專利名稱:治療乳腺癌的cxcr4受體拮抗性多肽的篩選與應用的制作方法
技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物,具體地說是一種治療乳腺癌的CXCR4 受體拮抗性多肽的篩選與應用。
技術(shù)背景乳腺癌的發(fā)病率己逐漸上升到女性惡性腫瘤的首位。乳腺癌細胞只有 轉(zhuǎn)移到維持生命所必需的器官如肝和肺時,才會變得致命。降低死亡率的 最好方法是早發(fā)現(xiàn)、早治療。發(fā)明一種能夠早期發(fā)現(xiàn)和治療乳腺癌的方法, 對于挽救乳腺癌病人的生命是十分重要的,是現(xiàn)代醫(yī)學科學的一個重要任 務。現(xiàn)代醫(yī)學研究認為遠隔部位處轉(zhuǎn)移灶的建立和生長依賴于腫瘤細胞和 宿主環(huán)境之間的相互作用。轉(zhuǎn)移是若干個連續(xù)步驟的結(jié)果,是一種器官選 擇性的過程。2001年Muller等在《Nature》雜志首次發(fā)表的關(guān)于趨化因子 受體CXCR4 (CXCchemokine receptor 4)與其特異性配體基質(zhì)細胞衍生 因子(SDF-1, Stromal cell-derived factor-l)相互作用密切介導腫瘤轉(zhuǎn)移的研究成果提供了乳腺癌轉(zhuǎn)移分子機制的有力證據(jù)。他們證實乳腺癌轉(zhuǎn)移的部位都是些高表達趨化因子受體配體SDF-la的部位,如肝、肺、骨。 癌細胞高表達趨化因子受體CXCR4,與配體SDF-1的結(jié)合是乳腺癌轉(zhuǎn)移的 分子生物學基礎。當SDF-la與CXCR4結(jié)合時,CXCR4活化Gai-蛋白-介 導的信號一Ras/MAP激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /AKt。阻斷CXCR4 與SDF-la的相互作用能有效消弱乳腺癌細胞向局部淋巴結(jié)和肺組織的轉(zhuǎn) 移。因此以趨化因子及其受體分子為藥物靶點,在近十年引起了學術(shù)界和 醫(yī)學研究單位的高度重視和注意。多種CXCR4受體的肽拮抗劑已被公開。 如Tamamura等人報道的CXCR4抑制劑T140在這些疾病中有著良好的治 療前景。但是肽抑制劑的不適當?shù)奈?、分布、代謝、排泄或毒性性質(zhì)限 制了它們的臨床應用。CXCR4特異性抑制劑AMD3100,其作為一種阻斷 CXCR4-介導的病毒進入的抗-HIV藥物進入臨床試驗,目前尚未有報道 AMD3100是否能夠有效地阻斷通過CXCR4調(diào)節(jié)的乳腺癌轉(zhuǎn)移。更重要的是,臨床研究顯示AMD3100與心臟有關(guān)的副作用,近來被推出臨床試驗。 因此,針對CXCR4受體涉及癌癥轉(zhuǎn)移信號以及許多其他病原性疾病的 事實,鑒定新的有效的受體拮抗劑十分重要。本發(fā)明的一個目的是提供來源于趨化因子類似物特定序列,通過競爭 性結(jié)合抑制CXCR4受體信號而不引起生理性剌激作用的多肽藥物??ú先饬鱿嚓P(guān)的皰疹病毒編碼的趨化因子vMIP-II (virus macrophage inflammatoiy protein-II )已證明是廣譜的人趨化因子受體拮抗 劑。由人皰疹病毒8的K4基因編碼,是一個廣譜趨化因子受體拮抗劑, 特別是對CCR5和CXCR4有較高的親和力。我們的目的是根據(jù)趨化因子 家族的結(jié)構(gòu)相似性,通過對vMIP-II與其他趨化因子序列以及分子結(jié)構(gòu)建 模對比,尋找趨化因子與受體結(jié)合相關(guān)的高度保守區(qū),合成相應部位來源 于vMIP-II能具有CXCR4受體結(jié)合活性的多肽。這方面的內(nèi)容大多國外文 獻均在探索研究中或針對與fflV-l病毒的抗感染研究,而在乳腺癌轉(zhuǎn)移方 面未見相關(guān)應用研究報道。首先通過對IL-8、 SDF-1 a 、 MIP-1 P 、 RANTES 進行X線晶體衍射和對其溶液中的結(jié)構(gòu)研究表明CXC和CC類的趨化因子 單體都有相似的三維結(jié)構(gòu)。每個趨化因子的C末端均有三股反平行的P-片層包繞的a -螺旋。趨化因子通過和相應受體的高親和結(jié)合產(chǎn)生生物學功 能。對CXC及CC類趨化因子來說,N末端有很大的活動度,是和相應受 體高親和作用的部位,而C末端a螺旋中帶大量電荷的區(qū)域是和肝素或 GAG低親和結(jié)合位點,這種低親和結(jié)合對趨化因子發(fā)揮生物學功能極其重 要。