專利名稱：微粒測量方法、用于測量的基板、以及測量裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及孩史粒測量方法、用于樣i粒測量的基板、以及微粒測 量裝置。更具體地i兌，本發(fā)明涉及一種孩i粒測量方法，該方法能夠 控制將光發(fā)射到微粒被引入其中的樣品流體通道的時間。
背景技術(shù)：
在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域,為了區(qū)分樣i粒，例如包括細(xì)胞、微生物以及 脂質(zhì)體的生物孩i粒，或包括"交乳顆粒、凝"交顆粒以及工業(yè)顆粒的合 成顆粒，已使用了將微粒分散液引入到流體通道中并對引入到流體 通道中的微粒進行光學(xué)測量的裝置。
作為 一個例子，有一種才艮據(jù)大小或形狀來區(qū)分合成顆粒的顆粒 分析儀。該顆粒分析儀通過在氦(He)等離子體中逐一地激發(fā)和發(fā) 射孩1粒來進行孩￡粒的光譜檢測，從而測量孩吏粒的元素組成或直徑以 及顆粒H量。
此外，對于生物微粒，廣泛進行使用流式細(xì)胞術(shù)(流式細(xì)胞儀) 的光學(xué)測量。流式細(xì)胞術(shù)是一種測量待測微粒(如細(xì)胞或微珠)的大小或結(jié)構(gòu)的4支術(shù)，其中通過4吏;微粒流到流動室中的鞘液的層流中 部，借助于光學(xué)檢測單元將光照射到微粒上，然后檢測由微粒產(chǎn)生 的散射光或熒光。
近年來，在開發(fā)一種用于對在流體通道內(nèi)的^效粒進行上述光學(xué) 測量的孩支芯片，其中流體通道通過利用半導(dǎo)體工業(yè)的4青細(xì)加工4支術(shù) 設(shè)置在由玻璃或塑料形成的基板上。
使用這樣的微芯片的分析系統(tǒng)稱作p-TAS (微型全分析系統(tǒng))、 芯片實-驗室(lab on chip )、或生物芯片，并且作為一種能夠改善孩i 粒的光學(xué)測量的速度、集成化、或測量裝置的小型化的技術(shù)已經(jīng)引 起了關(guān)注。在fi-TAS的情況下，特別期望應(yīng)用于貴重微量樣品或許 多樣品的生物分析，因為可以利用少量樣品進行分析，或可以一次 性使用微芯片。
JP-T-2005-538727披露了 一種孩i芯片(參照該文獻(xiàn)中圖17的顆 粒分類系統(tǒng)1700)，用于對流體通道中的孩史粒進4亍光學(xué)測量和分類。 該顆粒分類系統(tǒng)1700包括多個平刊4喿作的分類沖莫塊1701 (樣品流 體通道)。在該顆粒分類系統(tǒng)1700中，將樣品從輸入?yún)^(qū)1710引入 到每個分類才莫塊1701中并在4企測區(qū)1720同時測量顆4立的預(yù)定特 性。因此，可以實現(xiàn)顆粒的高速測量和分類。

發(fā)明內(nèi)容
在多個樣品流體通道i殳置在基4反上并同時進4亍孩i粒的光學(xué)測 量的情況下(如在JP-T-2005-538727中4皮露的孩史芯片)，用于測量 的光對每個樣品流體通道掃描和照射祐J人為是有效的。
在通過分別獨立地將光照射到每個才羊品流體通道來進4于測量 的情況下，每個樣品流體通道都需要光源和用于將光乂人光源引導(dǎo)到才羊品流體通道的光學(xué)系統(tǒng)。相反，通過用光掃描和照射多個才羊品流 體通道，就可以用單個光源和單個光學(xué)系統(tǒng)進4亍測量。在這種情況 下，因為裝置的構(gòu)造^皮簡化，所以可以降低裝置的制造成本。
因此，期望提供一種當(dāng)通過用光掃描樣品流體通道而對引入到 設(shè)置在基板上的多個樣品流體通道中的微粒進行光學(xué)測量時，能夠 獲得高測量精度的測量方法、用于測量的基板、以及測量裝置。
才艮據(jù)本發(fā)明的 一種實施方式，通過用光掃描才羊品流體通道而對
引入到以預(yù)定距離i殳置在基才反上的多個才羊品流體通道中的孩i粒進 4亍光學(xué)測量的纟效粒測量方法，包4舌以下步-驟用光順序照射至少兩 個或更多個與樣品流體通道一起提供的參考區(qū)域；檢測由于參考區(qū) 域引起的在光中發(fā)生的光學(xué)特性的變化；以及控制光對樣品流體通 道的發(fā)射時間。
在該孩史粒測量方法中，光對樣品流體通道的發(fā)射時間是基于由 參考區(qū)域之一引起的光學(xué)特性變化的檢測時間和由另 一個參考區(qū) 域引起的光學(xué)特性變化的才企測時間之間的時間差，以及樣品流體通 道的數(shù)量來控制的。
在該微粒測量方法中，參考區(qū)域可以是其中引入了用于參考的 樣丈?；?和用于參考的熒光物質(zhì)的參考流體通道。在這種情況下，可
學(xué)特性的變化來控制光對樣品流體通道的發(fā)射時間。
此外，才艮據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，提供了用于微粒測量的 基4反，其中多個才羊品流體通道以預(yù)定距離i殳置，并且通過用光掃描 樣品流體通道對可1入到樣品流體通道中的微粒進行光學(xué)測量，所述 基板包括至少兩個或更多個能夠引起照射光的光學(xué)特性變化的參 考區(qū)域，并且參考區(qū)域與樣品流體通道一起i殳置。此外，才艮據(jù)本發(fā)明的又一實施方式，^是供了一種纟效粒測量裝置，
