專利名稱：氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料及其制備方法。屬于 生物催化和生物傳感領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生物傳感器是由固定化的細(xì)胞、酶、抗體或其它生物活性物質(zhì)與信號(hào)轉(zhuǎn)換 器相配合組成的傳感器。它是近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)和電子學(xué)、工程學(xué)相互滲透而發(fā) 展起來(lái)的一種新型信息技術(shù)，具有特異性能強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)速度快、成本 低和使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。，生物傳感器在醫(yī)、藥、農(nóng)、牧等學(xué)科和食品、發(fā)酵、 制藥等工業(yè)部門(mén)以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面均有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
選擇適當(dāng)?shù)妮d體材料使生物分子固定化是決定生物傳感器特性的關(guān)鍵技 術(shù)。 一個(gè)成功的載體需要能夠?qū)⑸锓肿臃€(wěn)定的固定或者結(jié)合在轉(zhuǎn)換器表面， 并且能夠保持生物分子的功能和活性，同時(shí)能夠容易接觸目標(biāo)檢測(cè)物，并且能 夠與轉(zhuǎn)換器表面有緊密的結(jié)合。其中介孔材料由于其高的比表面積、大的孔容 和均一的孔徑分布而倍受人們的關(guān)注。各種各樣的介孔硅材料已經(jīng)被用于生物 傳感器的制備，但是硅質(zhì)材料低的導(dǎo)電率限制了電子在生物分子與電極之間的 傳遞。
最近，利用模板法制備介孔碳材料得到了大量報(bào)道，這些材料不僅具有高 的比表面積，大的孔容和均一的孔徑分布，同時(shí)還有高的導(dǎo)電率和好的水、熱
穩(wěn)定性，因此非常適用于生物傳感器的制備。Taeghwan Hyeon等(Adv. Mater 2005, 17, 2828-2833)將葡萄糖氧化酶負(fù)載在介孔碳上制備得到了高性能的葡 萄糖傳感器，該傳感器的靈敏度比以往報(bào)道的都要高出1 2個(gè)數(shù)量級(jí)，其檢測(cè) 限也比以往文獻(xiàn)報(bào)道的要低。這充分說(shuō)明了介孔碳材料在生物傳感器制備方面 的優(yōu)勢(shì)。但是介孔碳材料的生物兼容性不好，生物分子與其結(jié)合后活性損失嚴(yán) 重，這在很大程度上限制了其在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。另外，以往制備的介孔 碳孔徑較小，不適合大的生物分子負(fù)載，這也是其用于生物傳感器制備的不利 因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種 氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料及其制備方法。 具體的制備步驟如下
(1) 制備碳氮前驅(qū)物溶液，碳氮前驅(qū)物溶液由碳氮前驅(qū)物、溶劑以及酸添 加劑在室溫混合攪拌1 5小時(shí)得到，其中碳氮前驅(qū)物包括乙二胺、丙烯腈、三 聚氰胺或六亞甲基四胺，溶劑包括四氯化碳、甲醛、乙二醛或二甲基亞砜所用 酸添加劑包括對(duì)甲苯磺酸、衣糠酸等，碳氮前驅(qū)物溶液中碳氮前驅(qū)物的質(zhì)量百
分?jǐn)?shù)為5 60%，添加劑的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.1 5%。
(2) 將干燥的介孔氧化硅分子篩模板(如MCF、 MSU、 FDU-12等)浸 入到碳氮前驅(qū)物溶液中，在70 100。C攪拌1 12小時(shí)，然后在100 150°C處 理6 36小時(shí)，其中模板與碳前驅(qū)物溶液的質(zhì)量比為0.05 0.5: 1。
(3) 將步驟(2)得到的產(chǎn)物在惰性氣氛下碳化，碳化溫度為500 900°C， 恒溫時(shí)間為2 12小時(shí)。