趨化因子完全發(fā)揮其生物學功能需要高親和結(jié)合和低親和結(jié)合同時發(fā) 揮作用。基于SDF-la三維結(jié)構(gòu)的分析,Crump等提出了 SDF-la和CXCR4 相互作用的雙位點模型,即CXCR4 N端Glul5和Asp20通過靜電吸引與 SDF-laN端Arg8和Argl2形成第一相互作用位點后,SDF-la N端處于無 序狀態(tài)的第1 11位氨基酸(KPVSLSYRCPC)形成特定構(gòu)象,并與CXCR4 螺旋區(qū)的凹槽結(jié)合,從而誘導CXCR4跨膜螺旋區(qū)的構(gòu)象變化,CXCR4從 低能量構(gòu)象狀態(tài)進入過渡態(tài),由此產(chǎn)生的靜電信號促使CXCR4 ELC2 Argl88與ELC3 Glu277通過靜電相互作用和氫鍵形成的鹽橋斷裂,暴露出 CXCR4ELC3 Asp262, SDF-laLysl與Asp262的側(cè)鏈通過兩個強氫鍵結(jié)合形成第二結(jié)合位點,CXCR4進入激活狀態(tài),從而啟動下游的PKs或MAPKs 信號轉(zhuǎn)導過程。通過EMBL Clustalw軟件對比分析SDF-la與vMIP-II的 同源性,發(fā)現(xiàn)在N端有較大的同源性,SDF-laN端是結(jié)合趨化因子受體的 部位,而CXCR4是SDF-la的唯一受體,因此認為vMIP-II的N末端部 分主要結(jié)合CXCR4受體。同時NMR顯示其N端具有較大流動性,可伸 入溶液中并具有二級結(jié)構(gòu),5 8個殘基組成的圈樣結(jié)構(gòu),和其他構(gòu)像之間 能快速轉(zhuǎn)換,提示在小片段的N端趨化因子肽的結(jié)構(gòu)和他們結(jié)合受體的能 力間可能有聯(lián)系。我們通過化學合成法合成N端21個氨基酸多肽,命名 為NT21MP,并通過D型氨基酸修飾增強其結(jié)合活性。由于此合成肽不包 含具有生物學活性的C端結(jié)構(gòu)域,因此與CXCR4結(jié)合后不引起胞內(nèi)Ca2+ 迅速內(nèi)流,故不引起信號傳導,從而對細胞增殖、趨化及黏附活性未見激 活作用,但可通過競爭性結(jié)合作用對趨化因子與相應受體的結(jié)合起到拮抗 作用。在體內(nèi)外藥效實驗中均表現(xiàn)出抗乳腺癌活性。前哨淋巴結(jié)(SLN)是原發(fā)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所必經(jīng)的第一批淋巴 結(jié)。作為阻止腫瘤細胞從淋巴道擴散的屏障的臨床意義已受到人們的重視。 通過對SLN定位活檢,預測區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,可避免腋窩淋巴結(jié)的盲 目清掃,是乳腺癌手術(shù)治療技術(shù)的又一次革命。準確定位和活檢SLN是成 功預測腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。乳腺癌SLNB歸納起來有三種方法 一是 利用生物染料使淋巴管淋巴結(jié)著色的方法,二是注射放射性膠體,用淋巴 閃爍顯像和Y計數(shù)器探測儀檢測的方法,三是聯(lián)合應用生物染料與放射性 膠體識別的方法?;铙w染料注射法是用藍色染料顯示淋巴引流的路徑,并 利用淋巴引流路徑上淋巴結(jié)出現(xiàn)的順序以及相對于腫瘤的位置,協(xié)助SLN 的定位?;铙w染料注射法雖然有簡單、價廉、無放射性污染等優(yōu)點,但由 于各種染料的注射方法及用量沒有統(tǒng)一的標準,假陰性率高達30% 40%; 而且,在尋找SLN時比較盲目,若SLN離腫瘤部位較遠時尋找更為困難。 放射性核素標記法是利用放射性核素的示蹤作用協(xié)助定位SLN的方法,術(shù) 前應用淋巴閃爍顯像或術(shù)中應用Y計數(shù)器探測儀定位追蹤探測"熱"結(jié)節(jié), 即為SLN。核素標記物普遍采用99mTc。常用的被標記物有硫膠體、葡聚糖 等。應用放射性核素標記法定位SLN,大多數(shù)學者研究結(jié)果表明此方法是可行的,是一種有前途的方法。但由于目前所用的放射性藥物沒有一種有很高的SLN的檢出率的效果,各人報道的假陰性率從0%~12%不等,其效 果還不盡人意。綜上所述,為了進一步提高SLN定位的準確性,滿足臨床 需要,探索一種新的淋巴顯像劑更顯迫切。CXCR4受體在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細 胞表面高表達,是乳腺癌細胞比較特異的生物學標志物。