專利名稱：：抗肌鈣蛋白抗體和心血管風(fēng)險的制作方法抗肌鈣蛋白抗體和心血管風(fēng)險
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及心肌病領(lǐng)域。本發(fā)明公開了從個體獲得的樣品中存在的抗心肌肌4丐蛋白抗體可以作為診斷標(biāo)志物、尤其在評估個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險中使用。描述了輔助評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的方法，包括體外測量抗心月幾肌4丐蛋白抗體和任選地一種或多種在評估個體發(fā)生心月幾病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，并且使所獲得的值或諸值與個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。盡管在治療上有顯著進(jìn)步，但是心肌疾病(CVD)在發(fā)達(dá)國家仍是發(fā)病率和死亡率的單一最常見原因。因此，預(yù)防心肌病如心力衰竭、心肌梗死和中風(fēng)是具有重要公共衛(wèi)生意義的領(lǐng)域。已經(jīng)描述了幾種未來心肌病的風(fēng)險因素并且它們目前在臨床廣泛用于檢測具有高風(fēng)險的個體。此類篩查試驗(yàn)包括例如評估總膽固醇水平、LDL膽固醇水平、HDL膽固醇水平和C反應(yīng)性蛋白水平。然而，為數(shù)眾多的心肌病在具有似乎低至中等風(fēng)險狀況的個體中出現(xiàn)，并且確定此類患者的診斷性選項(xiàng)仍然有限。眾多心血管合并癥會在心臟表現(xiàn)出來。這些合并癥總稱為冠心病。i貪斷為患有潛在冠心病的個體可一皮分成不顯示臨床癥狀的個體和表現(xiàn)氣促和/或胸痛的那些個體。后者組可^&劃分成患穩(wěn)定型心絞痛(SAP)的個體和患急性冠狀動脈綜合征(ACS)的那些個體。ACS患者可以顯示不穩(wěn)定型心絞痛(UAP),或這些個體已經(jīng)患有心肌梗死(MI)。MI可以是ST升高的MI或ST不升高的MI。MI出現(xiàn)后，可以出現(xiàn)左心室功能紊亂(LVD)。LVD患者可以發(fā)生充血性心力衰竭(CHF)，死亡率約15%。心臟是獨(dú)特的器官。這對于心臟組織和其眾多組分而言也是如此。心臟特異性蛋白質(zhì)釋放至循環(huán)中(例如作為心肌梗死的結(jié)果)是心臟壞死的標(biāo)志。對此類心臟特異性標(biāo)志物的才企測構(gòu)成心月幾梗死和充血性心力衰竭領(lǐng)域中診斷方法的基礎(chǔ)。眾所周知并成熟的是，可以通過測量循環(huán)中的心肌肌4丐蛋白水平以高靈敏度和高特異性診斷急性ML充血性心力衰竭的嚴(yán)重期和急性期可以通過測量例如腦源性利尿鈉肽(BNP)或其氨基端前肽(NT-原BNP)而診斷。盡管已經(jīng)在心肌合并癥的急性期診斷方面的確取得一些進(jìn)展，然而仍存在對急性期情況下進(jìn)一步改進(jìn)診斷的巨大需求，以便區(qū)分可能需要不同治療模式的患者亞群，尤其是建立并改進(jìn)對個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的評估?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗心肌肌釣蛋白抗體可以作為診斷標(biāo)志物使用，尤其在心肌病領(lǐng)域中使用?？剐募〖♂灥鞍卓贵w單獨(dú)或任選地與心血管風(fēng)險的一種或多種其它標(biāo)志物組合在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中是有價值的。發(fā)明簡述本發(fā)明描述了確定并在心肌病評估中利用抗心肌肌鈣蛋白抗體的存在、不存在或水平的新診斷試馬全。