǒng)的檢査方法結(jié)合臨床癥狀來確定，主要原因是現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)記物抗體對腫瘤的識別存在特異性差和識別抗原不確定等因素，造成檢出結(jié)直腸癌的敏感性和特異性低(秦曉光，1995)。在大多文獻(xiàn)報道中，單克隆抗體對結(jié)直腸癌的敏感性和特異性分別為30-60%和20-50%。CEA，CA19-9，CA72-4等抗原的單克隆抗體對結(jié)直腸癌的輔助診斷，如抗CEA單克隆抗體識別癌胚抗原，由于大多數(shù)腫瘤都不同程度的表達(dá)CEA，所以抗CEA單抗用于診斷某一腫瘤的特異性差。但為提高結(jié)直腸癌的檢出率，在臨床上多種單克隆抗體聯(lián)用能提高檢出陽性率見表l，由此成為診斷腫瘤的選擇(吳道紅,2004;徐笑紅，1998)。表1CA-724,CA19-9,CEA和CA-50對不同腫瘤的陽性結(jié)果組另J咲檢陽性率w陽性率W陽性率(W陽性率W胃癌組54.55"力腸癌組縣m肝癌組107i"〗6"51〗11.211<1』胰腺癌組6it7"〗202"l〗1薦9"5食道癌組5J〗"41，".0D125"5正常對照組50d000d00000目前，胰腺癌的診斷主要通過一些常用腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測來實現(xiàn)，如CA19-9，CA50，CA242等指標(biāo)，它們對于診斷腫瘤發(fā)生，監(jiān)測預(yù)后及復(fù)發(fā)起到了重要作用。目前最常用的是將CEA，CA19-9和CA242聯(lián)用。CA19-9在胰腺癌中的敏感性最強(80%)，但特異性很低(43%)，CEA與CA242聯(lián)用后可將特異性提高至92%，但三者聯(lián)用后，靈敏度僅為29%(Nietal.,2005)。這些指標(biāo)的特異性及敏感性尚不能滿足臨床需要，因此需要尋找新的診斷及聯(lián)合診斷指標(biāo)進(jìn)一步提高胰腺癌的早期診斷率。近年來，在子宮內(nèi)膜癌的診斷中，糖類抗原成為發(fā)展迅速，應(yīng)用廣泛的腫瘤標(biāo)志物，主要為糖蛋白與糖脂，抗原決定簇定位于糖鏈或蛋白核上，它們的出現(xiàn)為臨床腫瘤的診斷帶來方便，如CA19-9，CA72-4，CA125，CA15-3等(Yamazawaetal.，2005;Hareyamaetal.，1996;Cherchietal.，2002;Loetal.,1999)。這些糖類抗原的敏感性均在30%67%之間。CA19-9與CA125聯(lián)用，敏感性可高達(dá)83.3%，特異性為87.2%，可見聯(lián)合檢測可有效提高正確診斷率，對子宮內(nèi)膜癌的輔助診斷具有一定價值。幾十年來，單克隆抗體在疾病的診斷和治療中發(fā)揮重要作用，特別是針對表達(dá)特異性抗原的疾病，單克隆抗體與抗原的反應(yīng)檢測可以作為疾病診斷的"金"標(biāo)準(zhǔn)。但是，與其他非腸道腫瘤不同的是，結(jié)直腸癌常常過度分泌表達(dá)表面高度糖基化的粘蛋白，由于形成"糖被"覆蓋粘蛋白，識別蛋白抗原表位的單克隆抗體受空間位阻影響，不能有效發(fā)揮結(jié)合作用，因而在診斷上用處不大，相反，能夠識別、結(jié)合粘蛋白糖鏈的單克隆抗體成為診治結(jié)直腸癌的重要工具。本發(fā)明提供的單克隆抗體命名為3P9，經(jīng)過檢測單克隆抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞的選擇性結(jié)合，而與正常結(jié)腸細(xì)胞不結(jié)合特性，多輪篩選獲得。與目前臨床應(yīng)用IgG類抗體不同，3P9為IgM類單克隆抗體，因此具有不同于IgG的抗體結(jié)構(gòu)、生化特性和生物學(xué)功能。我們的實驗證明，3P9單克隆抗體分子量大于600KD，識別、結(jié)合靶抗原表位為s-Tn結(jié)構(gòu)，特異識別結(jié)直腸癌變細(xì)胞，能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和引起結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。單獨使用該抗體的免疫組化染色即可較為準(zhǔn)確地診斷各種分化程度的結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，胰腺癌的癌變程度，確定癌變區(qū)域，改變目前使用多種抗體聯(lián)合診斷此類癌癥敏感性和/或特異性低的現(xiàn)狀。3P9單克隆抗體抑制結(jié)腸腫瘤生長和引起細(xì)胞凋亡的功能，顯示出3P9單克隆抗體在結(jié)腸腺癌的治療方面潛在的應(yīng)用價值