將其應用于SLN 的檢測定位應該有其無可比擬的優(yōu)越性。我們通過采用放射性核素對 CXCR4特異性拮抗肽NT21MP進行標記,利用受配體結(jié)合效應,可靶向 特異性的定位于轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié),提高SLN定位的準確性和特異性,探索一 種SLN定位的新途徑。可作為臨床術(shù)前和術(shù)中前哨淋巴結(jié)檢測指標,準確 反應區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況。因而更敏感并減少因淋巴管阻塞造成的假陰 性;另一方面,通過不同的放射性標記,可通過靶向受體配體結(jié)合作用, 于術(shù)后靶向定位于轉(zhuǎn)移部位行局部放射治療。經(jīng)廣泛查閱國內(nèi)外各種公開出版物和醫(yī)學教科書,廣泛檢索世界各國 專利資料,均未見有與本發(fā)明相同的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多 肽的篩選與應用方法的發(fā)明,尤其是放射性標記后前哨淋巴結(jié)的檢測和術(shù) 后耙向放射性治療。因此本發(fā)明具有新穎性和創(chuàng)造性,由于本發(fā)明在制藥 工業(yè)中有著重要的應用,所以本發(fā)明具有實用性。經(jīng)檢索,專利文獻中與治療乳腺癌有關(guān)的多肽的發(fā)明,僅有日本腫瘤 療法科學股份有限公司申請的申請?zhí)?00580034527.5的"與乳腺癌相關(guān)的 基因和多肽"一項。該申請?zhí)峁┝诵碌娜梭w基因B1194、A2282V1、A2282V2、 A2282V3,它們的表達在乳腺癌中顯著增加。這些基因及其編碼的多肽, 可用于例如診斷乳腺癌,并作為開發(fā)抗乳腺癌藥物的靶分子。該發(fā)明的技 術(shù)內(nèi)容與本發(fā)明完全不同,具有不同的技術(shù)路線和方法,是完全不同的兩項發(fā)明。因此本發(fā)明具有新穎性和創(chuàng)造性。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的有三 一是提供用于治療或預防與病原性或不希望的CXCR4受體活性和/或信號相關(guān)的疾病的多肽藥物。尤其是,現(xiàn)認為本發(fā) 明提供的多肽藥物干擾生理性SDF-la配體與CXCR4受體的結(jié)合,并且抑 制受體的活性以及隨后的下游信號途徑。提供了在有此需要的宿主中靶向診斷或者耙向治療,抑制乳腺癌細胞生長和降低轉(zhuǎn)移的多肽藥物。因此,本發(fā)明的首要目的在于提供一種對趨化因子受體CXCR4具有表型敲除效 應、無生理性剌激作用的天然來源蛋白成份。通過生物信息學比對,確定 來源于HHV8 MIP-II特異結(jié)合CXCR4受體的氨基酸序列,為提高其生物 學活性,進行部分氨基酸的D型修飾。二是在此所述的多肽藥物具有與 CXCR4受體相互結(jié)合的能力,可標記后靶向診斷前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況。三 是通過多肽特異性的結(jié)合CXCR4,可通過放射性標記的多肽藥物提高局部 放療濃度。因此本發(fā)明的主要內(nèi)容是該藥物來源于HHV8 MIP-IIN端21個氨基 酸,是以對趨化因子受體CXCR4的拮抗作用為基礎,并通過D型氨基酸 修飾提高其生物學活性;通過"mTc-合成肽靶向診斷前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況; 通過放射性標記的合成肽提高原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移部位的放療濃度。本發(fā)明來源于HHV8 vMIP-II的CXCR4受體拮抗活性多肽NT21MP 包含了 vMIP-II結(jié)合趨化因子受體CXCR4的活性位點,具有特異結(jié)合 CXCR4受體的活性,能阻斷SDF-la/CXCR4間的相互作用,而具有抗乳腺 癌轉(zhuǎn)移的作用。通過標記的NT21MP—方面可靶向診斷前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀 況,指導手術(shù)清掃區(qū)域;另一方面,提高局部放療濃度,從而提高療效, 減少副作用。