專利名稱：：珠體組、珠體組的制造方法和珠體組的使用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種在生化分析技術中特別有用的新型技術。更具體地，本發(fā)明涉及一種能夠通過新型方法進行各個珠體的識別的珠體組、珠體組的制造4支術和關于該珠體組的應用4支術。
背景技術：
：在生化技術等領域中，在某些情況下可以使用通常稱為"珠體(微珠)"的微粒載體。作為珠體最廣泛采用的生化應用，可列舉的有<吏用石圭石珠體或聚合物-朱體作為用于液相色語法的分離柱中的填充材料。通過使玉朱體的表面結合抗體、抗生物素蛋白等，還可以4吏其用于從生物樣品中捕獲、分離、精制目標物質等。例如，將其上已預先固定了對蛋白質中的特定氨基酸序列的抗體的珠體混合在細胞提取液中以捕獲目標蛋白質(或其復合體)的方法已成為用于分析蛋白質的相互作用的有用方法(ISOBE,Toshiaki和TAKAHASHI,Nobuhiro:"ExtraIssue-ExperimentalLecture2forPostgenomeAge,ProteomeAnalysisMethods,',p.166-174,2000，YodoshaCo.,Ltd.)。還已知有使用"磁性珠體，，的方法?？梢耘e出使用其上已固定有針對微生物抗原的抗體的磁性^朱體來通過抗原-抗體反應從樣品中捕獲和4企測目標樣t生物的例子(日本專利/>開第2006-017554和2001-004631號等)。還已經^是出了另一種方法，將》茲性珠體與樣史通道系統(tǒng)組合以進行細胞的分離(日本專利公開第2006-006166號)。又已經提出了另一種方法。根據該方法，允許在珠體表面進行物質間的相互作用(例如雜交)。然后，為了分析物質間的相互作用存在與否，向相互作用的位置施加電場，從而使珠體根據保持在珠體上的各物質電荷量(庫侖力)而遷移(日本專利z厶開第2003-302373號)。此外，分析4支術已經建立了實際應用，其中，4吏用了可以通過色一種一種地區(qū)分這些不同種的珠體的珠體組(最多由多達100種J朱體組成)("LUMINEX，，系統(tǒng)(注冊商標)；訪問http:〃hitachisoftjp/dnasis/luminex/microbead/beads.html)。然而，因為不同種珠體是根據發(fā)光強度的不同區(qū)分的，所以該方法需要精確地才全測發(fā)光。
發(fā)明內容如上所述，目前在生化領域對珠體的應用技術的開發(fā)仍在進行中，并期待其應用在未來進一步擴展。另一方面，對可以在各種生化分析技術的領域促成高速化、綜合分析的實現、效率的提高、精度的提高等新型技術有突出的需求。例如，主要的技術需求包括在DNA序列技術中的讀取時間的高速化、以及在藥物篩選技術中工作效率的提高。近年來，已報道了不編碼蛋白質的核糖核酸(RNA)存在并控制蛋白質的功能，并且已4是出某些DNA片#殳充當了風濕病發(fā)病的原因。因此，對用于細月包中作為片段存在的DNA或RNA序列的綜合和高精度檢測中的技術有突出的需求。希望4是供可以滿足上述^t術需求的新型生化分析:J支術。更具體地，本發(fā)明的主要需求是提供一種能夠顯著增加可一種一種地區(qū)分的各種珠體的數量的珠體識別技術，以及利用珠體識別技術的應用分析技術。在本發(fā)明的一個實施例中，因此提供了一種由多個珠體子組組成的珠體組，其中，每個子組中的珠體每個都設置有允許參與預定的對應反應或相互作用的物質固定在其上的表面，并且，在所述J朱體組中的所述各個J朱體分別i殳置有不同的物理要素，以《更所述J朱體組中的所述各個J朱體可以通過計算才幾分析在所述J朱體組中的所述各個珠體的拍攝圖像而被分成所述多個子組。珠體的外形、珠體核心部分的外形、標i只符等可以作為物理要素的例子。