專利名稱：一種呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物殘留分析和免疫技術領域，涉及硝基呋喃類的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，特別涉及一種呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
背景技術：
呋喃唑酮(FZ)是一種硝基呋喃類的廣譜抗生素，價格低廉，殺菌效果好，可以有效治療多種由革蘭氏陽性和陰性菌引起的感染，并對某些原蟲、真菌有一定作用，從而被廣泛應用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并被作為治療藥物和飼料添加劑。但是，呋喃唑酮在體內(nèi)迅速代謝，代謝產(chǎn)物為3-氨基-2-唑酮(AOZ)，該分子與細胞膜蛋白結合成為結合態(tài)，可長期保持穩(wěn)定，從而延緩原藥在體內(nèi)的清除速度。而普通的食品加工方法(如燒烤、微波加工、烹調(diào)等)難以使蛋白結合態(tài)殘留物大量降解，食用含有該殘留物的肉制品會對人體產(chǎn)生一定的毒副作用。蛋白結合態(tài)的呋喃唑酮殘留物含有稱為3-氨基-2-唑酮(AOZ)的完整側鏈，在人胃的弱酸性條件下，側鏈可以從蛋白結合態(tài)的母體分子上解離下來，AOZ可以代謝成為A-羥乙基肼，該代謝物有致突變性和致癌性?；诖嗽颍瑲W盟已于1995年禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素，在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。2004年美國也公布了禁止在進口動物源性食品中使用呋喃唑酮。我國也于2002頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。因此，為了保障人民身體健康，保證進出口動物源性產(chǎn)品的質(zhì)量，需要尋求一種快速、靈敏、方便的呋喃唑酮殘留的檢測方法。
已經(jīng)報道的檢測呋喃唑酮殘留的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、色/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫法。HPLC和LC-MS都有高靈敏度、高特異性的特點，但是它們需要昂貴笨重難以攜帶的儀器,大量的有機溶劑,繁瑣的衍生化及費時的樣品處理過程。ELISA分析與其它方法相比，優(yōu)勢在于靈敏度高，特異性強，儀器設備要求不高，測定成本低，方法快速、簡便，試劑保存時間較長，自動化程度高，無放射性同位素污染，可現(xiàn)場操作進行快速大批量的檢測。故研究開發(fā)一種快速、靈敏、方便呋喃唑酮的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有直接的經(jīng)濟效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是改進現(xiàn)有檢測技術，提供一種檢測呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內(nèi)的酶標板和設在盒體內(nèi)試劑；其特征在于，所述酶標板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)與卵清蛋白偶聯(lián)制成；所述試劑包括呋喃唑酮的多克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗兔的抗體、呋喃唑酮系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。
其中所述酶標板優(yōu)選乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發(fā)光酶標板。
所述包被抗原濃度優(yōu)選5^g/mL。所述包被抗原制備具體由3-氨基-2-唑酮(AOZ)按照戊二醛法與活化的分子量范圍是6.7KDa 6.8KDa的卵清蛋白(cOVA)偶聯(lián)完成；其中涉及的反應方程式是:
OAOZ
O
OVA'
NH2 H
O
O N一N:
cOVA
AOZrcOVA
O
NH
OVA
上述呋喃唑酮的多克隆抗體的工作濃度優(yōu)選1:4000 。
所述呋喃唑酮的多克隆抗體是由呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑酮(AOZ)與對醛基苯甲酸反應得到的衍生物3- (4羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑垸酮(CPAOZ)與分子量范圍是6.7 KDa 6.8 KDa的牛血清蛋白偶合制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備得到；其涉及的反應方程式為