(4) 將碳化后得到的復(fù)合物加入到質(zhì)量比為2 20%的氫氟酸或2 30% 的強(qiáng)堿(氫氧化鈉、氫氧化鉀等)溶液中，室溫或加熱攪拌6 24小時(shí)，然后 過(guò)濾分離并洗漆，在60 120。C下干燥后得到去除模板后的氮摻雜介孔碳材料。
(5) 將步驟(4)中得到的產(chǎn)物，用10%~35%的硝酸在50~80 。C處理1~15 小時(shí)，以對(duì)其表面進(jìn)行修飾。
(6) 酶分子的固定化，將步驟(5)得到的產(chǎn)物與酶分子以0.1 1的質(zhì)量 比在室溫下攪拌混合2 24小時(shí)，離心并洗滌，得到氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳 感材料。其中所用酶分子包括血紅蛋白、肌紅蛋白、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白 酶或辣根過(guò)氧化物酶。
本發(fā)明所得氮摻雜介孔碳固定化酶載體的特征為具有大孔徑的高比表面 積、大孔容的介孔材料，主孔道由14-17 nm的介孔組成，次級(jí)孔則是由3~4 nm 的介孔組成，主要起連通作用，其比表面積在450n^gJ以上，孔容在0.80cm3 g"以上，其組成為CNx，其中X為氮原子與碳原子的摩爾比，由碳?xì)涞治鰷y(cè) 得其值為0.19 1.2。該材料具有很高的酶分子負(fù)載量，為17% 25%，且其負(fù)載 酶分子的活性也能保持在自由酶活性的40%以上。
所得到的氮摻雜介孔碳固定化酶重新分散于緩沖溶液中以后(如Nafion磷 酸緩沖溶液，殼聚糖磷酸緩沖溶液)，可以直接修飾在工作電極上(如熱解石墨電極、玻碳電極、IT0玻璃電極或鉑電極)，成膜，得到生物傳感器用酶電極。 將得到的酶電極接入到電化學(xué)工作站中，采用循環(huán)伏安法測(cè)試其電化學(xué)特征， 用時(shí)間-電流法來(lái)測(cè)定該生物傳感器對(duì)底物如雙氧水的響應(yīng)。測(cè)試結(jié)果表明，本 發(fā)明所得生物傳感器具有極快的響應(yīng)速度和寬的線性范圍，其檢測(cè)靈敏度得到 顯著提高，而且它的檢測(cè)限也很低。修飾后的氮摻雜介孔碳制備得到的生物傳
感器對(duì)雙氧水的檢測(cè)靈敏度高達(dá)477 mAL mor1 cm—2，比以往報(bào)道的都要高。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在
(1) 采用大孔徑介孔硅為模板，制備得到大孔徑的氮摻雜介孔碳，更有利于 大的生物酶分子負(fù)載在其孔道中，其負(fù)載量達(dá)到23.4%，比在其他介孔材料中得 到的高得多。
(2) 通過(guò)氮的摻雜，可以增加有效增加介孔碳表面的活性位點(diǎn)，使其更有利 于與酶分子進(jìn)行結(jié)合，從而提高其生物相容性。
(3) 通過(guò)硝酸處理，對(duì)其表面進(jìn)行親水性修飾，使其更容易分散于水中，與 酶分子結(jié)合。另外，碳表面的親水性修飾，也為酶分子提供了更好的親水性微 環(huán)境，使酶分子的活性得到更好的保持，從而更有利于其在生物催化和生物傳 感領(lǐng)域的應(yīng)用。
(4) 本發(fā)明所制氮摻雜介孔碳有高熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性，并且環(huán)境友好， 能保護(hù)孔道中的酶分子抵制熱沖擊。
(5) 由本發(fā)明所得材料制備得到的生物傳感器具有快的響應(yīng)時(shí)間、寬的線性 范圍、很高的靈敏度和極低的檢測(cè)限。
(6) 本發(fā)明獲得生物傳感材料的方法簡(jiǎn)單、便于控制、實(shí)用性強(qiáng)。


圖1為氮摻雜介孔碳的透射電鏡圖。
圖2為氮摻雜介孔碳吸附酶分子前后的氮?dú)馕角€，圖中從上到下依次 對(duì)應(yīng)吸附酶分子前和吸附酶分子后的氮摻雜介孔碳。
圖3為氮摻雜介孔碳吸附酶分子前后的孔徑分布，圖中從上到下依次對(duì)應(yīng) 吸附酶分子前和吸附酶分子后的氮摻雜介孔碳。
圖4為所制備傳感的循環(huán)伏安圖，圖中實(shí)線和虛線分別對(duì)應(yīng)實(shí)施例2和對(duì) 比例2。
圖5為所制備傳感的電流響應(yīng)值對(duì)雙氧水濃度的曲線，圖中從上到下依次 對(duì)應(yīng)實(shí)施例2、對(duì)比例2、實(shí)施例3。
具體實(shí)施例方式