同時,它作為一個CXCR4受體特異的拮抗劑,在治療HIV/ 艾滋病感染等CXCR4受體相關(guān)的疾病具有良好的作用,在制藥工業(yè)具有 光明的前景。本明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的一種治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選與應用,來源于 HHV8 MIP-II N端特異結(jié)合CXCR4受體多肽的制備與標記,應用于 CXCR4介導的乳腺癌靶向診斷與靶向放射性治療。治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽來源于HHV8 MIP-II N端部分 氨基酸序列,通過化學合成法并進行D型氨基酸修飾獲得。NT21MP具有特異性結(jié)合CXCR4的作用,并無生理性生物活性作用, 是趨化因子受體結(jié)合劑。NT21MP可下調(diào)乳腺癌細胞的CXCR4的活性表達,對SDF-1引起細胞粘附和趨化有劑量依賴的阻斷作用,可阻斷SDF-la/CXCR4間作用,是 CXCR4受體的封閉劑。NT21MP可用于治療趨化因子受體CXCR4相關(guān)疾病如惡性腫瘤的轉(zhuǎn) 移和HIV-1感染等。NT21MP可抑制乳腺癌原發(fā)瘤的生長、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié) 的形成。NT21MP可用99mTc標記。標記的99mTc-NT21MP可耙向結(jié)合與乳腺癌 轉(zhuǎn)移小鼠的腋窩淋巴結(jié)。通過放射性標記多肽,可術(shù)前術(shù)中靶向診斷乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和術(shù)后 靶向放射性治療。NT21MP可下調(diào)HER2的表達,并提高Herceptin抑制乳腺癌細胞株增 殖的藥物敏感性。本發(fā)明來源于HHV8 MIP-II的CXCR4受體拮抗活性肽是利用趨化因 子家族高度同源的特點,利用多序列比較分析來尋找與CXCR4受體結(jié)合 的多個趨化因子間的高度保守區(qū),也就是它們可能與CXCR4受體結(jié)合相 關(guān)的區(qū)域或殘基。通過分子三維空間顯示的方法來分析這些位點的空間位 置的基礎上遴選出包含有CXCR4受體結(jié)合位點的而且來源于vMIP-II的 多肽片段,并利用生物信息學軟件分析多肽片段是否具有與CXCR4特異 結(jié)合的生理性趨化因子相應部位相似的空間結(jié)構(gòu)。然后通過化學合成法取 得相應的源于vMIP-II的CXCR4受體拮抗活性多肽。本發(fā)明所述的多肽的前十個氨基酸進行D型氨基酸修飾,增強了其受 體結(jié)合活性。本發(fā)明所述的多肽具有特異性結(jié)合CXCR4的作用,但無生理性生物 學活性作用,是趨化因子受體的封閉劑。可下調(diào)細胞表面CXCR4的表達, 并抑制生理性趨化因子SDF-la對CXCR4高表達乳腺癌細胞的粘附和趨化 活性。本發(fā)明所述多肽能與體內(nèi)生理性趨化因子競爭結(jié)合趨化因子受體,從 而阻斷生理性趨化因子引起信號傳導作用,在趨化因子受體相關(guān)疾病如惡 性腫瘤的轉(zhuǎn)移,重癥貧血,動脈粥樣硬化等有治療作用。本發(fā)明所述多肽可抑制乳腺癌原發(fā)腫瘤的生長,并可抑制腋窩淋巴結(jié) 和肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明所述的多肽可下調(diào)PCNA,上調(diào)乳腺癌細胞的凋亡指數(shù)。本發(fā)明所述的多肽具有下調(diào)乳腺癌細胞株表面受體HER2的表達,從 而增加HER2特異性拮抗劑Herceptin的藥物敏感性。本發(fā)明所述多肽具有特異性結(jié)合CXCR4的作用,可靶向診斷乳腺癌 患者前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況。并可靶向增強腫瘤原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位局部放療。經(jīng)廣泛査閱國內(nèi)外各種公開出版物和醫(yī)學教科書,廣泛檢索世界各國 專利資料,均未見有與本發(fā)明相同的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多 肽的篩選與應用方法的發(fā)明。