專利名稱：多孔生物測定襯底以及用于生產(chǎn)這種襯底的方法和設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對某些分析物來分析生物樣本流體的領(lǐng)域，并且尤 其涉及適于在生物樣本流體中檢測至少一個分析物的多孔生物測定 襯底。具體來說，本發(fā)明允許對生物樣本流體進行準確且高效的分析。 本發(fā)明進一步涉及一種用于通過將多種物質(zhì)沉積到該襯底上來生產(chǎn) 生物測定襯底的方法，并且涉及一種可通過該方法獲得的生物測定襯 底。本發(fā)明還涉及一種用于針對樣本流體中存在的一個或多個分析物 分子來分析樣本流體的方法。所述分析物可以包括能夠結(jié)合到襯底上
的捕獲探針的任何化合物(compound)，包括目標生物化合物、蛋白 質(zhì)、DNA等。該方法可以用于分子診斷試驗，例如用于測量傳染病的 病原體和抗病基因的存在。
背景技術(shù)：
分析物生物流體(如人類的血液或組織樣本)中的某種細菌、病毒和 /或真菌的存在和/或濃度。捕獲探針具有對預(yù)定指示因子的選擇性結(jié) 合能力，所述指示因子例如為蛋白質(zhì)、屬于特定細菌、病毒或真菌的 DNA或RM序列。在微陣列技術(shù)中， 一組特定捕獲探針例如通過印刷 固定在生物傳感器固體襯底的特定位置處，其中這組捕獲探針中的每 一個被選擇來特別地與一個特定的目標生物化合物相互作用(例如在 DNA微陣列的情況下的雜交)。合適的探針可以包括含有特定指示因 子(indicative factor )的生物5危體，例々口特定DNA序歹寸和/或抗體 的溶液。在襯底已經(jīng)裝配了這樣的捕獲探針之后，強制分析物流體流 過(flow through)該襯底，或強制析物流體在該襯底上流過(flow over)。為了能夠在分析物流體中使得指示因子的存在可視化，分析 物流體的分子可以例如具有焚光和/或磁性標記。在ELISA(酶聯(lián)免 疫吸附法)的情況下，將酶而不是放射性標記附著到第二抗體。隨后 通過該酶的催化作用形成強烈的有色或熒光化合物。分析物流體的(標記)分子附著到襯底中的那些對所考慮的分子具有結(jié)合能力的捕 獲探針上。至少在使用熒光標記時，這使得在特定因子附著到的斑點 上產(chǎn)生可檢測的熒光。所捕獲的分子典型地通過利用光源的照明以及
例如在CCD相機的輔助下記錄的熒光圖案來讀取。所述記錄的圖案是 細菌或一組細菌存在的特征。通過向捕獲探針提供對于不同因子的不 同特異性，所述陣列可以用于同時對多種不同的因子進行測定。使用 這樣的陣列使得能夠在單次運行中實現(xiàn)用于大量因子的分析物流體 的高通量篩選。
為了確保高通量篩選的良好質(zhì)量和效率，所希望的是將分析物流 體的盡可能多的標記分子結(jié)合到襯底的那些對所考慮的分子具有結(jié) 合能力的探針上。當分子的結(jié)合(或在DNA鏈的情況下的雜交)不夠 時，可能漏掉某些指示因子并且/或者熒光圖案不可以被清楚地區(qū)分 并且/或者在某種其它意義下是有缺陷的。雖然已知的生物測定襯底 以及用于生成這種生物測定襯底的方法產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)合效率，
種生物測定襯底的方法。而且，具有增加的分析速度的快速篩選是所 希望的，特別是在臨床診斷領(lǐng)域中更是如此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有改進的結(jié)合效率的多孔生物測定 襯底，其包括用于PCR和/或電泳的襯底。本發(fā)明的另一個目的是提
法。本發(fā)明的另」個目的是提供^"種用于生產(chǎn)這種襯底的設(shè)備，其能 夠?qū)⒍喾N物質(zhì)沉積到所述襯底上。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用 于檢查分析物流體(如人類的血液或組織樣本)中的某些細菌、病毒 和/或真菌的存在的方法，該方法具有改進的分析效率。
可以通過包括一個或多個捕獲探針的多孔生物測定襯底來實現(xiàn) 上述目的，該捕獲探針的每一個能夠特定地結(jié)合至少一個目標分析 物，其中在尺寸大于襯底孔徑分布05。的孔中的捕獲探針的平均濃度 至少等于尺寸小于05。的孔中的捕獲探針的平均濃度。廣義地說，通 過提供其中平均來說較大孔包括較高濃度的捕獲探針的襯底，與已知 的生物測定襯底相比，獲得了結(jié)合效率增加的襯底。本發(fā)明的另一個優(yōu)點在于，對于流過和流過其上的配置二者，都可以更快地執(zhí)行分析。 當施加了外部壓力時，尤其如此。
在根據(jù)本發(fā)明的多孔生物測定襯底的優(yōu)選實施例中，尺寸大于
05。的孔中的捕獲探針的平均濃度至少是尺寸小于05。的孔中的捕獲探
針的平均濃度的兩倍，甚至更優(yōu)選地至少是尺寸小于0s。的孔中的捕
獲探針的平均濃度的5倍，以及最優(yōu)選地至少是尺寸小于05。的孔中 的捕獲探針的平均濃度的10倍。
本發(fā)明的優(yōu)點對于具有寬孔徑分布的襯底尤其顯著。特別優(yōu)選的 襯底具有這樣的孔徑分布使得(09。-01()) > 205Q。更優(yōu)選的生物測 定襯底具有這樣的孔徑分布使得(09。-0,。) > 505。。另一個優(yōu)選的 生物測定襯底具有這樣的孔徑分布使得(09。-05。) > 205。且(05。-010) > 2010。