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種單克隆抗體，所述單克隆抗體可與癌癥抗原特異性結(jié)合，從而可以用于制備診斷癌癥的診斷劑或試劑盒。具體地，本發(fā)明提供以下1.一種單克隆抗體，所述抗體具有下列特征1)抗體為IgM類免疫球蛋白，抗體輕鏈類型K型；2)識別抗原為粘蛋白表面涎酸化的糖鏈結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，所述涎酸化的糖鏈結(jié)構(gòu)為s-Tn(涎酸N-乙酰半乳糖苷)糖鏈結(jié)構(gòu)。2.以上l所述的單克隆抗體，其特異識別結(jié)直腸腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌及胰腺癌組織，不識別相應(yīng)的正常組織。3.以上l所述的單克隆抗體，其由保藏編號為CGMCCNo.2643的雜交瘤細(xì)胞系分泌。4.以上l所述的單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNO:1所顯示，其輕鏈氨基酸序列如SEQIDNO:2所顯示。5.—種基因工程抗體，其與以上3或4所述的單克隆抗體具有30%以上同源序列，其中包括Fab片段，F(xiàn)(ab)'片段，F(xiàn)d片段，F(xiàn)v片段和Fc片段，也包括具有同源序列的各片段相互組合，或利用部分具有同源序列的各片段與其它蛋白、肽鏈形成的衍生物。6.—種編碼以上l-5任一項所述的單克隆抗體的核苷酸序列。7.以上1至5中任何一項所述的單克隆抗體在制備用于體內(nèi)診斷或體外診斷腫瘤的診斷劑或試劑盒中的應(yīng)用。8.以上7所述的應(yīng)用，其中體外診斷包括直接或間接標(biāo)記以上所述的單克隆抗體，利用酶聯(lián)免疫吸收實驗(ELISA)，免疫膠體金技術(shù)，免疫組織化學(xué)染色，免疫熒光，Western-blot檢測手段建立的相應(yīng)診斷方法。9.以上7所述的應(yīng)用，其中體內(nèi)診斷包括直接或間接標(biāo)記以上所述的單克隆抗體，注射或服用所述標(biāo)記抗體，依據(jù)所述抗體與腫瘤抗原結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行腫瘤組織和細(xì)胞的定位，腫瘤成像，腫瘤發(fā)生和發(fā)展診斷，治療后監(jiān)視以及腫瘤殺傷效果評價。10.以上7所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤選自由表達(dá)涎酸化糖鏈結(jié)構(gòu)的腫瘤所組成的組。在一個實施方案中，所述腫瘤選自由甲狀腺癌，乳腺癌，膀胱癌胃癌，皮膚癌，肺癌，頭頸癌，卵巢癌，精巢癌，胰腺癌，食道癌，8結(jié)直腸腺癌，和子宮內(nèi)膜腺癌組成的組。在一個實施方案中，所述腫瘤選自由胰腺癌，結(jié)直腸腺癌，和子宮內(nèi)膜腺癌組成的組。11.一種診斷劑，其用于診斷腫瘤，包含以上1-5任一項所述的單克隆抗體作為活性成分。在一個實施方案中，所述腫瘤為結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌。12.—種試劑盒，其用于診斷腫瘤，包含以上1-5任一項所述的單克隆抗體。在一個實施方案中，所述腫瘤為結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌。本發(fā)明用人結(jié)腸癌細(xì)胞為抗原，通過免疫小鼠獲得一株高表達(dá)IgM類抗體的雜交瘤細(xì)胞株(CGMCCNo.2643)，通過對該抗體的生化分析和結(jié)合表位鑒定，確定本發(fā)明提供的抗體能特異性識別粘蛋白糖基化的糖鏈結(jié)構(gòu)。對213例正常及519例腫瘤組織切片的對比免疫組化染色分析，此抗體特異識別各種分化程度的結(jié)直腸腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌以及胰腺癌組織和細(xì)胞，對相應(yīng)的正常組織不識別。因此，該抗體可用于結(jié)直腸腺癌、子宮內(nèi)膜腺癌以及胰腺癌的早期診斷，治療監(jiān)測，篩查以及腫瘤成像。圖1.3P9單克隆抗體類型鑒定。A.檢測3P9單抗的抗體類別和輕鏈型-光吸收值；B.典型的IgM型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。圖2.3P9單克隆抗體的純化和生化特性。A.經(jīng)預(yù)裝柱Sephadex-200層析的純化圖譜，峰A,B,C,D，E分別為不同洗脫體積下的洗脫峰；B.點雜交(Dotblotting)檢測洗脫峰中純化抗體，結(jié)果顯示抗體主要集中在第一峰(A);C.純化抗體的nativeSDS-PAGE電泳圖；D.純化抗體的還原性SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。圖3.3P9單克隆抗體與牛頜下腺粘蛋白(BSM)的結(jié)合反應(yīng)。圖4.過碘酸鈉氧化對單克隆抗體3P9與牛頜下腺粘蛋白結(jié)合反應(yīng)的影響。圖5.神經(jīng)氨酸酶對單克隆抗體3P9與牛頜下腺粘蛋白結(jié)合反應(yīng)的影響。圖6.胰蛋白酶對單克隆抗體3P9與牛頜下腺粘蛋白結(jié)合反應(yīng)的影響。9圖8.3P9單克隆抗體識別人結(jié)直腸腺癌組織細(xì)胞。單克隆抗體3P9與結(jié)直腸腺癌結(jié)合的著色區(qū)主要在結(jié)直腸癌腺上皮的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，同時在腺腔內(nèi)也有彌漫的著色；而在正常結(jié)直腸組織中沒有陽性著色信號。箭頭所示為黃棕色陽性著色部位。圖9.3P9單克隆抗體識別人子宮內(nèi)膜腺癌組織細(xì)胞。單克隆抗體3P9與子宮內(nèi)膜腺癌結(jié)合的著色區(qū)主要在其腺上皮的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，同時在腺腔內(nèi)也有彌漫的著色；而在正常子宮內(nèi)膜組織中沒有陽性著色信號。箭頭所示為黃棕色陽性著色部位。圖10.3P9單克隆抗體識別人胰腺癌組織細(xì)胞。