尤其是放射性標記后前哨淋巴結(jié)的檢測和術(shù) 后靶向放射性治療,因此本發(fā)明具有新穎性和創(chuàng)造性。由于本發(fā)明在制藥 工業(yè)中有著重要的應用,所以本發(fā)明具有實用性。由于乳腺癌的發(fā)病率已 逐漸上升到女性惡性腫瘤的首位,所以本發(fā)明具有重要的意義。本發(fā)明的優(yōu)點是(1)來源于趨化因子類似物的部分序列,僅結(jié)合受體 而無生理性刺激作用;(2)合成的多肽序列來源于乳腺癌轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用 的趨化因子受體CXCR4的唯一配體類似物,因此具有高特異性結(jié)合活性, 阻斷生理性趨化因子的趨化作用,可阻斷乳腺癌的靶器官轉(zhuǎn)移能力;(3)標 記的合成肽通過受體配體特異性結(jié)合, 一方面將其放射性與正常組織預定 閾表達水平進行比較,評價前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況,從而指導手術(shù)清掃區(qū)域; 另一方面,通過特異性的受體配體結(jié)合靶向作用,使局部放射性治療效果 提高。說明書附1為發(fā)明的NT21MP與CXCR4受體生理性趨化因子SDF-la的多重 序列對比分析,保守性極高的殘基位置由星號標記在序列下方的相應位置, 保守性稍低的殘基由打點標記出來;圖2 SDF-la與CXCR4受體結(jié)合模式圖;圖3 SDF-la和vMIP- II核磁共振圖比較;圖4不同濃度NT21MP作用后MCF-7和SKBR3細胞CXCR4的蛋白 表達(X400)。 A ,a.對照組;B,b. NT21MP Q.5昭;C, c. NT21MP 2嗎;D,d.NT21MP IO嗎;E,e. NT21MP 50ng/ml. A~E. MCF-7細胞;a~e. SKBR3細 胞;圖5不同濃度NT21MP作用后SKBR3和MCF-7細胞中CXCR4蛋白 的表達。l.對照組;2. NT21MP lpg/ml; 3. NT21MP 10pg/ml; 4.對照組;5. NT21MP lng/ml; 6. NT21MP 10嗎/ml.其中1~3為SKBR3細胞;4 6為 MCF-7細胞;圖6不同濃度NT21MP作用后SKBR3和MCF-7細胞中CXCR4 mRNA 的表達。M為Marker; l.對照組;2. NT21MP ljig/ml; 3. NT21MP 10jig/ml; 4. 對照組;5. NT21MP l嗎/ml; 6. NT21MP 10pg/ml.其中1~3為SKBR3細胞; 4 6為MCF-7細胞;圖7 NT21MP對乳腺癌細胞MCF-7細胞的黏附抑制作用;圖8 NT21MP對乳腺癌細胞MCF-7細胞的趨化抑制作用;圖9不同濃度NT21MP對乳腺癌細胞株SKBR3細胞周期變化的影響。 A.對照組;B.NT21MPlpg/ml;C.NT21MP10|ig/ml;
圖10不同處理組對乳腺癌細胞株SKBR3細胞周期變化的影響。A: 對照組;B:多肽處理組;C: Herceptin處理組;D:聯(lián)合用藥組;圖11荷乳腺癌小鼠腫瘤大小。1. NT21MP 500pig/Kg; 2. NT21MP 50ng/Kg; 3. NT21MP 5pg/Kg; 4.多西他賽17.86pg/Kg +NT21MP 50pg/Kg; 5.多西他賽17.86pg/Kg/;圖12荷乳腺癌小鼠轉(zhuǎn)移組腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。1. NT21MP 500pg/Kg; 2. NT21MP 50^g/Kg; 3. NT21MP 5ng/Kg; 4. Herc印tin 36.04jig/Kg+NT21MP 50ng/Kg; 5. Herc印tin 36 g;圖13荷乳腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移HE染色。l.NT21MP500ng/Kg;2.NT21MP 50pg/Kg; 3. NT21MP 5pg/Kg; 4. Herc印tin 36.04pg/Kg + NT21MP 5(Hig/Kg;5.Herc印tin 36.04pg/Kg; 6.荷乳腺癌小鼠未用藥組;圖14 99 Tcm-NT21MP在荷乳腺癌小鼠放射性活性。圖15荷乳腺癌小鼠腫瘤細胞PCNA檢領!)(X200)丄NT21MP500)ig/kg; 2. NT21MP 50ng/kg; 3. NT21MP 5pg/kg; 4. NT21MP 50pg/kg+Herc印tin 36.04嗎/kg; 5. Herc印tin 36. 