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及輔助評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的方法，包括步驟a)體外測量抗心肌肌釣蛋白抗體和任選地一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，和b)使在(a)中獲得值或諸值與個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。這些新試驗(yàn)廣泛地包括(1)評估未來心肌病(例如心H幾梗死和充血性心力衰竭)的風(fēng)險，和(2)確定某些個體將或多或少獲地從使用祐:設(shè)計(jì)為預(yù)防和/或治療心肌病的某些療法中獲益的可能性。本發(fā)明還公開了包含心肌肌鈣蛋白和適用于測量抗所述心肌肌鈣蛋白抗體的輔助試劑的試劑盒。本發(fā)明的這些和其它方面將聯(lián)系發(fā)明詳述而更詳細(xì)地描述。發(fā)明詳述在第一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗心肌肌鈣蛋白抗體作為診斷標(biāo)志物的用途。技術(shù)人員了解可以在確定個體樣品內(nèi)存在的抗體中使用的不同方法。確定患者樣品內(nèi)存在的抗體的診斷領(lǐng)域叫做血清學(xué)。對患者樣品內(nèi)所包含抗體的檢測例如在傳染病或自身免疫性疾病的診斷中是極重要的。據(jù)信心肌肌4丐蛋白的釋放僅在心肌受損并變壞死時才發(fā)生。直至九十年代末，檢測心臟壞死的最佳標(biāo)準(zhǔn)是還是升高的CK-MB(肌酸酐激酶的心臟特異性同種型)水平。在過去十年結(jié)束時，心肌肌鈣蛋白已經(jīng)作為至少優(yōu)異的標(biāo)志物出現(xiàn)。肌鈣蛋白沖t驗(yàn)的意義已經(jīng)由Goldmann,B.U.等(Curr.CorttrolTrialsCardiovasc.Med.2(2001)75-84)綜述。現(xiàn)在已經(jīng)普遍認(rèn)為心肌肌鉀蛋白陽性試驗(yàn)在檢測心肌梗死中有極高靈敏度。擴(kuò)張性心肌病(DCM)是以心肌收縮功能漸進(jìn)性衰退和心室擴(kuò)張為特征的心肌疾病。近來，Nishimura,H.等(Science291(2001)319畫322)報(bào)道PD-1受體缺陷性小鼠發(fā)生嚴(yán)重DCM。他們還發(fā)現(xiàn)這些小鼠產(chǎn)生抗心肌月幾釣蛋白I抗體。Okazaki,T.和Honjo,T.(TrendsinMolecularMedicine11(2005)322-326)證實(shí)肌釣蛋白I是由DCM患者中心臟自身抗體所識別的約15種自身抗原之一。已知抗心肌肌釣蛋白抗體可以存在于具有急性冠狀動脈綜合征的一些患者的循環(huán)中。這些抗體已經(jīng)被筌定為用于測量相同類型心肌肌鈣蛋白的不同測定法之間不一致性數(shù)據(jù)的原因。這些抗肌鈣蛋白抗體導(dǎo)致測定靈敏度下降，因此例如在心肌梗死后，延誤對心肌肌鈣蛋白的檢測(Eriksson,S.等，N.Engl.J.Med.352(2005)98-100)。該組研究員因此建議設(shè)計(jì)用于肌鈣蛋白I的不受來自抗肌釣蛋白I自身抗體影響的新測定法(Eriksson,S.等，N.Engl.J.Med.352(2005)98-100)。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在患者樣品中確定的抗心肌月幾釣蛋白抗體的存在和/或水平具有診斷用途。它們可以例如用作評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中的標(biāo)志物。冠詞"a"和"an"在本文中用來指一種或多于一種(即至少一種)的該冠詞的語法對象。例如，"amarker"意指一種標(biāo)志物或多于一種標(biāo)志物。