專利名稱：結核分枝桿菌檢測液相芯片及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物類，具體地是涉及結核分枝桿菌檢測液相芯片及其制備方法。

背景技術：
由結核分枝桿菌(TB)引起的結核病是現(xiàn)今世界上最普遍的人類傳染病之一。全世界已有1/3人口約20億人感染了結核分枝桿菌(MTB)。每年有900萬新結核病人，約300萬人死于結核病。我國現(xiàn)有結核病人約600多萬，每年還至少有113萬新生結核病例發(fā)生，每年因結核病死亡人數(shù)高達25萬，且75％的結核病例發(fā)生在15-50歲的青壯年當中，嚴重影響了我國國民經(jīng)濟和人口素質發(fā)展。準確及時診斷活動性肺結核，有效控制傳染源，對我國的結核預防控制至關重要。早期診斷MTB感染的方法越來越顯得重要。
結核病控制存在的最主要問題是結核病人或感染動物的發(fā)現(xiàn)率低?，F(xiàn)有的結核病實驗室診斷主要依靠細菌學檢測、免疫學檢測、質譜分析、PCR診斷、DNA指紋技術和基因芯片檢測技術。對結核病人痰的細菌學檢測是結核病診斷、治療及評價治療效果最可靠的標準。常規(guī)的細菌學檢測方法有痰涂片法、培養(yǎng)法、藥敏試驗及根據(jù)其理化特性而建立的菌型鑒定法。涂片法是最基本的檢測方法，具有簡便、快速的特點，但敏感性差，平均檢出率只有25％～35％，無法區(qū)分死菌、活菌。培養(yǎng)法周期太長，約4～8周，同時必須結合藥敏試驗和菌種鑒定試驗才能進一步確診，這樣所需周期更長，不利于臨床上結核病的診斷和治療，加之試驗過程中的影響因素很多，不易標準化，不能滿足臨床需要。Bactec快速培養(yǎng)儀檢測系統(tǒng)雖然可縮短培養(yǎng)時間，但也需2-4周，而且需要特殊的儀器設備，費用昂貴，無法在基層推廣應用；噬菌體檢測技術雖然快速、簡便，但特異性差，只能用于結核病人初篩；PCR分子生物學診斷技術快速、靈敏，是很有前途的診斷方法，但其相對成本較高，而且假陽性率較高，不能區(qū)分死菌與活菌；血清特異性抗體檢測方法簡便、實用，但目前所用抗原多為PPD、LAM、38kD、16kD等，這些抗原多數(shù)是分枝桿菌屬所共有的，因此特異性不強。
抗原檢測一直是確認或評估病原體感染及感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價值，在其它許多疾病如HBV、HCV、HIV、SYPHILIS診斷方面獲得廣泛應用。特異性抗原檢測最重要的特征在于通過檢測相關病原體的特異性抗原(標志物)實現(xiàn)。使用這一方法檢測結核桿菌，必須尋找到結核桿菌特異性抗原(標志物)。
為了尋找結核桿菌特異性抗原(標志物)，過去，研究人員多從結核桿菌菌體蛋白中尋找，結果多數(shù)菌體抗原并非結核桿菌特有，而是分枝桿菌屬菌共有。后來研究結核桿菌的生長，從結核桿菌培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)了大量分泌抗原，其中一些抗原是菌體中所沒有的，且為毒株結核桿菌所特有。理論上講，由于分泌性抗原是由活的結核桿菌產(chǎn)生并釋放到周圍環(huán)境介質中，因此，檢測上述多種結核桿菌的分泌性抗原能顯著提高結核病診斷的陽性率，也可以通過檢測分泌性抗原的存在與含量確定結核桿菌尤其是活菌存在及其生長情況。
人和動物結核桿菌在感染過程中，不同的生長環(huán)境、生長階段，不同的感染方式，結核桿菌能啟動表達不同的蛋白表達系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，結核桿菌早期感染階段會分泌一些小分子量抗原如ESAT-6、CFP-10等，生長階段會釋放或分泌Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT32、MPT53、MPT63、MPT64、MPT70、Mtb81、Mtb48、38kD等蛋白。因此，僅依靠檢測一兩種結核桿菌分泌抗原很難達到診斷目的。
人型(標準菌株H37Rv)是人類結核病的主要病原菌，牛型結核桿菌(M.Bovis)可經(jīng)飲用未消毒的帶菌牛乳引起腸道結核感染?，F(xiàn)在為防止結核病，普遍接種的卡介苗就是減毒的牛型分枝桿菌，因此與病原菌的抗原有著很高的同源性，這一問題就成了結核桿菌需要考慮的另一關鍵問題。自1998年標準菌株H37Rv基因組序列公布以來，大部分編碼蛋白質的功能基因得以闡明，特別是運用雙向電泳和質譜技術在蛋白組水平上分離和鑒定出了一些可區(qū)別人型和牛型以及BCG，極具輔助診斷潛力的特異性蛋白質抗原，為結核病特異性診斷奠定了基礎。這些主要包括糖脂類抗原、Ag85復合物、16kDa蛋白、38kDa蛋白等。特別值得注意的是，自從1996年，Matsumoto等采用遞減雜交法闡明BCG在體外處理中被刪除的3個差異區(qū)域(RD區(qū))以來，人們已經(jīng)在各種BCG菌株中發(fā)現(xiàn)了有16個這樣的區(qū)域。這些區(qū)域中所包含的一些抗原，如ESAT6、CFP10以及MPT64等，就極有可能排除BCG對結核皮膚實驗以及ELISA的干擾。