04pg/kg; 6.荷乳腺癌小鼠未加藥組;7.試劑盒陽性片;8.陰性對照組;圖16荷乳腺癌小鼠腫瘤細胞凋亡檢測(X200)。 1. NT21MP500嗎/kg; 2. NT21MP 50pg/kg; 3. NT21MP 5pg/kg; 4. NT21MP 50ng/kg+Herc印tin 36.04pg/kg; 5. Herc印tin 36. 04|ig/kg; 6.荷乳腺癌小鼠未加藥組;7.試 劑盒陽性片;8.試劑盒乳腺癌標本對照組;具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例1, vMIP-II與CXCR4受體結(jié)合因子的多重序列對比分析 先選用與CXCR4受體特異結(jié)合的人源性趨化因子序列進行基于結(jié)構(gòu) 的多重序列對齊分析,在全部趨化因子序列中均存在的殘基即可能是與該 受體結(jié)合有關(guān)的殘基(即標準結(jié)合殘基模型的建立)。再將vMIP-II的序列 引入標準結(jié)合殘基模型中進行多重序列比較分析從而得出vMIP-II與該受 體結(jié)合有關(guān)的殘基即vMIP- II與受體結(jié)合高度相關(guān)的殘基。我們對從NCBI 獲得的幾種趨化因子的蛋白序列進行了序列比對(包括IL-8、 SDF-la、 MIP-1P、 RANTES)。從結(jié)果看,趨化因子的C末端均有三股反平行的P -片層包繞的a-螺旋,帶大量的電荷,是和肝素或GAG低親和結(jié)合位點, 這種低親和結(jié)合對形成趨化梯度、穩(wěn)定高親和力結(jié)合、刺激細胞的活化都 有作用。而N末端有很大的活動度,是和相應受體高親和作用的部位,趨 化因子通過和相應受體的高親和結(jié)合產(chǎn)生生物學功能。趨化因子完全發(fā)揮 其生物學功能需要高親和結(jié)合和低親和結(jié)合同時發(fā)揮作用。由于SDF-la 唯一的受體是CXCR4,因此推測SDF-1 a的N端可能是結(jié)合CXCR4的部 分。采用EMBLClustalw軟件進行蛋白序列多重對齊比較分析SDF-lct和 vMIP-II的同源性。從圖1 (在比對下方, 一些位點被標記為星號或圓點,這些標記分別 顯示這些殘基在序列中是絕對或是高度保守的)的結(jié)果可以看出vMIP-II 與SDF-1 a具高度同源性,SDF-1 a與CXCR4結(jié)合位點的主要在變異較 大的N端,而SDF-1 a N端前23個和vMIP- II N端前20個氨基酸序列為 信號肽。因此,根據(jù)圖1上面序列分析和殘基空間位置分析結(jié)果,可以設 計對應CXCR4受體結(jié)合理論位點的多肽,具有結(jié)合CXCR4活性,但無生理性趨化因子的生物學活性。本發(fā)明的源于HHV8 MIP-II的CXCR4受體 拮抗活性多肽分別包含對應CXCR4結(jié)合理論位點的多肽,序列是 LGASWHRPDKCCLGY(NT21MP)。并將前1 10個氨基酸進行D型氨基 酸修飾。實施例2, NT21MP的制備。本發(fā)明所述的多肽是在生物信息學分析的基礎上,得到vMIP-II與 CXCR4受體的結(jié)合位點,然后通過化學合成法獲得。實施例3, NT21MP下調(diào)乳腺癌細胞表面表達的CXCR4受體。 SK-BR3及MCF-7乳腺癌細胞株分別加不同濃度的NT21MP處理后, 分別以免疫組化、RT-PCR及Western blot法,檢測NT21MP對細胞表面 CXCR4受體蛋白表達的影響。實驗結(jié)果顯示,相對與陰性對照組,NT21MP 可明顯降低細胞內(nèi)CXCR4的表達量。實施例4, NT21MP的對乳腺癌細胞的趨化、黏附和增殖活性。 SKBR3細胞預先用不同濃度NT21MP處理后,分別加到平板內(nèi)和 Transwell趨化小室上室。未經(jīng)NT21MP處理的細胞作為空白對照,用含有 SDF-la (stromal cell-derived factor-la)的培養(yǎng)基作為陽性對照。觀察 NT21MP作用下SKBR3細胞的黏附和趨化活性。實驗結(jié)果顯示NT21MP 具有特異性結(jié)合趨化因子受體CXCR4的作用,是一個高效而特異的 CXCR4拮抗劑,能結(jié)合趨化因子受體,卻不引起乳腺癌細胞趨化、黏附及 增殖活性,為趨化因子受體的封閉因子。實施例5, NT21MP對生理性趨化因子引起的細胞趨化抑制實驗。 SKBR3細胞預先分別用不同濃度的NT21MP處理30min。未經(jīng)多肽 處理的細胞作為空白對照。