在本發(fā)明中，抗心肌肌鈣蛋白的"anantibody"和"antibodies"視為可互換的，因?yàn)榧夹g(shù)人員理解，總是眾多抗體被檢測到。心肌肌釣蛋白"心月幾肌釣蛋白"是在心臟組織中存在并且在除心臟之外的組織中根本不存在或不以任何相關(guān)的程度存在的肌釣蛋白。例如對于人類，已經(jīng)描述了兩種心臟特異性肌4丐蛋白。這些人心臟特異性肌釣蛋白分別-故稱為肌釣蛋白T和肌《丐蛋白I。肌鈣蛋白T具有約37.000Da的分子量。在心肌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)的肌鈣蛋白T同種型(cTnT)與骨骼肌TnT差異明顯，以至于能產(chǎn)生識別這些TnT同種型的抗體。TnT被視為急性心肌損傷的標(biāo)志物；參考Katus,H.A.等，J.Mol.Cell.Cardiol.21(1989)1349-1353;Hamm,C.W.等，N.Engl.J.Med.327(1992)146-150;Ohman,E.M.等,N.Engl.J.Med.335(1996)1333-1341;Christenson,R.H.等，Clin.Chem.44(1998)494-501和EP0394819。肌鈣蛋白I(TnI)是肌鈣蛋白復(fù)合體的25kDa抑制性部分，存在于肌肉組織中。Tnl在Ca"缺乏下與肌動蛋白結(jié)合，抑制肌動球蛋白的ATP酶活性。心肌中存在的Tnl同種型(cTnl)與骨骼肌Tnl相異400/0，從而允許通過免疫區(qū)分這兩種同種型。cTnl的正常血漿濃度是<0.1ng/ml(4pM)。cTnl在心臟細(xì)胞死亡后釋放進(jìn)入血流；因此，血漿cTnl濃度在急性心肌梗死患者中升高(Benamer,H.等，Am.J.Cardiol.82(1998)845-850)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及輔助評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的方法，包括a)體外測量抗心肌肌4丐蛋白抗體和任選地一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，和b)將(a)中獲得的值或諸值與個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的方法"輔助評估"個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險。技術(shù)人員理解的是，沒有生物化學(xué)標(biāo)志物以100%特異性和同時100%靈敏度診'斷給定疾病。相反，生物化學(xué)標(biāo)志物^L用來以某種可能性或預(yù)測值評估疾病的存在、不存在或嚴(yán)重性。因此，在常規(guī)臨床診斷中，通常在診斷、治療和控制潛在疾病中一起考慮多種臨床癥狀和生物學(xué)標(biāo)志物。測量抗心肌肌4丐蛋白抗體將輔助醫(yī)生建立正確的診斷或預(yù)后的工作。確診或最終預(yù)后總是由醫(yī)生作出。術(shù)語"心肌病"涉及影響心肌的一組病癥。優(yōu)選的心肌病組由動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、急性冠狀動脈綜合征(包括心肌梗死和不穩(wěn)定心絞痛)組成。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中評估的心肌病選自充血性心力衰竭和急性冠狀動脈綜合征。還優(yōu)選，術(shù)語"心肌病"就本發(fā)明的意義而言涉及心臟移植后患者中的移植排斥。在又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及輔助對心肌梗死患者評估癥狀明顯的心力衰竭(overtheartfailure)風(fēng)險的方法，包括a)體外測量抗心肌肌4丐蛋白抗體和任選地一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，和b)將(a)中獲得的值或諸值與個體發(fā)生癥狀明顯的心力衰竭的風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。