o<formula>formula see original document page 4</formula>上述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中所述辣根過氧化酶標記的羊抗兔的抗體的工作濃度優(yōu)選1:1000。所述呋喃唑酮系列標準溶液濃度分別為0.1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.8ng/mL 、 lng/mL、5ng/mL禾口 10ng/mL。
所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaCl 80g、 KH2P04 2.0g、 Na2HP04.12H20 29.0g、KC1 2.0g的水溶液。
所述濃縮洗滌液是含有體積分數(shù)0.05%吐溫-20的pH7.5、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
所述發(fā)光液是0.01M魯米諾與pH=8.8、 0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲垸溶液和體積比濃度為3/10000 11202的混合液。所述魯米諾為發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強劑。
本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結合起來，利用酶催化底物的化學發(fā)光反應檢測產(chǎn)物濃度。用對甲苯酚作為增強發(fā)光反應，其機理為自由基機理。
其中涉及的發(fā)光反應式為<formula>formula see original document page 5</formula>
本發(fā)明的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒最低檢測限可達0. 01ng/ml，線性檢測范圍在O. 1-10ng/ml，板內(nèi)變異系數(shù)在20%以內(nèi)，水樣品中回收率在78%-118%之間。本發(fā)明的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具備如下的特點
(1) 所制備的抗體對于呋喃唑酮有著很高的特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)對水樣品中呋喃唑酮的殘留進行專一的檢測和評定。
(2) 樣品前處理簡單，無需衍生化和過柱凈化。
(3) 結果靈敏度高，性能穩(wěn)定，比傳統(tǒng)的比色酶聯(lián)免疫檢測法，有著更高的靈敏度和更低的檢測下限。


圖1為本發(fā)明呋喃唑酮抗體的抑制率曲線。圖2為本發(fā)明呋喃唑酮抗體的工作曲線。
具體實施例方式
實施例1 3-氨基-2-唑酮(A0Z)的衍生化，免疫原、包被抗原、及抗體的制備
(1) A0Z的衍生化
A0Z的衍生物CPA0Z的制備方法如下
將75 mg(O. 5mrao1) 3 —羧基苯甲醛溶于5 mL甲醇中，得A液。將51 mgAOZ(O. 5■ol)溶于15 mL甲醇中，得B液。將A、 B液混合，攪拌，于65'C回流，通過薄層析法跟蹤，約9小時反應結束。旋轉蒸干后加入約20mL乙醇洗滌抽濾。得到A0Z的衍生物CPA0Z。
(2) 免疫原的制備
混合酸酐法制備呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物(A0Z)免疫原CPAOZ-cBSA步驟如下稱取50 mg (0.21 mmol) CPA0Z溶于10 mL無水DMF (無水N-N 二甲基甲酰胺)中攪拌溶解，加入77 wL (0.32 mmol)三正丁胺，冰浴反應10分鐘，然后逐滴加入132;/L(1.01腿ol)氯甲酸異丁酯，室溫反應l小時。稱取121mgcBSA (牛血清白蛋白)(1. 8 wmol)溶于20mL 50%DMF中，將活化完的CPA0Z逐滴加入溶解好的cBSA中，于0一4"C反應4小時。反應結束，先后用磷酸鹽緩沖液PBS (0.01 M pH 7.4)緩沖液和蒸餾水透析5天，期間更換透析液，以便較好除去未偶聯(lián)的小分子。透析后，反應液冷凍干
5燥。得到的白色絮狀物即為免疫原。
(3) 包被抗原的制備戊二醛法制備呋喃唑酮及其代謝產(chǎn)物(A0Z)包被抗原的歩驟如下
稱取117mg(2.6 wmol)卵清蛋白(cOVA)溶在10 mL硼砂緩沖液(0. 05 M pH 8. 5)中，攪拌溶解。稱取IO. 6 mg (0. 104mtno1) AOZ加入上述溶液中，然后量取0. 2mL 25%的戊二醛逐滴加入到上述溶液中于室溫反應4小時。先后用磷酸鹽緩沖液PBS(O. 01 MpH7.4)緩沖液和蒸餾水于0 — 4'C透析五天，每6小時更換一次透析液。將透析后的溶液凍干，得到的黃色固體粉末即為包被抗原。
(4) 多克隆抗體的制備合成的免疫原被用來免疫兩只雄性新西蘭大白兔。
