專利名稱：：特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用小量試樣、經(jīng)簡便的操作、高效地分離定量存在于特定部位的脂質(zhì)的方法和試劑。
背景技術(shù)：
：膽固醇、中性脂肪、磷脂，在血漿中結(jié)合于脫輔基蛋白質(zhì)，形成脂蛋白。脂蛋白根據(jù)物理性質(zhì)的不同，可分類為乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。LDL有時再細(xì)分為中密度脂蛋白(IDL)和LDL，而脂蛋白的分解產(chǎn)物(remnant)有時也作為一種脂蛋白處理。已知這些脂蛋白中LDL是引起動脈硬化的病因物質(zhì)，而HDL顯示抗動脈硬化作用。流行病學(xué)上，已知LDL中的脫輔基蛋白質(zhì)和膽固醇值與動脈硬化性疾病的發(fā)病頻度呈正相關(guān)，而HDL中的脫輔基蛋白質(zhì)和膽固醇值與動脈硬化性疾病的發(fā)病頻度呈負(fù)相關(guān)。目前為預(yù)防和診斷缺血性心臟病，要進(jìn)行LDL中和HDL中脫輔基蛋白質(zhì)和膽固醇的測定。作為LDL和HDL中脂質(zhì)的測定法，已知有例如經(jīng)超速離心分離使LDL和HDL與其他脫輔基蛋白質(zhì)分離后，供各脂質(zhì)測定的方法；經(jīng)電泳分離后進(jìn)行脂質(zhì)染色，測定其發(fā)色強(qiáng)度的方法。然而這些方法操作均復(fù)雜，不能處理大量的樣品，日常幾乎不用。脂蛋白中的脂質(zhì)測量最一般的測定法，是HDL中膽固醇的測定法。作為HDL膽固醇測定方法，用于臨床檢查領(lǐng)域的方法，有在樣品中加沉淀劑，使HDL以外的脂蛋白凝集，經(jīng)離心分離將其除去，測定僅含分離的HDL的上清液中的膽固醇的沉淀法。該法需要較多數(shù)量的樣品，整個分析工序不能完全自動化。近年也探討用酶分別定量HDL膽固醇的方法。例如在膽汁酸鹽和非離子性表面活性劑存在下進(jìn)行酶反應(yīng)的方法(日本特許公開公報昭63-126498號)，先使HDL以外的脫輔基蛋白質(zhì)凝集，僅使HDL中的膽固醇發(fā)生酶反應(yīng)后，在使酶失活的同時使凝聚物再溶解而測定吸光度的方法(日本特許公開公報平6-242110號)，組合使用使HDL以外的脂蛋白沉淀的沉淀試劑和膽固醇測定試劑，測定不沉淀的HDL中的膽固醇的方法(日本特許公報2600065號)，使用抗體的方法(日本特許公開公報平9-96637號)，使用糖化合物的方法(日本特許公開公報平7-301636號)，在第一反應(yīng)中，在特殊的表面活性劑的存在下使膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶作用于HDL以外的脂蛋白，在優(yōu)先作用于其中所含的膽固醇之后，在抑制對HDL以外的膽固醇的反應(yīng)的同時測定HDL中的膽固醇的方法(日本特許公開公報平9-299號)，使用特定的表面活性劑和膽固醇測定用酶試劑，在HDL中的膽固醇與膽固醇測定用酶試劑優(yōu)先反應(yīng)的時間內(nèi)進(jìn)行測定的方法(日本特許公開公報平11-56395號)，使膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶與特異地作用于HDL中的膽固醇的表面活性劑組合的方法(曰本特許公開公報2001-103998號)。在HDL膽固醇之后測定的LDL膽固醇測定法，通過大規(guī)模流行病學(xué)研究廣泛了解了臨床意義，但尚未開發(fā)出HDL膽固醇測定中的沉淀法這樣的方法，因此利用換算法(Freidewald法，以下簡稱F式法)。它求出根據(jù)超速離心分離法的結(jié)果設(shè)計的"推定值"。F式法從總膽固醇減去HDL膽固醇和VLDL膽固醇算出LDL膽固醇，使用中性脂肪濃度的1/5的值作為VLDL膽固醇。由于是從中性脂肪推定VLDL膽固醇，中性脂肪濃度超過400mg/dl的人和III型高脂血癥患者不能使用，而且因用餐使中性脂肪一過性地增加時，也有產(chǎn)生負(fù)面影響的問題。為此也開發(fā)了LDL膽固醇的酶測定法，有從含LDL膽固醇的樣品消除HDL膽固醇之后，測定殘存的LDL膽固醇的方法(日本特許再公開公報平8-828734號)，在糖化合物及/或蛋白增溶劑的存在下測定樣品中的LDL膽固醇的方法(日本特許再公開公報平8-829599號)。也有使用有特定結(jié)構(gòu)的表面活性劑的方法(日本特許公開公報平9-313200號)和在含胺的緩沖液中使用作用于LDL以外的表面活性劑的方法(日本特許公開公報10-38888號)。中性脂肪由于在血漿中多數(shù)存在于VLDL中，在用上述F式法推定LDL膽固醇時，被用于推定VLDL膽固醇值(VLDL膽固醇二TG/5)。中性脂肪的測定，一般使用以下方法在第一反應(yīng)中消耗游離甘油后，在第二反應(yīng)中用脂蛋白脂肪酶生成的游離甘油被磷酸化，再讓甘油磷酸氧化酶與其作用，使生成的過氧化氫與過氧化物酶、4-氨基安替比林、Trinder色素反應(yīng)使之發(fā)色的方法。游離甘油的消耗使用所謂的無色發(fā)色法，過氧化物酶及其底物之一和過氧化氫酶，以及它們的組合被廣泛使用。特定脂蛋白中的中性脂肪測定，已知以前使用超速離心分離法和凝集劑的分離法、使用凝膠過濾的分離法等，還有使用抑制特定脂蛋白以外的脂蛋白的反應(yīng)的表面活性劑和HLB15以上的表面活性劑的方法(國際專利公開號00/43537)。