技術(shù)人員顯而易見，MI患者可能在MI發(fā)生之前就已經(jīng)患有心力衰竭，這種情況下本發(fā)明方法可輔助評估疾病惡化的風(fēng)險。根據(jù)"ACC/AHA2005成人慢性心力衰竭診斷與控制最新指南"(Hunt,S.等，www.acc.org=ACC/AHA實(shí)用指南),在心力衰竭領(lǐng)域中的疾病連續(xù)過程(continuum)如今分成四期。在A和B期中，發(fā)現(xiàn)具有發(fā)生心力衰竭風(fēng)險的個體，而C和D期4戈表顯示心力衰竭征兆和癥狀的患者組。本文因而將如以上參考文獻(xiàn)中給出的從A至D不同期的詳細(xì)定義包括進(jìn)來。從臨床角度來看，該疾病在代償期和非代償早期(在A期中徹底無癥狀，而B期中具有器質(zhì)性心臟病，但是無征兆及癥狀，參考ACC/AHA實(shí)用指南)是臨床無癥狀的。該疾病的外顯征兆(如氣短)不出現(xiàn)，直至完全進(jìn)入非代償期(即根據(jù)ACC/AHA指南的C和D期)。當(dāng)前診斷基于患者在C和D期中的外顯癥狀。癥狀明顯的心力衰竭就本發(fā)明的意義而言是如ACC/AHA指南所定義在C和D期中的心力衰竭?？剐募〖♀}蛋白抗體是在"體外，，測量。這意味著從個體獲得用于診斷目的樣品。該樣品用于一項(xiàng)或幾項(xiàng)體外研究并且不用于該個體的治療。優(yōu)選的樣品是心臟組織活枱，樣品、全血、血漿或血清，尤其優(yōu)選血漿和血清。在為檢測抗心肌肌4丐蛋白抗體所建立的優(yōu)選測定法中，心肌肌釣蛋白抗原直接或間接地與固相結(jié)合。通常，將樣品在樣品緩沖液中稀釋。固相結(jié)合的抗原與所研究(稀釋)的樣品溫育。溫育在允許研究樣品內(nèi)包含的抗體與固相結(jié)合抗原相結(jié)合的條件下進(jìn)行。通過合適方法檢測與固相結(jié)合抗原相結(jié)合的抗體。在抗病原體(如病毒病原體)抗體的檢測中，極頻繁及很有利地使用根據(jù)(例如在US4,945,042描述的)雙抗原橋模式的抗體檢測系統(tǒng)。相同的測定原理可以用來檢測抗心肌肌《丐蛋白抗體。根據(jù)這種橋概念的免疫測定法需要使用直接或間接與固相結(jié)合的抗原并且使用直接或間接可檢測的同種或交叉反應(yīng)性的速溶性抗原。所研究的抗體，若存在，則在固相結(jié)合抗原與標(biāo)記的^r測抗原間形成橋。只有這兩種抗原由特異性抗體-例如由抗心肌肌鉤蛋白抗體橋接時，才產(chǎn)生與樣品中存在的抗體濃度關(guān)聯(lián)的信號。本發(fā)明方法中所用的心肌肌鈣蛋白抗原在一個優(yōu)選實(shí)施方案中包含肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T。還優(yōu)選建立用于分別檢測抗肌鈣蛋白I抗。在后一測定法中，每種心肌肌鈣蛋白單獨(dú)地用作抗原。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中測量的抗體是抗肌釣蛋白I的抗體。在實(shí)施本發(fā)明方法的優(yōu)選模式中，把來自骨骼肌的肌鈣蛋白添加至樣品緩沖液中以便通過封閉非特異性抗體即在肌肉肌鈣蛋白和心肌肌鈣蛋白之間發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體而增強(qiáng)與心肌肌鈣蛋白結(jié)合的抗體的特異性。技術(shù)人員要理解，檢驗(yàn)結(jié)果可以以定性及定量性術(shù)語記錄。本發(fā)明涉及將個體的標(biāo)志物水平與預(yù)定值進(jìn)行比較。預(yù)定值可以采取多種形式。它可以是單一臨界值，如中位數(shù)或均數(shù)。