應注意，本文廣泛使用的術語"反應或相互作用"表示了化學結合(包括物質間的非共價結合、共價結合和氫鍵結合)和離解，并且例如，廣泛地包括諸如作為核酸(核苷酸)之間的互補結合，以及大分子-大分子、大分子-小分子和小分子-小分子的結合或離解的雜交的特定結合或離解。只要使用通過計算機分析拍攝到的珠體圖像的方法，就不限定3朱體的區(qū)別。例力o，J朱體組可以由在二維或三維形狀不同的多個J朱體子組構成，并且通過計算機分析拍攝到的珠體圖像，可以基于每個多朱體形狀的不同將^朱體分成多個組。作為另一個實例，可以將在珠體組中的各個J朱體分別設計為包括核心部分和作為核心部分的外層的外殼部分，并JU亥心部分分別i殳置有隨子組的不同而不同的體組中的各個珠體的拍攝圖像的信息分析核心部分的形狀而被分成多個子組。作為另一個實例，可將多個J朱體子組:沒置有隨子組的不同而不同的標識符，并且標識符的不同可以通過計算沖幾分析J朱體組中的各個珠體的拍攝圖像而區(qū)分。在本發(fā)明的另一個實施例中，還提供了一種用于構成根據權利要求1所述的珠體組的珠體的制造方法，包括以下步驟將在多個子組中的珠體分別"i殳置為具有不同的物理要素，以<更可以通過計算機分析珠體的拍攝圖像將珠體組中的珠體區(qū)分成多個子組，其中，珠體屬于多個子組之一；以及分別對子組中的所得珠體實施表面處理，以便預定的對應物質能夠分別固定在子組中的珠體上。珠體的外形、》朱體核心部分的外形、標識符等可以作為物理要素的例子。在本發(fā)明的又一個實施例中，還4是供了一種用于確定目標核酸鏈的堿基序列的方法，包括至少要使用上述珠體組；以及一種用于才全測生物大分子參與的反應或相互作用(例如雜交)的方法，包括至少要使用上述珠體組。根據本發(fā)明的珠體組通?？梢杂煽梢园醋咏M的不同而逐個區(qū)分的大量J朱體子組構成，因此，可以#:用作能夠在各種分析才支術中獲得高速化、綜合分析的實現、效率的提高、精度的提高等的有用工具?？蓪⒈景l(fā)明廣泛使用在例如堿基序列確定(序列測定)技術；為各種目的實踐的雜交檢測技術，包括基因表達分析等；藥物篩選技術；涉及DNA、RNA等的序列分布和定量的測量技術；探針設計技術；蛋白質組分析方法；等等。圖1是示出了根據本發(fā)明的珠體組的第一實施例的示圖2是示出了根據本發(fā)明的珠體組的第二實施例的示圖3是描述了才艮據本發(fā)明的珠體組的第三實施例(第二實施例的{奮改)的示圖4是示出了用于說明圖1的珠體組的制造方法的一個實例的i兌明性處理流程的示圖5是示出了用于在制造方法中的光掩膜的一個實例的平面圖6A圖6C是示出了其中還配置了光屏蔽部分的光掩膜中的透光區(qū)i或的實例的平面反應的和無念圖8是示出了能夠執(zhí)行珠體形狀的測量和熒光強度的測量的系統(tǒng)構造的一個實例的示意性框圖9是關于J朱體形狀的識別和評估的流程圖10是關于珠體形狀的識別和評估的程序的概念圖11是柱狀表示分別對應于每個核心部分的形狀都不同的總共七種珠體所測量的熒光強度的示圖；圖12裊示出了用千通過估用固宏A才良;te;^發(fā)曰；體組上的堿基序列來確定目標DNA4氐聚物的序列的相克念的示意圖；以及珠體組來檢測雜交的概念的示意圖。具體實施例方式下文中，將參考附圖來描述本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例。(1)珠體圖1是示出了根據本發(fā)明的珠體組的第一實施例的示圖，具體地，該J朱體組是"由多個J朱體子組組成的珠體組，其中，在每個子組中的珠體都設置有表面，能夠在該表面上固定參與預定的對應反應或相互作用的物質，并且在珠體組中的各個珠體分別設置有不同組中的各個珠體的拍攝圖像而被分成多個子組"。圖2是示出了珠體組的第二實施例的示圖，以及圖3是示出了珠體組的第三實施例的示圖。