單克隆抗體3P9與胰腺癌結(jié)合的著色區(qū)主要在其腺上皮的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，同時在腺腔內(nèi)也有彌漫的著色；而在正常胰腺組織中沒有陽性著色信號。箭頭所示為黃棕色陽性著色部位。圖11.3P9單克隆抗體抑制結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的遷移。A-G為分別加入100ug/ml,50ug/ml,25ug/ml,12.5ug/ml,6.3ug/ml,3ug/ml,Oug/ml系列稀釋單克隆抗體3P9處理原代結(jié)腸癌移植瘤細(xì)胞HCT-820小時后，劃痕區(qū)細(xì)胞的遷移均受到抑制，且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性；H為培養(yǎng)前劃痕區(qū)細(xì)胞生長情況。圖12.3P9單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列及輕鏈氨基酸序列。SEQ.ID.NO:1.3P9單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ.ID.NO:2,3P9單克隆抗體輕鏈氨基酸序列。將經(jīng)克隆篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞株3P9于2008年8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCCNo.2643。具體實施例方式下文將參考實施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。實施例一、3P9單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立和單克隆抗體的產(chǎn)生材料l.細(xì)胞SW1116結(jié)腸癌細(xì)胞系，購自美國ATCC(AmericanTypeCultureCollection,ATCCNo.CCL-233),SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCCNo.CRL-1581)。2.培養(yǎng)基無血清DMEM，高糖DMEM，HAT,HT培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自武漢三利公司，細(xì)胞培養(yǎng)板為Coming產(chǎn)品J.T^齊U豕乙一醇PEG(MW4000)購自Sigma公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純4.動物BALB/c小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。5.抗體鑒定使用小鼠單抗分型試劑SigmaImmunoTypeKit抗體亞型檢測試劑盒。方法1.小鼠免疫以lxl07/mlSW1116細(xì)胞懸液與福氏完全佐劑(Sigma)各0.5ml混和乳化，腹腔注射0.2ml/只小鼠；2周后以不完全福氏佐劑(Sigma)的混合乳化懸液二次免疫，再過兩周以不含佐劑的細(xì)胞懸液直接尾靜脈注射加強免疫，末次免疫3天后取出脾臟分離淋巴細(xì)胞。向脾臟注射約0.2-0.5ml無血清培養(yǎng)基DMEM使其脹大，再用彎曲的注射針頭多點刺破脾膜，用擠壓的方法使淋巴細(xì)胞從中逸出。2.雜交瘤細(xì)胞株的建立將小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0與上述小鼠免疫脾細(xì)胞按1:5混合離心，加lml聚乙二醇PEG在37。C水浴中融合，加入15ml含15。/。胎牛血清的高糖DMEM后移入T75培養(yǎng)瓶，融合細(xì)胞于37。C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加入HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為lxl06/ml，分細(xì)胞懸液入兩塊96孔板(0.2ml/L)37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，以HT培養(yǎng)基半量換液，1周后以HT培養(yǎng)基培養(yǎng);7-20天后選擇有克隆生長的培養(yǎng)孔，檢測上清中有無抗體表達(dá)，運用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法(Yanetal.,2003)篩選出抗體表達(dá)陽性克隆。3.-陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆采用有限稀釋法(倍比稀釋)連續(xù)克隆雜交瘤細(xì)胞3次篩選出穩(wěn)定表達(dá)抗體的細(xì)胞株，凍存于液氮中。4.腹水抗體制備采用小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞收集腹水的方法制備，方法參見文獻(xiàn)(Mathewsetal.,1980;Rammohanetal.，1983)。結(jié)果經(jīng)克隆篩選獲得一株穩(wěn)定表達(dá)單克隆抗體的細(xì)胞株3P9，將所述細(xì)胞株于2008年8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國，北京朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCCNo.2643。