其通過用光掃描才羊品流體通道而對引入到以預(yù)定3巨離i殳置在基4反 上的多個樣品流體通道中的孩i粒進4亍光學(xué)測量，該裝置包括光照 射部，用光順序照射至少兩個或更多個與樣品流體通道一起設(shè)置的 參考區(qū)域；光檢測部，檢測由于參考區(qū)域引起的在光中發(fā)生的光學(xué) 特性的變化；以及光控制部，基于光檢測部的輸出，控制光對樣品 流體通道的發(fā)射時間。
在本發(fā)明中，"微粒"的實例包括各種類型的微粒，例如包括 細(xì)胞、微生物以及脂質(zhì)體的生物微粒，或包括膠乳顆粒、凝膠顆粒 以及工業(yè)顆粒的合成顆粒。細(xì)胞的實例包括動物細(xì)胞(例如，血細(xì) 胞)和植物細(xì)胞。微生物的實例包括細(xì)菌如大腸桿菌，病毒如煙草 花葉病毒，真菌如酵母菌等。生物高分子物質(zhì)的實例包括構(gòu)成各種 細(xì)胞的染色體、脂質(zhì)體、線粒體、細(xì)胞器等。此外，工業(yè)顆?？梢?是，例如，有機高分子材料、無機高分子材料、或金屬。有機高分 子材料的實例包括聚苯乙烯、苯乙烯二乙烯苯、聚曱基丙烯酸曱酯 等。無機高分子材料的實例包括玻璃、硅石、磁性材料等。金屬的 實例包括金膠體、鋁等。通常，這樣的微粒為球形。然而，微粒也 可以為非3求形。此外，大小或質(zhì)量也沒有特別的限制。
此外，假定"參考區(qū)域"是指這樣的區(qū)，其中照射用于微粒的 光學(xué)測量的光以引起光的光學(xué)特性變化。此外，假定本文提及的"光 學(xué)特性的變化"包括由光的漫射、衍射、偏轉(zhuǎn)、吸收等引起的波長 變化、偏轉(zhuǎn)變化、以及強度變化。在廣義上，假定"光學(xué)特性的變 化，，進一步包括這樣的變化，其中照射光^皮吸收以發(fā)射具有不同波 長的熒光。類似地，假定"用于參考的微粒"和"用于參考的熒光
質(zhì)。人、 、、 、、' 、、。、、根據(jù)本發(fā)明的實施方式，提供了 一種當(dāng)通過用光掃描樣品流體 通道而對引入到設(shè)置在基板上的多個樣品流體通道中的微粒進行 光學(xué)測量時，能夠獲得高測量精度的測量方法、用于測量的基板、 以及測量裝置。


圖l是示出了根據(jù)本發(fā)明實施方式的微粒測量裝置的構(gòu)造的示
意圖2是示出了根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板的構(gòu)造的示意圖(頂 視圖)；
圖3是示意性地示出了基板的檢測區(qū)的放大圖(頂視圖)；
圖4是示意性地示出了才羊品流體通道和參考流體通道對測量光 的掃描線才羊以傾4牛而不是直角交叉的狀態(tài)附著的基4反的4企測區(qū)的 放大圖(頂視圖)；
圖5是示意性地示出了在通過將測量光束照射到樣品流體通道 來進行測量的情況下，基板的檢測區(qū)的放大圖(頂視圖)；
圖6是示意性地示出了根據(jù)另一實施方式的基板的檢測區(qū)的放 大圖(頂視圖)；
圖7是示出了根據(jù)另一實施方式的基板的構(gòu)造的示意圖(頂視
圖)；
圖8是示意性地示出了圖7所示的基板的檢測區(qū)的放大圖(頂 一見圖)；以及圖9是示出了利用光控制部對測量光的發(fā)射時間進行控制的控 制步駛《的流禾呈圖。
具體實施例方式
在下文，將參照附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。此外，以下 本發(fā)明的范圍。
圖1是示出了才艮據(jù)本發(fā)明實施方式的橫t粒測量裝置的構(gòu)造的示 意圖。
在該附圖中，由符號1指示的微:粒測量裝置包4舌用于獨t粒測 量的基板ll(在下文中，簡稱為"基板ll"),其中設(shè)置有樣品流體 通道lll，通過該樣品流體通道可以引入孩史粒(樣品)；激光源12， 發(fā)射用于微粒光學(xué)測量的激光(參考附圖中的黑色箭頭)；掃描 部13,用激光U掃描在基板11上的每個樣品流體通道111;物鏡 14，用于將激光I^聚光到樣品流體通道111的預(yù)定位置；以及準(zhǔn)直 鏡15，用于使來自激光源12的激光"變成平行光束。
包括^敫光源12、掃描部13、物鎮(zhèn)14、以及準(zhǔn)直鏡;15的光4企測 部進一步包括檢測器16，用于檢測待檢測的光L2 (參考附圖中的 陰影線箭頭)，所述光L2通過用測量光Li照射樣品流體通道111， 從而由引入到樣品流體通道111中的微粒產(chǎn)生。
通過根據(jù)待測量的微粒和測量目的選擇不同的波長，優(yōu)選使用 激光Li (在下文中，稱作"測量光L ，)。作為激光源12,可以適 當(dāng)?shù)剡x擇和使用已知光源，如使用氬、氦等的氣體激光器，半導(dǎo)體 激光器(LD)，以及發(fā)光二極管(LED)。例如，為了測量微粒的元素組成，選擇波長對應(yīng)于每種元素的 吸收波長的測量光L!。此外，在測量用多種熒光染沖牛標(biāo)記的纟效粒的 熒光的情況下，使用波長對應(yīng)于每種熒光染料的激發(fā)波長的測量光Li。