應注意，在這些圖中所示的第一、第二和第三實施例都是通過實例簡單示出了才艮據本發(fā)明的J朱體組的一些典型實施例并且本發(fā)明并不局限于此?，F在將描述圖1所示的5朱體組1。該J朱體組1是由多種5朱體構成，多種珠體的立體形狀不同，從而可以基于由計算機進行的圖像處理使這些珠體相互區(qū)分。例如，如在圖1中由數l共同表示，珠體組1由立方體(正六面體)J朱體11和三角4偉(正四面體)J朱體12構成。應注意，盡管為了更容易理解本實施例示出了這兩種珠體，4旦是對于J朱體種類的lt量并沒有明確的限制，并且可以才艮據目的和需要來合理設置。作為^朱體組1的j奮改，J朱體組可以由具有不同二維形狀(例如圓形、正方形、三角形等)的多種J朱體構成，從而多種珠體可以基于計算機進行的圖像處理而相互區(qū)分(圖中未示出)。還可以設計成對J朱體組1或修改應用預定標識符。應用這些標識符以通過向計算機進行的圖像處理提交由CCD相機等拍攝的圖像來區(qū)分珠體的種類。另一方面，對標識符的具體種類并沒有明確的限制?？梢詠V人凄丈字、數列、字符、字符串、圖形、圖樣、條形碼、附加形狀部分和這些標識符中的兩種或兩種以上的組合來合理地選4奪和采用這些標識符。至于應用了這些標識符的區(qū)域，只要可以根據CCD照相機等拍攝的圖像來區(qū)分標識符，就不作特定限制。例如，這些區(qū)域可以是J朱體的表面，或者可以是珠體的內側部分。將構成珠體組1的珠體設計成使它們的表面都能夠固定參與預定的對應反應或相互作用的物質。如需要，可以向珠體11、12的表面施加涂覆處理或化學處理以分別固定所需物質。例如，J朱體可以被處理成使所需物質通過諸如二硫結合、酰胺結合、卵白素-生物素結合等的化學結合分別固定到珠體的表面上。接下來，從如圖2中的放大圖所示的珠體可以觀察到(參看圖2中虛線箭頭前部所示的相無圖)，在圖2所示的第二實施例的珠體組2中的珠體通常設置有核心部分2a(構成每個珠體的核心結構部分)和外殼部分2b(凈皮形成為包裹核心部分2a的外圍)。為了可以將珠體組2的各個J朱體分成多個子組，核心部分2a以多種形狀形成。例如，如正一見圖所示的形狀，除了圓形之外，還以多邊形(例如三角形、T者力口正方形和矩形的四邊形、五邊形和六邊形和星形)形成了核心部分2a。以圓形作為實例，可以假定每個核心部分2a的尺寸為例如直4至約50nm。作為每個核心部分2a的形狀，只要能夠區(qū)分核心部分的圖像，就可以視需要來選擇二維形狀、三維形狀等。另外，也可以4艮據目的或應用來—見需要確定每個核心部分2a的尺寸。外殼部分2b用作每個5朱體的表面層部分，并且是通過由涂覆處理(將在隨后的下文中描述)向對應的核心部分2a涂覆合成樹脂(例如，聚苯乙烯)形成的部分。對外殼部分2b的外形并沒有明確的限制，但是作為實例，它可以是球形或非常接近于球形的形狀。更理想地，構成珠體組2的各個珠體可以具有相同的表面積。圖2通過實例示出了其中的核心部分2a的正-見圖形狀為圓形的珠體子組21、其中的核心部分2a的正視圖形狀為正方形的珠體子組22、以及其中的核心部分2a的正視圖形狀為三角形的珠體子組23。通過處理由CCD相機等拍攝的珠體圖像、以及通過計算機分析其信息，J朱體組2的各個J朱體可以被分成^朱體子組21、J朱體子組22和珠體子組23之一。應注意，也可以根據目的視需要來設置每個核心部分2a的形習犬不同的一個或多個額外5朱體子《且(未示出)。接下來參考圖3，將描述根據本發(fā)明的第三實施例(即，第二實施例的修改)的珠體組20。如圖3所示，J朱體組20的特征在于已應用預定標識符。應用這些標識符以通過佳^寺由CCD相沖幾等拍攝的圖像經過由計算機進行的信息處理來逐個子組地區(qū)別珠體。關于特定種類的標識符，并不局限于如圖3所示的這樣單個凄丈字，而可以合理地采用數列、字符、字符串、圖形、圖樣、條形碼、附加形^!