細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體含量100-200ng/ml,腹水中抗體含量2-5mg/ml。小鼠單抗分型試劑鑒定單抗亞型為IgM類抗體，抗體輕鏈為ic型(圖1)，說明該細(xì)胞株能穩(wěn)定高表達(dá)IgM/K型單克隆抗體。實施例二、3P9單克隆抗體的純化和生化特性材料3P9單克隆抗體腹水由雜交瘤細(xì)胞腹腔接種BALB/c小鼠收獲腹水獲得；預(yù)裝層析柱Sephadex-200,柱體積100ml，Phamacia產(chǎn)品，辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體購自SantCruz公司，ECL熒光檢測試劑盒購自Pierce公司，使用AKTAFPLC蛋白層析系統(tǒng)純化。方法將上述腹水4。C解凍，15,000g離心20分鐘，收集上清，0.2um膜除菌；pH7.2,O.OIMPBS平衡預(yù)裝柱，腹水5ml上樣；pH7.2,0.01MPBS洗脫，流速lml/分鐘，收集各洗脫峰；洗脫峰樣品10ul點在硝酸纖維素膜上，自然風(fēng)干后做點雜交(Dotblotting)鑒定；蛋白生化特性用nativeSDS-PAGE和還原性SDS-PAGE電泳分析；蛋白生物學(xué)活性用Westernblotting觀!j定。點雜交5%脫脂牛奶室溫封閉1小時，PBST洗滌三次，再用PBS洗滌三次，1:2000稀釋辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體室溫孵育1小時，加增強化學(xué)發(fā)光齊U(enhancedchemiluminescence，ECL.)顯色。結(jié)果腹水經(jīng)過Sephadex-200洗脫下五個峰(圖2A)，第一峰面積最大，占30%總峰面積。點雜交結(jié)果(圖2B)顯示，功能抗體組分主要存在于第一峰，第二峰含量微少，其余為雜蛋白峰。收集的第一峰蛋白nativeSDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2C)經(jīng)QaulityOne軟件分析，蛋白純度達(dá)95%;還原性SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2D)顯示為約75KD蛋白帶。實施例三、3P9單克隆抗體與牛頜下腺粘蛋白的結(jié)合材料3P9單克隆抗體由腹水抗體經(jīng)Sephadex-200純化獲得；純化牛頜下腺粘蛋白(BSM，bovinesubmaxillarymucin)(Sigma)，辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體購自SantCruz公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附測定板購自美國ComingCostar公司。方法包被液稀釋BSM至50ng/ml，每個板孔加lOOul,室溫2小時或4。C過夜，甩去包被液，PBS洗滌，2%BSA-PBS封閉1小時，加50ul12系列稀釋純化的3P9單克隆抗體37'C溫育1小時，PBS或PBST洗滌，加50ul辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體(PBS2,000倍稀釋)37匸溫育1小日寸，PBS洗滌或PBST洗滌，加200ul顯色液(配方5.1ml的0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入4.9ml的0.1M檸檬酸溶液，加10|il30%過氧化氫和4mg鄰苯二胺(OPD))室溫顯色10min，加入20pl2MH2S04終止反應(yīng)，490nm下檢測光吸收值。結(jié)果以初濃度為100ng/ml的純化抗體測定時，吸收值約0.55，2倍系列稀釋后呈明顯對數(shù)下降(圖3)。純化3P9單克隆抗體與BSM結(jié)合曲線表明結(jié)合反應(yīng)與抗體濃度有關(guān)，符合抗原抗體結(jié)合解離特征。實施例四、過碘酸鈉抑制3P9單克隆抗體與牛頜下腺粘蛋白的結(jié)合材料3P9單克隆抗體由腹水抗體經(jīng)Sephadex-200純化獲得；純化牛頜下腺粘蛋白(BSM,bovinesubmaxillarymucin)(Sigma),過碘酸鈉購自Sigma公司，辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體購自SantCruz公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附測定板購自美國ComingCostar公司。'方法包被液(15mM碳酸鈉，35mM碳酸氫鈉)稀釋BSM至50ng/ml，每個板孔加lOOul,室溫2小時或4"C過夜，甩去包被液，PBS洗滌，加lOOul系列稀釋過碘酸鈉室溫置放20分鐘，棄過碘酸鈉溶液加200ul包被液中和5分鐘，PBS洗滌，加2%BSA-PBS封閉1小時，加50ul純化3P9單克隆抗體(200ng/ml)37'C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加50ul辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體(PBS2,000倍稀釋)37。