發(fā)明內(nèi)容然而，以前使用的添加劑，在對特定脂蛋白的特異性以及對用于脂質(zhì)測定的酶活性的影響等方面不能充分滿足。而為了探索適合條件的添加劑，必須用超速離心分離裝置等昂貴的儀器，從新鮮的人血液中至少分離調(diào)制主要的脂蛋白HDL、LDL、VLDL，分別進(jìn)行評價、挑選，要化很多時間和經(jīng)費(fèi)。因此本發(fā)明的目的在于提供操作簡便、高效、適于各種自動分析裝置的特定部位中的指質(zhì)測定法。于是，本發(fā)明者進(jìn)行深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)至少在確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序中使用特定的表面活性劑，能特異地測定樣品中測定對象脂蛋白中的脂質(zhì)，而且這些表面活性劑具有共同的結(jié)構(gòu)特征。即本發(fā)明提供了特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定法，其特征在于，在特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定法中，至少在確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序中使用多環(huán)類聚氧化烯(polyoxyalkylene)衍生物。本發(fā)明還提供了特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定試劑，其特征在于，含有作用于特定脂蛋白的多環(huán)類聚氧化烯衍生物及目標(biāo)脂質(zhì)測定試劑。根據(jù)本發(fā)明，可從許多表面活性劑中選擇高效有用的表面活性劑，使用它進(jìn)行特定部位中脂質(zhì)的定量，不必進(jìn)行離心分離等前處理，操作簡便，而且高效。并且用小量試樣可經(jīng)簡便的操作進(jìn)行特異的測定，適用于各種分析方法，在臨床檢查領(lǐng)域也極為有用。圖1是表示本發(fā)明方法與以前的方法(使用CholestestNLDL)的相關(guān)性的圖。圖2是表示本發(fā)明方法與以前的方法(使用CholestestLDL)的相關(guān)性的圖。圖3是表示本發(fā)明方法與以前的方法(使用CholestestNHDL)的相關(guān)性的圖。圖4是表示本發(fā)明方法與以前的方法(使用CholestestLDL)的相關(guān)性的圖。圖5是表示本發(fā)明方法測定LDL中性脂肪的結(jié)果的圖。圖6是表示本發(fā)明方法測定HDL中性脂肪的結(jié)果的圖。圖7是表示與本發(fā)明的表面活性劑的HLB的相關(guān)系數(shù)的關(guān)系的圖。圖8是表示與本發(fā)明的表面活性劑的芳基數(shù)目的相關(guān)系數(shù)的關(guān)系的圖。具體實施例方式本發(fā)明所用的多環(huán)類聚氧化烯衍生物，可列舉多環(huán)類即有2個以上芳基的非離子性或陰離子性表面活性劑。該芳基可列舉苯基、萘基、烷基苯基、苯基垸基、苯基鏈烯基等。烷基苯基可列舉壬基苯基等dC2o烷基苯基。苯基烷基可列舉芐基等苯基-QC6垸基。苯基鏈烯基可列舉苯乙烯基等苯基C2C6烷基。這些芳基的數(shù)目較好是210，特別好是28。但縮合物的場合不受此限制。多環(huán)類基團(tuán)的較好例子是苯基上有15個，較好有1-3個選自苯基、萘基、烷基苯基、苯基垸基和苯乙烯基中的芳基取代的基。該表面活性劑的聚氧化烯基，可列舉聚氧化乙烯基、聚氧化乙烯聚氧丙烯基、聚氧丙烯基等，特別好是聚氧乙烯基。聚氧化烯加成摩爾數(shù)，隨測定對象的目標(biāo)脂質(zhì)、聚氧化烯基的種類而異，較好是2100,更好是510，特別好是1050。多環(huán)類聚氧化烯衍生物中，作為非離子性表面活性劑，較好是聚氧化烯醚類非離子性表面活性劑。并且非離子性表面活性劑的場合，其HLB較好是1218。作為陰離子性表面活性劑，較好是磺酸酯類、磷酸酯類或磺基琥珀酸酯類陰離子性表面活性劑。在目標(biāo)脂質(zhì)是膽固醇的場合，作為多環(huán)類聚氧化烯衍生物，是作用于特定的脂蛋白的HLB1218的非離子性表面活性劑，較好是使用對目標(biāo)脂質(zhì)的特異性不依賴于該表面活性劑的HLB的、專門受芳基數(shù)目支配的表面活性劑。在目標(biāo)脂質(zhì)是膽固醇的場合，作為多環(huán)類聚氧化烯衍生物，是作用于特定的脂蛋白的HLB1218的非離子性表面活性劑，較好是使用有2個以上的芳基的表面活性劑(但除外測定LDL中的膽固醇時測定特異性受緩沖液影響的HLB1315的表面活性劑)。此外，在目標(biāo)脂質(zhì)是HDL中的膽固醇的場合，作為多環(huán)類聚氧化烯衍生物，較好是使用優(yōu)先作用于HDL的HLB14.118、特別好是HLB14.318的非離子性表面活性劑。而在目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的膽固醇的場合，作為多環(huán)類聚氧化烯衍生物，較好是使用優(yōu)先作用于LDL以外的HLB15.118、特別好是HLB15.318的非離子性表面活性劑。而在目標(biāo)脂質(zhì)是特定脂蛋白中的中性脂肪的場合，作為多環(huán)類聚氧化烯衍生物，較好是使用優(yōu)先作用于LDL以外的HLB為1218的有2個以上芳基的非離子性表面活性劑。在目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的中性脂肪的場合，多環(huán)類聚氧化烯衍生物，較好是使用優(yōu)先作用于LDL以外的HLB為1215的有2個以上芳基的非離子性表面活性劑。這里的優(yōu)先作用，是指對特定脂蛋白的作用優(yōu)先于其他脂蛋白。特別好的聚氧化烯衍生物，可例舉有多個苯基的聚氧化烯多環(huán)苯基醚、聚氧化乙烯三芐基苯基醚、聚氧化烯多苯乙烯基苯基醚、聚氧化烯苯基苯酚醚、聚氧化烯多苯乙烯基苯基醚縮合物、聚氧化烯烷基苯基醚縮合物、聚氧化烯二苯乙烯化苯基醚、聚氧化烯苯乙烯化苯基醚、聚氧化烯烯丙基苯基醚、聚氧化烯多環(huán)苯基磺基琥珀酸酯等。