犬部分或這些標識符中的兩種或兩種以上的組合。應注意，在圖3中，作為簡單實例示出應用了標識符(數)l的珠體子組201、應用了另一標識符(數)2的珠體子組202和應用了另外一標識符(數)3的3朱體子組203。關于應用了標識符的區(qū)域，只要可以從由CCD相機等拍攝的圖像中識別出標識符，就不作任何明確限制。當珠體具有核心結構時，可以〗奪標識符應用于J朱體核心結構部分的表面(在該情況下，他們的形狀可以相同)。也可以不考慮珠體是否具有核心結構，^|尋標識符應用于珠體的表面。(2)根據本發(fā)明的珠體組的制造方法首先，描述構成上述珠體組1(見圖1)的珠體的示例性制造過禾呈?？梢圆捎靡韵路椒?，即，通過預定的.光力口工曝光系纟充(photofabricationexposuresystem)來三維圖才羊4匕曝光光固4匕樹脂，將圖樣化曝光的樹脂浸入預定的有才幾溶劑中以洗掉在未固化部分的樹脂，并且僅保留曝光并固化的部分，以顯影三維圖樣并因此制造所需的三維結構。可以將三維圖樣轉換成繪圖數據(其三維CAD數據已被切成薄的橫截面)，并且使用由對應于切片數據(slicedata)的紫外線波長的LED或LD構成的光源，然后通過打開和關閉DMD(數字樹二鏡器件)的各個像素形成對應于切片數據的二維圖樣。通過物鏡，使二維圖樣的紫外光照射在已涂覆光固化樹脂的基板上，從而圖樣化曝光該光固化樹脂。在完成特定切片層的曝光之后，涂覆對應于下一層的光固化樹脂作為疊層，然后使其暴露給對應于下一層的圖樣的uv光。通過重復這些步驟，可以執(zhí)行對應于立體快速原型的三維圖樣曝光。當浸入所得的光固化樹脂的圖樣化曝光塊時，在曝光處理之后，在充滿有可引起未曝光和未固化樹脂部分分解的有機溶液的電解槽中，可以獲得所需的三維結構。由于DMD的像素尺寸小至約15pm，所以使用具有大約10的放大率以及相當高的數值孔徑的物鏡可以執(zhí)行微米(pm)級別的圖樣曝光，從而可以用微米級別的精度來實現立體快速原型制作。應注意，可使用LCOS(珪基液晶)代替DMD。描述了采用通過使用SXRD(硅晶體反射顯示器)的LCOS的實例，SXRD是一種反射型液晶器件，通過外加電壓來控制形成在硅鏡表面上的每個液晶的取向，從而改變其反射率。由于其像素尺寸小至約79所以可以期待得到兩倍于從DMD可得到的解析度。作為每個珠體的構造，可以釆用邊長50nm的立方體(正六面體)或三角錐(正四面體)。另外，在平面上以矩陣圖樣排列了多達100個J朱體的在每個面上形成有標識符(例如，條形碼形式的凸面)的構造的珠體。即使排列相同類型的100個珠體，它們也完全可以;故配置在1平方毫米之內。通過上述光加工處理可以制造具有不同于立方體和正四面體的各種立體形狀并在其表面上攜帶不同條形碼的多種珠體。在通過上述光加工方法制造^朱體之后，通過無電鍍處理在珠體的表面上以約幾十納米的厚度涂覆諸如Ni(鎳)的金屬，從而可以強烈反射可見光。在無電鍍方法中，例如，將珠體放在溶解了氨基磺酸鎳、二氯化4巴等的水溶液中，并且通過使用把膠體，使Ni沉積在珠體的表面上。接下來，4吏鍍鎳J朱體分散在例如聚苯乙烯/丙酮溶液中，并且通過注射向強攪拌下的己烷中逐滴添加分散液，從而用聚苯乙烯來涂覆珠體表面。通過過濾來聚集所得的沉淀物，然后通過使用超聲波使其再分散到曱醇/水溶液中。通過離心分離，聚集成下層。聚集層用曱醇清洗后干燥。使干燥后的珠體在培養(yǎng)皿中展薄，才妄下來進4亍臭氧化以在玉朱體表面上形成羧基。向珠體中添加EDC(1，2-二氯乙烷；100mg/mL)和NHS(N-羥基丁二酰亞胺；100mg/mL)的混合溶液。在振蕩作用下，混合溶液和珠體在室溫下反應30分鐘。反應產物通過過濾聚集起來并用水清洗，然后與例如合成低聚物(具有氨基末端并且具有特定的DNA堿基序列)/NaCl(1M)溶液進行反應。