結核分枝桿菌抗原多而復雜，在宿主體內表達的數(shù)量、種類或時機可能隨病人的個體免疫背景和病程而異，表現(xiàn)出不同的抗原抗體譜。檢測時有的抗原不表達，未檢測出相應的抗體；有的抗體含量高，有的則低。目前臨床上對于結核分枝桿菌抗原的檢測項目的開展的還基本處于空白期，因此，多種抗原聯(lián)合檢測，在保證特異性的基礎上有助于提高靈敏度，并可用于結核分枝桿菌的自然感染或卡介苗接種后陽轉者的區(qū)別。
本發(fā)明根據(jù)大量的文獻資料確定了ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL這八種結核分枝桿菌特異性分泌抗原用于結核桿菌感染的檢測。
(1)ESAT-6早期分泌性抗原靶6，ESAT-6是結核桿菌感染早期的分泌型蛋白。主要存在于致病性結核桿菌而不存在于非結核分枝桿菌。這個證據(jù)極大地推動了把ESAT-6作為診斷試劑的研究。所以，ESAT-6是區(qū)別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的最佳候選抗原。有關的研究證明ESAT-6可用于鑒別卡介苗接種(BCG)和結核桿菌感染。
(2)CFP-10該抗原和ESAT-6-樣都是從培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)的，同樣僅分布于各型結核桿菌中。這種分子和ESAT-6一樣經(jīng)常出現(xiàn)在結核病人中，但在BCG中沒有該類分子，同樣也不出現(xiàn)在接種BCG的健康人中。
(3)38kD蛋白38kD蛋白是1986年Young.D等人首次用單克隆抗體為基礎經(jīng)親和層析純化而成。Andersen等從結核桿菌中分離了該蛋白的基因，認為38kD蛋白只能在致病的分枝桿菌中檢出，BCG中只能檢出非常少的量，而其他分枝桿菌不能檢出。Haslov等比較了5種結核桿菌抗原，發(fā)現(xiàn)38kDa蛋白的免疫學活性最強，是結核桿菌的主要免疫原。缺乏抗38KD抗體的血清很難與結核桿菌其它抗原發(fā)生反應。38kDa蛋白是一種脂蛋白和主要免疫原，其誘發(fā)豚鼠遲發(fā)性超敏反應(DTH)的效果優(yōu)于其它單一抗原，用于結核病血清學檢測敏感性和特異性較高。Espitia C等研究了38kD蛋白用于血清診斷的方法，發(fā)現(xiàn)該蛋白可與57％的病人血清反應，與對照組沒有反應。張小剛等采用自制的重組結核分枝桿菌38kD蛋白作為ELISA抗原，其敏感性、特異性分別為67.2％和96.8％，與Espitia C等報告的靈敏度68％與特異性96％的結果相似。
(4)16kD蛋白16kDa蛋白也被稱為MPT63或者TBP16。核酸雜交技術、免疫印記技術和抗體阻斷技術表明，16kDa蛋白質存在于結核菌復合群中，在其他分枝桿菌不存在該抗原的基因，因而也不表達該抗原。16kD用于診斷的靈敏度為63％，特異性為93.1％。
(5)脂阿拉伯甘露糖(LAM)LAM是分枝桿菌所特有的細胞壁成分，具有特異性。研究表明LAM具有較強的免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生相應的抗體。用于結核病的血清學診斷，其敏感性在50％～75％，特異性在50％～75％。有關LAM抗原的應用報道很多，Antunes等用美國生產(chǎn)的結明試劑盒(MycoDot TM)檢測活動性肺結核病人的敏感性為63.0％，特異性為92.4％，認為檢測LAM抗體是結核病一項有效的輔助診斷方法。
(6)Ag85B抗原85復合體(Ag85)是一組具有較強細胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白，分子量約為30～32kDa。分枝桿菌各菌株均可分泌Ag85。結核分枝桿菌Ag85中至少包括三種蛋白成分——Ag85A、Ag85B和Ag85C，其中有免疫作用的主要為Ag85A和Ag85B。Ag85具有分枝菌酸轉移酶的活性，在分枝桿菌細胞壁合成的最后階段發(fā)揮必要的作用。它還能和人纖連蛋白(FN)相結合，有助于結核菌入侵宿主細胞。Ag85可能發(fā)展成為結核病的血清學診斷抗原?；顒有越Y核病人血清中的Ag85抗體平均水平比其他分枝桿菌疾病患者和健康對照者高50～150倍，可通過檢測血循環(huán)中Ag85抗體，對活動性結核加以診斷。Kashyap等用間接ELISA法檢測89％疑似結核性腦膜炎患者腦脊液中存在Ag85抗體，認為檢測Ag85抗體為結核性腦膜炎的早期和確定性診斷提供了一個更靈敏的選擇。Ag85B分子量為30kD，是結核桿菌的主要分泌蛋白，約占分泌蛋白總量的22％-30％。在對結核病的診斷上，Ag85B較Ag85A和Ag85C更有價值。
(7)MPT64又稱MPB64，是一種24kD的結核分枝桿菌分泌蛋白，僅存在與結核分枝桿菌復合群中。Harboe等首先在牛型和人型結核桿菌的培養(yǎng)濾液中，檢測到MPT64，但在BCG中沒有此抗原。隨后用PCR雜交研究表明，編碼MPT64的基因在某些BCG亞株中缺失。
