專利名稱：：補體4檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于測定人體體液成份的試劑組合，特別是測定人體血清中的補體4(C4)的檢測試劑，可廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景補體是存在于血清及組織液中的一組具有酶樣活性的球蛋白。補體系統(tǒng)由20多種血漿蛋白和血細胞受體組成，約占血清總蛋白的10%,補體4(C4)屬于01球蛋白，分子量為20萬，由肝細胞合成。C4是補體經(jīng)典激活途徑的一個重要組分，被Cls激活后被裂解為"和U兩個片段，C4b激活期短，一部分與抗原抗體復(fù)合物及細胞表面結(jié)合，并與活化的Ga結(jié)合成G轉(zhuǎn)化酶，參與補體經(jīng)典激活途徑。人血清中C4濃度的增高見于風濕熱急性期、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、皮肌炎、心肌梗死、肝癌及各種類型的多關(guān)節(jié)炎等，人血清中C4濃度的降低見于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性活動性肝炎、多發(fā)性硬化性全腦炎、IgA腎病、胰腺癌晚期。已知測定補體4(C4)的方法有免疫擴散法、免疫電泳法、放射免疫分析法、這些方法都存在著操作繁瑣，需要特殊的設(shè)備，樣品需要預(yù)處理，不能進行批量樣本分析和不能直接上全自動生化分析儀檢測等缺點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述
背景技術(shù)：
的不足，提供一種G檢測試劑，其試劑應(yīng)有操作簡單、準確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強的特點，并且適用于各種類型的全自動生化分析儀。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是補體4檢測試劑，包括-a、一種使樣品中C4抗原位點充分暴露、從而有利于與抗C4抗體試劑充分結(jié)合的C4反應(yīng)劑，包括的成分及占反應(yīng)劑的重量百分比為防腐劑0.01-1、穩(wěn)定劑0.05-1、電解質(zhì)0.1-10、高分子加速劑2-8、表面活性劑0.1-10和反應(yīng)促進劑0.1-0.5，其余是5-200勵1/L緩沖劑；b、一種與人血清中的C4抗原有高度特異反應(yīng)性的抗C,抗體試劑，包括的成分及占抗C4抗體試劑的重量百分比為抗G抗體5-50、抗氧化劑0.001-0.5和穩(wěn)定劑0.05-20，還包括防腐劑0.01-1、電解質(zhì)0.1-10、高分子加速劑2-8、表面活性劑0.1-10，其余是5-200畫1/L緩沖劑;c、一種用來與樣品比較、進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準劑，包括的成分及占校準劑的重量百分比為防腐劑0.01-1、穩(wěn)定劑0.1-1、防霉劑0.05-0.1和適量C4抗原，其余是20—10O醒ol/L緩沖劑；所述的液體血清型恒定值校準劑分為五份，其中四份校準劑中加入的C4抗原含量分別是0.10-0.20g/L、0.25-0.35g/L、0.40-0.50g/L、0.52-0.70g/L，另l份a抗原不加。所述的四份校準劑中加入的C4抗原含量分別是0.15g/L、0.28g/L、0.40g/L和0.52g/L。所述的抗C4抗體來自羊、馬、鼠或兔等哺乳動物。所述的校準劑中的緩沖液選自PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、雙甘氨肽、二甘氨酸、硼酸鹽中的一種或多種，PH值為5-10。所述的C4反應(yīng)劑及抗C4抗體試劑中的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲垸緩沖液、PIPES緩沖液、HEPES緩沖液、TAPS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液中的一種或多種，PH值為5-10。所述的C4反應(yīng)劑及抗C4抗體試劑中的緩沖液優(yōu)選磷酸鹽，PH值為7.4-8.1。所述的穩(wěn)定劑選自乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、?；蛉搜灏椎鞍滓叶肌⒏事短谴?、海藻糖中的一種或多種。所述的表面活性劑選自非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑中的一種或多種。所述的表面活性劑優(yōu)選非離子表面活性劑。所述的電解質(zhì)可以是陰離子電解質(zhì)或陽離子電解質(zhì)。所述的電解質(zhì)優(yōu)選陽離子電解質(zhì)中的氯化鈉。所述的防腐劑選自疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、廣譜殺菌劑中的一種或多種。本發(fā)明的原理是利用抗原抗體反應(yīng)，加入反應(yīng)劑(即樣品稀釋液)，解除樣本中抗原周圍的電子層和水化層，使抗原位點充分暴露，然后加入抗C4抗體試劑；高特異反應(yīng)性的抗C4抗體試劑與樣本中相應(yīng)的C4抗原反應(yīng)，形成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的C4含量成正比，在規(guī)定波長下測定該不溶性抗原-抗體復(fù)合物的吸光度值，與己知恒定的校準劑比較，通過公式△Au<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>△As式中AAu為以空白管吸光度為對照的樣品管吸光度AAs為以空白管吸光度為對照的校準管吸光度Cs為校準劑中C4的濃度可計算出樣本中G的含量。