首次免疫，用注射器對抽法將弗氏完全佐劑與免疫原按1: 1混合成油包水的乳濁液，每只兔注射0.5 mg免疫原，進行背部皮下多點注射(5-IO點)。首免兩周后第一次加強免疫用弗氏不完全佐劑與同樣量的抗原混合，進行第二次免疫，劑量、方法同首免。以后每隔兩周加強免疫一次，劑量減半。第五次不加佐劑只用生理鹽水進行末次免疫，注射七天后進行心臟采血。血液在4'C靜置過夜，次日10000 g/miri離心15分鐘得抗血清，得到多克隆抗體。
實施例2化學發(fā)光酶聯(lián)免疫吸附檢測法(CL-ELISA)的建立
(一) 抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣)酶標板縱向用100wL/孔的，濃度梯度按80. 0 # g/mL 、 40.0wg/mL、 20.0wg/mL、
10. 0#g/mL、 5. Owg/mL、 2. 5wg/mL、 1.25wg/mL、和O. 625 w g/mL的包被抗原溶液包被，4 °C放置過夜，用280;iL/孔的洗滌液洗板三次，再用250 w L/孔封閉液封閉，室溫
放置2. 5小時，洗滌三次；橫向加入100 ^L/孔，稀釋梯度按l: 100 、 1: 200 1:
51200的抗體溶液，室溫放置2小時，洗滌三次；加入100 ;iL/孔的l: IOOO的辣根過氧化酶標記的羊抗兔抗體，室溫放置l小時，洗滌三次；加入100/iL/孔的發(fā)光液，測定發(fā)光值。以發(fā)光值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進行特異性測定。
(二) 抗體靈敏度的測定
經(jīng)上述方陣法優(yōu)選，申請人選擇包被抗原濃度為5Ag/mL，抗體濃度為1:4000，進行抗體的靈敏度的測定
(1)包被過程用0. 05MpH9. 6的碳酸鹽緩沖液，將呋喃唑酮的包被抗原配成5//g/mL的溶液，每個聚苯乙烯板的反應孔中加100wL， 4'C過夜。
次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，280pL/孔，每次5分鐘，拍干。(此步簡稱洗滌，下同)。
(2) 封閉過程用250wL/孔的封閉液封閉上述已包被的酶標板，室溫孵育2. 5小時，洗滌。
(3) 競爭過程加稀釋抗體(1:2000) 50wL/孔與不同濃度的藥物50^L/孔于上述已封閉的反應孔中，室溫孵育2-4小時，洗滌。
(4) 酶標過程于各反應孔中加入新鮮稀釋辣根過氧化酶標記的羊抗兔的抗體(1:1000) 100;iL/孔，室溫孵育1. 5小時，洗滌。
6(5) 發(fā)光過程于各反應孔中加入100 wL/孔臨時配制的發(fā)光液，立即用化學發(fā)光免疫分析儀檢測。
(6) 計算過程檢測結果以抑制率計算，％抑制率=%B/Bo， B是加入競爭者的發(fā)光值，Bo是沒有競爭者的發(fā)光值。計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。
實施例3、本發(fā)明的檢測呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝
(1) 檢測呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組成
a、 包被有包被抗原(AOZ與卵清蛋白的偶聯(lián)物)的固相載體(乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發(fā)光酶標板)；
b、 呋喃唑酮抗體工作液(體積比濃度為1:4000);
c、 呋喃唑酮標準溶液6瓶，濃度分別為O. lng/mL、 0. 5ng/mL、 0. 8ng/mL 、 lng/mL、 5ng/mL和10ng/mL;
d、 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體工作液(工作濃度為1:1000);
e濃縮磷酸鹽緩沖溶液:NaCl 80g， KH2P04 2 . 0g， Na2HP04. 12H202 29. 0g， KC1 2. 0g溶于1000mL蒸餾水中
f 濃縮洗滌液上述濃縮磷酸鹽緩沖液加入體積比濃度為0.05y。的吐溫20(Tweeri20)。g、發(fā)光液0.01M魯米諾十0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲垸溶液(pH8. 8) +體積比濃度為3/10000的H202 。
(2) 酶標板的制備
將包被抗原溶于包被液中，配成5ng/mL的溶液，酶標板的每孔加入100iiL， 4'C孵育過夜，傾去包被液，每孔加入280uL洗滌液洗滌3次，拍干，然后加入250yL/孔的封閉液，37r孵育2h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用錫箔紙真空密封在4'C下保存。
實施例4、本發(fā)明的呋喃唑酮的酶聯(lián)免疫試劑盒的測定程序
(一) 試劑盒使用的注意事項