(8)結核菌糖脂抗原(TBGL)結核菌糖脂抗原是分枝桿菌細胞壁上的糖脂類物質，具有菌屬特異性。近年來的研究表明，糖脂類抗原在診斷方面有很大的優(yōu)勢。Maekura等建立了糖脂類抗原抗體快速檢測方法，并做了臨床評價，對痰涂片陰性的活動性肺結核的靈敏度為56.8％，對痰培養(yǎng)陰性的活動性肺結核的靈敏度為51.2％。將TBGL與核酸擴增方法(NAA)聯(lián)合用于檢測，檢出率比兩者單獨使用時進一步提高。Tiwari等用脂質體顆粒作為載體，利用純化的TBGL抗原特異的與結核病患者血清中的TBGL抗體結合，形成藍色凝集顆粒來診斷活動性結核病，其敏感性、特異性分別達94％和98.3％。該方法快速(4min)、經(jīng)濟，且可以區(qū)別活動性肺結核、卡介苗(BCG)免疫接種者與健康人群，可用于人群大規(guī)模篩選肺結核病人。
傳統(tǒng)的抗原檢測方法主要有放射免疫法，酶聯(lián)免疫法及電化學發(fā)光免疫法等。然而這些方法每次測試只能獲得一種抗原的濃度。同時，傳統(tǒng)的免疫檢測方法受靈敏度限制，因此對于一些低濃度的分泌抗原存在檢測結果不準確等缺陷。


發(fā)明內容
針對目前結核桿菌的檢測及抗結核療效評估的方法的敏感性和特異性不高以及一次反應只能檢測一種抗原的缺陷，本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種結核分枝桿菌檢測液相芯片，該液相芯片對血清中ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL八種結核分枝桿菌特異性分泌抗原同步并行檢測。
解決上述技術問題的技術方案如下 一種結核分枝桿菌檢測液相芯片，主要包括有 1)包被微球含有分別包被了ESAT-6捕獲抗體的微球、包被了CFP-10捕獲抗體的微球、包被了38kD蛋白捕獲抗體的微球、16kD蛋白捕獲抗體的微球，包被了LAM捕獲抗體的微球、包被了Ag85B捕獲抗體的微球，包被了MPT-64捕獲抗體的微球、和包被TBGL捕獲抗體的微球中三種或三種以上，上述微球分別具有不同顏色編碼； 2)生物素標記檢測抗體分別用生物素標記的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的檢測抗體中的對應于包被微球的三種或三種以上； 3)鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)。
液相芯片技術也叫流式熒光技術，該技術由一種微球作為反應載體，微球用聚苯乙烯材料制成，直徑5.6um，表面有活性羧基可供化學偶連用，抗原、抗體等生物大分子可通過氨基與微球表面的羧基通過化學反應共價結合(即包被過程)。在微球制造過程中加入紅外和遠紅外兩種熒光染料，根據(jù)兩種染料混合比例的不同將微球進行編碼，可區(qū)分出上百種不同編碼的微球。使用時，先將ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的捕獲抗體分別包被于不同顏色編碼的微球上，同時分別用生物素標記ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的檢測抗體。將包被好的八種微球混合，懸浮于液相，再加入標本，在懸液中微球上標記的捕獲抗體與標本中相應的檢測物的某一個表位異性地結合，之后加入生物素標記的檢測抗體與標本中相應檢測物的另一表位特異性結合，反應完全后加入熒光物質-藻紅蛋白標記的鏈親和素，由于鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)可以與生物素高度特異性結合，因此反應體系中最后形成“微球-捕獲抗體+待檢測物+生物素標記的檢測抗體+SA-PE”的六種復合物，以微球為載體，通過Luminex系列液相芯片分析儀器檢測，讀取微球的色彩編號及SA-PE的熒光值。微球色彩編號可辨別檢測項目，SA-PE熒光值與各檢測物濃度呈正相關，通過測定ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL標準品在不同濃度下的熒光值，可以獲得各個檢測指標標準品濃度-熒光值標準曲線以及標準曲線方程。將待測血清樣本檢測所得熒光值代入標準曲線方程即可分別求得待測樣本中的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的量。
由于所有反應均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質的天然構象，使探針和被檢測物的反應更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。