預(yù)定值可以基于對照組而建立，如其中在一個定義組內(nèi)的風(fēng)險兩倍于另一個定義組中的風(fēng)險。預(yù)定值可以是一個范圍，例如其中將受檢驗(yàn)群體均等(不均等)分組，如低風(fēng)險組、中等風(fēng)險組和高風(fēng)險組，或劃分象限，最低象限是具有最低風(fēng)險的個體而最高象限是具有最高風(fēng)險的個體。預(yù)定值可以取決于選擇的具體群體。例如，看起來健康的群體具有不同于患有既往心肌病的成員群體'正常，標(biāo)志物范圍。因此，所選的預(yù)定值可以考慮其中個體所屬的分類。合適的范圍和分類可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅以常規(guī)實(shí)-瞼而選擇。若測量的抗體高于預(yù)定的閾值水平，則可以例如記錄為陽性結(jié)果。此類閾值水平通常設(shè)定至健康對照群體的卯％百分位數(shù)或95%百分位數(shù)。當(dāng)實(shí)施本發(fā)明時，優(yōu)選在健康對照群體的95%百分位數(shù)上的閾值水平。定量值可以通過對本領(lǐng)域技術(shù)人員無需解釋的方法而輕易與疾病狀態(tài)建立關(guān)聯(lián)。目前，不知道在個體中導(dǎo)致抗心肌肌鈣蛋白抗體形成的原因。肌鈣蛋白釋放進(jìn)入循環(huán)可能是由于心臟的一個或多個壞死事件而發(fā)生。在循環(huán)中的心月幾月幾4丐蛋白可以觸發(fā)抗所述心肌月幾釣蛋白抗體的形成。這種自身抗體或簡而言之抗心肌肌鈣蛋白抗體可以是不同類別的免疫^求蛋白。在感染期間，首種抗體即免疫球蛋白M類(IgM)形成。在IgM形式的第一體液免疫應(yīng)答后是次級體液免疫反應(yīng)，反映為或多或少明顯的免疫球蛋白G類(IgG)抗體形成。通常認(rèn)為對免疫系統(tǒng)的"攻擊"持續(xù)時間越長，例如在感染的情況下，感染持續(xù)持續(xù)時間越長和/或感染越嚴(yán)重和/或傳染原越經(jīng)常地觸發(fā)免疫應(yīng)答，則IgG應(yīng)答一般會越高。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在患者樣品中存在的抗心肌肌鈣蛋白抗體可以包含免疫球蛋白的IgG類以及IgM類免疫球蛋白抗體。還可能的是不同類別抗心肌肌釣蛋白抗體指示不同亞組的患者。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法基于免疫球蛋白G和M類抗心肌肌釣蛋白抗體。高滴度的抗心肌肌4丐蛋白抗體可以視為指示未來心臟合并癥的4支高風(fēng)險。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法基于^r測免疫球蛋白M類(IgM)抗心肌肌釣蛋白抗體。高滴度的IgM抗體可以視為指示心肌最近的壞死事件。高滴度IgM抗體可以表明需要更適于心臟急性事件的療法。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法基于免疫球蛋白類別G類(IgG)抗心肌肌4丐蛋白抗體。高滴度IgG抗體可以視為指示心臟在過去的至少一個壞死事件。該事件在過去最有可能在獲得樣品四周之前出現(xiàn)。高滴度IgG抗體也可以視為指示嚴(yán)重發(fā)作和/或幾個壞死性發(fā)作并且可以提示更適于心臟既往和/或'隄性事件的治療才莫式。當(dāng)已經(jīng)用本發(fā)明方法對個體的樣品分析其未來患有心肌病的風(fēng)險時，所述個體可^皮分層為一種或多種;f莫式的治療性療法。這些療法可以選自抗體(單克隆抗體、多克隆抗體)、小分子、藥理學(xué)活性化合物即抗炎藥和降脂藥(例如他汀類)、溶栓藥(例如血小板拮抗劑)、纖蛋白溶解藥(例如肝素)、血管形成術(shù)療法(例如PCTI(經(jīng)皮治療性介入)、球嚢擴(kuò)張(balloondilatation)、支架術(shù)、旁路手術(shù))。