所得的反應產物通過過濾聚集起來后干燥，從而獲得用預期檢測探針表面修飾后的目標珠體。接下來，參考圖4和5描述用于制造構成J朱體組2的珠體的方法的一個實例。通過向基板(其上已通過使用由照相平板印刷術圖樣化的印才莫來圖樣化催化劑)實施無電鍍可以制造在多朱體組2中的每個不同形狀的核心部分2a(參看圖2)。以下將更具體地描述以上的制造方法。圖4是用于制造根據本發(fā)明的珠體組1的方法的概念處理流程圖。如圖4所示，首先在基板(例如，玻璃制成的基板)5上層壓保護膜3和干膜抗蝕劑4(例如，"SUNFORT，，，AsahiKaseiCorporation的產品)(參看圖4中的步驟PJ。在保護膜3上結合光掩膜6(例如，玻璃掩膜，其上圖樣化有圓形、三角形、正方形、五邊形、六邊形、星形或矩形)之后，4丸4亍UV曝光(參看圖4中的步驟P2)?？蛇x地，代替在基4反5上的干"莫抗蝕劑4,能夠i殳計成以預定形4犬形成的沖亥心部分可以通過4非列可用酸或石咸除去的層(由Si02或MgO構成的犧牲層)而從基板5上剝去。圖5示出了在當形成圓形核心部分使所采用的光掩膜6上的光屏蔽圖樣(或透光圖樣)的一個實例。在圖5中，各個圓61是透光區(qū)域，而除了這些圓之外的區(qū)域62表示光屏蔽區(qū)域。每個圓61的尺寸可以祐:i殳計成具有例如50jam的直徑。通過設計在光掩膜6上的每個透光區(qū)域(圓61)的內側部分設置由單個數字、數列、字符、字符串、圖形、圖樣(例如光點圖樣)、條形碼或這些標識符之中的兩個或兩個以上的組合形成的光屏蔽部分(非曝光部分)，能夠制造具有對應于光屏蔽部分的數字、字符等的核心部分。圖6A~圖6C是示出了排列在光掩膜6上的每個透光區(qū)域(圓61)和設置有光屏蔽部分的實例的示圖。圖6A示出了排列單個彩:字形式的光屏蔽部分的實例，圖6B示出了排列光圖樣形式的光屏蔽部分的另一實例，而圖6C示出了排列矩形圖形(或條形碼)形式的光屏蔽部分的又一實例。現在，再次參考圖4進行描述。在上述紫外曝光步驟P2之后，剝去保護膜3和光掩膜6(參看圖4中的步驟P3),隨后，用弱堿性的水溶液除去未曝光的部分，接下來進行干燥(參看圖4中的步驟PJ。接下來，在純凈水(20mL)中制備二氯化把(5mg)和鹽酸(O.lmL)的水溶液、然后涂覆在所形成圖沖羊的凸面上并進4亍干燥(見圖4中的步驟Ps)。作為用于形成催化劑圖樣7的方法，可以通過光在基板上固定例如用于無電鍍的光壽丈催化劑(參考文獻"TechnicalReport2000"，p52，SumitomoOsakaCementCo.,Ltd.)或4巴月交體。接下來，將在凸面上轉移了催化劑圖樣的基板5在被控制在85°C(參看圖4中的步驟P6)的"BF-Ni溶液"(商標，KhozaiCorporation的產品)中4ft入10分4中，用水清:冼，然后用強堿清;先(參看圖4中的步驟P7)。在通過使用玻璃濾器聚集剝去后的核心部分8之后，將它們與玻璃濾器一起在真空中干燥以獲得珠體的核心部分8(參看圖4中的步驟Ps)。應注意，這樣獲得的核心部分8(對應于圖2中的符號2a)被設計成具有例如約2jum的厚度。將通過上述步驟PiPs獲得的核心部分8添加到丙酮中1wt%的聚苯乙烯(分子量100,000)溶液中，并JU吏其徹底地分散在該溶液。在烈攪拌下的己烷中，從注射器中逐滴加入該分散液，以使核心部分8的表面涂覆有苯乙烯，乂人而形成了外殼部分(對應于圖2中的符號2b)。通過過濾聚集所得的沉淀物，然后通過使用超聲波使其再分散到曱醇/水溶液中。通過離心分離聚集下層。聚集層用甲醇清洗后干燥。(3)使用珠體的實例以具有通過上述制造方法獲得的核心部分8作為核心的構造的千燥珠體作為實例，下文中將基于實例來描述干燥珠體的一個應用實例(序列測定)。將獲得的干燥珠體在培養(yǎng)皿中展薄，并且通過在臭氧化處理系統(tǒng)("PDC200"，商標；由YamatoK.K.