本發(fā)明另一需要解決的技術問題是提供上述結核分枝桿菌檢測液相芯片的制備方法。一種制備結核分枝桿菌檢測液相芯片的方法，主要包括以下步驟 (1)相應的捕獲抗體包被微球 -將50μL微球活化后，≥8000g，離心； -吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，后將微球于≥8000g，離心1-2min；重復該步驟； -吸棄上清，將微球重懸于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s； -往懸浮的微球中加入相應的0.8-1.2μg抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550μL； -用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr； -偶聯(lián)了抗體后的微球以≥8000g的速度，離心1-2min； -吸棄上清，將微球重懸于500μL PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲振蕩約20s； -室溫避光振蕩30min；再于≥8000g，離心1-2min； -吸棄上清，將微球重懸于1mL PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；微球≥8000g，離心1-2min；重復該步驟一次； -吸棄上清，將微球重懸于500-1000μL PBS-TBN溶液中； -每種包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)后置于2-8℃避光單獨保存，使用時，依據(jù)檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)微球的濃度均為40個/μl； (2)每種檢測抗體的生物素標記 -依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至1mg/ml的體積，視為目標體積； -配置10mg/ml的NHS-Biotin反應液； -按摩爾比1∶100于反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應液； -加入體積為目標體積的pH8.9的1/10的NaHCO3溶液； -加入pH7.4的PBS補至目標體積； -包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，于25℃恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉速為800rpm-1000rpm； -將反應液轉至透析盒內，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin； -使用時根據(jù)需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合。
所述活化微球的步驟如下 -用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球； -取50μL微球離心1-2min； -去掉上清夜，將微球重懸于100μL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，≥8000g離心1-2min； -吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s； -加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻； -加入10μL50 mg/mL EDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻； -室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。
本發(fā)明方法結合液相芯片平臺高通量、準確靈敏的特性與雙抗體夾心法高靈敏度的特性，同步檢測8種結核桿菌特異性分泌抗原，能提高結核病感染陽性檢出的敏感性，為結核桿菌感染實驗室診斷及抗結核療效評估提供有利依據(jù)。
本發(fā)明所公開的多項結核分枝桿菌抗原并行檢測液相芯片則可一次反應同時完成多種結核分枝桿菌特異性抗原的定量檢測，填補目前臨床定量檢測結核分枝桿菌特異性抗原開展不足的缺陷，從而為對早期結核病的準確診斷提供一種準確可靠的手段。本發(fā)明所提供的多項結核分枝桿菌抗原并行檢測液相芯片還具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。
另外，本發(fā)明的制備方法簡單易行，穩(wěn)定性好，其技術方案中的各種工藝參數(shù)如微球和抗體的量、反應過程等均是在大量試驗基礎上得出的，為制備過程最佳的參數(shù)值。



圖1是檢測ESAT-6的標準曲線示意圖； 圖2是檢測CFP-10的標準曲線示意圖； 圖3是檢測38kD蛋白的標準曲線示意圖； 圖4是檢測16kD蛋白的標準曲線示意圖； 圖5是檢測LAM的標準曲線示意圖； 圖6是檢測Ag85B的標準曲線示意圖； 圖7是檢測MPT-64的標準曲線示意圖； 圖8是檢測TBGL的標準曲線示意圖。