以下以實(shí)施例的方式說(shuō)明本發(fā)明，但不僅限于下述實(shí)施例。 實(shí)施例1
準(zhǔn)確量取2.4ml乙二胺和3.4ml四氯化碳，混合均勻，加入0.5gMCF模板， 在90。C回流處理6小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至烘箱干燥12小時(shí)，得到的固體用研缽研 細(xì)，然后在氮?dú)鈿夥障?，?00。C碳化5小時(shí)。所得碳化物用10。/。HF溶液處理 以除去硅模板。所得到氮摻雜介孔碳的氮?dú)馕角€和孔徑分布如圖1和圖2 所示，其比表面積和孔容分別為474m、」和0.85 cm3 g—1 ，由吸附曲線得到其 孔徑約為17nm。
稱取80mg所制得氮摻雜介孔碳，放入4ml的20。/。硝酸中，于60。C反應(yīng)6h 進(jìn)行修飾，過(guò)濾，洗滌并干燥。
稱取10mg上述修飾過(guò)的氮摻雜介孔碳，加入2mg/ml的血紅蛋白緩沖溶液 中，混合攪拌20h離心，洗滌，得到固定化的血紅蛋白。血紅蛋白能夠催化雙 氧水氧化鄰羥基苯酚的反應(yīng)，通過(guò)紫外來(lái)測(cè)試產(chǎn)物的量隨時(shí)間的變化，可以得 到血紅蛋白的催化活性。
由此得到氮摻雜介孔碳的透射電鏡如圖1所示，其孔道在17nm左右。氮 氣吸附曲線(圖2)和孔徑分布(圖3)表明該材料的比表面積和孔容分別為 474m2g-4Q 0.85 cm3 g—1 ，其孔徑約為17 nm。其組分為CNX，由碳?xì)涞治?測(cè)得X值為0.20。
該法所制得固定化血紅蛋白的活性為自由酶活性的43.2%。其熱穩(wěn)定性也得 到很大提高，固定化血紅蛋白在90。C的緩沖溶液中處理15分鐘仍能保持76.6% 的活性，而自由血紅蛋白在90°C的緩沖溶液中處理15分鐘后就只有28.5%的 活性。
對(duì)比例1
采用未經(jīng)過(guò)硝酸修飾的氮摻雜介孔碳來(lái)進(jìn)行血紅蛋白的固定化，其余操作 同實(shí)施例l。由此得到固定化酶的負(fù)載量為17.3%,同樣比在其他介孔材料中報(bào) 道的要高。其活性為自由酶活性的14.1%，比實(shí)施例1中的耍低的多。該固定 化酶在90。C的緩沖溶液中處理15分鐘仍能保持83.0%的活性。實(shí)施例2
將熱解石墨電極在砂紙上打磨光滑，在去離子水中超聲處理io分鐘，取出 干燥。然后稱取lOmg實(shí)施例1中得到的固定化酶，分散在2ml的5 wt%Nafion 磷酸緩沖溶液中，取0.5ml，均勻滴涂在熱解石墨電極上，在室溫下干燥成膜， 形成生物傳感器用于電化學(xué)測(cè)定。
電化學(xué)測(cè)定在Cffl 440型電化學(xué)工作站上進(jìn)行，采用三電極體系，其中石 墨電極為工作電極，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl為參比電極。所制得酶?jìng)鞲衅鞯难?環(huán)伏安圖如圖4所示， 一對(duì)可逆氧化還原峰的出現(xiàn)說(shuō)明該酶?jìng)鞲衅髂軌驅(qū)崿F(xiàn)酶 和電極間的直接電子傳遞，其電子傳遞速率常數(shù)為4.9s"，這比以往文獻(xiàn)報(bào)道的都 要高，說(shuō)明所制得酶?jìng)鞲衅骶哂泻芨叩碾娮觽鬟f速率。同時(shí)該酶?jìng)鞲衅鲗?duì)雙氧 水的電催化氧化也具有很快的響應(yīng)時(shí)間(到達(dá)95 %飽和電流值的時(shí)間小于5秒) 和寬的線性范圍(l 100,ol)，以及高的靈敏度和低的檢測(cè)限。該酶?jìng)鞲衅鞯?靈敏度為477mALmol"cm—2，比以往報(bào)道的都要高。其電流響應(yīng)值對(duì)雙氧水濃 度的曲線如圖5所示。
對(duì)比例2
在實(shí)施例2中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是改用對(duì)比例1中得到 的固定化酶來(lái)制備酶?jìng)鞲衅鳌Ｓ纱说玫降拿競(jìng)鞲衅?，其循環(huán)伏安圖如圖4所示。 一對(duì)可逆氧化還原峰的出現(xiàn)，說(shuō)明該酶?jìng)鞲衅魍瑯幽軌驅(qū)崿F(xiàn)酶分子和電極之間 的直接電子傳遞，其電子傳遞速率常數(shù)為4.0s"，說(shuō)明該酶?jìng)鞲衅魍瑯泳哂泻芸?的電子傳遞速率。該酶?jìng)鞲衅鲗?duì)雙氧水的電催化同樣具有很快的響應(yīng)時(shí)間(到 達(dá)95%飽和電流值的時(shí)間小于5秒)和寬的線性范圍(1 120pmo1)。其電流響 應(yīng)值對(duì)雙氧水濃度的曲線如圖5所示，由此計(jì)算得到該酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏度為239 mALmor1 cnf2，比實(shí)施例2中的要低。