掃描部13纟皮布置成在由激光源12發(fā)射的測量光L^的光路上的 多面4竟或電流4竟(galvano mirror )、聲光元4牛、電光元4牛等，并以 預(yù)定周期用測量光"掃描樣品流體通道lll。例如，在二向色4竟的 情況下可以以約1 kHz的周期進4于掃描，而在24面體多面4竟的情 況下則以約20 kHz的周期進行掃描。優(yōu)選通過遠(yuǎn)心光學(xué)系統(tǒng)進行 測量光L！的照射，其中測量光Li垂直照射到樣品流體通道111并 且在每個樣品流體通道lll的成像表面上的測量光L！的光點寬度是 固定的。
才企測器16沖企測和》文大由孩史粒產(chǎn)生的待^r測光L2,將待4企測光 L2轉(zhuǎn)換成電信號，并將待檢測光L2輸出至分析部(未示出)?；?輸入電信號，分析部分析微粒的光學(xué)特性并輸出測量結(jié)果。在圖1 中，示出了通過分光計17并使用多通道光電倍增管(PMT)作為檢測 器16來祐4冊化(grating) 4爭4企測的光L2以及檢測每個波長的待抬r
測光L2的一種'lf況。 -
根據(jù)待測量的孩i粒和測量目的，用于分析微粒的光學(xué)特性的參 數(shù)可以是散射光(如用于測量微粒大小的前向散射光或側(cè)向散射 光)、熒光、以及用于測量結(jié)構(gòu)的瑞利散射或米氏散射。此外，熒 光可以是相干熒光或可以是非相干熒光。
此外，在JP-T-2005-538727中4皮露的用于基于測量結(jié)果進4亍樣史 粒的分類(分離)的構(gòu)成元件可以設(shè)置在微粒測量裝置1中。雖然 本文略去詳細(xì)說明，但4是供了與樣品流體通道111連通的用于分離 的流體通道，以便在進行分離時從流過樣品流體通道111的孩i粒分類和回收具有期望光學(xué)特性的微粒。此外，在基板11上設(shè)置了驅(qū) 動構(gòu)件(制動器)，用于控制在樣品流體通道111和用于分離的流體
通道之間的連接部分中的凝:粒的流動方向?；趤碜苑治霾康姆蛛x 信號，通過控制驅(qū)動構(gòu)件來進行分離。
除上述構(gòu)造之外，根據(jù)本發(fā)明的實施方式的微粒測量裝置1還 包括光控制部18,控制將測量光"發(fā)射到樣品流體通道111的時 間?；赹r測器16輸出的電信號，通過控制激光源12，光控制部 18控制掃描和照射每個流體通道111的測量光L的發(fā)射時間。此 外，雖然分析部和光控制部18 #:描述為分開的構(gòu)件，^旦不用i兌， 分析部和光控制部18可以形成為一個構(gòu)件。
圖2是示出了根據(jù)本發(fā)明實施方式的基板11的構(gòu)造的示意圖 (頂一見圖)。
在由符號11指示的基板上，以預(yù)定距離設(shè)置微?？杀灰肫?中的樣品流體通道111。在圖l和2中，示出了在基板11上設(shè)置總 共12個樣品流體通道111的情況。然而，-沒置的樣品流體通道111 的數(shù)量可以是兩個以上的任何數(shù)量。
基才反11由允許測量光L,透射通過并對于測量光U具有^f氐波長 色散和小的光學(xué)誤差的材料形成，如玻璃或各種類型的塑料(PP、 PC、 COP、 PDMS)。
當(dāng)使用玻璃作為基板11的材料時，通過濕式蝕刻或干式蝕刻 而轉(zhuǎn)印(transfer)流體通道(樣品流體通道111和后面所要描述的 參考流體通道112)。此外，當(dāng)使用塑料作為基板11的材料時，通 過納米壓印或才莫塑來形成流體通道。因此，可以以預(yù)定距離形成具 有均勻?qū)挾鹊牧黧w通道，具有5 pm或更小誤差的精度。將包含待測量微粒的分散溶劑從樣品入口 nil (其設(shè)置在樣品 流體通道111的一端)引入到每個才羊品流體通道111中。
在這種情況下，通過流動系統(tǒng)(未示出)，可以將凝:粒逐一地 排列在樣品流體通道lll內(nèi)。該流動系統(tǒng):帔配置為包括用來發(fā)送 作為層流的包含微粒的分散溶劑的噴嘴；以及用來僅發(fā)送作為層流 的溶劑的噴嘴。通過這兩個噴嘴，在溶劑層流(鞘流)的中部產(chǎn)生 分散溶劑的層流。另外，當(dāng)發(fā)送包含微粒的分散溶劑時，通過將小 壓力差施加于噴嘴，可以將孩i粒逐一地排列在層流中。因此，可以 通過將測量光L,照射到逐一排列在樣品流體通道lll中部的微粒上 來進行光學(xué)測量。
引入到才羊品流體通道111中的凝:粒以附圖中由箭頭F所指的方 向流過樣品流體通道111，并在^r測區(qū)D (參照附圖中的點線)照 射測量光在照射以后，佳:孩M立在箭頭F所指的方向進一步流動， 然后從i殳置在樣品流體通道111的另 一端的樣品出口 1112排出基板 11。
通過4吏掃描部13用激光源12發(fā)射的測量光Li掃描每個樣品流 體通道111,來進4亍測量光L的照射(參照圖1 )。在圖2中，點箭 頭S指出測量光的掃描線。將在假定測量光M從圖2中基板11 的下方向上方掃描的情況下進^H兌明。此外，并不需要在掃描線S 上的一個方向進4于掃描，而可以是以雙向"主返)方式進4亍。