C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加200ul顯色液(配方5.1ml的0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入4.9ml的O.IM檸檬酸溶液，加10pl30%過氧化氫和4mg鄰苯二胺(OPD))室溫顯色10min，加入202MH2S04終止反應(yīng)，490nm下檢測光吸收值。結(jié)果經(jīng)過碘酸鈉處理后，光吸收值隨過碘酸鈉劑量增大而降低，表現(xiàn)出明顯劑量依賴關(guān)系。大于lug過碘酸鈉處理抗原后的光吸收值小于0.3(圖4)，說明過碘酸鹽的氧化作用影響了抗體與BSM結(jié)合。由于過碘酸鹽能引起粘蛋白表面的糖鏈結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，而不影響肽鏈結(jié)構(gòu)，所以3P9抗體結(jié)合粘蛋白BSM的表位結(jié)構(gòu)是糖鏈而非肽鏈。實施例五、神經(jīng)氨酸酶抑制3P9單克隆抗體與牛頜下腺粘蛋白的結(jié)合材料腹水經(jīng)Sephadex-200純化獲得純化3P9單克隆抗體；凍干純化牛頜下腺粘蛋白(BSM,bovinesubmaxillarymucin)(Sigma)，神經(jīng)氨酸酶購自Sigma公司，辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體購自SantCruz公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附測定板購自美國CorningCostar公司。方法包被液稀釋BSM至50ng/ml，每個板孔加lOOul,室溫2小時或4。C過夜，甩去包被液，PBS洗滌三次，分別加入lOOullug/ml和O.lug/ml的神經(jīng)氨酸酶溶液(PBS配制)37'C置放30分鐘，棄神經(jīng)氨酸酶溶液加1MEDTA(乙二胺四乙酸)溶液200ul室溫置放5分鐘，PBS洗滌，加2。/。BSA-PBS封閉l小時，加50ul純化3P9單克隆抗體(200ng/ml)37°C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加50ul辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體(PBS2,000倍稀釋)37。C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加200ul顯色液(配方5.1ml的0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入4.9ml的0.1M檸檬酸溶液，加10^30%過氧化氫和4mg鄰苯二胺(OPD))室溫顯色10min，加入20nl2MH2SO4終止反應(yīng)，490nm下檢測光吸收值。結(jié)果經(jīng)10ng和100ng神經(jīng)氨酸酶處理后，處理組的對光吸收值較對照組有明顯降低(圖5)，進(jìn)一步說明3P9單克隆抗體與BSM結(jié)合表位是糖鏈部分，并與涎酸化的糖鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)，神經(jīng)氨酸酶對糖鏈的改變抑制了抗體對抗原表位的識別與結(jié)合。實施例六、3P9單克隆抗體與牛頜下腺粘蛋白的結(jié)合不受胰蛋白酶作用的影響材料3P9單克隆抗體由腹水抗體經(jīng)Sephadex-200純化獲得；純化牛頜下腺粘蛋白(BSM,bovinesubmaxillarymucin)(Sigma)，胰蛋白酶購自Sigma公司，辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體購自SantCruz公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附測定板購自CorningCostar公司。方法包被液稀釋BSM至50ng/ml，每個板孔加lOOul,室溫2小時或4°〇過夜，甩去包被液，PBS洗滌，力P100ul系列梯度胰蛋白酶，37°C置放30分鐘，棄胰蛋白酶溶液加lMEDTA溶液200ul室溫置放5分鐘，PBS洗滌，力卩2%BSA-PBS封閉1小時，力卩50ul純化3P9單克隆抗體(200ng/ml)37。C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加50ul辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體(PBS2,000倍稀釋)37。C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加200ul顯色液(配方5.1ml的0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入4.9ml的0.1M檸檬酸溶液，加10|il30%過氧化氫和4mg鄰苯二胺(OPD))室溫顯色10min，加入20|ul2MH2S04終止反應(yīng)，490nm下檢測光吸收值。結(jié)果經(jīng)梯度胰蛋白酶處理后，除各處理組光吸收值較未處理組有微小降低外，未出現(xiàn)光吸收值明顯變化，各組吸收值均高于0.7,各組間無差別(圖6)，結(jié)果表明胰蛋白酶對粘蛋白肽鏈的改變不影響3P9單克隆抗體與BSM結(jié)合反應(yīng)，證明抗體識別，結(jié)合的抗原表位是非肽鏈結(jié)構(gòu)。