用于降低心肌病風(fēng)險的藥物包括選自抗炎藥、抗血栓藥和/或纖蛋白溶解藥、抗血小板藥、降脂藥、凝血酶直接抑制劑和糖蛋白IIb/IIIa受體抑制劑的那些藥物以及與細(xì)胞粘附分子結(jié)合并對白細(xì)胞與此類分子結(jié)合的能力抑制的藥物(例如抗細(xì)胞粘附分子抗體)?？寡姿幇ò⒙确宜?；二丙酸阿氯米松；阿孕奈德；oc-淀粉酶(oc-Amylase);安西法爾；安西非特；氨酚酸鈉；鹽酸氨普立糖；阿那白滯素；阿羅尼酸；阿尼扎芬；阿扎丙宗；巴柳氮二鈉；千達(dá)酸；苯喁洛芬；鹽酸千達(dá)明；菠蘿蛋白酶；溴派莫；布地奈德；卡洛芬；環(huán)洛芬；辛噴他宗；克利洛芬；丙酸氯倍他索；丁酸氯倍他索；氯吡酸；丙酸氯硫卡木>;醋酸可米+>;可托多+>;地夫可特；地奈德；去羥米木>;二丙酸地塞米*>;雙氯芬酸鉀；雙氯芬酸鈉；雙醋二氟4^^;二氟米酮鈉；二氟尼柳；二氟潑尼酯；地氟他酮；二曱基亞砜；羥西奈德；恩曱羥松；恩莫單抗；依諾利康鈉；依匹唑；依托度酸；依托芬那酯；聯(lián)苯乙酸；非那莫；芬布芬；芬氯酸；苯克洛酸；芬度柳；苯吡帕酮；芬替酸；夫拉扎酮；氟扎可特；氟芬那酸；氟咪唑；醋酸氟尼縮松；氟尼辛；氟尼辛葡曱胺；氟可丁酯；醋酸氟米;^;氟喹宗；氟吡洛芬；氟瑞托芬；丙酸氟替卡松；呋喃洛芬；呋羅布芬；哈西奈德；丙酸氯倍他；醋酸卣潑尼松；異丁芬酸；布洛芬；布洛芬鋁；布洛芬吡啶甲醇；依洛達(dá)普；吲哚美辛；吲哚美辛鈉；吲哚洛芬；吲哚克索；吲四唑；醋酸異氟潑尼松；伊索克酸；伊索昔康；酮洛芬；鹽酸洛非咪唑；氯諾昔康；氯替潑諾碳酸乙酯；甲氯芬那酸鈉；甲氯芬那酸；二丁酸甲氯松；曱氯那酸；5-氨基水楊酸；美西拉宗；磺庚甲潑尼龍；嗎尼氟酯；萘丁美酮；萘普生；萘普生鈉；萘普索；尼馬宗；奧沙拉秦鈉；奧古蛋白；奧帕諾辛；喁丙溱；羥布宗；鹽酸瑞尼托林；戊聚硫鈉；保泰松甘油酸鈉；吡非尼酮；吡羅昔康；肉桂酸吡羅昔康；吡羅昔康乙醇胺；吡洛芬；潑那扎特；普立非酮；普羅度酸；普羅喹宗；普羅沙唑；檸檬酸普羅沙唑；利美索龍；氯馬扎利；柳膽來司；沙那西定；雙水楊酸酯；水楊酸類(Salycilates);血根氯銨；司克拉宗；絲美辛；舒多昔康；舒林酸；舒洛芬；他美辛；他尼氟酯；他洛柳酯；特丁非??；替尼達(dá)普；替尼達(dá)普鈉；替諾昔康；替昔康；替昔米德；Tetrydamine;硫平酸；替可的松匹伐酯；托美?。煌忻蓝♀c；三氯奈德；三氟米酯；齊多美辛；糖皮質(zhì)素；佐美酸鈉.抗血栓藥和/或纖蛋白溶解藥包括纖維蛋白溶酶原(通過前激肽釋放酶、激肽原、因子XII、XIIIa、纖溶酶原前激活物和組織纖溶酶原i敫活物[TPA]的相互作用產(chǎn)生纖維蛋白溶酶)鏈激酶；尿激酶茴?；w溶酶原-鏈激酶激活物復(fù)合物；尿激酶原；(Pro-UK);rTPA(阿替普酶或activase;r指重組)、重組尿激酶原；尿激酶(Abbokinase);依米那酶；鹽酸SreptaseAnagrelide;比伐盧定；達(dá)肝素鈉；達(dá)那肝素鈉；鹽酸噠唑氧；硫酸依非那群；依諾肝素鈉；依非曲班；依非曲班鈉；亭扎肝素鈉；瑞替普酶(retaplase);三苯纟各雷；華法林；右旋糖酐?？寡“逅幇–l叩ridogrel;磺吡酮；阿司匹林；雙嘧達(dá)莫；氯貝丁酯；吡醇氨酯；PGE;胰高血糖素抗5-羥色胺藥物；咖啡因；茶堿己酮可可堿(TheophyllinPentoxifyllin);p塞氯匹定；阿那才各雷。降脂藥包括吉非貝齊、考來烯胺(cholystyramine)、考來替泊、煙酸、普羅布考(probucol)、洛伐他汀(lovastatin)、氯伐他汀、辛伐他汀、阿托伐斗也汀、普4戈他汀、西立伐z他汀(cirivastatin)。凝血酶直接抑制劑包括水蛭素、水蛭素原、比伐盧定(hirulog)、阿加曲班(agatroban)、PPACK、凝血酶適體。糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑是抗體和非抗體，包括但不限于ReoPro(阿昔單抗)、拉米非班、替羅非班。一種可以用來在抗心肌肌4丐蛋白抗體檢驗(yàn)呈陽性的個體中降低未來心臟病癥風(fēng)險的優(yōu)選藥物是阿司匹林。