在基板11中，參考流體通道112設(shè)置在樣品流體通道111的外 側(cè)，以使得在測量光Li掃描中可以在適當(dāng)時間將測量光"發(fā)射到 樣品流體通道111。
參考流體通道112設(shè)置在測量光"的掃描方向S上的樣品流體 通道111的兩端，并且每個參考流體通道112和與其相鄰的樣品流 體通道111之間的排列距離等于樣品流體通道111之間的預(yù)定距離。將用于參考的#:粒和/或用于參考的熒光物質(zhì)引入到參考流體 通道112中。用于參考的孩i粒和用于參考的熒光物質(zhì)并沒有特別限 制，只要當(dāng)照射測量光L時它們可以改變測量光"的光學(xué)特性， 并且可以使用通常使用的微珠或熒光染料。這里，"光學(xué)特性的變 化"包括由測量光Li的漫射、衍射、偏轉(zhuǎn)、吸收等引起的波長變化、 偏轉(zhuǎn)變化、以及強度變化。在廣義上，"光學(xué)特性的變化"進一步 包括照射光^皮吸收以發(fā)射具有不同波長的熒光的變化。
例如，當(dāng)微珠作為用于參考的微粒被引入到參考流體通道112 中時，測量光"的光學(xué)特性會由于微珠引起的漫射而發(fā)生變化。此 外，當(dāng)具有作為激發(fā)波長的測量光I^的波長的熒光物質(zhì)作為用于參 考的熒光物質(zhì)^皮引入到參考流體通道112中時，通過測量光L的照 射產(chǎn)生具有不同波長(發(fā)射波長)的熒光。
物質(zhì)的溶液從設(shè)置在參考流體通道112的一端的參考物質(zhì)入口 1121 引入到參考流體通道112中。通過i殳置在另 一端的參考物質(zhì)出口(未 示出)排出送到基板11外側(cè)的溶劑或溶液，可以在測量期間連續(xù) 地進行上述引入。此外，如圖2所示，可以封閉參考流體通道112 的另 一端并且可以 一次性注入和i真充溶劑或溶液。
此外，可以預(yù)先將用于參考的微粒和用于參考的熒光物質(zhì)引入 到參考流體通道112中。例如，在制造基板ll時，可以將用于參考 的孩i粒和用于參考的焚光物質(zhì)填充到參考流體通道112內(nèi)，而無需 i殳置參考物質(zhì)入口 1121。此外，可以4吏用單種物質(zhì)或多種物質(zhì)組合 作為各個用于參考的^f鼓粒和用于參考的熒光物質(zhì)，并且用于參考的 微粒和用于參考的熒光物質(zhì)兩者均可以被引入到參考流體通道112 中。量光"的光學(xué)特性的變化可以通過與用于待檢測光L2相同的檢測
系統(tǒng)加以沖企測，其中待4企測光L2由才羊品流體通道lll中的孩i粒產(chǎn)生。
具體地說，通過將測量光L！照射到用于參考的微?；?和用于 參考的熒光物質(zhì)上所產(chǎn)生的光通過物鏡14聚光，穿過掃描部13和 分光計17，通過檢測器16加以檢測，并被轉(zhuǎn)換成電信號(參照圖 1)。
然后，通過接收電信號的輸出、檢測測量光Li的光學(xué)特性的變 化、以及控制激光源12,光控制部18控制測量光I^對樣品流體通 道111的發(fā)射時間。
根據(jù)所要使用的用于參考的微粒和用于參考的熒光物質(zhì)，對作 為用于檢測光學(xué)特性變化的參數(shù)的波長、偏轉(zhuǎn)角、強度等進行設(shè)置。 例如，在上述實例中檢測由微珠引起的漫射，其中微珠用作用于參 考的微粒。此外，在使用用于參考的熒光物質(zhì)的情況下，進行對應(yīng) 于發(fā)射波長的熒光的檢測。
在下文中，將對利用光控制部18來控制測量光"的發(fā)射時間 進4亍具體地描述。
圖3是示意性地示出了基板11的檢測區(qū)D的放大圖(頂視圖)。
在該附圖中，符號I^表示在樣品流體通道111 (反應(yīng)區(qū)D)的 成4象表面上的測量光的激光光斑。測量光"從附圖中的下側(cè)向 上在掃描線S上掃描，并照射到參考流體通道112、各個樣品流體 通道lll、以及參考流體通道112。
14以圖中符號1所表示的預(yù)定距離來排列樣品流體通道111和參
考流體通道112。
將用于參考的微?；?和用于參考的熒光物質(zhì)？ 1入到參考流體 通道112中，并且當(dāng)測量光L^皮照射到參考流體通道112時，用于 參考的微粒或/和用于參考的焚光物質(zhì)會改變測量光L,的光學(xué)特性。
光控制部18根據(jù)檢測器16輸出的電信號檢測出光學(xué)特性的變 化，/人而計算在兩參考流體通道112之間測量光L掃描所需要的時 間T。
具體地i兌，々支定當(dāng)由一個參考流體通道112引起的光學(xué)特性變 化被檢出時的時間是時間0，則獲得直到由另 一個參考流體通道112 引起的光學(xué)特性變化被檢出的時間T。在圖3中，當(dāng)由位于附圖下 側(cè)的參考流體通道？I起的光學(xué)特性變化被檢出時的時間是時間0, 而當(dāng)由上部參考流體通道引起的相同變化被檢出時的時間是時間 T。
然后，利用獲得的時間T基于下式(1 )，光控制部18計算測 量光"的發(fā)射時間。
tk = 0 + kxT/(m+1) ... (1)