具體實施例方式 實施例1結核分枝桿菌快速檢測液相芯片的制備及抗原的檢測 本發(fā)明所述的捕獲抗體為分別能對應與ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL特異性結合的單克隆抗體；所述的檢測抗體為分別能與ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL特異性結合的單克隆抗體或多克隆抗體。本實施例所用的“ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL″重組蛋白購自英國SCiPAC公司，“ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL″的捕獲抗體與檢測抗體購自美國abcam公司。
本實施例中，所述各種溶液的配方如下 1.50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml) 2.PBS配方 3.PBS-TBN配方(即PBS中含0.1％BSA，0.02％Tween-20，0.05％Na3N，pH7.4) 1.結核分枝桿菌檢測液相芯片試劑盒，包括有 1)8-plex包被微球含有分別包被了ESAT-6捕獲抗體的20號微球，包被了CFP-10捕獲抗體的24號微球的偶聯(lián)體，包被了38kD蛋白捕獲抗體的32號微球，包被了16kD蛋白捕獲抗體的34號微球，包被了LAM捕獲抗體的38號微球，包被了Ag85B捕獲抗體的51號微球，包被了MPT-64捕獲抗體的53號微球，和包被了TBGL捕獲抗體的72號微球。
2)8-plex生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的檢測抗體； 3)鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE，10ug/ml)；還按照現(xiàn)有技術配套有 4)分析緩沖液； 5)8-plex標準品； 6)質控液I； 7)質控液II； 8)血清基質液； 9)封口膜； 10)濾板。
2.制備上述液相芯片試劑盒，包括有如下步驟 (1)按上述試劑盒的組成，每種捕獲抗體包被相應的微球，制備方法相同 -用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約20s； -取50μL微球(美國Luminex公司)于1.5ml的離心管中，8,000g以上速度離心2min； -去掉上清夜，將微球重懸于100μL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，8000g(或以上)速度離心2min； -吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s； -加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻； -加入10μL 50mg/mL EDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻； -室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻； -活化后的微球，≥8000g，離心2min； -吸棄上清，將微球重懸于250μL 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；微球≥8000g，離心1-2min；重復該步驟一次； -吸棄上清，將微球重懸于100μL 50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s； -往懸浮的微球中加入1μg抗體，用50mM的MES(pH5.0)溶液將總體積補至500μL； -用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩2hr； -偶聯(lián)抗體后的微球以≥8000g的速度，離心1-2min； -吸棄上清，將微球重懸于500μL PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s； -室溫避光振蕩30min； -微球≥8000g，離心1-2min； -吸棄上清，將微球重懸于1mL PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；微球≥8000g，離心1-2min；重復該步驟一次； -吸棄上清，將微球重懸于600μL PBS-TBN溶液中； -包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)； -包被好的微球置于2-8℃避光保存，每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，依據(jù)檢測項目選擇等比例混合。
(2)按上述試劑盒的組成，每種檢測抗體的生物素標記 -依據(jù)蛋白濃度計算反應體系，填寫表格； -依據(jù)蛋白濃度計算抗體溶液稀釋至1mg/ml的體積，視為目標體積(V)； -配置NHS-Biotin反應液； -按摩爾比1∶100于反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin(10mg/ml)反應液； -加入1/10目標體積的NaHCO3(pH8.9)溶液； -加入PBS(pH7.4)補至目標體積； -包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，于25℃恒溫箱中避光孵育4h，轉速為900rpm； -將反應液轉至透析盒內，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin； -測定蛋白濃度。