本發(fā)明方法還可以允許治療性處理來監(jiān)測已經(jīng)用所述方案治療的個體。在本發(fā)明另一個令人驚訝的方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗心月幾肌鈣蛋白抗體具有獨(dú)立于評估個體發(fā)生心月幾病風(fēng)險中所用的其它標(biāo)志物的預(yù)測值。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及輔助評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的方法，包括a)體外測量抗心肌肌4丐蛋白抗體和一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，和b)將(a)中獲得的值與個體發(fā)生心肌病風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。與抗心肌肌釣蛋白抗體一起使用的一種或多種額外標(biāo)志物可以#見為用于評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的標(biāo)志物組的一部分，即適于進(jìn)一步改進(jìn)風(fēng)險評估的一系列標(biāo)志物。該標(biāo)志物組中的標(biāo)志物總數(shù)優(yōu)選地少于20個標(biāo)志物，更優(yōu)選少于15個標(biāo)志物，還優(yōu)選是少于IO個標(biāo)志物，甚至更優(yōu)選8個或更少標(biāo)志物。優(yōu)選除了抗心肌肌4丐蛋白抗體之外，還包含2、3、4、5或6個標(biāo)志物的用于評估個體發(fā)生心力幾病風(fēng)險的標(biāo)志物組。技術(shù)人員了解已經(jīng)^皮描述為在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的多個標(biāo)志物。優(yōu)選地，一種或多種其它標(biāo)志物選自心肌肌鈣蛋白、利尿鈉肽或利尿鈉肽相關(guān)標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物、D-二聚體、膽固醇、高半胱氨酸、脂連蛋白、sCD40L、髓過氧化物酶和缺血^f飾的白蛋白。"標(biāo)志物"是其存在、不存在或水平可以與目的狀態(tài)例如與疾病建立關(guān)聯(lián)的分子或特征。利尿鈉肽和利尿鈉肽-相關(guān)標(biāo)志物利尿鈉肽優(yōu)選地選自A型利尿鈉肽(ANP)和/或B型利尿鈉肽(BNP)。術(shù)語"相關(guān)標(biāo)志物"如本文.中所用指具有特定標(biāo)志物或其生物合成性母體的至少10、12、15或20連續(xù)氨基酸的一種或多種多肽片段。優(yōu)選地當(dāng)存在于循環(huán)中時，所述片段是免疫學(xué)可檢測的片段。利尿鈉肽相關(guān)標(biāo)志物優(yōu)選地是ANP相關(guān)或BNP相關(guān)標(biāo)志物。腦源性利尿鈉肽或B型利尿鈉肽(BNP)人BNP由含108個氨基酸的前體分子的蛋白水解而衍生，該前體分子自此以下稱作BNPwq8。成熟BNP或"BNP利尿鈉肽"或"BNP-32"或簡稱"BNP"是代表所述前體第77-108位氨基酸的含32個氨基酸的分子，也可以稱作BNP77-1()8。BNP前體分子的剩余殘基第1-76在本領(lǐng)域已知為氨基端原BNP(NT-proBNP)。BNPw。s作為更大的前體即含總計(jì)134個氨基酸的前-原BNP的部分而合成，其中氨基端26個氨基酸代表"前"序列。成熟BNP本身可以作為額外標(biāo)志物在本發(fā)明中使用。前原-BNP、BNPwos和NT-proBNP分子均代表可以作為成熟BNP的替代物或本身作為標(biāo)志物而測量的BNP相關(guān)標(biāo)志物。