實施例七、單克隆抗體B72.3競爭3P9單克隆抗體與牛頜下腺粘蛋白的結(jié)合材料3P9單克隆抗體由腹水抗體經(jīng)Sephadex-200純化獲得；純化牛頜下腺粘蛋白(BSM，bovinesubmaxillarymucin)(Sigma),單克隆抗體B72.3工作液購自中杉金橋公司，辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司；96孔酶聯(lián)免疫吸附測定板購自ComingCostar公司。方法單克隆抗體B72.3工作液200ul與梯度量增加的3P9單克隆抗體混合(3P9單克隆抗體的初始濃度為600ng/ml)，每個梯度以稀釋液(PBS)補足500ul，混和均勻。包被液稀釋BSM至50ng/ml，每個板孔加lOOul,室溫2小時或4'C過夜，甩去包被液，PBS洗滌，加100ul上述系列單克隆抗體混合液，室溫置放l小時，PBS洗滌，力Q2MBSA-PBS封閉1小時，力Q50ul純化3P9單克隆抗體(200ng/ml)37。C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加50ul辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgG抗體(PBS2,000倍稀釋)37。C溫育1小時，PBS洗滌或PBST洗滌，加200ul顯色液(配方5.1ml的0.2M磷酸氫二鈉溶液，加入4.9ml的O.IM檸檬酸溶液，加10pl30%過氧化氫和4mg鄰苯二胺(OPD))室溫顯色10min，加入20pl2MH2S04終止反應(yīng)，490nm下檢測光吸收值。結(jié)果單克隆抗體B72.3與純化BSM有特異性結(jié)合；隨單克隆抗體3P9量的增加，單克隆抗體B72.3與BSM結(jié)合明顯減少(圖7)，表明單克隆抗體3P9競爭結(jié)合抗原表位，進(jìn)一步確定抗原表位為s-Tn(涎酸N-乙酰半乳糖苷)糖鏈結(jié)構(gòu)。實施例八、免疫組化分析3P9單克隆抗體對人腫瘤組織抗原的識別材料高密度多組織癌癥和正常人組織芯片(貨號CC00-08-001)購自陜西超英生物科技有限公司。其包括來自495例病人的500個組織樣品，囊括了12種人類最常見的癌癥類型，包括結(jié)腸癌，子宮內(nèi)膜癌，胰腺癌，乳腺癌，胃癌，肝癌，肺癌，腎癌，皮膚癌，頭頸癌，卵巢癌，精巢癌，膀胱癌，腦癌，前列腺癌，甲狀腺癌等。每種癌癥類型包括約25個癌變組織樣品和5個正常組織樣品。每個組織樣品的直徑為0.6mm，厚度5pm(詳細(xì)信息見此產(chǎn)品說明書)。其它樣品包括人結(jié)腸癌組織(52例)，直腸癌組織(50例)，子宮內(nèi)膜癌組織(6例)，食道癌(25例)及相應(yīng)的正常組織包括正常人結(jié)腸組織(48例)，直腸組織(50例)，子宮內(nèi)膜癌組織(3例)取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤國家重點實驗室，中國人民解放軍301和306醫(yī)院，北京法醫(yī)研究所。辣根過氧化物酶(HRP)羊抗鼠IgM抗體購自SantCruz公司；DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司(產(chǎn)品編號ZLI-9033),其它試劑購自北京化學(xué)試劑公司。方法凍存組織解凍后以4%多聚甲醛固定16-24小時。固定后的實驗材料放入70%酒精中，1小時后更換70%酒精一次，經(jīng)上行梯度(80%，90%，100%)酒精脫水，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，5jLim厚度切片。制備石蠟組織切片的具體步驟參見趙宗江《組織細(xì)胞分子學(xué)實驗原理與方法》，中國中醫(yī)藥出版社，2003年，第一版。免疫組化染色采用常規(guī)方法切片經(jīng)二甲苯脫蠟，下行梯度(100%，90%，80%，70%,50%，30%，)酒精復(fù)水；在含有0.3%過氧化氫的甲醇中室溫閉光孵育30分鐘去除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾；PBS沖洗三次，每次5分鐘；將切片置于10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)煮沸10分鐘，以修復(fù)抗原；讓切片在緩沖液中自然冷卻，然后用PBS沖洗三次，每次5分鐘；5%羊血清(北京中杉金橋，PBS稀釋羊血清)封閉1小時；棄去封閉液，用含有3P9單克隆抗體的一抗稀釋液(1:1000封閉液稀釋)覆蓋實驗組切片，對照組切片仍然用5%羊血清覆蓋，用含有標(biāo)記的二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgM，SantaCruz公司，1:500封閉液稀釋)覆蓋實驗組和對照組切片，37孵育1小時；PBS沖洗三次，每次5分鐘；最后用新鮮配置的DAB顯色試劑盒顯色；顯微鏡下觀察顯色至合適程度，PBS沖洗終止顯色反應(yīng)；用蘇木精溶液復(fù)染切片l-2分鐘；自來水沖洗切片10分鐘；上行梯度酒精(30%，50%，70°/。，80%，90%，100%)脫水，二甲苯透明后樹脂封片；37。C烘箱內(nèi)烘干切片后觀察并拍照。結(jié)果3P9單克隆抗體對各種癌癥類型的陽性檢出率差別很大(表2)，結(jié)合程度也有很大差別。其中對結(jié)腸腺癌的檢出率最高，達(dá)71.8%，其次是子宮內(nèi)膜腺癌(68%)，直腸腺癌(62%)，胰腺癌(55.6%),并且對這些癌癥的結(jié)合程度最強。_表2.人腫瘤組織3P9抗原檢測。