加到Transwell趨化小室上室,下室加1640培 養(yǎng)基(含SDF-la),孵育30min,收集遷移到下室的細胞并用血細胞記數(shù) 板記數(shù)。觀察NT21MP封閉SKBR3細胞表面的趨化因子受體而導致的趨 化抑制作用。實驗結(jié)果顯示,NT21MP對SDF-1引起細胞趨化有劑量依賴 的阻斷作用,是CXCR4受體的拮抗劑。乳腺癌轉(zhuǎn)移正是以特異性耙器官 表達的SDF-la對高表達CXCR4的乳腺癌趨化作用實現(xiàn)的。NT21MP通過 拮抗和封閉CXCR4受體,與體內(nèi)生理性趨化因子競爭結(jié)合趨化因子受體,有效阻斷SDF-lci/CXCR4的相互作用,阻斷SDF-la引起的白細胞趨化 活動以及細胞內(nèi)鈣離子流動,具有抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。實施6, NT21MP對乳腺癌細胞株CXCR4表達及細胞周期的影響。 為進一步探討NT21MP生物學活性的潛能及其可能的信號機制,通過 RT-PCR、免疫組化、共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測NT21MP對乳腺癌 細胞株SKBR3中CXCR4表達和細胞周期的影響。結(jié)果顯示,SKBR3細 胞高表達CXCR4和HER2。 NT21MP顯著下調(diào)SKBR3細胞中CXCR4受 體的表達。通過細胞周期測定,NT21MP在lug至lOug的濃度范圍對 SKBR3細胞周期影響與對照組相比無明顯變化(P〉0.05)。實施例7, NT21MP對乳腺癌化療藥物多西他賽和郝賽汀的敏感性影響。為進一步了解CXCR4與HER2在癌轉(zhuǎn)移機制中的相關(guān)性,我們選擇 了兩者均高表達的細胞株SKBR3。 NT21MP和Herceptin可下調(diào)SKBR3細 胞中CXCR4和HER-2的表達;Herceptin顯著抑制SKBR3細胞的生長。 與NT21MP聯(lián)合用藥后增加了 herceptin的敏感性;herceptin作用后細胞周 期阻滯于G1期,并且能減少S期的比例,與NT21MP聯(lián)合作用后,細胞 周期又進一步阻滯于G2期,S期細胞進一步降低。實施例8,體內(nèi)抗乳腺癌發(fā)展及抑制轉(zhuǎn)移作用。已建立近交系小鼠BALB/C小鼠,乳腺癌細胞株4T1建立的乳腺癌小 鼠模型。試驗以乳腺癌臨床化療藥物多西他賽為抑瘤組陽性對照,以郝賽 汀為轉(zhuǎn)移組的陽性對照。NT21MP設不同劑量組及聯(lián)合用藥組,靜脈注射 給藥,每日一次,連續(xù)給藥4w,每5天停藥2天。結(jié)果顯示,在成功制造 動物模型的基礎上,各劑量組NT21MP抗小鼠乳腺癌的效應與陰性對照組 比較有明顯的抗腫瘤增殖和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療作用,肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯減 少減??;在小鼠乳腺癌模型中,除檢測上述指標以外,檢測了肝、腎功能 的生化指標,結(jié)果顯示NT21MP明顯改善肝腎功能,血清ALP、 ASP及肌 酐均較未用藥組明顯下調(diào),差異有顯著性意義;采用免疫組化S—P法檢測 PCNA,結(jié)果顯示,相對于陰性對照組,多肽作用下PCNA指數(shù)呈劑量依 賴性下調(diào)(尸<0.01),尤其以聯(lián)合用藥組明顯;TUNEL法檢測小鼠腫瘤組織凋亡,陽性結(jié)果判定標準為凋亡的細胞核中有棕黃色顆粒。凋亡指數(shù)AI (凋亡細胞個/104ixm2) =10個視野凋亡細胞的平均數(shù)/每個視野的面積。 結(jié)果陰性對照組凋亡細胞形態(tài)典型,相對于陰性對照組,多肽用藥組凋亡 指數(shù)呈劑量依賴性提高(P<0.01),以聯(lián)合用藥組顯著。 實施例9, NT21MP的同位素標記及前哨淋巴結(jié)的檢測。 以"m丁c標記NT21MP,放射性標記率〉98%。小鼠種瘤7天,出現(xiàn)腫 塊后,分4點注射于腫塊周圍腺體內(nèi),按摩乳腺數(shù)分鐘。剝離腋窩淋巴結(jié), 制備勻漿,以Y探測儀測定放射性活性。轉(zhuǎn)移判定標準,以測定淋巴結(jié)放 射性活性高于空白對照組10倍以上,同時送肺組織標本常規(guī)病理檢査, HE染色。結(jié)果顯示,腋窩淋巴結(jié)陽性率與肺轉(zhuǎn)移有直接相關(guān)性。上述本發(fā)明的實施例,并不用于限制本發(fā)明。對于本領域的技術(shù)人員 來說,本發(fā)明可以有類似的變化和更改。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi), 所作的任何修改,改進等,均應包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選與應用來源于HHV8 MIP-II N端特異結(jié)合CXCR4受體多肽的制備與標記,應用于CXCR4介導的乳腺癌靶向診斷與靶向放射性治療。