根據(jù)本發(fā)明，還提供一種用于生產(chǎn)這種生物測定襯底的方法。在 該方法中，多個捕獲分子溶液例如從噴墨印刷設(shè)備的印刷頭釋放到該 多孔襯底上，并且該襯底具有失活(activating)介質(zhì)，其具有比捕 獲分子溶液的溶劑更低的蒸發(fā)率和/或更高的沸點。優(yōu)選地，在將捕 獲探針分子溶液釋放到該襯底上之前，向該襯底提供失活的介質(zhì)。而 且，特別優(yōu)選的方法還包括另一個步驟處理該襯底使得在將捕獲分 子溶液釋放到該襯底上之前使部分所述失活介質(zhì)從襯底蒸發(fā)。通過用 帶有指示特征(indicated characteristics)的失活介質(zhì)來處理襯 底，襯底的至少部分孔被(暫時)阻擋。然而，該失活介質(zhì)將更容易 從較大的孔蒸發(fā)。當失活介質(zhì)的被迫蒸發(fā)或自然蒸發(fā)發(fā)生時，襯底中 的較小的孔將至少部分地保持被阻擋。當將捕獲探針溶液施加到或進 入襯底時，所述(被阻擋的)較小的孔將在較小程度上可用于攝入 (uptake)捕獲探針溶液，因此捕獲探針溶液優(yōu)選地滲透并附著到較 大孔的表面。因為分析物流體更容易滲透所述多孔襯底中的較大的 孔，這就導(dǎo)致本發(fā)明的生物測定襯底的所期望的增長的結(jié)合效率。這 個優(yōu)點在流過配置中特別顯著，在流過配置中，流動受到毛細管力的 影響比受到壓降的影響更小。
具有比捕獲分子溶液的溶劑更低的蒸發(fā)率和/或更高的沸點的任 何失活介質(zhì)在原則上可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法。優(yōu)選地，所述失活 介質(zhì)包括具有比捕獲分子溶液的溶劑更低的蒸發(fā)率和/或更高的沸點的液體。更優(yōu)選的是，失活液體包括丙烯醇、醚以及從中獲得的酯、 和/或其混合物。
根據(jù)本發(fā)明的方法和測定襯底的額外的優(yōu)點在于，與迄今已知的 相比，對于相似的吞吐量，它需要更少的要被印刷的捕獲探針并且/ 或者需要更少的分析物流體。兩個優(yōu)點都降低了分析的成本。而且， 為了改進檢測限制，可能要執(zhí)行更多的流體混合和雜交的步驟，由此 增加分析時間。然而根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，與本領(lǐng)域公知的方法 相比，顯著減少了分析時間。
本發(fā)明進一步提供一種設(shè)備，并且具體地提供一種用于生產(chǎn)這種
生物測定襯底的噴墨設(shè)備。根據(jù)本發(fā)明的噴墨設(shè)備包括用于容納要 印刷到襯底上的物質(zhì)的容器，該設(shè)備包括至少一個印刷頭；以及分別 用于印刷頭和襯底的安裝裝置，其中該設(shè)備包括用于向襯底提供具有 比捕獲分子溶液的溶劑更低蒸發(fā)率的失活介質(zhì)的裝置。下面將更詳細 地描述該設(shè)備的特別優(yōu)選的實施例。
本發(fā)明還提供一種用于檢查分析物流體中的某些細菌、病毒和/ 或真菌的存在的方法，所述分析物流體諸如為人類的血液或組織樣 本。在該方法中，強制分析物流體流過根據(jù)本發(fā)明的襯底或者流過該 襯底之上。由于所述襯底材料是多孔的，所以流過是可能的。目標生 物化合物的結(jié)合是樣本流體自由和/或被迫流過生物測定襯底(即從 下表面到上表面或反之亦然)和/或通過在襯底上從位置A到位置B 的橫向流動的結(jié)果。為了增加結(jié)合的機會，可以重復(fù)流過若干次。本 發(fā)明的襯底具有額外的優(yōu)點對于相似的結(jié)合效率，這樣的泵吸周期 的數(shù)量可以更少。
如這里所使用的且除非另外聲明，術(shù)語《微陣列測定》表示這樣 的測定其中涉嫌(suspect)包括目標生物化合物的樣本流體(優(yōu) 選地為生物流體樣本(可選地包括懸浮在其中的較少數(shù)量的固體或膠 體顆粒))與生物傳感器固體襯底相接觸(即，流過其上或流過)， 其中該生物傳感器襯底包括跨越其表面的多個離散和孤立的區(qū)域，每 一個所述區(qū)域都具有一個或多個施加到其上的探針，并且針對探針的 特定地與目標生物化合物結(jié)合的能力來選擇每一個所述探針。顯然， 不是每一種沉積在襯底上的流體都需要成為探針，即具有結(jié)合特定分 析物的能力。所述測定還可以包括其他流體，如用于校準目的的流體、網(wǎng)格標識器等等。這種流體可能已經(jīng)包括標記。
如這里所使用的且除非另外聲明，術(shù)語《分析物》或《目標生物 化合物》表示被確定作為分析目標或分析點的生物分子化合物。它包
括生物分子化合物，諸如但不限于核酸及其相關(guān)化合物(例如DNA、 RNA、寡核苷酸及其相似物、PCR產(chǎn)物、基因組DNA、細菌人工染色體、 質(zhì)粒等等)、蛋白質(zhì)及其相關(guān)化合物(例如多肽、肽、單克隆抗體或 多克隆抗體、可溶性或結(jié)合受體、轉(zhuǎn)錄因子等等)、抗原、配體、半 抗原、碳水化合物及其相關(guān)化合物(例如，多糖、寡糖等等)、諸如 薄膜片段的細胞片段(cellular fragment)、細胞器、完整細胞、 細菌、病毒、原生生物等等。
如這里使用的且除非另外聲明，術(shù)語《捕獲探針》表示一種生物 制劑，其能夠在存在所述目標生物化合物或與之反應(yīng)時特定地與《目 標生物化合物》或《分析物》相結(jié)合，并且用于檢測所述目標生物化 合物的存在。探針包括生物分子化合物，諸如但不限于核酸及其相關(guān) 化合物(例如DNA、 RNA、寡核苷酸及其相似物、PCR產(chǎn)物、基因組 DNA、細菌人工染色體、質(zhì)粒等等)、蛋白質(zhì)及其相關(guān)化合物(例如 多肽、單克隆抗體、受體、轉(zhuǎn)錄因子等等)、抗原、配體、半抗原、 碳水化合物及其相關(guān)化合物(例如，多糖、寡糖等等)、細胞器、完 整細胞等等。探針還可以包括特定物質(zhì)，如目標化合物與之結(jié)合的某 些生物聚合物。