_腫瘤類型3P9免疫染色陽性率(％)病例總數(shù)陽性例數(shù)1.3P9單克隆抗體對人結(jié)直腸腺癌組織細(xì)胞抗原的識別21662809345一9900905019401049001111212312332311癌斯瘤瘤癌癌癌癌癌膜癌tkk胞脫膨臉癌癌癌癌癌癌癌J腺內(nèi)腺癌普維肪細(xì)細(xì)列狀腺胱癌膚癌頸巢巢腺淺^i口g腦霍纖脂肝腎前甲乳膀胃皮肺頭卵精胰食直子結(jié)17單克隆抗體3P9識別、結(jié)合結(jié)直腸腺癌細(xì)胞及其分泌物，呈現(xiàn)強黃棕色(如圖8中箭頭所顯示)顯色反應(yīng)，而正常組織無顯色反應(yīng)(圖8)，說明單克隆抗體3P9能夠特異識別、結(jié)合人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞及分泌表達(dá)的產(chǎn)物，即抗原。對125例臨床結(jié)腸腺癌組織和正常組織的免疫組化結(jié)果分析顯示，單克隆抗體3P9識別人結(jié)腸腺癌的敏感性71.8%,(51〃1)，特異性79.6%(43/54)，陽性預(yù)測值(PPV)82.3%(51/62)，陰性預(yù)測值(NPV)68.3%(43/63);對100例臨床直腸腺癌組織和正常組織的免疫組化結(jié)果分析顯示，單克隆抗體3P9識別人直腸腺癌的敏感性62%,(31/50),特異性62°/。(31/50)，陽性預(yù)測值(PPV)62%(31/50)，陰性預(yù)測值(NPV)62%(31/50)見表3。表3.3P9單克隆抗體檢測結(jié)直腸腺癌，子宮內(nèi)膜腺癌，胰腺癌的敏感性和特異性分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>PPV:陽性預(yù)測值；NPV:陰性預(yù)測值;2.3P9單克隆抗體對人子宮內(nèi)膜腺癌組織細(xì)胞抗原的識別單克隆抗體3P9識別、結(jié)合子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞及其分泌物，呈現(xiàn)強黃棕色顯色反應(yīng)(如圖9中箭頭所顯示)，而正常組織無顯色反應(yīng)(圖9)，說明單克隆抗體3P9能夠識別、結(jié)合人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞及分泌表達(dá)的產(chǎn)物。對37例臨床子宮內(nèi)膜腺癌組織和正常組織的免疫組化結(jié)果分析顯示，單克隆抗體3P9識別人子宮內(nèi)膜腺癌的敏感性68%(17/25),特異性100%(12/12)，陽性預(yù)測值(PPV)100°/。(17/17)，陰性預(yù)測值(NPV)60%(12/20)見表3。3.3P9單克隆抗體對人胰腺癌組織細(xì)胞抗原的識別單克隆抗體3P9識別、結(jié)合胰腺癌細(xì)胞及其分泌物，呈現(xiàn)強黃棕色顯色反應(yīng)(如圖IO中箭頭所顯示)，而正常組織無顯色反應(yīng)(圖IO)，說明單產(chǎn)物。對25例臨床胰腺癌組織和正常組織的免疫組化結(jié)果分析顯示，單克隆抗體3P9識別人胰腺癌的敏感性55.6%，(10/18),特異性100%(7/7)，陽性預(yù)測值(PPV)100%(10/10)，陰性預(yù)測值(NPV)46.7%(7/15)見表3。4.3P9單克隆抗體對不同癌癥的陽性檢出率與腫瘤分化程度的關(guān)系免疫組化結(jié)果表明，3P9對不同癌癥的檢出率有隨腫瘤分化程度的降低而下降的趨勢，這在結(jié)腸腺癌，子宮內(nèi)膜腺癌和胰腺癌中尤為明顯。但通過f檢驗這些癌癥不同分化程度之間陽性檢出率的差別，發(fā)現(xiàn)并沒有顯著性差異(表4)，說明單克隆抗體3P9對不同癌癥的陽性檢出率與腫瘤的分化程度沒有相關(guān)性。表4.3P9抗原檢測陽性率與腫瘤分化程度的關(guān)系。腫瘤類型免疫染色強度尸值()(+)(++)(+++)結(jié)腸癌(42.1)亞型腺癌(42.1)11143-分級I(100)000111(55.6)4140NSIII(22.2)7002UND(0)0000子宮內(nèi)膜癌(68.4)亞型腺癌(68.4)6724-分級I(66.7)1200II(77.8)2412NS111(57.1)3112UND(0)0000胰腺癌(55.6)亞型腺癌(55.6)8613-分級i(o)100011(75)3603III(20)4010NSUND(O)0000(-)沒有陽性染色或陽性細(xì)胞數(shù)所占比例小于10%;(+)陽性細(xì)胞數(shù)所占比例大于或等于10%但小于25%;(++)陽性細(xì)胞數(shù)所占比例大于或等于25%但小于50%;(+++)陽性細(xì)胞數(shù)所占比例大于或等于50%;NS,沒有顯著性差異；UND,未知分化程度。實施例九、3P9單克隆抗體抑制腫瘤細(xì)胞的遷移材料結(jié)腸癌裸鼠移植瘤HCT-8由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所動物室提供，胰蛋白酶，膠原酶I購自Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)板為Falcon(BectonDickinson.Labware,FranklinLakes,NJ,USA)產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM(含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素50ug/ml),其余試劑購自北京化學(xué)公司。