本發(fā)明提供的試劑使用時測得的數(shù)據(jù)準確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強；并且樣本不用預(yù)稀釋，采用血清型液體恒定值校準液后不需每批更改參數(shù)，因而操作簡單，還適用于各種類型的全自動生化分析儀。具體實施方式本發(fā)明所提供的補體4檢測試劑包括以下成份a、一種使樣品中G抗原位點充分暴露，有利于與抗C4抗體試劑充分結(jié)合的G反應(yīng)劑，即樣品稀釋液，包括防腐劑0.0卜1、穩(wěn)定劑0.05-1、電解質(zhì)O.1-10、高分子加速劑2-8，還可包括表面活性劑O.1-10和反應(yīng)促進劑0.1-0.5，其余是5-200mmol/L緩沖劑；上述防腐劑、穩(wěn)定劑、電解質(zhì)、高分子加速劑、表面活性劑及反應(yīng)促進劑的含量均為在C4反應(yīng)劑中所占的重量百分比。b、一種與人血清中的C4抗原有高度特異反應(yīng)性的抗C4抗體試劑，包括抗G抗體5-50、抗氧化劑0.001-0.5、穩(wěn)定劑0.05-20，和防腐劑0.01-1、電解質(zhì)0.1—10、高分子加速劑2-8、表面活性劑。1-10，其余是5—200腦1/L緩沖劑；上述抗C4抗體、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、電解質(zhì)、高分子加速劑及表面活性劑的含量均為在抗C4抗體試劑中所占的重量百分比。作為雙試劑使用時，C4反應(yīng)劑和抗C4抗體試劑可以按3:1的體積比例進行組合搭配，也可以是4:1、5:1、或7:1。緩沖劑可以是磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、PIPES緩沖液、HEPES緩沖液、TAPS緩沖液、甘氨酸緩沖液或硼酸緩沖液等，本發(fā)明優(yōu)選磷酸鹽緩沖液；緩沖液的ra值為5-10，本發(fā)明優(yōu)選ra值為7.4-8.1，在此范圍內(nèi)反應(yīng)效果最好。防腐劑可以是疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚或廣譜殺菌劑，本發(fā)明從環(huán)保角度考慮，優(yōu)選廣譜殺菌劑。穩(wěn)定劑的可以是乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛(人)血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇或海藻糖。電解質(zhì)的可以是陰離子或陽離子，本發(fā)明優(yōu)選陽離子中的氯化鈉(NaCl)。加速劑可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000，本發(fā)明優(yōu)選聚乙二醇6000。表面活性劑可以是非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，本發(fā)明優(yōu)選非離子表面活性劑，包括Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，這些表面活性劑可以單獨使用，也可以兩種或兩種以上混合使用。反應(yīng)促進劑可以是溴化己二甲胺或聚凝胺?？笴4抗體可以是羊抗人C4抗血清、馬抗人C,抗血清、鼠抗人C4抗血清、兔抗人C4抗血清等，這些血清均可外購獲得，也可自制?？寡趸瘎┛梢允嵌』u基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羥基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。抗氧化劑可以先溶解在10-100ml丙二醇或乙醇中，然后加入到抗C4抗體試劑中。c、一種用來與樣品比較、進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準劑，包括、防腐劑0.01-1、穩(wěn)定劑0.1-1、防霉劑0.05-0.1和適量"抗原，其余是2O-100mmol/L緩沖劑；上述防腐劑、穩(wěn)定劑、防霉劑的含量均為在校準劑中所占的重量百分比。校準劑中C4濃度值有以下幾個選擇第l點為Og/L，可用生理鹽代替；第2點為0.10-0.20g/L，優(yōu)選0.15g/L;第3點0.25-0.35g/L，優(yōu)選0.28g/L;第4點0.40-0.50g/L，優(yōu)選O.40g/L;第5點0.52-0.70g/L;優(yōu)選0.52g/L。液體血清型CV恒定值校準劑共分為四份，按照上述不同的C4濃度值加入相應(yīng)的C,抗原。C4抗原可直接外購，或者自制。本發(fā)明的標準配置為每個上述雙試劑和/或單試劑配置有4瓶不同C4濃度的校準劑，另外1瓶校準劑的G濃度為零。校準劑中的緩沖劑可以是PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、P0PS0、Tricie、甘氨酸、雙甘氨肽、二甘氨酸、硼酸鹽等；防腐劑可以是疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、廣譜殺菌劑等，可以單獨使用或幾種混合使用；防霉劑可以是丙酸鈉、脫氧乙酸等，也可單獨使用或幾種混合使用；穩(wěn)定劑可以是乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、牛(人)血清白蛋白、丙三醇、單糖、多糖等，可以單獨使用或幾種混合使用。