這些聚氧化烯衍生物的市售品，有聚氧化烯多環(huán)苯基醚Pegnol005(HLB14.6，東邦化學(xué)工業(yè)公司制)；Newcol610(HLB13.8)、Newcol710(HLB13.6)、Newcol710F(HLB13.5)、Newcol714(HLB15.0)、Newcol714F(HLB14.4)、Newcol740(HLB17.9)、Newcol2600FB(HLB13.4)、Newcol2608F(HLB13.0)、Newcol2609(HLB13.0)、(以上日本乳化劑公司制)；聚氧化烯多苯乙烯基苯基醚PioninD-6112W(HLB13.0)、PkminD-6115X(HLB14.5)、PioninD-6115Z(HLB15.5)(以上，竹本油脂公司制)；聚氧化烯苯基苯酚醚SorpolT-15(HLB12.0)、SorpolT-20(HLB13.3)、SorpolT-26(HLB14.4)(以上東邦化學(xué)工業(yè)公司制)；聚氧化烯多苯乙烯基苯基醚縮合物PioninD-6320(HLB13.0)(竹本油脂公司制)；聚氧化烯烷基苯基醚縮合物PioninD-640(HLB14.3)(竹本油脂公司制)、R-1020(HLB18.0)(日光化學(xué)公司)；聚氧化烯二苯乙烯化苯基醚EmulgenA-90(HLB14.5)(花王公司制)；聚氧化烯苯乙烯化苯基醚Sanmol2SP-180(HLB14.5)(日華化學(xué)公司制)；TSP-16(HLB12.7)(青木油脂公司制)；聚氧化烯烯丙基苯基醚NewKalgenFS-12(HLB13)(竹本油脂公司制)；聚氧化烯多環(huán)苯基磺基琥珀酸酯AirrolT-1500(東邦化學(xué)工業(yè)公司制)等。這些多環(huán)類聚氧化烯衍生物可單獨、混合或與其他表面活性劑組合使用。本發(fā)明的多環(huán)類聚氧化烯衍生物可以是多個多環(huán)類聚氧化烯衍生物的混合物。例如有芐基的苯基醚，可以是單芐基、二芐基、三芐基的形態(tài)單獨或混合。有苯乙烯基的苯基醚，可以是單苯乙烯基、二苯乙烯基、三苯乙烯基的形態(tài)單獨或混合。各形態(tài)的混合比沒有特別限制，較好是單取代物120%、二取代物1040%、三取代物4090%，更好是單取代物215%、二取代物1040%，三取代物5090%。這些混合的市售品的例子有Pegnol005(大致的混合比的平均值，單取代物為7%,二取代物20%，三取代物73%)，其各成分的用量隨化合物而異，沒有特別限制，為0.0001質(zhì)量％10質(zhì)量％(以下簡稱％)，較好使用0.001%5%。本發(fā)明的多環(huán)類聚氧化烯衍生物可至少用于確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序。本發(fā)明是測定特定脂蛋白中的目標(biāo)脂質(zhì)的方法及其試劑，特定脂蛋白包括HDL、LDL、IDL、VLDL、乳糜微粒及其分解物。目標(biāo)脂質(zhì)包括膽固醇、中性脂肪、磷脂。因此測定對象可列舉HDL中的膽固醇、LDL中的膽固醇、VLDL中的膽固醇、IDL中的膽固醇、乳糜微粒中的膽固醇、它們的分解物中的膽固醇、HDL中的中性脂肪、LDL中的中性脂肪、VLDL中的中性脂肪、IDL中的中性脂肪、乳糜微粒中的中性脂肪、它們的分解物中的中性脂肪、HDL中的磷脂、LDL中的磷脂、VLDL中的磷脂、IDL中的磷脂、乳糜微粒中的磷脂、它們的分解物中的磷脂。它們的多數(shù)與動脈硬化性疾病有深刻的關(guān)聯(lián)，迫切要求分離定量。本發(fā)明的方法包括測定目標(biāo)脂質(zhì)的工序以及確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序，但確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序可與測定目標(biāo)脂質(zhì)的工序分開進(jìn)行，也可以同時進(jìn)行。而這些工序并不表示試劑等分階段使用，較好是在一個體系中進(jìn)行這些工序。作為確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序，可列舉對特定脂蛋白以外的脂蛋白進(jìn)行前處理的工序、用測定所用的酶與來自已預(yù)先經(jīng)前處理的反應(yīng)液中的目標(biāo)脂蛋白中的目標(biāo)脂質(zhì)反應(yīng)的工序等。測定目標(biāo)脂質(zhì)的工序，使用測定目標(biāo)脂質(zhì)的試劑，這些試劑包括從脂蛋白游離目標(biāo)脂質(zhì)的酶，例如酯分解酶。作為樣品，可使用包括人在內(nèi)的動物特別是哺乳類的體液、機(jī)體成分，較好是全血、血清、血漿、腦脊液、汗、尿、淚液、唾液、皮膚、粘膜，特別好是血清、血漿。樣品可直接使用，也可經(jīng)稀釋，或者經(jīng)過分離裝置分離，也可經(jīng)過干燥。特定脂蛋白以外的脂蛋白，例如在目標(biāo)脂質(zhì)是HDL中的脂質(zhì)的場合是HDL以外的脂蛋白，即LDL、VLDL、IDL、乳糜微粒和它們的分解物，在目標(biāo)脂蛋白是LDL的場合是HDL、VLDL、IDL、乳糜微粒以及它們的分解物。本發(fā)明的表面活性劑，與對特定脂蛋白具有高親和性的場合相反，有時對特定脂蛋白具有比其他脂蛋白低的親和性，可根據(jù)目標(biāo)脂質(zhì)分別使用。本發(fā)明中用于目標(biāo)脂質(zhì)測定的試劑酯分解酶，是用于測定構(gòu)成脂蛋白的脂質(zhì)的酶，例如膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶、磷脂脂肪酶等使酯鍵分解的酶都可以，它們可以來自微生物、來自動物、來自植物，也可以基因操作而制得。也不管有否經(jīng)化學(xué)改性。它們可以為溶液狀態(tài)或干燥狀態(tài)，可載持或結(jié)合于不溶性載體。這些酶根據(jù)需要，可組合使用用于目標(biāo)脂質(zhì)測定的其他酶、輔酶、發(fā)色劑。作為其他酶可使用膽固醇脫氫酶、膽固醇氧化酶、甘油磷酸化酶、甘油磷酸氧化酶、甘油磷酸脫氫酶、甘油脫氫酶、丙酮酸磷氧化酶、乳酸脫氫酶、膽堿氧化酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、心肌黃酶等。