實(shí)施例3
在實(shí)施例2中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是將10mg實(shí)施例1中 的固定化酶分散于4ml的5 wt% Nafion磷酸緩沖溶液中，再取0.5ml用于制備 生物傳感器。該酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)時(shí)間同樣小于5秒，線性范圍為1 80pmo1。其 電流響應(yīng)值對(duì)雙氧水濃度的曲線如圖5所示，由此計(jì)算得到該酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏 度為142 mAL mo" cnf2，比實(shí)施例2和對(duì)比例2中的都要低。實(shí)施例4
在實(shí)施例1中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是將碳氮前驅(qū)物溶液由 乙二胺和四氯化碳的混合溶液改為三聚氰胺、乙二醛和對(duì)甲苯磺酸的混合溶液。
實(shí)施例5
在實(shí)施例1中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是將碳氮前驅(qū)物溶液由 乙二胺和四氯化碳的混合溶液改為丙烯腈、二甲基亞砜和衣糠酸的混合溶液。
實(shí)施例6
在實(shí)施例1中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是酶分子由血紅蛋白改 為葡萄糖氧化酶。
實(shí)施例7
在實(shí)施例1中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是酶分子由血紅蛋白改 為辣根過(guò)氧化物酶。
實(shí)施例8
在實(shí)施例2中，其他實(shí)驗(yàn)方法和制備步驟不變，只是將10mg實(shí)施例1中 的固定化酶分散于2ml的5wt。/。殼聚糖磷酸緩沖溶液中，再取0.5ml用于制備
生物傳感器。
由上述實(shí)施例可以看出，通過(guò)氮的摻雜和表面的親水修飾，介孔碳材料的 生物相容性得到很大的提高，其負(fù)載酶分子的活性得到了較好的保持，由此形 成的酶?jìng)鞲衅?，具有很快的響?yīng)時(shí)間，寬的線性范圍，高的靈敏度和低檢測(cè)限。
權(quán)利要求
1、氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料，其特征主孔道由14～17nm的介孔組成，次級(jí)孔則是由3～4nm的介孔組成，其比表面積在450m2g-1以上，孔容在0.80cm3g-1以上，其組成為CNx，其中X為氮原子與碳原子的摩爾比，X為0.19～1.2，酶分子負(fù)載量為17％～25％。
2、 按權(quán)利要求1所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料，其特征在于 該材料可直接修飾在工作電極上，成膜，得到生物傳感用酶電極。
3、 按權(quán)利要求2所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料，其特征在于， 由該材料制得的傳感具有很快的響應(yīng)時(shí)間，寬的線性范圍，高的靈敏度和低的 檢測(cè)限。其檢測(cè)靈敏度可以高達(dá)477 mA L mo1-1 cm-2。
4、 按權(quán)利要求2或3所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料，其特征 在于由該材料制得的傳感無(wú)需電子媒介體，生物大分子在電極表面可以實(shí)現(xiàn)直 接的電子傳遞，屬于第三代生物傳感器。該生物傳感器的電子傳遞速率常數(shù)可 高達(dá)4 9 s-1。
5、 氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料的制備方法，其特征在于制備過(guò)程 由兩部分組成，首先以乙二胺、丙烯腈或者三聚氰胺為碳氮源，采用模板碳化 法制備氮摻雜介孔碳，然后用硝酸對(duì)其表面進(jìn)行親水性處理得到。