如這里所使用的且除非另外聲明，術(shù)語《標記》表示生物或化學 的制劑，其具有可通過適當?shù)难b置來檢測的至少一個物理屬性(比如 但不限于放射性(radioactivity)、光學屬性、磁性)，從而使得 能夠確定其空間位置和/或所述可檢測物理屬性的強度，所述標記諸 如但不限于發(fā)光分子(例如熒光劑、磷光劑、化學發(fā)光劑、電學發(fā)光 劑、生物學發(fā)光劑等等)、有色分子、在反應(yīng)時產(chǎn)生顏色的分子、酶、 磁珠、放射性同位素、可特定結(jié)合的配體、可由聲波共振檢測的微泡 等等。
參照下面所描述的實施例并結(jié)合通過實例示出本發(fā)明原理的附 圖，本發(fā)明的這些和其他方面將變得顯然并被闡明。


在附圖中
圖1示意性示出了根據(jù)本發(fā)明的可通過將捕獲探針印刷到襯底 上而獲得的生物試驗陣列；
圖2示意性示出了根據(jù)本發(fā)明的具有多孔襯底的生物測定設(shè)備； 圖3表示根據(jù)本發(fā)明的多孔襯底的照片；
圖4示意性示出了根據(jù)本發(fā)明的多孔襯底的實施例的開孔孔徑 分布。
具體實施例方式
將通過特定實施例并參考某些附圖來描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不 限于此，而僅僅受權(quán)利要求的限定。權(quán)利要求中的任何附圖標記不應(yīng) 被解釋為限制其范圍。所描述的附圖僅僅是示意性的而非限制性的。 在附圖中，為了說明性的目的， 一些元件的尺寸被夸大并且不是按比 例繪制。在術(shù)語"包括"用于本說明書和權(quán)利要求的地方，它不排除 其他元件或步驟。在指示單數(shù)名詞時使用定冠詞或不定冠詞如"一"、 "一個"或"這"的地方，除非另外特別地聲明，這包括多個該名詞。
而且，說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語第一、第二、第三等被用 于區(qū)分相似的元件，但不一定用于描述先后順序或時間順序。應(yīng)當理 解，如此使用的術(shù)語在適當情況下是可交換的，并且這里所描述的本 發(fā)明的實施例能夠以除這里所描述和示出的順序之外的順序來操作。
圖1示出通過將多個捕獲探針斑點(2)沉積(優(yōu)選地通過將其 噴墨印刷)在多孔襯底(102)(比如薄膜)上而獲得的生物試驗陣 列(1)。根據(jù)本發(fā)明的方法，在印刷捕獲斑點(2)之前已經(jīng)用失活 介質(zhì)(并且在該特定實例中用乙二醇)處理了村底(102)。在所示 的實例中，試驗陣列(1)被128個斑點(2)的圖案覆蓋，該圖案包 括以預(yù)定圖案印刷的43種不同的生物流體。斑點(2)被編號，并且 每個編號表示唯一的基因序列或包括參考材料。注意到，基因序列在 陣列(1)中的多個相互距離較遠的位置上多次重復(fù)出現(xiàn)。多孔襯底 (102)被安裝在支持結(jié)構(gòu)(4)上。具有支持結(jié)構(gòu)或支架(4)的多 孔襯底(102)被放置在藥筒(cartridge) (5)中。圖2中示出了 典型的設(shè)置。在外殼(10)中，要被分析的樣本流體(16)在腔(15 ) 中提供并且在入口 (3)處施加壓力。該壓力迫使樣本流體(16)向下通過多孔固體襯底(102)。如果希望的話，玻璃板(7)允許對固 體襯底(102)的光學分析。提供了用于分析固體襯底(102)關(guān)于一 個或多個目標生物混合物的存在的分析裝置(25 )。所述分析裝置(25 ) 可以包括光源和光學檢測路徑、透鏡、濾波器、數(shù)碼相機等，以測量 所述光學熒光圖案。可以存在其他裝置(26)，例如用于分析固體襯 底溫度、填充孔容積以及其他想要監(jiān)測的參數(shù)。虛線表示裝置U5) 和(26)可以最終組合為單一的設(shè)備(例如光學檢測裝置，如CCD相 機或其他任何種類的光學檢測設(shè)備，其中相機僅僅是一種可能的裝 置。其他可能的裝置包括光電檢測器或顯微鏡)?？梢砸?guī)定樣本流體
(16)多次循環(huán)通過腔(15)和襯底(102)。優(yōu)選地，襯底(102) 連續(xù)地或間歇地但是有規(guī)則地被樣本流體(16)浸濕。通過強迫分析 物流體通過多孔襯底來分析該分析物流體中的某種細菌、病毒和/或 真菌的存在。樣本流體自由和/或被迫流過生物測定襯底的表面(即 從下表面流到上表面或反之亦然)使得分析物流體與捕獲探針相接 觸，這允許目標生物混合物結(jié)合到這些能夠與其結(jié)合的捕獲探針。更 特別地，使得包括具有對于不同細菌的DNA的不同基因序列特征的樣 本流體(比如PCR產(chǎn)物)與包括斑點(2)陣列的多孔襯底(102)相 接觸。不同的MA類型(基因序列)附著到不同的印刷的捕獲探針。 在圖l所示的實施例中，不同的斑點是可視化的。編號1到18表示 9個不同的病原體和9個阻力。為了測量的可靠性，相同的生物選擇 性捕獲材料可以被印刷在薄膜(102)的四個不同象限(11， 12， 13， 14)中。在每一個象限(11， 12， 13， 14)中，相同編號的斑點具有 不同的相鄰斑點，從而防止不太強烈的斑點(2)因為過度暴露