以上所述的所有生化原料和試劑均可外購獲得。根據(jù)本發(fā)明制備的產(chǎn)品在28'C避光條件下有效期為一年。以下實施例中的各成分含量，除標有明確的單位之夕卜，均為所占重量百分比。實施例一1、C,反應(yīng)劑(R1)磷酸鹽(緩沖劑)100咖ol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5NaCL(電解質(zhì))10PEG-6000(高分子加速劑)6疊氮鈉防腐劑)0.1溴化己二甲胺(反應(yīng)促進劑)0.3乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.052、抗C4抗體試劑(R2)磷酸鹽(緩沖劑)100mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性劑)5NaCL(電解質(zhì))10PEG-6000(髙分子加速劑)4疊氮鈉(防腐劑)0.4乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.05兔抗人G抗血清15丁基羥基茴香醚(抗氧化劑)0.01甘露糖醇(穩(wěn)定劑)53、液體血清型CV直定值校準劑CAPSO(緩沖劑)100,ol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)0.01乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.1牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)0.5.丙酸鈉(防霉劑)0.05液體血清型恒定值校準劑分為五份，將G抗原按照第1點為Og/L，第2點為0.15g/L;第3點為0.28g/L;第4點為0.40g/L;第5點為0.52g/L分別加入上述五份溶液中，然后用0.22um的濾膜抽濾除菌，放2-8匸保存。也可將試劑(Rl)與(R2)按3:l的體積比例混合，以作為單一試劑使用。實施例二1、d反應(yīng)劑(Rl)TAPS(緩沖劑)150mmol/L聚氧乙烯苯基醚(表面活性劑)0.1NaCL(電解質(zhì))0.1PEG-8000(高分子加速劑)4.5廣譜殺菌劑(防腐劑)0.01聚凝胺(反應(yīng)促進劑)0.1氯化鎂(穩(wěn)定劑)1.02、抗(；抗體試劑(R2)TAPS(緩沖劑)5mmol/L聚氧乙烯苯基醚(表面活性劑)0.1NaCL(電解質(zhì))0.1PEG-6000(高分子加速劑)7廣譜殺菌劑(防腐劑)0.01乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)2羊抗人C4抗血清50苯多酚(抗氧化劑)0.5氯化鎂(穩(wěn)定劑)13、液體血清型恒定值C4校準劑CAPS0(緩沖劑)20mraol/L苯酚(防腐劑)0.05丙三醇(穩(wěn)定劑)1牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1脫氧乙酸(防霉劑)0.1液體血清型恒定值校準劑分為五份，將C4抗原按照第1點為0g/L，第2點為0.15g/L;第3點為0.28g/L;第4點為0.40g/L;第5點為0.52g/L分別加入上述五份溶液中，然后用0.22iim的濾膜抽濾除菌，放2-8。C保存。也可將試劑(Rl)與(R2)按7:l的體積比例混合，以作為單一試劑使用。實施例三1、"反應(yīng)劑(R1)HEPES(緩沖劑)200mmol/L聚氧乙烯垸基苯基醚(表面活性劑)6.0NaCL(電解質(zhì))0.5PEG-8000(高分子加速劑)4.0對羥基苯甲酸乙酯(防腐劑)1.0聚凝胺(反應(yīng)促進劑)0.5海藻糖(穩(wěn)定劑)1.02、抗C4抗體試劑(R2)PIPES(緩沖劑)150mmol/LTheist(表面活性劑)10.0NaCL(電解質(zhì))0.5PEG-6000(高分子加速劑)2.0對羥基苯甲酸乙酯(防腐劑)1.0乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.05馬抗人C4抗血清35二丁基羥基甲苯(抗氧化劑)0.3丙三醇(穩(wěn)定劑)103、液體血清型恒定值C4校準劑甘氨酸(緩沖劑)100mmol/L廣譜殺菌劑(防腐劑)0.07乙二胺四乙酸二鈉(穩(wěn)定劑)0.5牛血清白蛋白(穩(wěn)定劑)1.0丙酸鈉(防霉劑)0.8液體血清型恒定值校準劑分為五份，將C4抗原按照第1點為Og/L，第2點為0.15g/L;第3點為0.28g/L;第4點為0.40g/L;第5點為0.52g/L分別加入上述五份溶液中，然后用0.22um的濾膜抽濾除菌，放2-8"C保存。也可將試劑(Rl)與(R2)按4:l的體積比例混合，以作為單一試劑使用。以下為測定樣品中C4含量的具體操作步驟，檢測儀器為具有340nm波長，37x:恒溫裝置的生化分析儀、雙試劑基本操作:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將測量出的結(jié)果通過下列公式進行計算:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>AAu為以空白管吸光度為對照的樣品管吸光度AAs為以空白管吸光度為對照的校準管吸光度Cs為校準劑中G的濃度便可計算出該樣本中的G含量。