6、 按權(quán)利要求5所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料的制備方法， 其特征在于該方法由以下步驟組成(1)制備碳氮前驅(qū)物溶液，碳氮前驅(qū)物溶液由碳氮前驅(qū)物、溶劑以及酸添 加劑在室溫混合攪拌1 5小時(shí)得到，其中碳氮前驅(qū)物包括乙二胺、丙烯腈、三 聚氰胺或六亞甲基四胺，溶劑包括四氯化碳、甲醛、乙二醛或二甲基亞砜所用 酸添加劑包括對(duì)甲苯磺酸、衣糠酸等，碳氮前驅(qū)物溶液中碳氮前驅(qū)物的質(zhì)量百 分?jǐn)?shù)為5 60%，添加劑的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0. 1 5%。(2) 將千燥的介孔氧化硅分子篩模板(如MCF、 MSU、 FDU-12等)浸 入到碳氮前驅(qū)物溶液中，在70 100。C攪拌1 12小時(shí)，然后在100 150。C 處理6 36小時(shí)，其中模板與碳前驅(qū)物溶液的質(zhì)量比為0.05 0.5: 1。(3) 將步驟(2)得到的產(chǎn)物在惰性氣氛下碳化，碳化溫度為500 900°C， 恒溫時(shí)間為2 12小時(shí)。(4) 將碳化后得到的復(fù)合物加入到質(zhì)量比為2 20%的氫氟酸或2 30%的強(qiáng)堿(氫氧化鈉、氫氧化鉀等)溶液中，室溫或加熱攪拌6 24小時(shí)，然后 過(guò)濾分離并洗滌，在60 120。C下干燥后得到去除模板后的氮摻雜介孔碳材料。(5) 將歩驟(4)中得到的產(chǎn)物，用10% 35%的硝酸在50 80 。C處理 1 15小時(shí)，以對(duì)其表面進(jìn)行修飾。(6) 酶分子的同定化，將步驟(5)得到的產(chǎn)物與酶分子以0. 1 1的質(zhì)量 比在室溫下攪拌混合2 24小時(shí),離心并洗滌，得到氮摻雜介孔碳固定化酶生物 傳感材料。其中所用酶分子包括血紅蛋白、肌紅蛋白、葡萄糖氧化酶、木瓜蛋 白酶或辣根過(guò)氧化物酶。
7、 按權(quán)利要求6所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料的制備方法， 其特征在于模板采用大孔徑的介孔氧化硅如MCF、 MSU、 FDU-12等為模板， 由此得到的氮摻雜介孔碳既具有高的比表面積，又具有大的孔徑。
8、 按權(quán)利要求6所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料的制備方法， 其特征在于采用硝酸氧化處理，來(lái)改善其表面的親水性，從而使其更好地與生 物分子結(jié)合。修飾后的氮摻雜介孔碳所負(fù)載血紅蛋白的活性是修飾前的3倍多。
9、 按權(quán)利要求6所述的氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料的制備方法， 其特征在于采用新型的氮摻雜介孔碳為載體來(lái)固定生物酶分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氮摻雜介孔碳固定化酶生物傳感材料及其制備方法，屬于生物催化和生物傳感領(lǐng)域。以介孔氧化硅為模板，乙二胺、丙烯腈或三聚氰胺為碳氮源，制備得到介孔碳，再用硝酸對(duì)其表面進(jìn)行修飾，得到親水性修飾的氮摻雜介孔碳。該材料具有高的比表面積、大的孔容、大的孔徑以及很好的生物相容性，同時(shí)還有很好的水、熱穩(wěn)定性和導(dǎo)電性。以此為載體固定化的酶分子，其活性能夠得到很好的保持?；诘獡诫s介孔碳固定化酶的生物傳感具有快的響應(yīng)時(shí)間，寬的線性范圍，高的靈敏度和低的檢測(cè)限。另外，該固定化酶生物傳感材料的制備工藝簡(jiǎn)單可控，條件溫和，原料易得，設(shè)備常規(guī)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101435792SQ20081020478
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月17日
發(fā)明者師琳璞, 高秋明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所