3.用于檢測，包括如下步驟 1)使用前先取出所有試劑，放置平衡至室溫。
2)標準品的稀釋每個標準品設6個稀釋度，然后等比例混合，使各自得終濃度為所需的濃度。各管稀釋方法及理論濃度(同下表中的預期濃度) 注意每個濃度標準品稀釋完后均必須用渦旋混合儀徹底混勻后才可用于下一濃度的稀釋?；靹蜻^程避免產(chǎn)生泡沫。
3)設置96孔板布局，確定96孔板上標準品、質控品、待測樣品及空白孔的位置。考慮到儀器讀數(shù)的順序是按照從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序縱向讀數(shù)，在設置96孔板布局時應遵循從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序排列。
4)按照設置好的96孔板布局，每孔加25μl分析緩沖液，再分別加入25ul標準品、質控品到各自孔中，空白孔加25ul分析緩沖液。
5)分別取出上述制備的針對結核分枝桿菌特異性分泌抗原檢測的捕獲抗體偶聯(lián)微球，用渦旋混合儀混勻30鈔，超聲處理30秒，按等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)的微球濃度均為40個/μl。往每孔中加入的八種捕獲抗體偶聯(lián)微球的混合懸液25μl。包被微球應在臨用前混勻，且混勻后應立即使用，否則放置過久微球會再沉淀。
6)用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振蕩器上以600轉速度震蕩，孵育60分鐘。
7)孵育完成后每孔加入25ul上述制備的生物素標記的檢測抗體的混合液(其中所述八種生物素標記的檢測抗體事先按等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到10ug/ml，搖勻)，用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振蕩器上以600轉速度震蕩，再孵育60分鐘。
8)孵育完成后每孔加入25ul鏈親和素藻紅蛋白，用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25℃放置在微孔板振蕩器上以600轉速度震蕩，再孵育30分鐘。
9)于Luminex系列液相芯片分析儀上讀取結果。儀器可自動繪制標準曲線，并計算出待測樣品的測值。
4.實驗結果分析 (請參見表1-4，圖1至圖8) 本發(fā)明所公開的結核分枝桿菌快速檢測液相芯片只需25μL的血清樣本，并且在3個小時之內一次反應同時完成八種結核分枝桿菌特異性分泌抗原的定量檢測。通過多種抗原的聯(lián)合檢測，在保證特異性的基礎上提高樂檢測的靈敏度，并可用于結核分枝桿菌的自然感染或卡介苗接種后陽轉者的區(qū)別。同時，與放射免疫，化學發(fā)光檢測及酶聯(lián)免疫吸附等方法相比，液相芯片平臺檢測線性范圍更寬，靈敏度更高，重復性更好。由于所有反應均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質的天然構象，使探針和被檢測物的反應更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。
通過標準曲線的分析，可以看到本發(fā)明所提供的結核分枝桿菌快速檢測液相芯片對結核分枝桿菌特異性分泌抗原的檢測具有很寬的檢測線性范圍及很高的檢測靈敏度和特異性。八種結核分枝桿菌特異性分泌抗原檢測的標準曲線的線性在97.7pg/ml～100ng/ml的濃度范圍內R2均≥0.99，最低檢測限可達97.7pg/ml。同時，各個標準點的實測濃度與預期濃度的相對誤差不超過8％。因此，本發(fā)明提供的結核分枝桿菌快速檢測液相芯片能對結核分枝桿菌感染后人的血清、腦脊液、痰液中極微量的結核桿菌特異性分泌抗原進行檢測，并且能一次性檢測八種目前已被大量文獻證實在結核分枝桿菌感染的不同病程中特異表達的分泌性抗原，從而提高結核分枝桿菌檢測的準確率和檢測的效率。
表1 表2 表3 表4
權利要求
1.一種結核分枝桿菌檢測液相芯片，其特征是，主要包括有
1)包被微球含有分別包被了ESAT-6捕獲抗體的微球、包被了CFP-10捕獲抗體的微球、包被了38kD蛋白捕獲抗體的微球、16kD蛋白捕獲抗體的微球，包被了LAM捕獲抗體的微球、包被了Ag85B捕獲抗體的微球，包被了MPT-64捕獲抗體的微球、包被TBGL捕獲抗體的微球中三種或三種以上，上述微球分別具有不同顏色編碼；
2)生物素標記檢測抗體分別用生物素標記的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的檢測抗體中的對應于包被微球的三種或三種以上；和
3)鏈親和素藻紅蛋白。