(overexposure )于相鄰的斑點而不被檢測?？梢詫姸刃拾唿c(Rl 到RIO)印刷在薄膜(102)上，以及將四個斑點(D)印刷在薄膜的 角落以用于在薄膜(102)上的強度校準分布。也印刷了 PCR控制斑 點(Pl， P2)以通過PCR驗證合適的DNA放大。
如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的生物試驗陣列優(yōu)選地包括總共130個 斑點，但也可以包括更多的斑點，例如超過1000個。斑點的典型直 徑低于100-300jum，但還可以甚至更低，并且它們;故定位為間距典 型小于400jam的圖案中，所述間距優(yōu)選地小于300 n m。所述斑點優(yōu) 選地以周期性圖案來印刷，例如以正方形、矩形或六邊形的結(jié)構(gòu)來印刷。此外，典型地將大量的不同生物流體(優(yōu)選地為ioo個或更多)
印刷到薄膜上(102)。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種多孔生物測定襯底，其包括一個或多個能 夠分別特定地結(jié)合一個目標分析物的捕獲探針，其中在尺寸大于襯底 的孔徑分布05。的孔中的捕獲探針的平均濃度至少等于尺寸小于05。 的孔中的捕獲探針的平均濃度。廣義地說，通過提供其中平均來說更 大的孔包括更高濃度的捕獲探針的襯底，與已知的生物測定襯底相 比，獲得了結(jié)合效率增加的襯底。生物測定襯底通常由多孔材料制成， 該多孔材料具有帶有孔徑分布的內(nèi)孔。圖3示出具有優(yōu)選的寬孔徑分 布的合適生物測定襯底的照片。從圖3容易推斷出，典型的多孔襯底 包括處于從幾納米(nm)到微米(iLiin)范圍內(nèi)的開口孔徑。當向已 知的薄膜提供捕獲探針時，由于毛細管力、溶劑的蒸發(fā)以及由于表面 張力的作用等等，所述探針優(yōu)選地附著到較小的孔的內(nèi)表面。然而， 分析物流體的流動輸運(特別是在濕潤的薄膜的情況下)更容易通過 較大的孔發(fā)生，這是因為這些孔對于流過的阻力更低。由于平均來說， 已知襯底中的較大孔包括較少的捕獲探針分子，捕獲探針分子與分析 物流體特定結(jié)合的可能性將低于預(yù)期，并且因此將出現(xiàn)下降的結(jié)合效 率。發(fā)明人已經(jīng)首次設(shè)計了一種生產(chǎn)襯底(在該襯底中，平均來說與 較小的孔相比，較大的孔包括更多的捕獲探針分子)方法，并且因此 獲得了增加的結(jié)合效率和篩選方法，。
在本發(fā)明的上下文中，并參照圖4，尺寸0i。、 05。和09。是孔徑分 布的特征尺寸。如圖4所示，由在y軸上表示的一些度量30 (其表 示某一尺寸的孔的量、或相對表面、或體積分數(shù))相對于在x軸上表 示的開口孔徑31的曲線圖來表示孔徑分布。度量30當然依賴于用于 估計孔徑分布的特定測量技術(shù)。這樣定義特征尺寸Ow、 05()和09。使 得孔體積的10%小于或等于0lfl，孔體積的50。/。的小于或等于05。，以及 孔體積的90%的小于或等于09。。已知的若干方法本身可以用于估計所 述多孔襯底的孔隙度和孔徑分布。用于測量和/或量化孔徑和孔徑分 布的公知方法包括成像分析技術(shù)、氣體吸附以及侵入方法(如汞侵入 方法)。除其他因素之外，要使用的合適方法依賴于平均孔徑，例如 汞入侵是更合適的用于測量較大孔的方法。這些方法是眾所周知的并 且本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠沒有任何困難地選擇合適的測量方法。在孔中的捕獲探針的濃度也可以通過本領(lǐng)域中眾所周知的方法來估計。合 適的方法包括成像技術(shù)(光學和/或電子顯微鏡)與標準標記法的結(jié) 合使用。典型地，熒光或放射性標記或包括金屬納米顆粒的標記使用
允許分別通過(共焦的)熒光顯微鏡、通過x射線圖像板、和/或在
電子顯微鏡下檢測捕獲探針和它們的平均濃度。
在多孔生物測定襯底的優(yōu)選實施例中，在尺寸大于0s。的孔中的
捕獲探針的平均濃度至少是尺寸小于05。的孔中的捕獲探針的平均濃
度的兩倍。所述多孔生物測定襯底的更優(yōu)選實施例的特征在于，在尺
寸大于05。的孔中的捕獲探針的平均濃度至少是尺寸小于05。的孔中的
捕獲探針的平均濃度的五倍。如下面將變得顯而易見的那樣，在較大 的孔中的捕獲探針的平均濃度可能受到較小孔的體積百分比的影響， 其中所述較小的孔(暫時)在將捕獲探針溶液提供給襯底時不能訪問。 與現(xiàn)有技術(shù)的襯底相比，當村底本身具有相對較寬的孔徑分布 時，本發(fā)明的襯底的結(jié)合效率方面的可被觀察到的改進更大。因此特
別優(yōu)選的多孔生物襯底具有這樣的孔徑分布使得(09。-0le) > 205。， 以及更優(yōu)選地為使得(09。-0m) > 505Q。另一個優(yōu)選的生物測定襯 底具有這樣的孔孔徑分布使得(090-05。) > 205。且(05。-010) >2010。