制造)中的臭氧化，在玉朱體的表面形成羧基。然后向具有分別以100mg/mL混合的EDC(1，2-二氯乙烷)和NHS(N-羥基丁二酰亞胺)的溶液中添加珠體。在室溫下的振蕩下，它們進行30分鐘的反應。反應產物通過過濾聚集起來并用水清洗，然后與具有氨基末端(作為引物)/NaCl(1M)溶液的DNA低聚物進行反應。所得的反應產物通過過濾聚集起來然后被干燥，從而提供目標珠體。作為珠體的核心部分，總共設置了七個子組，例如，包括作為如正—見圖所示的圖形的圓形、三角形、正方形、五邊形、六邊形、星形和矩形。在各個子組中的珠體的表面上，通過酰胺結合分別固定下表1所示的堿基序列的7-mer的DNA低聚物(作為引物)。在該實例中，還預先才是供了已知序列的25-mer的DNA低聚物(序列編號8:tccgataacagtgatcagcatggct)作為目標。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>在上述7個珠體子組每個都4皮測量出多達1mg并被混合到一起之后，添力口用"CYTM3"(焚光染泮+，AmershamBiosciencesLimited的產品)示蹤的ddNTP、"IPROOFDNAPOLYMERASE"(商標，Bio-RadLaboratories,Inc.的產品)以及目標DNA^f氐聚物，然后添加"IPROOFHFBUFFER"(商標，Bio-RadLaboratories,Inc.的產品)，以分別以200mM和1j^M來調節(jié)ddNTP和目標DNA低聚物的濃度。在將所得的混合溶液在98。C加熱10秒鐘之后，將混合溶液冷卻至30°C并以相同溫度保持1分鐘。再次將混合溶液在98°C保持10秒鐘之后，進行離心分離。在埃彭道夫管中進行反應，并將由用1M的NaCl清洗和隨后的離心分離組成的才喿作重復三次。向這樣獲^尋混合物添加1M的NaCl(10(iL)，并且只于各個J朱體的形4犬和焚光強度進行測量。當采用一種方法以通過固定在各個珠體子組上的DNA低聚物(作為引物)和作為模板的目標DNA低聚物(序列編號8)之間的互補鏈的構造(使用引物的聚合酶擴增反應)來嘗試堿基序列的復制工作時，可以經i殳計^使其代替利用以熒光染料示蹤的ddNTP方法，預先將諸如熒光染料(例如，焚光素)和猝滅劑(例如，"BHQTM1"，BiosearchTechnologies,Inc.的產品)的染料-猝滅劑對分別結合至固定在珠體上的各個DNA低聚物的5'-位置和3M立置，并且作為利用固定的DNA低聚物(作為引物)的擴增反應的結果，猝滅劑被釋放并消除了由猝滅劑引起的熒光熄滅從而發(fā)出了熒光。本質上，可以通過使用以下方法來執(zhí)行預期的分析(例如，模板DNA的堿基序列的確定)，即，根據珠體子組預先改變待固定的DNA低聚物(作為引物)的種類，并且確認關于互補鏈(使用引物的聚合酶擴增反應)的形成進入到哪個珠體子組或哪幾個子組。通過舉例，圖7示意性示出了不同堿基序列A、B、和C的DNA低聚物(作為引物)已被分別固定在三種珠體21、22和23上、作為關于固定在J朱體21(在珠體21、22、23中21具有圓形核心部分)上的DNA低聚物(作為引物)A的模板目標DNA(參看圖7中的符號T)已被雜交，并且使使用DNA低聚物(作為引物)A的聚合酶擴增反應能夠執(zhí)行的情況。例如，通過測量從通過聚合酶擴增反應合成的ddNTP引起的熒光和來自在DNA低聚物(作為引物)A上示蹤的熒光染料的熒光的強度并且還指定這些熒光從珠體21引起，可以確定作為模板的目標DNA(參看圖7中的符號T)至少具有能夠與DNA低聚物(作為引物)A形成互補鏈的堿基序列區(qū)域。當目標DNA的數量4艮小時，可以i殳計為重復4吏用引物的聚合酶擴增反應。