2.一種制備權利要求1所述結核分枝桿菌檢測液相芯片的方法，主要包括以下步驟
(1)相應的捕獲抗體包被微球
-將50μL微球活化后，≥8000g，離心；
-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，后將微球于≥8000g，離心1-2min；重復該步驟；
-吸棄上清，將微球重懸于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；
-往懸浮的微球中加入相應的0.8-1.2μg抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550μL；
-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr；
-偶聯(lián)了抗體后的微球以≥8000g的速度，離心1-2min；
-吸棄上清，將微球重懸于500μL PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲振蕩約20s；
-室溫避光振蕩30min；再于≥8000g，離心1-2min；
-吸棄上清，將微球重懸于1mL PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；微球≥8000g，離心1-2min；重復該步驟一次；
-吸棄上清，將微球重懸于500-1000μL PBS-TBN溶液中；
-每種包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)后置于2-8℃避光單獨保存，使用時，依據(jù)檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)微球的濃度均為40個/μl；
(2)每種檢測抗體的生物素標記
-依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至1mg/ml的體積，視為目標體積；
-配置10mg/ml的NHS-Biotin反應液；
-按摩爾比1∶100于反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應液；
-加入體積為目標體積的pH8.9的1/10的NaHCO3溶液；
-加入pH7.4的PBS補至目標體積；
-包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，于25℃恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉速為800rpm-1000rpm；
-將反應液轉至透析盒內，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin；
-使用時根據(jù)需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到10ug/ml。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征是所述活化微球的步驟如下
-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；
-取50μL微球離心1-2min；
-去掉上清夜，將微球重懸于100μL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，≥8000g離心1-2min；
-吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s；
-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；
-加入10μL 50mg/mL EDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；
-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結核分枝桿菌快速檢測液相芯片，主要包括有包被微球；分別用生物素標記的檢測抗體；和鏈親和素藻紅蛋白。本發(fā)明所提供的檢測結核分枝桿菌分泌特異性抗原的液相芯片具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。同時，各項結核分枝桿菌分泌特異性分泌抗原標志物可自由組合，使用方便。同時，由于所有反應均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質的天然構象，使探針和被檢測物的反應更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。
文檔編號G01N33/569GK101216491SQ20081002568
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月8日 優(yōu)先權日2008年1月8日
發(fā)明者許嘉森, 林一群, 楊惠夷 申請人:廣州益善生物技術有限公司