2. 如權(quán)利要求1所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選與應 用,其特征在于來源于HHV8MIP-IIN端部分氨基酸序列,通過化學合成 法并進行D型氨基酸修飾獲得。
3. 如權(quán)利要求2所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選與應 用,其特征在于NT21MP具有特異性結(jié)合CXCR4的作用,并無生理性生物 活性作用,是趨化因子受體結(jié)合劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選與應 用,其特征在于NT21MP可下調(diào)乳腺癌細胞的CXCR4的活性表達,對SDF-1 引起細胞粘附和趨化有劑量依賴的阻斷作用,可阻斷SDF-ld/CXCR4間作 用,是CXCR4受體的封閉劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選與應 用,其特征在于NT21MP可用于治療趨化因子受體CXCR4相關(guān)疾病如惡性 腫瘤的轉(zhuǎn)移和HIV-1感染等。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選 與應用,其特征在于NT21MP可抑制乳腺癌原發(fā)瘤的生長、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的形成。
7. 如權(quán)利要求2或3所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選 與應用,其特征在于NT21MP可用",c標記。標記的99mTc-NT21MP可耙 向結(jié)合與乳腺癌轉(zhuǎn)移小鼠的腋窩淋巴結(jié)。
8. 如權(quán)利要求2至7中任一權(quán)利要求所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮 抗性多肽的篩選與應用,其特征在于通過放射性標記多肽,可術(shù)前術(shù)中耙 向診斷乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和術(shù)后耙向放射性治療。
9. 如權(quán)利要求2或3所述的治療乳腺癌的CXCR4受體拮抗性多肽的篩選 與應用,其特征在于NT21MP可下調(diào)HER2的表達,并提高Herceptin抑制 乳腺癌細胞株增殖的藥物敏感性。
全文摘要
本發(fā)明提供了作用于治療CXCR4受體介導的乳腺癌的多肽藥物的篩選、修飾方法、標記及其應用。比較人源性趨化因子SDF-1α與人皰疹病毒8 MIP-II的同源區(qū)域,得到vMIP-II與CXCR4受體的結(jié)合位點,獲得CXCR4特異結(jié)合活性肽。具有特異結(jié)合CXCR4的作用,阻斷生理性SDF-1α與CXCR4的結(jié)合,是一個高效而特異的趨化因子受體拮抗劑??梢种埔吧蚐DF-1α對乳腺癌細胞的趨化活性及乳腺癌細胞的生長,同時抑制CXCR4陽性腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移,具有雙重靶效應。本發(fā)明還提供標記性多肽靶向定位于前哨淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移部位,用于乳腺癌術(shù)前術(shù)中前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的檢測和靶向放射性治療。
文檔編號G01N33/68GK101334411SQ20081001686
公開日2008年12月31日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者丁勇興, 楊清玲, 陳昌杰 申請人:楊清玲