下文中將描述用于測量珠體形狀的示例性方法以及用于測量熒.光強,度的示例性方法。例如，可以通過4吏用圖8所示構造的系統(tǒng)100來扭^f于3朱體形狀和熒光強度的測量。該系統(tǒng)IO(H皮構造成使用于引導珠體樣品的注射泵101和用于輸送輔助溶液以控制流速和珠體分離的另一注射泵102通過Y形管103連4妾在一起，并且將J朱體樣品經由Y形管103引入到流動室104中。作為流動室104,例如，可以使用光導纖維連接毛細管(NipponElectricGlassCo.,Ltd.的產品；內徑0.25x0.127mm)。打開排列在流動室104附近的焚光激發(fā)激光器105,從而連續(xù)監(jiān)控流動室104的發(fā)射。激光器105的這種打開是周期性存在的，通過PMT(光電倍增管)108,經由安排在光傳播路徑上的分色鏡106和濾光器107檢測熒光，并且在濾光處理和增幅之后，將所得的熒光輸入到鎖定》文大器109中來測量其強度。在熒光的強度開始增加時，打開圖像檢測激光器110以通過CCD相機112經由顯微鏡111來拍攝珠體的形狀，通過計算機113基于來自它們拍攝的圖像的形狀來識別珠體，并將圖像信息記錄在計算機113的存儲單元中。在分析單元114，累積熒光強度數據和圖像信息來分析它們的相互關系。為了增加圖像識別的準確性，可設計多次執(zhí)行圖像輸入操作直到熒光強度下降。通過將在每個輸入操作中的熒光強度與在前輸入操作中的對應值進行比較，取確定后的最大值作為珠體的熒光強度并分析在對應于最大值的輸入操作中輸入的圖像，可以確定珠體的類型。然后將珠體的類型和最大熒光強度作為數值的組合而存儲。接下來，具體描述用于識別珠體形狀的方法的一個實例?？梢酝ㄟ^用作為基準的圖形進行疊加來執(zhí)行珠體形狀的識別及其評估。圖9是關于珠體形狀的識別及其評估的示例性流程圖，以及圖10是關于珠體形狀的識別及其評估的示例性程序的概念圖。下文中將描述的在示例性識別方法中所采用的是通過沖企測所得的多個圖<象的邊*彖來拔:耳又J朱體的核心部分的形狀的方法。應注意，對于珠體的形狀識別，也可以使用諸如依賴特征點的提取的識別方法的其4也方法。檢測拍攝圖像的邊緣，提取核心部分的圖像，然后確定圖像中的最長邊。將最長邊設為垂直軸，將圖像尺寸標準化。將所拍攝的圖像相互比較，并選擇具有最大面積的圖像作為候選圖像。執(zhí)行候選圖像與每個基準圖像的疊加，并辨別給出最大重疊的基準圖像(具體參看圖10)。增加在各個圖像上測量的熒光強度的最大值以計算來自各個圖像的熒光的總量。接下來，要描述用于堿基序列的歸屬的示例性操作。在圖11中，柱狀示出了分別對應于總共七種珠體(每種珠體的核心部分的形狀都不同)而實際測量的熒光強度。乂人固定有作為才莫板DNA(低聚物)的部分序列的DNA低聚物的珠體(如正視圖所示，具有圓形、三角形、正方形、五邊形、以及六邊形形a犬作為4亥心部分的形狀)，基本上測量到相同的熒光量(參看圖11)。另一方面，從末端堿基不同的珠體類型(在正視圖每個核心部分的形狀中具有星形的形狀)以及能夠與目標DNA低聚物(模板)形成任何互補鏈的珠體類型(在正視圖每個核心部分的形狀中具有矩形的形狀)，僅可以觀察到少量的熒光(參看圖11)。目標DNA低聚物的序列的概念的示意圖。通過并排提高珠體的堿基序列的熒光強度(參看圖12)、疊加重疊的序列區(qū)i或以確定序列、以.及獲纟尋互補的序列，可以4青確確定目標DNA低聚物的序列。在關于序列的確定的實例中，已具體描述了使用7種堿基序列所得到的結果。當使用每個都由例如7個堿基組成的7種堿基序列時，存在多達4的7次冪(16,384)個組合。通過〗吏用所有這些組合的珠體，可以確定任何所給的堿基序列。當已一定程度了解堿基序列時，可以使待使用的珠體種類比該實例中的更少。作為根據本發(fā)明的珠體組的應用，已以序列測定技術為中心描述了該實例。