口和/或通道的網(wǎng)絡(luò)?？诙嗫滓r底可以是納米多^或'微孔的，'即孔、開 口和/或通道的平均尺寸(以0"的值表征)可以適當?shù)匕诖蠹s 0. 05 jam到10. 0 jum之間。在一個實施例中，這個平均孔徑可以在0. 1 pm到3. Oium之間。在另一個實施例中，平均孔徑可以在大約0.2 jum到1/im之間。術(shù)語"孔隙度"通常意指或包括某一材料中的所 有孔或孔洞(void)相對于整個材料的體積的比率。換句話說，孑L隙 度通常是非固體體積占材料的總體積的比例。在本發(fā)明的意義中，術(shù) 語"開口孔隙度"(也被稱為有效的孔隙度)尤其意指或包括其中有 效地發(fā)生流體的流動的總體積中的部分。由于所述開口孔隙度本身在 本申請的上下文中是重要的(封閉的孔對于捕獲探針和樣本流體都不 可訪問)，所以除非另外明確地指出，術(shù)語"孔隙度"和"開口孔隙 度，，可交換地在本申請中使用。在本發(fā)明的意義中，孔隙度尤其是 0%體積到100 / 體積之間的分數(shù)。根據(jù)優(yōu)選實施例，所述孔隙度的范 圍從20%體積到98%體積，更優(yōu)選地為從30%體積到80%體積，并且更優(yōu)選地為從40%體積到70%體積。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述多孔襯底材料選自包括下列的
組
-非晶態(tài)聚合物，其優(yōu)選地來自包括下列的組PC(聚碳酸酯)、 PS (聚苯乙烯)、P固A (聚曱基丙烯酸曱酯)、聚丙烯酸酯、聚醚、 纖維素酯、硝酸纖維素、醋酸纖維素、纖維素或其混合物，
-半結(jié)晶聚合物，其優(yōu)選地來自包括下列的組PA(聚酰胺-尼 龍材料)、PTFE (聚四氟乙烯)、聚三氟乙烯、PE (聚乙烯)、PP (聚丙烯)、或其混合物，
-橡膠，其優(yōu)選地來自包括下列的組PU(聚氨酯)、聚丙烯酸 酯、基于硅烷的聚合物(如PDMS (聚二曱基硅氧烷))、或其混合 物，
-凝膠(-具有流體溶劑矩陣的聚合物網(wǎng)絡(luò))，其優(yōu)選地來自包 括下列的組瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、或其混合物
-金屬(如鋁、鉭、鈦)、兩種或更多金屬的合金，摻雜的金屬 或合金、金屬氧化物、金屬合金氧化物、或其混合物
或上述這些的混合物。這些材料已經(jīng)示出了本發(fā)明內(nèi)的合適材料。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，固體的多孔襯底材料的內(nèi)表面區(qū)域比該區(qū) 域的尺寸大X倍，其中因子X〉100。根據(jù)另一個實施例，因子X〉1000， 根據(jù)可替代實施例X>10000，以及根據(jù)又一個實施例，X>100000。
襯底的厚度不是本發(fā)明的限制性特征，并且該厚度可以在從大約
50nm到高達大約3jum或更高(例如高達lmm )之間變化。如果薄膜 是自由無束縳的，例如在流過(flow-through)設(shè)備(如上所述)的 情況下，襯底厚度可以處于這樣的范圍中從liim到數(shù)百jum，例如 從20lum至ij 400jam，或從50 p m至'J 200 ji m。
襯底(例如薄膜)的形狀和/或尺寸不應(yīng)當被認為是本發(fā)明的限 制性特征。它可以是例如直徑范圍在大約3mm到15mm之間的圓形， 但是任何其它襯底形狀(矩形，正方形，橢圓形，…)和/或尺寸也 可以是合適的。來適當選擇。例如，如果目標生物化合物是DNA,則探針可以是但不 限于合成的寡核苷酸、其類似物、或特定抗體。目標生物化合物的合 適修改的非限制性實例是置換了生物素的目標生物化合物，在該情況 下，探針可以承載抗生物素蛋白的功能。
在本發(fā)明的特定實施例中，若干不同的探針被沉積到襯底中和/ 或襯底上。在更具體的實施例中，在沿著所述固體襯底的一個表面的 物理上不同的位置上以陣列的方式定位(spotted)多個不同的探針， 以允許并行地測量不同的目標生物化合物。該實施例通常被稱為微陣 列。
為了更容易地支持隨后的檢查和識別， 一個或多個附加的斑點 (例如用于強度校準和/或位置檢測)也可定位到襯底材料的表面上。 定位可以由本領(lǐng)域中已知的任何方法來實施，所述方法例如但不限 于，噴墨印刷、壓電定位、機器人接觸印刷、微量吸管吸允等等。在 定位之后，由于襯底(例如薄膜)固有的或(例如經(jīng)激活)所獲得的 屬性自發(fā)地，或通過附加的物理處理步驟(比如但不限于例如通過烘 干、加熱、溫度處理步驟的交聯(lián)、或通過暴露于光源)，將探針固定 到襯底材料的表面上。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種用于生產(chǎn)生物測定襯底的方法，其中多個 捕獲分子溶液從至少一個印刷頭釋放到多孔襯底上，該方法包括以下
高的沸i的失J介質(zhì)。通過處理具有所指示特征的失^介質(zhì)的襯^底， 可以獲得改進的結(jié)合效率并且因此可以獲得改進的篩選方法。
雖然發(fā)明人不知道所述改進的準確原因，但是下面提供了嘗試性 的解釋。生物測定襯底由具有孔徑分布的內(nèi)部孔的多孔材料制成。當 向已知的薄膜提供捕獲分子溶液時，似乎合理的是，捕獲探針優(yōu)選附 著到較小探針的內(nèi)表面。事實上，捕獲分子溶劑被認為首先從較大的 孔蒸發(fā)，由此在較小的孔中局部地增加捕獲探針的濃度。特別地，當 薄膜是電荷中性的，則缺乏使得捕獲探針附著到薄膜表面的驅(qū)動力。 在捕獲分子溶液的溶劑的蒸發(fā)期間，溶解的捕獲分子在剩余流體中曰 益結(jié)塊直到它們形成凝膠。而且，由于毛細管力和表面張力，剩余流 體具有對最小孔的偏好。因此，凝膠化、沉降(分子到孔壁的)和最 終結(jié)晶和/或固定優(yōu)選地發(fā)生在最小的孔中。然而，分析物流體的流動輸運優(yōu)選地通過較大的孔發(fā)生。因為平均來說，越大的孔包括越少 的捕獲探針分子，所以將導(dǎo)致捕獲探針分子與分析物流體在流過期間 特定結(jié)合的可能性的降低，并且因此導(dǎo)致降低的結(jié)合效率。根據(jù)本發(fā)