二、單試劑基本操作<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>混勻，37X:孵育5分鐘，在波長340nm處以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度值。將測量出的結(jié)果通過下列公式進行計算:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>式中AAu為以空白管吸光度為對照的樣品管吸光度AAS為以空白管吸光度為對照的校準管吸光度Cs為校準劑中C4的濃度便可計算出該樣本中的G含量。權(quán)利要求1、補體4檢測試劑，其特征在于該試劑包括a、一種使樣品中C4抗原位點充分暴露、從而有利于與抗C4抗體試劑充分結(jié)合的C4反應(yīng)劑，包括的成分及占反應(yīng)劑的重量百分比為防腐劑0.01-1、穩(wěn)定劑0.05-1、電解質(zhì)0.1-10、高分子加速劑2-8、表面活性劑0.1-10和反應(yīng)促進劑0.1-0.5，其余是5-200mmol/L緩沖劑；b、一種與人血清中的C4抗原有高度特異反應(yīng)性的抗C4抗體試劑，包括的成分及占抗C4抗體試劑的重量百分比為抗C4抗體5-50、抗氧化劑0.001-0.5和穩(wěn)定劑0.05-20，還包括防腐劑0.01-1、電解質(zhì)0.1-10、高分子加速劑2-8、表面活性劑0.1-10，其余是5-200mmol/L緩沖劑；c、一種用來與樣品比較、進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準劑，包括的成分及占校準劑的重量百分比為防腐劑0.01-1、穩(wěn)定劑0.1-1、防霉劑0.05-0.1和適量C4抗原，其余是20-100mmol/L緩沖劑；所述的液體血清型恒定值校準劑分為五份，其中四份校準劑中加入的C4抗原含量分別是0.10-0.20g/L、0.25-0.35g/L、0.40-0.50g/L、0.52-0.70g/L，另1份C4抗原不加。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的四份校準劑中加入的C4抗原含量分別是0.15g/L、0.28g/L、0.40g/L和0.52g/L。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的抗C4抗體來自羊、馬、鼠或兔等哺乳動物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的校準劑中的緩沖液選自PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、雙甘氨肽、二甘氨酸、硼酸鹽中的一種或多種，PH值為5-10。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的C4反應(yīng)劑及抗C4抗體試劑中的緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、PIPES緩沖液、HEPES緩沖液、TAPS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液中的一種或多種，PH值為5-10。所述的C4反應(yīng)劑及抗C4抗體試劑中的緩沖液優(yōu)選磷酸鹽，PH值為7.4-8.1。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的穩(wěn)定劑選自乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、?；蛉搜灏椎鞍滓叶?、甘露糖醇、海藻糖中的一種或多種。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的表面活性劑選自非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑中的一種或多種。8、根據(jù)權(quán)利要求3所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的電解質(zhì)可以是陰離子電解質(zhì)或陽離子電解質(zhì)。9、根據(jù)權(quán)利要求3或4或5或6或7或8所述的補體4檢測試劑，其特征在于所述的防腐劑選自疊氮鈉、乙基汞硫代硫酸鈉、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯、苯酚、廣譜殺菌劑中的一種或多種。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于測定人體體液成份的試劑組合。目的是提供一種C₄檢測試劑，該試劑應(yīng)有操作簡單、準確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強的特點，并且適用于各種類型的全自動生化分析儀。技術(shù)方案是補體4檢測試劑，包括a.一種使樣品中C₄抗原位點充分暴露、從而有利于與抗C₄抗體試劑充分結(jié)合的C₄反應(yīng)劑，b.一種與人血清中的C₄抗原有高度特異反應(yīng)性的抗C₄抗體試劑c、一種用來與樣品比較、進行結(jié)果計算的液體血清型恒定值校準劑。文檔編號G01N33/53GK101403748SQ20081016208公開日2009年4月8日申請日期2008年11月7日優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日發(fā)明者王賢理,凱蒙,蔡偉偉,蔡其浩申請人:王賢理