它們可來自微生物、來自動物、來自植物，也可經(jīng)基因操作制得。也不管有否經(jīng)化學(xué)改性。它們可以為溶液狀態(tài)或干燥狀態(tài)，可載體或結(jié)合于不溶性載體。作為輔酶可使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、硫代NAD、硫代NADP等，作為發(fā)色劑只要經(jīng)POD和心肌黃酶作用形成色素的都可以，可使用4-氨基安替比林、Trinder色素類、甲膘色素類等。這些酶可單獨或2種以上組合使用，其用量根據(jù)酶而不同，沒有特別限制，可為0.001單位1000單位/mL，較好使用0.1單位1000單位/mL。本發(fā)明中2個工序可分別實施，也可用同一試劑實施。本發(fā)明的含酶的試劑中可在不損害測定的特異性的條件下，為調(diào)節(jié)酶的作用而配合其他酶、鹽、用于調(diào)節(jié)pH的緩沖劑、表面活性劑類、防腐劑、白蛋白等蛋白質(zhì)類、抗生素、皂角苷、凝集素、聚陰離子類(磷鎢酸的鹽、硫酸葡聚糖、聚乙烯硫酸酯、硫酸化環(huán)糊精等)、2價金屬的鹽、聚乙二醇類、對磷脂等特定的脂蛋白具有親和性的試劑、防腐劑和作為過氧化氫酶抑制劑的疊氮化物的鹽。其中聚陰離子類或2價金屬的鹽是控制目標(biāo)脂質(zhì)測定試劑的反應(yīng)的成分，可與作用于特定脂蛋白的表面活性劑多環(huán)類聚氧化烯衍生物合同。作為緩沖劑，"GOOD"緩沖劑、磷酸、三羧甲基氨基甲垸(tris)、鄰苯二甲酸、檸檬酸鹽等通?？捎糜趐H59的范圍的緩沖液以及在此范圍內(nèi)有緩沖作用的緩沖劑都可以使用。其用量沒有特別限制，較好是0.005M2M。特別好是0.011M。本發(fā)明所用的多環(huán)類聚氧化烯衍生物，例如其反應(yīng)性并不依賴于緩沖液。反應(yīng)溫度，上述2個工序可相同也可不同，較好是本發(fā)明的試劑處于溶液狀態(tài)的溫度，例如104(TC。與多環(huán)類聚氧化烯衍生物合用的表面活性劑，例如在已用多環(huán)類聚氧化烯衍生物對目標(biāo)以外的脂蛋白中的脂質(zhì)進(jìn)行前處理后用于測定目標(biāo)脂質(zhì)的表面活性劑、在不損害測定的特異性的情況調(diào)節(jié)酶的作用、控制目標(biāo)脂質(zhì)測定試劑的反應(yīng)的表面活性劑等。它們不需要用于確定特異性的工序的上述多環(huán)類聚氧化烯衍生物那樣的特異性。作為這些表面活性劑，可使用沒有芳基的表面活性劑、只有l(wèi)個芳基的表面活性劑。它們可以是非離子性或離子性表面活性劑，作為非離子性的可使用沒有芳基的聚氧乙烯烷基醚類、聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物、有1個苯基的聚氧乙烯垸基苯基醚類。作為聚氧乙烯烷基醚類可使用Emulgen709(花王公司制)等，作為聚氧乙烯烷基苯基醚類可使用TritonX100(Sigma公司制)等，作為聚氧乙烯聚氧丙烯縮合物類可使用PluronicF-108(旭電化公司制)等。作為離子性的可使用膽汁酸類。這些表面活性劑的用量較好使其濃度成為0.00015%。特別好是成為0.0015%。添加這些脂質(zhì)測定用的酶試劑后，最終檢出目標(biāo)脂質(zhì)的方法沒有特別限制，例如可利用再將過氧化物酶的和心肌黃酶與色原組合進(jìn)行吸光度分析，直接檢出輔酶和過氧化氫的方法，測定金屬等的氧化還原的方法等。本發(fā)明的試劑，不僅以溶液狀態(tài)提供，也以干燥狀態(tài)提供、凝膠狀態(tài)。各制劑可以在玻璃瓶、塑料容器之外，以涂布、含浸于各種不溶性載體，如膠乳、玻璃、膠體等粒子、球狀載體、半導(dǎo)體和玻璃等平板狀、紙和硝化纖維素等膜狀載體、纖維狀載體的各種形式提供。本發(fā)明測定HDL或LDL膽固醇時，在多環(huán)類聚氧化烯衍生物的存在下，例如使膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶進(jìn)行反應(yīng)。也可在多環(huán)類聚氧化烯衍生物存在下對HDL或LDL以外的脂蛋白中的膽固醇進(jìn)行前處理，而在下一工序中使膽固醇氧化酶和膽固醇酯酶與殘留的HDL或LDL反應(yīng)。在測定HDL或LDL中性脂肪時，在第一工序中對游離甘油進(jìn)行前處理，在下一工序中使脂蛋白脂肪酶起作用，使一般的中性脂肪測定試劑起反應(yīng)而進(jìn)行測定。這些多環(huán)類聚氧化烯衍生物可用于第一工序也可用于第二工序。較好的實施方式，可列舉在使游離甘油不參與反應(yīng)的前處理工序和使脂蛋白脂肪酶作用于特定脂蛋白的工序組成的特定脂蛋白中的中性脂肪測定體系中，在多環(huán)類聚氧化烯衍生物存在下使脂蛋白脂肪酶與特定脂蛋白的中性脂肪反應(yīng)測定特定脂蛋白中的中性脂肪的方法；以及在使游離甘油不參與反應(yīng)的前處理工序和使脂蛋白脂肪酶作用于特定脂蛋白的工序組成的特定脂蛋白中的中性脂肪測定體系中，在HLB1215的多環(huán)類聚氧化烯衍生物存在下對游離甘油和特定脂蛋白以外的中性脂肪進(jìn)行前處理的特定脂蛋白中的中性脂肪測定方法。在樣品中游離甘油用其他途徑測定的場合或者樣品中的甘油與特定脂蛋白中的中性脂肪相比可以忽略的場合，游離甘油的前處理工序或其試劑也可以省略。這些基本的工序，作為血清中HDL膽固醇、LDL膽固醇、中性脂肪等的測定法己經(jīng)普及。實施例以下列舉實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不受它們限制。實施例中有時把多環(huán)類聚氧化烯衍生物稱為本發(fā)明的表面活性劑。