質(zhì)的襯底，可以相信，襯底中的較小孔被失活介質(zhì)有效地(至少是部 分地和/或暫時地)填充或阻擋，并且長時間保持如此，并且優(yōu)選地 至少直到向襯底提供捕獲分子溶液和/或強迫分析物流體通過薄膜為 止。
在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法中，在將捕獲分子溶液釋放到襯底上之 前，向襯底提供失活介質(zhì)。雖然這對于根據(jù)本發(fā)明的方法不是必不可 少的，但是用失活介質(zhì)來預(yù)處理襯底通常產(chǎn)生比在將捕獲分子溶液釋 放到襯底上期間或之后用失活介質(zhì)來處理襯底的結(jié)合效率更高的結(jié) 合效率。
在根據(jù)本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實施例中，在將捕獲分子溶液釋放到
襯底上之前，在5秒到90分鐘之間的時限內(nèi)向襯底提供失活介質(zhì)。 甚至更優(yōu)選的是，在30秒到60分鐘之間的時限進行。最優(yōu)選的是在 l分鐘到30分鐘的時限進行。
根據(jù)本發(fā)明，在根據(jù)本發(fā)明的方法中可以使用與捕獲分子溶液的 溶劑相比蒸發(fā)更慢或在更高溫度時沸騰的任何介質(zhì)。所述介質(zhì)可以是 氣態(tài)的或流體。在本方法的優(yōu)選實施例中，失活介質(zhì)包括流體。這種 流體可以容易地通過任何適當?shù)姆椒ㄊ┘拥揭r底，如通過印刷技術(shù)活 通過浸涂。特別合適的失活流體包括丙烯醇化合物，從其獲得的乙醚 和/或酯，或它們的混合。合適的示例一般包括例如乙二醇、二甘醇、 三甘醇、四甘醇以及聚乙二醇，和/或它們與水的混合物。而且可有 利地使用(聚)丙二醇、丙二醇、二丙二醇等等，例如與具有極性的 聚乙二醇相比，后者是更低極性的溶劑。其他合適的示例包括對本二 酸酯或鄰苯二甲酸二辛酯。 一些失活流體可能需要附加的清洗步驟。
當實施根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法時，在捕獲分子的實際印刷的步驟 之前，襯底中的較小孔至少部分地被直接填充(臨時)了失活介質(zhì)。 這樣選擇失活介質(zhì)以使得其蒸發(fā)更慢并且優(yōu)選地明顯比用于印刷捕 獲分子的溶劑更慢，或在更高溫度下(高于沸點)蒸發(fā)。因此，捕獲 分子溶液優(yōu)選地采用具有比失活介質(zhì)更好溶解性的溶劑。在本發(fā)明的上下文內(nèi)，當?shù)谝徽舭l(fā)率比第二蒸發(fā)率低至少10%,優(yōu)選地低至少 30%,并且最優(yōu)選地低至少50%時，認為第一蒸發(fā)率顯著低于第二蒸 發(fā)率。雖然根據(jù)本發(fā)明的方法不限于此，但是當前使用的大多數(shù)捕獲 分子溶液是水溶液。這意味著在這種情況下的合適的失活介質(zhì)以比在 相同溫度和壓力條件的水更慢的速率蒸發(fā)。根據(jù)一般物理原理，毛細 管力與孔半徑成反比，并且因此其在最小的孔中最大。然而流動阻力 與孔半徑的四次方成反比，并且因此與毛細管力相比，隨著孔直徑的 降低，流動阻力增加得快得多。因此，將要花費一些時間來用失活介 質(zhì)填充襯底中的孔，并且特別地填充較小的孔。因此，在用失活介質(zhì) 處理村底的時間和已經(jīng)填充了失活介質(zhì)的孔的體積百分比(vol. -%) 之間存在折中。失活液體存在或與多孔襯底接觸的越長，則越多的孔 將最終填充有失活液體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法的特征在于，向襯底提供失活介質(zhì)，以使 得襯底中的孔的大約50°/。的體積填充有失活介質(zhì)。優(yōu)選地，孔的超過 80%的體積填充有失活介質(zhì)。在本方法的甚至更優(yōu)選的實施例中，向 襯底提供失活介質(zhì)以使得基本上襯底中的所有開口孔都被失活介質(zhì) 所填充。
為了加速處理，根據(jù)本發(fā)明來執(zhí)行另一個附加(可選的)的處理， 如清洗、溫度處理步驟、光照或暴露于氣流。
優(yōu)選地，在多孔襯底中的至少部分孔已經(jīng)填充了失活介質(zhì)之后， 向該村底提供合適的生物流體的捕獲探針陣列。根據(jù)本發(fā)明，使用適 合于該目的的噴墨設(shè)備來將多個捕獲分子溶液從至少一個印刷頭釋 放到該多孔襯底上。當捕獲分子溶液的液滴撞擊襯底表面時，至少部 分液滴材料由襯底的多孔結(jié)構(gòu)所占據(jù)，即進入襯底的至少一些孔中。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的方法包括另一個步驟使得該襯底受到 這樣的處理以便在將捕獲分子溶液釋放到襯底上之前使部分失活介 質(zhì)從襯底蒸發(fā)。該處理可以例如包括在壓力下施加空氣和/或其他 氣態(tài)介質(zhì)的流。這些流的施加導(dǎo)致較大的孔首先打開，即釋放那里存 在的任何物質(zhì)-如失活介質(zhì)。事實上，對于這些(較大的)孔來說， 毛細管力最低。在至少一些失活液體已經(jīng)蒸發(fā)了之后，將捕獲探針印 刷到襯底上。由于在捕獲分子溶液的溶劑與失活介質(zhì)之間的蒸發(fā)率的 不同，捕獲分子優(yōu)選地附著和/或開始附著到較大的孔的內(nèi)表面。由于分析物在其通過/沿著襯底被抽運時也優(yōu)選通過較大的孔，所以該 措施改進了雜交效率。本發(fā)明的方法提供對于在多孔襯底上和/或中 的分析物流體分布的改進的控制。而且，所述方法通過匹配孔(基于 尺寸選擇)來增強生物流體流動的捕獲可能性，其中捕獲探針優(yōu)選地 位于其中分析物優(yōu)選地正在流動的孔處。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，原則上可以使用具有任何孔隙度的任何 襯底。優(yōu)選的襯底包括具有寬孔徑分布的多孔襯底。甚至更優(yōu)選的襯