這里，"m"表示樣品流體通道111的數(shù)量，而"tk"表示第k 次照射樣品流體通道111的測量光L對沖羊品流體通道111的發(fā)射時 間。此外，根據(jù)待使用的基板ll，樣品流體通道lll的數(shù)量m可以 預(yù)先i殳置和存^f諸在測量裝置1的光控制部18中。具體地說，在圖3中(樣品流體通道lll的數(shù)量m是12),從 ^立于附圖下側(cè)的才羊品流體通道111開始順序;也在時間T/13、 2T/13、 3T/13、 4T/13、 5T/13、 6T/13、 7T/13、 8T/13、 9T/13、證/13、 11T/13、 以及12T/13發(fā)射測量光LlQ在各個時間測量光L！的發(fā)射時間非常 短，例如，約1 ps。
如上所述，由于才羊品流體通道111和參考流體通道112以預(yù)定 的相等距離l排列，因此每個計算的時間可以看作是測量光L,的激 光點的中心與每個樣品流體通道111在其寬度方向的中央一致的時 間。
因此，通過定時發(fā)射測量光Lp測量光Lt可以在適當(dāng)?shù)臅r間 照射到每個樣品流體通道111,而在激光光斑位于槽脊(基板的流 體通道之間的區(qū)域)的情況下或在激光光斑的中心偏離樣品流體通 道111的中央的情況下無需進行不必要的測量光照射。
因此，在根據(jù)本發(fā)明的實施方式的微粒測量裝置1中，通過檢 測由i殳置在基玲反上的參考流體通道引起的測量光U的光學(xué)特性變 化，可以控制測量光I^對每個樣品流體通道111的發(fā)射時間。因此， 即使連接于微粒測量裝置1的基板11的位置偏離，通過在適當(dāng)?shù)?時間用測量光U照射每個樣品流體通道111，仍然可以獲得高測量 精度。
圖4示出了樣品流體通道111和參考流體通道112以傾斜于測 量光L的掃描線S而沒有成直角交叉狀態(tài)附著的基板11。圖4是 示意性地示出了檢測區(qū)D的放大圖。
^口上所述，通過蝕刻、納米壓印等，可以以相等3巨離在基4反上 形成流體通道，具有5 pm或更小誤差的精度。為此，只要使用設(shè) 計成具有相同大小、相同寬度或數(shù)量的流體通道等的基板，就可以唯一地確定測量光對基板上的樣品流體通道的照射時間。然而，在
這種情況下，當(dāng)如圖4所示，基板的連接位置發(fā)生偏離時，測量光 不可能在適當(dāng)?shù)臅r間照射到樣品流體通道。因此，不可能獲得4青確 的測量結(jié)果。
另一方面，在根據(jù)本發(fā)明實施方式的微粒測量裝置1中，即使 樣品流體通道111和參考流體通道112以偏離垂直方向或傾4牛于掃 描線S (如圖4所示)，通過基于在參考流體通道112之間掃描測量 光Li所需要的時間T計算測量光I^的發(fā)射時間，仍然可以在適當(dāng) 的時間照射測量光L"
此外，在根據(jù)本發(fā)明實施方式的微粒測量裝置1中，在激光光 斑位于槽脊的情況下或在激光光斑的中心偏離樣品流體通道111的 中央的情況下，并不照射不必要的測量光"。因此，當(dāng)通過將多個 測量光束照射到一羊品流體通道111來進4于測量時，通過抑制光束之 間的干涉(串?dāng)_)，可以獲得高測量靈敏度。
圖5是示意性地示出了在通過將多個測量光束照射到樣品流體 通道111進行測量時的檢測區(qū)D的放大圖。在該附圖中，符號I^、 L^以及Lw表示在樣品流體通道111 (反應(yīng)區(qū)D)的成像表面上的 每個測量光的^敫光光J汪。
例如，在測量由多種熒光染料標(biāo)記的^f鼓粒的熒光特性的情況 下，通過利用多個激光源將多個測量光束照射到^f敖粒上，其中激光 源發(fā)射波長對應(yīng)于各種熒光染料的激發(fā)波長的光。雖然圖5示出了 使用三種測量光束Lp Lu以及Lk3的情況，但可以根據(jù)需要任意 設(shè)定測量光束的數(shù)量。例如，測量光束L。 Lw以及Lw可以分別 具有405 nm、 473 nm以及658 nm的波長。測量光束I^、 Lw以及Lw分別通過掃描線S2以及S3掃描， 并且將測量光束照射到樣品流體通道111。借助于圖1所示的掃描 來自每個激光源的光的掃描部13，可以連同測量光束"一起掃描 測量光束L^和Lw?？商鎿Q地，可以通過分開的i殳置用于測量光 束Lw和Ll3的掃描部來掃描測量光束Lw和Lw。為了4吏裝置的構(gòu) 造簡單，優(yōu)選通過同一掃描部一起掃描測量光束Lp Lw以及Lw。
在如上所述的通過掃描三個測量光束1^、 L,-2以及Lw來進行 測量的情況下，當(dāng)通過照射各種測量光而同時由不同才羊品流體通道 111產(chǎn)生待檢測的光束時，由于待檢測的光束之間的串?dāng)_可能會產(chǎn) 生噪聲。這可能會降低測量靈敏度。
例如，在/人圖5所示的位置掃描測量光束Li、 Ll2以及Lw的 情況下，發(fā)射所有測量光束Lp LL2以及Lw時，待檢測的光束L2、
L2-2以及L2，3分別通過在樣品流體通道111中的纟鼓粒照射測量光束而
產(chǎn)生。因此，會發(fā)生4寺測量的光束之間的串4尤。