實施例1(HDL膽固醇的測定)按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定HDL膽固醇，將其測定值與市售的HDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用15例人血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4pL中添加含0.01%4-氨基安替比林、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑240nL，于37。C保溫5分鐘后，加入含本發(fā)明的表面活性劑1%、1單位/mL膽固醇氧化酶(Oriental酵母)、1單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、1單位/mL過氧化物酶、0.04%N，N-二磺基丁基間甲苯胺、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑80(iL，于37。C在副波長700nm/主波長600nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的HDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定，求出與本發(fā)明的方法的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果示于表1。如表1所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法之間具有良好的相關(guān)性。作為對照，用有1個苯基的表面活性劑(TritonX100)代替本發(fā)明的表面活性劑同樣進(jìn)行測定。表1相關(guān)系數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例2(HDL膽固醇的測定)按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定HDL膽固醇，將其測定值與市售的HDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用15例人血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4)aL中加含0.01X4-氨基安替比林、45pM毛地黃皂苷(東京化成)、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑240pL，于37'C保溫5分鐘后，加入含本發(fā)明的表面活性劑1%、1單位/ml膽固醇氧化酶(Oriental酵母)、l單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、l單位/mL過氧化物酶、0.04重量%N，N-二磺基丁基間甲苯胺、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑80pL，于37。C在副波長700nm/主波長600nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的HDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定，求出與本發(fā)明的方法的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果示于表l。如表2所示，發(fā)明本發(fā)明的方法與以前的自動分析法之間具有良好的相關(guān)性。作為對照，用有1個苯基的表面活性劑(TritonX100)代替本發(fā)明的表面活性劑同樣進(jìn)行測定。表2相關(guān)系數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例3(HDL膽固醇的測定)按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定HDL膽固醇，將其測定值與市售的HDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用15例人血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4pL中加含0.01X4-氨基安替比林、0.04%磷鎢酸鈉(々〉,)、0.2%氯化鎂、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑240(iL，于37"C保溫5分鐘后，加入含本發(fā)明的表面活性劑1%、1單位/mL膽固醇氧化酶(Oriental酵母)、l單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、1單位/mL過氧化物酶、0.04重量％N,N-二磺基丁基間甲苯胺、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑80iaL，于37"C在副波長700nm/主波長600nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司帝U)作為市售的HDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定，求出與本發(fā)明的方法的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果示于表3。如表3所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法之間具有良好的相關(guān)性。作為對照用有1個苯基的表面活性劑(TritonX100)代替本發(fā)明的表面活性劑同樣進(jìn)行測定。