底。這樣6 優(yōu)選襯底通常表現(xiàn)出在某^介質(zhì)流口過方面的差^,這依賴 于襯底和介質(zhì)分別是干-濕、濕-濕還是濕-干。襯底的優(yōu)選種類包括 合適聚合物的薄膜。在本領(lǐng)域中，多向和單向的多孔薄膜是公知的， 而與根據(jù)本發(fā)明的方法無關(guān)，并且其是商業(yè)可獲得的。此外，根據(jù)本 發(fā)明，優(yōu)選地使用帶電的和增壓的和/或化學功能化的薄膜。
本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)這種生物測定襯底的噴墨設(shè)備，并且 涉及一種可通過該方法獲得的生物測定襯底。根據(jù)本發(fā)明的噴墨設(shè)備 包括分別用于印刷頭和襯底的安裝裝置，由此該設(shè)備包括用于向襯底
^選實施例中，用于向村底提供失活介^、的裝置包括印刷頭。更優(yōu)選 的噴墨設(shè)備還包括用于測量在填充由失活介質(zhì)的襯底中存在的失活
介質(zhì)的量的裝置，最優(yōu)選的為襯底中的孔的體積百分比(vol.-%)。
此外，根據(jù)優(yōu)選實施例，所述設(shè)備包括用于通過控制所述襯底頂部的 局部溫度、氣流和幾何形狀來控制所述印刷的流體(特別是所述失活 流體和所述捕獲探針流體的印刷溶劑)的蒸發(fā)率的裝置。
包括生物活性分子的物質(zhì)優(yōu)選地溶解在溶液中。該溶液典型地為 流體，如水或不同類型的酒精，并且該溶液還可以包括少量的添加劑， 例如用于調(diào)節(jié)表面張力、粘度或沸點，從而優(yōu)化印刷特性、斑點形成、
生物流體的保質(zhì)期(shelf life)等。
盡管已經(jīng)針對特定實施例并參照某些附圖和前面的描述而說明 并描述了本發(fā)明，但是這些說明和描述被認為是說明性的或示范性的 而非限制性的。本發(fā)明不限于所描述的實施例。相反地，根據(jù)本發(fā)明 的噴墨印刷機可以用于液滴到薄膜上的任何布局(placement)。它 特別適合于生產(chǎn)用于分子診斷的生物傳感器。診斷包括在復(fù)雜的混合物(比如血液或唾液)中迅速并靈敏地檢測蛋白質(zhì)和核酸，以用于現(xiàn) 場試驗和用于實驗中心的診斷。其他應(yīng)用在醫(yī)療(用于心臟病、傳染
病和腫瘤的DNA/蛋白質(zhì)的診斷)、食品以及環(huán)境i貪斷領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1. 一種多孔生物測定襯底，其適合用于檢測在至少一種樣本流體中的至少一種分析物，該襯底包括一個或多個捕獲探針，每一個捕獲探針能夠特定地結(jié)合至少一個目標分析物，其中在尺寸大于050的襯底孔徑分布的孔中的捕獲探針的平均濃度至少等于尺寸小于050的孔中的捕獲探針的平均濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的多孔生物測定襯底，其中在尺寸大于05。的 孔中的捕獲探針的平均濃度至少是尺寸小于05。的孔中的捕獲探針的 平均濃度的兩倍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的多孔生物測定襯底，其中在尺寸大于05。的 孔中的捕獲探針的平均濃度至少是尺寸小于05。的孔中的捕獲探針的 平均濃度的五倍。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項的多孔生物測定襯底，其中孔徑 分布是這樣的使得(09。-0h) > 2050。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的多孔生物測定襯底，其中孔徑分布是這樣 的使得(09。-010) > 5050。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項的多孔生物測定襯底，其中孔隙 度的范圍是從20 vol。/。到98 vol%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的多孔生物測定襯底，其中所述孔隙度的范圍 是從30 vo"/o到80 vol%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的多孔生物測定襯底，其中所述孔隙度的范圍 是從40 vo"/o到70 vo"/。。