為了避免串?dāng)_，由每個樣品流體通道111產(chǎn)生的待檢測光需要 通過單獨的4企測器加以4企測。然而，在這種情況下，由于裝置的構(gòu) 造變得復(fù)雜，因此會出現(xiàn)制造成本方面的問題。
可以加以4企測，則優(yōu)選通過縮短每個測量光束Lp Lw以及Lw的
發(fā)射時間來避免4寺測量的光束同時由不同的樣品流體通道111產(chǎn) 生。
在;^艮據(jù)本發(fā)明實施方式的;f效粒測量裝置1中，當(dāng)測量光的激光 光斑的中心與每個才羊品流體通道111在其寬度方向的中央一致時， 則發(fā)射測量光。例如，在圖5中，4又發(fā)射測量光束Ln其激光光斑的中心位于樣品流體通道111在寬度方向的中央，而不發(fā)射測量光 束Ll2和Lw,其激光光斑的中心偏離樣品流體通道lll的中央。
因此，在孩i粒測量裝置l中，可以避免待測量的光束同時由不 同的樣品流體通道111產(chǎn)生并且抑制待測量的光束之間串?dāng)_的發(fā) 生。因此，可以獲得高測量靈敏度。
另外，在通過分開i殳置的掃描部掃描具有不同波長的測量光束 Lp Lw以及Lw的情況下，必須將用于參考的微粒或/和用于參考 的熒光物質(zhì)(其可以引起每種波長的不同的光學(xué)特性變化)引入到 參考流體通道112中，以便在光控制部18中分別4全測每個測量光 束的特性變化，并控制每個發(fā)射時間。
圖6是示意性地示出了根據(jù)另一個實施方式的基板11的4企測 區(qū)D的》文大圖(頂^L圖)。
在圖6中，符號L表示在樣品流體通道111 (反應(yīng)區(qū)D )上的 成4象表面上的測量光I^的激光光斑。類似于圖3,以由附圖中的符 號1所表示的預(yù)定距離來排列樣品流體通道111和參考流體通道 112。
然而，在圖6中，參考流體通道112在測量光Li的掃描方向S 一皮設(shè)置在樣品流體通道111的一側(cè)，以致4皮此相鄰。
在這種情況下，利用獲得的時間T，基于下式(2)，光控制部 18計算測量光"的發(fā)射時間。
tk = 0 + (k + 1) x T/(m + 1) ... ( 2 )
19這里，"m，，表示樣品流體通道111的數(shù)量，而"tk"表示第k 次照射樣品流體通道111的測量光"對樣品流體通道111的發(fā)射時 間。
如前所述，在利用來自^r測器16的電信號，光控制部184全測 和計算由參考流體通道112引起的光學(xué)特性變化的情況下，假定當(dāng) 由一個參考流體通道112 f I起的光學(xué)特性變化被檢出時的時間是時 間0,則時間T表示直到由另一個參考流體通道112引起的光學(xué)特 性變化被4企出的時間。即，時間T相當(dāng)于在參考流體通道112之間 測量光"^皮掃描所需要的時間。
具體地說，在圖6中(樣品流體通道111的數(shù)量m是12 )，將 測量光M發(fā)射到每個樣品流體通道111時的時間從位于附圖下側(cè)的 樣品流體通道111開始依次為時間21713、 3T/13、 4T/13、 5T/13、 6T/13、 7T/13、 8T/13、 9T/13、 10T/13、 11T/13、 121713、以及13T/13。
因此，在參考流體通道112沿著測量光Li的掃描方向S以預(yù)定 距離l排列的條件下，可以任意設(shè)定參考流體通道112的排列位置。 在這種情況下，通過才艮據(jù)參考流體通道112的排列位置適當(dāng)?shù)母?發(fā)射時間的計算7>式(式(1)和(2)),則當(dāng)測量光"的激光光斑 的中心與每個樣品流體通道111在寬度方向的中央一致時可以發(fā)射 測量光"。
此外，參考流體通道112的數(shù)量并不總是需要為兩個。例如， 也可以^吏用三個以上的參考流體通道112。同沖羊在這種情況下，發(fā) 射時間的計算7>式(式(1 )和(2))優(yōu)選^^艮據(jù)參考流體通道112 的排列位置和數(shù)量進4亍更改。圖7是示出了根據(jù)另一個實施方式的基板11的構(gòu)造的示意圖 (頂視圖)。圖8是示意性地示出了基板11的檢測區(qū)D的放大圖(頂
視圖)。
類似于圖2，樣品流體通道111以預(yù)定3巨離H殳置在由符號11 表示的基板上(參照圖8)。將微粒引入到樣品流體通道lll中的方
法、測量光Li的掃描方向S等類似于圖2中描述的那些。
然而，在圖7中，代替參考流體通道112，參考區(qū)域113設(shè)置 在才羊品流體通道111的外側(cè)，作為一種用于在掃描測量光"時在適 當(dāng)時間將測量光L發(fā)射到各個樣品流體通道111的構(gòu)造。
將參考區(qū)域113 i殳置在測量光M的掃描方向S上的樣品流體通 道111的兩側(cè)，并且在每個參考區(qū)域113和與其相鄰的樣品流體通 道111之間的排列距離等于樣品流體通道111之間的預(yù)定距離l(參 照圖8 )。
類似于參考流體通道112，參考區(qū)域113是這樣的區(qū)域，其中 通過照射測量光Lp不僅可以發(fā)生由測量光"的漫射、衍射、偏 轉(zhuǎn)、吸收等引起的波長變化、偏轉(zhuǎn)變化以及強度變化，而且可以發(fā) 生照射光#1吸收乂人而發(fā)射具有不同波長的熒光的變化。