表3相關(guān)系數(shù)比較表面活性劑相關(guān)系數(shù)表面活性劑相關(guān)系數(shù)表面活性劑相關(guān)系數(shù)SorpolT-150.90Newcol7140.87AirrolT15000.93SorpolT-200.84Newcol714F0.88TritonXI00(比較例)0.73實施例4(LDL膽固醇的測定)按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定LDL膽固醇，將其測定值與市售的LDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用15例人血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4pL中加由l單位/mL膽固醇氧化酶(東洋紡)、1單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、1單位/mL過氧化物酶、0.02%N,N-二磺基丁基間甲苯胺、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)、本發(fā)明的表面活性劑1%組成的第一試劑240pL，于37r保溫10分鐘后，加入含0.02%4-氨基安替比林、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)、1。/。Emulgen709的試劑80nL，于37。C在副波長660nm/主波長546nm測定吸光度的變化量。使用CholestestLDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的LDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定。結(jié)果示于表4。如表4所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法之間具有良好的相關(guān)性。作為對照用有1個苯基的表面活性劑(TritonX100)代替本發(fā)明的表面活性劑同樣進(jìn)行測定。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例5(HDL膽固醇和LDL膽固醇的測定)按本發(fā)明方法，用日立7170型自動分析裝置測定HDL膽固醇，將其測定值與市售的HDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用50例血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4)iL中添加含1單位/mL膽固醇氧化酶(東洋紡)、1單位/mL過氧化物酶、0.02%N,N-二磺基丁基間甲苯胺、0.2mM氟滅酸(〉^7)、50mMNaCl、50mMBis-Tris緩沖液(pH6)的試劑240|iL，于37。C保溫5分鐘后，加入含1單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、1%Pegnol005、0.02%4-氨基安替比林、50mMBis-Tris緩沖液(pH6)的試劑80fiL，于37'C在副波長700nm/主波長600nm測定度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的HDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定。其結(jié)果示于圖1。如圖l所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法具有良好的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)^0.999。接著，按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定LDL膽固醇，將其測定值與市售的LDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用50例血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4pL中添加由l單位/mL膽固醇氧化酶(旭化成)、l單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、l%Pegnol005(東邦化學(xué)工業(yè))、l單位/mL過氧化物酶、0.01%4-氨基安替比林、200mLNacl、50mMEMS緩沖液(pH6.5)組成的第一試劑240|uL，于37'C保溫5分鐘后，加入含0.04%N,N-二磺基丁基間甲苯胺、1%Emulgen709、50mMEMS緩沖液(pH6.5)的試劑80fiL，于37i:在副波長660nm/主波長546nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的LDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定。其結(jié)果示于圖2。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法具有良好的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r-0.999。以上結(jié)果表明本發(fā)明的表面活性劑具有可用于多種特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定的性質(zhì)。實施例6(HDL膽固醇和LDL膽固醇的測定)按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定HDL膽固醇，將其測定值與市售的HDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用20例人血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4|iL中添加含0.01%4—氨基安替比林、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)的試劑240|uL，于37。