1) 使用之前將所有試劑溫度升至室溫，使用后立刻將所有試劑放回冰箱，4'C下保存。
2) 在使用過程中務必不能讓微孔干燥。
3) 按照推薦的洗板順序操作。
4) 使用中避免光線直射。
(二) 試劑的準備
1) 樣品稀釋液將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍后使用。
2) 洗滌液將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍后使用。
3) 發(fā)光液0. 01M魯米諾+0. 001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH8.8) + 3/10000 (體積比)H202 。
(三) 樣品前處理
(1) 水樣將水樣經(jīng)過0.45um的濾膜抽濾，然后加入體積比濃度為0.05%的吐溫-20。得到待測樣品。
(2) 牛奶將牛奶樣品在4'C、 10000轉/分鐘離心15分鐘，脫除脂肪層；將脫脂的牛奶用洗滌液稀釋成1:10，得到待測樣品。(3) 尿樣將尿樣品在4°C， 10000轉/分鐘離心15分鐘，去掉沉淀，將剩余的豬尿用洗滌液稀釋成1: 10。得到待測樣品。
(4) 動物組織取樣品與4 mL 0. 1 M的鹽酸混合，并且放在一起用超生波提取20 min，然后10000轉/分鐘離心15 tnin,取上清液用10 M NaOH調(diào)pH至9. 5±0. 5，旋渦振蕩5 min，然后10000轉/分鐘離心15 min。取上清液加5 mL異丁醇振蕩2 min，混合物室溫下靜止15 min，然后3000轉/分鐘離心10 min，分出有機相，水相再用異丁醇(每次10 mL)萃取兩次，三次萃取的有機相合并在一起，50-6(TC水浴減壓蒸干，殘余物用洗滌液重新溶解配成l: IO的溶液，得到待測樣品。
(四) 檢測步驟
1) 加樣向酶標板中加入50yL/孔的呋喃唑酮系列標準濃度溶液或樣品溶液，然后加入呋喃唑酮抗體工作液50yL/孔，室溫(25°C)恒溫孵育2. 5h;
2) 洗滌傾出孔中液體，向酶標板中加入280ixL/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
3) 加酶標二抗每孔加入酶標二抗工作液100uL，室溫恒溫孵育1.5h;
4) 洗滌傾出孔中液體，向酶標板中加入280y L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
5) 加發(fā)光液每孔加入發(fā)光液lOOuL;
6) 檢測用化學發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強度。
(五) 結果判斷
以所測得的標準品發(fā)光值，除以第一個標準(0標準)的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率(B/BO)，以抑制率為縱坐標，呋喃唑酮濃度的對數(shù)為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。
%抑制率=%標準品發(fā)光值(或樣品)/0標準品發(fā)光值。
實施例5試劑盒特異性的試驗
判定試劑盒特異性的指標是交叉率，將呋喃唑酮，呋喃他酮，呋喃西林，呋喃妥因，AOZ, NPAOZ,CPAOZ配成濃度梯度，用試劑盒測定各藥物的IC5。值，每個藥物4個復孔，
結果列于下表
競爭藥物
IC50 (ng/ml)
交叉率
呋喃唑酮
CPAOZ呋喃西林呋喃他酮呋喃妥因
實施例6試劑盒精密度和準確度試驗取0. 1， 0. 5， 0. 8， 1, 5, 10ppb的呋喃唑酮標樣，添加到水樣品中，來檢測呋喃唑酮回收率。每個濃度的批間變異系數(shù)都以不同的5天的5個重復數(shù)據(jù)進行計算，批內(nèi)變異系數(shù)以同一天的5次重復數(shù)據(jù)計算。根據(jù)制定的標準曲線的線性方程進行回收率的定量計算。
結果見下表
0. 150. 1011810150. 1035103
0.550, 391117850.416683
0.850. 77179650.80617101
151.131611351.0319103
554. 395138854. 566491
10510.424104510.1510102
從上述測定結果看，變異系數(shù)低于27%，回收率在78-113%之間。表明本試劑盒的回收率比較吻合理論值，有著可靠的準確度；而且變異系數(shù)較小，重復性好。
9
批內(nèi)回收率
檢測結果 變異 回收率系數(shù)
(ppb)(%) (%)
批間回收率
檢測結果變異 回收率系數(shù)
(ppb) (%) (%)
添加濃度(ppb)
檢測次數(shù)
檢測次數(shù)
權利要求