然而，珠體組的應用并不局限于序列測定技術。例如，它也可以應用于4企測雜交等。如圖13所示，例如，將多種J朱體21、22和23添加給相互作用的預定位置，在各個珠體21、22和23上，已預先固定了不同堿基序列的DNA4果4十DpD2和D3。將用熒光染料F示蹤的目標(例如，cDNA)T！添加至相互作用的位置，并且在預定的適當條件下進4亍雜交。共同分析通過珠體的識別獲得的結果以及通過熒光強度測量獲得的結果。例如，當發(fā)現僅從珠體21發(fā)出熒光時，確定目標T,具有與固定在珠體21上的DNA探針D,互補的序列。以這種方式，可以發(fā)現例如疾病相關基因的表達狀態(tài)。當在樣品中同時存在多種DNA(或RNA)時，即4吏分析無法確定它們的堿基序列，本發(fā)明仍可以發(fā)現具有特定部分序列的DNA(或RNA)的存在比例。當在本.發(fā)明中^f吏用雜交才企測的方法時，對^企測方法;殳有明確的限制。根據目的，例如，可以自由選擇以使用特別結合成雙鏈的插入劑來發(fā)出熒光、或采用不同于熒光檢測的檢測方法(例如，依靠;改射性物質的^r測、或電4企測)，而不局限于熒光示蹤目標的方法。權利要求1.一種由多個珠體子組構成的珠體組，其中，每個子組中的所述珠體每個都設置有允許參與預定的對應反應或相互作用的物質固定在其上的表面，并且，所述珠體組中的所述各個珠體分別設置有不同的物理要素，以便所述珠體組中的所述各個珠體可以通過計算機分析所述珠體組中的所述各個珠體的拍攝圖像而被分成所述多個子組。2.根據權利要求1所述的珠體組，其中，所述珠體組由二維或三維形狀不同的多個J朱體子組構成。3.根據權利要求1所述的珠體組，其中，所述珠體組中的所述各個J朱體分別包4舌核心部分和作為所述核心部分的外層的外殼部分，并且，所述核心部分分別i殳置有隨子組的不同而不同的關于所述珠體組中的所述各個珠體的拍攝圖像的信息來分析所述核心部分的所述形狀而#:分成所述多個子組。4.根據權利要求1所述的珠體組，其中，所述多個5朱體子組設置有隨子組的不同而不同的標識符，并且，所述標識符的不同可以通過計算才幾分析所迷珠體組中的所述各個珠體的拍才聶圖4象而區(qū)分。5.—種用于構成才艮據4又利要求1所述的J朱體組的^朱體的制造方法，包括以下步驟將多個子組中的所述5朱體分別i殳置為具有不同的物理要素，以便可以通過計算機分析所述珠體的拍攝圖像將所述珠體組中的所述5朱體區(qū)分成所述多個子組，其中，所述5朱體屬于所述多個子癥且之一；以及分別對所述子組中的所得珠體實施表面處理，以便預定的對應物質能夠分別固定在所述子組中的所述珠體上。6.—種用于確定目標核酸鏈的》咸基序列的方法，包纟舌至少4吏用才艮據斗又利要求1所述的珠體組。7.—種用于4企測生物大分子參與的反應或相互作用的方法，包才舌至少使用根據權利要求1所述的珠體組。8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述反應或相互作用是雜又。全文摘要本發(fā)明提供了一種珠體組、珠體組的制造方法和珠體組的使用方法，其中珠體組由多個珠體子組構成。在每個子組中的珠體每個都設置有一個表面，該表面允許參與預定的對應的反應或相互作用的物質固定在其上。在珠體組中的各個珠體分別設置有不同的物理要素，從而可以通過由計算機分析在珠體組中的各個珠體的拍攝圖像來將珠體組中的各個珠體分成多個子組。文檔編號G01N33/68GK101303348SQ200810096190公開日2008年11月12日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權日2007年5月10日發(fā)明者中川和博,大西通博,安田章夫,山本拓郎,岸井典之,市村真理,武田實,鹽野真由美,阿部友照申請人:索尼株式會社