C保溫5分鐘后，加入含1單位/mL膽固醇氧化酶(Oriental酵母)、1單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、1%EmulgenA90、1單位/mL過氧化物酶、0.04%N,N-二磺基丁基間甲苯胺、100mMPEPES緩沖液(pH6.5)的試劑80pL，于37'C在副波長700nm/主波長600nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的HDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定。其結(jié)果示于圖3。如圖3所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法具有良好的相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r=0.952。接著，按本發(fā)明的方法，用日立7170型自動分析裝置測定LDL膽固醇，將其測定值與市售的LDL膽固醇測定試劑的測定值進(jìn)行比較。用20例人血清作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4pL中添加由1單位/mL膽固醇氧化酶(東洋紡)、1單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、1單位/mL過氧化物酶、0.02%N,N-二磺基丁基間甲苯胺、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)、1%EmulgenA90組成的第一試劑240pL，于37"C保溫IO分鐘后，加入含0.02%4-氨基安替比林、100mMPIPES緩沖液(pH6.5)、1%Emulgen709的試劑80nL，于37。C在副波長660nm/主波長546nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的HDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定。其結(jié)果示于圖4。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法具有良好的相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r-0.987。以上結(jié)果，表明本發(fā)明的表面活性劑具有可用于多種特定脂質(zhì)中的脂質(zhì)測定的性質(zhì)。實施例7(LDL膽固醇的測定)用各種緩沖液配制本發(fā)明方法的LDL膽固醇試劑，將其測定值進(jìn)行比較。測定用日立7170型自動分析裝置，用人血清15例作樣品。本發(fā)明的試劑，是在血清2.4juL中加由含1單位/mL膽固醇氧化酶(東洋紡)、1單位/mL膽固醇酯酶(旭化成)、l單位/mL過氧化物酶、0.02n/。N，N-二磺基丁基間甲苯胺、1%Pegnol005的100mM各種緩沖液組成的第一試劑240|aL，于37。C保溫5分鐘后，加入含0.02%4-氨基安替比林、l%Emulgen709、lOOmM各種緩沖液的試劑80pL，于37'C在副波長660nm/主波長546nm測定吸光度的變化量。使用CholestestNHDL(第一化學(xué)藥品公司制)作為市售的LDL膽固醇測定試劑，按所附的使用說明測定。其結(jié)果示于圖5。如圖5所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法與以前的自動分析法具有良好的相關(guān)關(guān)系。且不隨緩沖液的種類而變化。表5相關(guān)系數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例8(LDL中性脂肪的測定)以血清作樣品，經(jīng)超速離心分離法分離各脂蛋白部位，測定各部位中的總膽固醇，標(biāo)繪于圖5。再按本發(fā)明的方法，測定同一樣品的中性脂肪，標(biāo)繪于圖5。測定用日立7150型自動分析裝置進(jìn)行，總膽固醇測定使用匕'-7才一卜ST-CHO(第一化學(xué)藥品制)。本發(fā)明的LDL中性脂肪測定試劑，是在血清3pL中加由0.5單位/mL甘油激酶(旭化成)、3單位/mL甘油一3—磷酸氧化酶(東洋紡)、1.5單位/mL過化物酶(東洋紡)、1單位/mLLPL(東洋紡)、l%Pegnol005(東邦化學(xué)工業(yè))、3mM氯化鎂、0.5mM氯化鈣、2.5mMATP、0.02%乙基磺基丁基間甲苯胺、50mMMES緩沖液(pH6.3)組成的第一試劑30(HiL，于37。C保溫5分鐘后，加含0.01%4-氨基安替比林、1%Emulgen709、50mMMES緩沖液(pH6.3)的試劑100pL，于37。C在副波長700nm/主波長546nm測定吸光度的變化量。如圖5所示，本發(fā)明的方法能特異地測定LDL中的TG。實施例9(HDL中性脂肪的測定)以血清作樣品，經(jīng)超速離心分離法分離各脂蛋白部位，測定各部位中的總中性脂肪，標(biāo)繪于圖6。再按本發(fā)明的方法，測定同一樣品的中性脂肪，標(biāo)繪于圖6。測定用日立7170型自動分析裝置進(jìn)行，總中性脂肪測定使用匕°-7才一卜STG-N(第一化學(xué)藥品制)。本發(fā)明的HDL中性脂肪測定試劑，是在血清2.8pL中加由3單位/mL甘油激酶(旭化成)、3單位/mL甘油一3—磷酸氧化酶(東洋紡)、500單位/mL過氧化氫酶、3mM氯化鎂、3mMATP、2mM乙基磺基丁基間甲苯胺、100mMPIPES緩沖液(pH7)組成的第一試劑210pL，于37'C保溫5分鐘后，加入含500單位/mL脂肪酶(旭化成)、1單位/mL甘油單酯脂肪酶(旭化成)、10單位/mL過氧化物酶(東洋紡)、1.5%Pegnol005(東邦化學(xué)工業(yè))、0.04%4-氨基安替比林、lmM氯化鈣、100mMPIPES緩沖液(pH7)的試劑70iiiL，于37r在副波長700nm/主波長546nm測定吸光度的變化量。