方法將結(jié)腸癌裸鼠移植瘤切成lmmS小i央，參照《動物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)指南》(科學(xué)出版社，R.I.弗雷謝尼，2000年，第四版)方法制備原代結(jié)腸癌移植瘤細(xì)胞HCT-8。HCT-8細(xì)胞生長成單層時，用移液槍頭在單層細(xì)胞上劃痕，棄培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞兩次，加入含系列稀釋單克隆抗體3P9的DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)20小時，在相差顯微鏡下觀察劃痕區(qū)細(xì)胞生長情況。結(jié)果與培養(yǎng)前劃痕(圖11H)相比，單克隆抗體3P9抑制HCT-8原代結(jié)腸癌細(xì)胞遷移，且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性(圖11A-G)。參考文獻(xiàn)Boland,C.R.,J,A.Roberts,B.Siddiqui,J.Byrd，andY.S.Kim，1986,Cancer-associatedcolonicmucininculturedhumantumorcellsandathymic(nude)mousexenografts,CancerRes.,46(11):5724-5729.Bresalier，R.S.,Y.Niv,J.C.Byrd，Q.Y.Duh,N.W,Toribara,R.W.Rockwell,R.Dahiya,andY.S,Kim，1991,Mucinproductionbyhumancoloniccarcinomacellscorrelateswiththeirmetastaticpotentialinanimalmodelsofcoloncancermetastasis,J.Clin.Invest,87(3):1037-1045.CherchiPL,CapobiancoG,AmbrosiniG,FaddaGM，PigaMD，RuiuG,FattoriniF,DessoleS,2002,Intracysticevaluationoftumormarkersinbenignandmalignantovarianpathology,EurJGynaecolOncol"23(2):163-5.CoppolaD,2000，Molecularprognosticmarkersinpancreaticcancer,CancerControl,7(5):421-427Finkelstein,S.D.，R.Przygodzki,V.E.Pricolo,S.A.Sakallah,P.A.Swalsky,A.Bakker,R.Lanning，K.I.Bland,andD.LCooper,1996b,PredictionofBiologicAggressivenessinColorectalCancerbyp53/K-ras-2TopographicGenotyping,Mol.Diagn.，1(1):5-28.Finkelstein,S.D.，R.Przygodzki,V.E.Pricolo,S.A.Sakallah,P.A.Swalsky,A.Bakker,R.Lanning,K.I.Bland,andD.L.Cooper,1996a，PredictionofBiologicAggressivenessinColorectalCancerbyp53/K-ras-2TopographicGenotyping,Mol.Diagn.，1(1):5-28.Hammel,P.,andT.Soussi,2000,Serump53antibodyassay:evaluationincolorectalcancer,Rev.Med.Interne,21(2):167-173.Hara,A.，M.Saegusa,H.Mitomi,M.Kurihara,K.Ishiham,K.Hotta，andI.21Okayasu,2000，Colonicmucin-carbohydmtecomponentsincolorectaltumorsandtheirpossiblerelationshiptoMUC2，p53andDCCimmunoreactivities,Pathol.Res.Pract.,196(3):159-166.Hareyama,H.，Sakuragi,N.,Makinoda,S.,andFujimoto,S.1996,SerumandtissuemeasurementsofCA72-4inpatientswithendometrialcarcinoma,JClinPathol"49(12):967—970.Ho，S.B.,N.W.Toribara，R,S.Bresalier,andY.S.Kim,1988,Biochemicalandothermarkersofcoloncancer,Gastroenterol,Clin.NorthAm.，17(4):811-836.Itzkowitz,S.H.，E.J,Bloom,T.S.Lau,andY.S.Kim,1992,MucinassociatedTnandsialosyl-Tnantigenexpressionincolorectalpolyps,Gut,33(4):518-523.Itzkowitz,S.H.,M.Yuan,C.K.Montgomery,T.Kjeldsen,H.K.Takahashi,W.L.Bigbee,andY.S.Kim,1989,Expressi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