這樣的可以引起測量光"的光學(xué)特性變化的區(qū)域可以通過在 基板11的表面上固定能夠漫射、衍射、偏轉(zhuǎn)以及吸收測量光M的 物質(zhì)而形成。例如，該區(qū)域可以通過4吏用以下方法來形成通過濺 射或氣相沉積來形成金屬膜或介電膜，或固定熒光物質(zhì)或著色物 質(zhì)。
可替換地，該區(qū)域還可以通過基板11表面的精細(xì)結(jié)構(gòu)來形成。 該精細(xì)結(jié)構(gòu)通過基板表面的細(xì)槽(fine groove)或槽埋置(pitembedding)而形成。在這種情況下，通過使分開設(shè)置的掃描部掃 描多個具有不同波長的測量光束來進行測量是有用的，如圖5中詳 細(xì)描述的，因為測量光產(chǎn)生對應(yīng)于波長的不同的反射角或傳輸衍射 角，從而可以單獨地檢測每個測量光束的特性變化。
還可以通過圖案化來形成金屬膜、介電膜以及精細(xì)結(jié)構(gòu)。因此， 即使芯片不干凈，仍然可以獲得多個信號圖象(signal pattern),因 為設(shè)置了多個圖象。因此，用于光盤等的糾^l昔變成可能，或可以代 替能夠規(guī)定更精確的位置的地址。
在參考區(qū)域113沿著測量光Li的掃描方向S以預(yù)定距離l排列 的條件下，可以任意地設(shè)定參考區(qū)域113的排列位置和數(shù)量，這類 似于4十對參考流體通道112所描述的。在這種情況下，4艮據(jù)排列位 置和數(shù)量，通過適當(dāng)更改發(fā)射時間的計算公式(式(1)和(2)), 可以在適當(dāng)?shù)臅r間發(fā)射測量光"。
接著，基于圖9所示的流程圖同時參照圖3的實例，將描述利 用光控制部18的測量光"的發(fā)射時間的控制步驟。
首先，在開始測量以后的第一次掃描中，掃描測量光L^以獲得 測量光Li的照射時間(步驟la)。在這種情況下，優(yōu)選的是，不檢 測通過測量光"的照射由孩Oi產(chǎn)生的祠"險測光L2。
在該第一次掃描(步驟la)中，光控制部18連續(xù)地發(fā)射測量 光Llt>因此，以參考流體通道112、各個樣品流體通道111、以及 參考流體通道H2的次序(/人圖3的下側(cè)向上)順序地照射測量光
光控制部18檢測由測量光照射到參考流體通道112所引起 的測量光M的光學(xué)特性變化，并獲得在參考流體通道112之間掃描測量光Li所需要的時間TlQ在圖3中，4艮定由下部參考流體通道 112引起的光學(xué)特性變化被檢出時的時間是時間0,由上部參考流 體通道112引起的相同變化被檢出時的時間是時間Tln
然后，在步驟lb中，利用獲得的時間基于下式(1)，光 4空制部18計算測量光"的發(fā)射時間。
tk = 0 + kxT/(m+ 1) ... ( 1 )
這里，"m"表示樣品流體通道111的數(shù)量，而"tk"表示第k 次照射樣品流體通道111的測量光"對樣品流體通道111的發(fā)射時 間。
然后，在第二次掃描中，通過新設(shè)定光學(xué)特性變化(其由位于 圖3下側(cè)的參考;危體通道112所引起)浮皮4企測時的時間為時間0， 光控制部18使測量光Li在各個獲得的時間進行發(fā)射(步驟2a)。
具體地說，在圖3中(樣品流體通道111的數(shù)量m是12 )，從 下部樣品流體通道111開始順序地在時間TV13、 2TV13、 3IV13、 4TV13、 5IV13、 6TV13、 7TV13、 8TV13、 9TV13、 10TV13、 11TV13、 以及12TV13發(fā)射測量光LlQ因此，在各個才羊品流體通道111進4亍 孩M立的測量。
為了獲得在第二次掃描中的時間0,在第一次掃描結(jié)束以后， 在第二次掃描開始時，光控制部18保持發(fā)射測量光Li。然后，在 將測量光Li照射到下部參考流體通道112并檢測光學(xué)特性變化/人而 獲得時間0以后，通過僅在各個上述時間發(fā)射測量光Lp光控制部 18進行第二次掃描。此外，光控制部18在第二次掃描中獲得測量光I^在參考流體 通道112之間掃描所需要的時間T2 (步驟2a)。
為此，在時間12T"13發(fā)射測量光Li到最后的樣品流體通道111 以后，光控制部18保持發(fā)射測量光L"因此，光控制部184企測當(dāng) 測量光Li照射到上部參考流體通道112時發(fā)生的光學(xué)特性變化，并 獲得時間T2。
隨后，基于在第(N-l )次掃描中獲得的時間Tw(步驟(N-l)a)， 光控制部18類似地計算用于第N次掃描的測量光I^的發(fā)射時間(步 驟(N-l)b ),并根據(jù)計算的發(fā)射時間進行第N次掃描(步驟Na )。
因此，在孩吏粒測量裝置1中，通過控制每次掃描的測量光" 的發(fā)射時間，每當(dāng)測量光"的激光光斑的中心與各個樣品流體通道 lll在寬度方向的中央一致時，發(fā)射測量光L"從而可以進行掃描。