1、一種呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內(nèi)的酶標板和設在盒體內(nèi)試劑；其特征在于，所述酶標板的各孔包被有包被抗原，其中包被抗原由呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑酮與卵清蛋白偶聯(lián)制成；所述試劑包括呋喃唑酮的多克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗兔的抗體、呋喃唑酮系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。
2、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述酶標板為乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發(fā)光酶標板。
3、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述包被抗原濃度為5pg/mL。
4、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述卵清蛋白的分子量范圍是6.7KDa 6.8KDa。
5、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述呋喃唑酮的多克隆抗體是由呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑酮與對醛基苯甲酸反應得 到的衍生物3- (4羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑浣酮與分子量范圍是6.7 KDa 6.8 KDa 的牛血清蛋白偶合制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔制備得到；其中所述呋喃 唑酮的多克隆抗體的工作濃度為1:4000。
6、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述辣根過氧化酶標記的羊抗兔的抗體的工作濃度為1:1000。
7、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述呋喃唑酮系列標準溶液濃度分別為0.1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.8ng/mL 、 lng/mL、 5ng/mL 禾口 10ng/mL。
8、 根據(jù)權利要求l所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaCl 80g、 KH2P04 2.0g、 Na2HP04.12H20 29.0g、 KCl 2.0g的水溶液。
9、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述濃縮洗滌液是含有體積分數(shù)0.05%吐溫-20的pH7.5、 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。
10、 根據(jù)權利要求1所述呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所 述發(fā)光液是0.01M魯米諾與pH=8.8、 O.OOIM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基 甲垸溶液和體積比濃度為3/10000 H202的混合液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呋喃唑酮的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內(nèi)的酶標板和設在盒體內(nèi)試劑；其中所述酶標板的各孔包被有包被抗原，包被抗原由呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑酮與卵清蛋白偶聯(lián)制成；所述試劑包括呋喃唑酮的多克隆抗體、酶標二抗即辣根過氧化酶標記的羊抗兔的抗體、呋喃唑酮系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、發(fā)光液。本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高、重復性好、簡便快速、準確的特點，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數(shù)量級，有望在畜牧養(yǎng)殖用水、飼料和動物源性食品(如奶樣、動物組織樣、尿樣)的呋喃唑酮殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/545GK101464462SQ20081015814
公開日2009年6月24日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權日2008年10月24日
發(fā)明者鍇 丁, 偉 劉, 劉中秋, 尹偉偉, 李偉華, 郗日沫 申請人:山東大學