9. 一種用于生產(chǎn)生物測定襯底的方法，其中多個捕獲探針分子溶 液從至少一個印刷頭釋放到所述多孔襯底上，該方法包括以下步驟活介質(zhì)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中在將所述捕獲探針分子溶液釋 放到所述襯底上之前，向所述襯底提供所述失活介質(zhì)。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中在將所述捕獲分子溶液釋放到 所述襯底上之前的5秒到90分鐘之間的時限內(nèi)向所述襯底提供所述 失活介質(zhì)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述時限是在30秒到60分鐘之間。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述時限是在l分鐘到30分 鐘之間。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9到13中任意一項的方法，其中向所述襯底提 供所述失活介質(zhì)，以使得所述襯底的開口孔的體積的大約50°/。填充了 所述失活介質(zhì)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述襯底的開口孔的體積的大 約80%填充了所述失活介質(zhì)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中基本上所述襯底的所有開口孔 都填充了所述失活介質(zhì)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求9-16中任意一項的方法，包括另一個步驟使 得所述村底受到這樣的處理在將所述捕獲分子溶液釋i文到所述襯底 之前，使部分失活介質(zhì)從所述襯底蒸發(fā)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求9-17中任意一項的方法，其中所述失活介質(zhì)包 括液體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述失活液體包括丙烯醇或其 混合物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求9-19中任意一項的方法，其中所述捕獲分子溶 液包括生物化學反應(yīng)物和/或寡核普酸、和/或多肽和/或蛋白質(zhì)、和/ 或細胞、和/或(部分)RNA/PNA/LNA。
21. —種可通過權(quán)利要求9-20中任意一項的方法獲得的多孔生 物測定襯底，包括一個或多個捕獲探針，每一個捕獲探針能夠特定地 結(jié)合一個目標分析物，其中在尺寸大于Os。的襯底孔徑分布的孔中的 捕獲探針的平均濃度至少等于尺寸小于05。的孔中的捕獲探針的平均 濃度。
22. —種用于檢查分析物流體存在某種細菌、病毒和/或真菌的方 法，該分析物流體例如為人類的血液或組織樣本，其中迫使所述分析 物流體流過根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項的襯底或流過所述襯底之 上。
23. —種用于檢查分析物流體存在某種細菌、病毒和/或真菌的 方法，該分析物流體例如為人類的血液或組織樣本，其中迫使所述分 析物流體流過根據(jù)權(quán)利要求9-20中任意一項的方法所獲得的襯底或流過所述襯底之上。
24. —種用于通過將多種物質(zhì)釋放到襯底上來生產(chǎn)生物測定襯底 的噴墨設(shè)備，該設(shè)備包括至少一個印刷頭，以及分別用于印刷頭和襯 底的安裝裝置，其中該設(shè)備包括用于向襯底提供具有比所述捕獲分子 溶液的溶劑更低的蒸發(fā)率的失活介質(zhì)的裝置。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的噴墨設(shè)備，其中所述用于向襯底提供失活 介質(zhì)的裝置包括印刷頭。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25的噴墨設(shè)備，其中所述設(shè)備進一步包 括用于測量在所述襯底中存在的失活介質(zhì)的量的裝置。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24-26中任意一項的噴墨設(shè)備，其中所述設(shè)備 進一步包括用于測量在填充了失活介質(zhì)的襯底中的孔的體積百分比 的裝置。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24-27中任意一項的噴墨設(shè)備，其中所述設(shè)備 進一步包括用于使得該襯底受到處理以便使部分失活介質(zhì)從所述襯 底蒸發(fā)的裝置。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的噴墨設(shè)備，其中所述設(shè)備進一步包括用于 控制所述失活介質(zhì)和/或捕獲探針溶劑的蒸發(fā)率的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供一種多孔生物測定襯底，其適用于檢測在生物樣本流體中的至少一個分析物。該襯底包括一個或多個捕獲探針，每一個捕獲探針能夠特定地結(jié)合一個目標分析物。在尺寸大于O₅₀的襯底孔徑分布的孔中的捕獲探針的平均濃度至少等于尺寸小于O₅₀的孔中的捕獲探針的平均濃度。因此，該襯底表現(xiàn)出改進的結(jié)合效率。本發(fā)明還涉及一種用于生產(chǎn)該生物測定襯底的方法和設(shè)備，并且涉及一種用于使用該襯底檢查分析物流體的方法。
文檔編號G01N33/53GK101535806SQ200780040800
公開日2009年9月16日 申請日期2007年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月30日
發(fā)明者A·皮里克, J·F·迪克斯曼, R·庫特 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司