在測量光"的掃描周期中發(fā)生偏離的情況下，這是特別有效 的。如上文對圖1的描述，通過掃描部13用測量光"掃描樣品流 體通道lll，其中掃描部13包括二向色鏡或多面鏡、電流鏡、聲光 元件、電光元件等，并i殳置在乂人激光源12發(fā)射的測量光I^的光路 中。在二向色4竟的情況下，可以以約1 kHz的周期進4亍掃描，而在 24面體多面4竟的情況下，則可以以約20 kHz的周期進4亍掃描。由 于驅(qū)動裝置的不穩(wěn)定性，即使可以高精度地控制每個掃描周期，但 技術(shù)上也難以保持完美的固定周期。
因此，在預(yù)先設(shè)定的發(fā)射時間(作為固定值)將測量光Li照射 到各個才羊品流體通道111的情況下，當(dāng)在測量過程中在掃描部13 的掃描周期發(fā)生偏離時，在不適當(dāng)?shù)臅r間發(fā)射測量光Li (當(dāng)測量光 Li的激光光斑位于槽脊(基板的流體通道之間的區(qū)域)或位于偏離樣品流體通道111中央的位置時)，因此不可能獲得精確的測量結(jié) 果。
另一方面，在根據(jù)本發(fā)明實施方式的微粒測量裝置1中，基于
在第(N-l )次掃描中獲得的時間Tn.p光控制部18在N次掃描中 控制測量光I^對各個樣品流體通道111的發(fā)射時間。因此，即使在 測量過程中掃描部13的掃描周期發(fā)生偏離，在測量光Li的激光光 斑的中心與各個樣品流體通道111在寬度方向的中央一致的條件 下，總是可以發(fā)射測量光Li。因此，可以獲得4青確的測量結(jié)果。
作為一個實例，雖然已利用示于圖3的基板11描述了利用光 控制部18的測量光Li發(fā)射時間的控制步驟，但相同的控制也可以 在圖6所示的根據(jù)另一實施方式的基板11上進行。
根據(jù)本發(fā)明實施方式的^f鼓粒測量方法可以用于諸如細(xì)胞、孩史生 物以及脂質(zhì)體的生物微粒，或諸如膠乳顆粒、凝膠顆粒以及工業(yè)顆 粒的合成顆粒的光學(xué)測量。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以根據(jù)設(shè)計要求和其它因 素進行各種變更、組合、子組合以及變化，只要它們在所附權(quán)利要 求書的范圍內(nèi)或其等同范圍內(nèi)。
2權(quán)利要求
1. 一種微粒測量方法，通過用光掃描樣品流體通道而對引入到以預(yù)定距離設(shè)置在基板上的多個樣品流體通道中的微粒進行光學(xué)測量，所述方法包括以下步驟用所述光順序照射與所述樣品流體通道一起設(shè)置的至少兩個或更多個參考區(qū)域；檢測由所述參考區(qū)域引起的在所述光中發(fā)生的光學(xué)特性的變化；以及控制所述光對所述樣品流體通道的發(fā)射時間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微粒測量方法，其中，所述控制是基于由所述參考區(qū)域之一引起的光學(xué) 特性變化的4企測時間和由另 一個所述參考區(qū)i^引起的光學(xué)特 性變化的檢測時間之間的時間差以及樣品流體通道的數(shù)量。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微粒測量方法，其中，所述參考區(qū)域是用于參考的微粒或/和用于參考的 熒光物質(zhì)被引入其中的參考流體通道，以及用于參考的熒光物質(zhì)引起的。
4. 一種用于孩i粒測量的基板，其中，多個樣品流體通道以預(yù)定距 離設(shè)置，并且通過用光掃描所述樣品流體通道而對引入到所述 樣品流體通道中的微粒進行光學(xué)測量，所述基板包括至少兩個或更多個參考區(qū)域，所述參考區(qū)域能夠引起照 射光的光學(xué)特性變化，并且所述參考區(qū)域是與所述樣品流體通道一起i殳置的。
5.一種孩i粒測量裝置，通過用光掃描才羊品流體通道而對引入到以 預(yù)定距離設(shè)置在基板上的多個樣品流體通道中的孩i粒進行光 學(xué)測量，所述裝置包括光照射部，用所述光順序照射與所述才羊品流體通道一起 設(shè)置的至少兩個或更多個參考區(qū)域；光檢測部，檢測由所述參考區(qū)域引起的在所述光中發(fā)生 的光學(xué)特'I"生的變4匕；以及光控制部，基于所述光才企測部的輸出，控制所述光對所 述才羊品流體通道的發(fā)射時間。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種能夠獲得高測量精度的微粒測量方法、用于測量的基板以及測量裝置。所述微粒測量方法通過用光掃描樣品流體通道而對引入到以預(yù)定距離設(shè)置在基板上的多個樣品流體通道中的微粒進行光學(xué)測量。該方法包括用光順序照射至少兩個或更多個與樣品流體通道一起設(shè)置的參考區(qū)域；檢測由參考區(qū)域引起的在光中發(fā)生的光學(xué)特性的變化；以及控制光對樣品流體通道的發(fā)射時間。
文檔編號G01N21/00GK101424612SQ20081017329
公開日2009年5月6日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者三宅和司, 今西慎吾, 古木基裕, 筱田昌孝, 鈴木明俊 申請人:索尼株式會社