如圖6所示，本發(fā)明的方法能特異地測定HDL中的TG。實施例10(表面活性劑的HLB與相關(guān)系數(shù)的關(guān)系)本發(fā)明的表面活性劑，HLB值雖沒有特別重要的意義，但較好定為12以上。圖7顯示本發(fā)明的實施例1至實施例4所示的相關(guān)系數(shù)與本發(fā)明的表面活性劑的HLB的關(guān)系。圖7表示本發(fā)明的表面活性劑的HLB值與相關(guān)系數(shù)的關(guān)系未見一定的傾向。實施例11(表面活性劑的芳基數(shù)與相關(guān)系數(shù)的關(guān)系)本發(fā)明的表面活性劑，以具有2個以上的芳基作為特征之一(表6)。圖8表示本發(fā)明的實施例1至實施例4所示的相關(guān)系數(shù)與本發(fā)明的表面活性劑的芳基數(shù)目的關(guān)系。本發(fā)明的表面活性劑中的縮合物類不包括在內(nèi)。圖8表明表面活性劑的芳基數(shù)在2個以上的場合，比只有l(wèi)個的對照方法可得到良好的相關(guān)系數(shù)。本發(fā)明中計數(shù)芳基時，將具有作為共同的結(jié)構(gòu)特征的苯環(huán)作為代表，以苯基數(shù)目表示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>權(quán)利要求1.特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定法，其特征在于，在特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定法，至少在確定目標(biāo)脂質(zhì)的特異性的工序中使用多環(huán)類聚氧化烯衍生物，其中目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的膽固醇，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB15.1～18的非離子性表面活性劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定法，其特征在于，目標(biāo)脂質(zhì)是特定脂蛋白中的中性脂肪，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB1218的有2個以上的芳基的非離子性表面活性劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定法，其特征在于，目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的中性脂肪，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB1215的有2個以上的芳基的非離子性表面活性劑。4.特定脂蛋白中的中性脂肪測定方法，其特征在于，在由使游離甘油不參與反應(yīng)的前處理工序以及使脂蛋白脂肪酶作用于特定的脂蛋白的工序組成的特定脂蛋白中的中性脂肪測定體系中，在HLB1218的多環(huán)類聚氧化烯衍生物的存在下使脂蛋白脂肪酶和特定脂蛋白的中性脂肪反應(yīng)。5.特定脂蛋白中的中性脂肪測定方法，其特征在于，在由使游離甘油不參與反應(yīng)的前處理工序以及使脂蛋白脂肪酶作用于特定的脂蛋白的工序組成的特定脂蛋白中的中性脂肪測定體系中，在HLB1215的多環(huán)類聚氧化烯衍生物的存在下對游離甘油和特定脂蛋白以外的中性脂肪進(jìn)行前處理。6.特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定試劑，其特征在于，含有作用于特定脂蛋白的多環(huán)類聚氧化烯衍生物以及測定目標(biāo)脂質(zhì)的試劑，其中目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的膽固醇，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB15.118的非離子性表面活性劑。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測定試劑，其特征在于，目標(biāo)脂質(zhì)是特定的脂蛋白中的中性脂肪，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB1218的有2個以上的芳基的多環(huán)類聚氧化烯衍生物。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的測定試劑，其特征在于，目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的中性脂肪，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB1215的有2個以上的芳基的多環(huán)基聚氧化烯衍生物。全文摘要本發(fā)明涉及特定脂蛋白中的脂質(zhì)測定法，該測定法至少在確定目標(biāo)脂質(zhì)測定的特異性的工序中使用多環(huán)類聚氧化烯衍生物，其中目標(biāo)脂質(zhì)是LDL中的膽固醇，多環(huán)類聚氧化烯衍生物是優(yōu)先作用于LDL以外的HLB15.1～18的非離子性表面活性劑。文檔編號G01N33/92GK101373190SQ20081012513公開日2009年2月25日申請日期2003年11月26日優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日發(fā)明者中西一夫,山本光章,山本祥子,齋藤和典申請人:積水醫(yī)療株式會社