此外，這些分子的一種或多種片段，包括選自BNP77-106、BNP79-106、BNP76-107、BNP69-108、BNP79—108、BNP8(M08、BNP81—108、BNP83-108、BNP簡、BNP53—85、BNP關(guān)、BNP3(M03、BNPwo7、BNP9.K)6和BNP3-雨的BNP相關(guān)多肽或標(biāo)志物也可以在循環(huán)中存在。此外，利尿鈉肽片段(包括BNP片段)可以包含一個或多個可氧化的甲硫氨酸，所述曱硫氨酸氧化成曱硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜產(chǎn)生額外的BNP相關(guān)標(biāo)志物。參見例如2003年4月17日提交的美國申請系列號10/419,059，該文獻(xiàn)因而完整地通過4爰引并入。以相似方式，本文以下所述的眾多標(biāo)志物作為更大的前體分子而合成，所述前體分子隨后^皮加工以提供成熟分子或標(biāo)志物；和/或在循環(huán)中以攜帶二次修飾的片段和/或標(biāo)志物分子形式存在。因此，對本文以下所述的每種標(biāo)志物的"相關(guān)標(biāo)志物"可以按照與如上對BNP所述的相似方式鑒定并使用。A型利尿鈉肽(ANP)A型利尿鈉肽(ANP)(又稱作心房鈉尿肽或心舒血管素Forssmann,W,G.等，Histochem.CellBiol.110(1998)335-357)是由前房肌細(xì)胞應(yīng)答于前房擴(kuò)張、血管緊張素II刺激、內(nèi)皮縮血管肽及(P-腎上腺素受體介導(dǎo)的)交感神經(jīng)刺激而合成、貯藏并釋放的含28個氨基酸的肽。ANP作為前體分子(pro-ANP)合成，由蛋白酶剪切轉(zhuǎn)化成活性形式ANP并且還形成氨基端ANP(l-98)。已經(jīng)^艮道氨基端ANP和ANP在表現(xiàn)心房顫動和心力衰竭的患者中上升(Rossi,A.等，J.Am.Coll.Cardiol.35(2000)1256-1262)。然而，技術(shù)人員會認(rèn)識到，因?yàn)榕cANP的關(guān)系，氨基端ANP分子的濃度也可以提供患者中的診斷或預(yù)后信息。短語"與ANP相關(guān)的標(biāo)志物"或"ANP相關(guān)肽"指除了含28個氨基酸的ANP分子之外，含有源自proANP分子(l-126)的至少10、12、15或20個連續(xù)氨基酸的任何多肽。ANP及與ANP相關(guān)肽的蛋白水解性降解也已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述并且這些天然存在的蛋白水解片段也包括在術(shù)語"ANP相關(guān)肽"中。心肌肌釣蛋白兩種心臟特異性月幾4丐蛋白，即肌釣蛋白I和月幾4丐蛋白T分別已經(jīng)如上例舉。盡管上文討論了心肌肌釣蛋白作為抗原在檢測抗肌4丐蛋白抗體中的用途，然而，作為標(biāo)志物組中的其它標(biāo)志物或分析物使用的心肌肌鈣蛋白是分子本身。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在測量心肌肌鈣蛋白中，可以測量相異的肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T同種型。因此，可以優(yōu)選地測量游離心肌月幾鈣蛋白I、游離心肌肌釣蛋白T、在包含肌4丐蛋白T和月幾鈣蛋白C之一或這兩種蛋白質(zhì)的復(fù)合體中的心肌肌鈣蛋白1、在包含肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白C之一或這兩種蛋白質(zhì)的復(fù)合體中的心肌肌4丐蛋白T、總心肌J幾鉤蛋白I(意指游離和復(fù)合的心肌肌鈣蛋白1)和/或總心肌肌鈣蛋白T。優(yōu)選地，心肌肌釣蛋白I和/或心肌肌4丐蛋白T根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)方法測量并且測量的值與抗心月幾肌釣蛋白抗體的測量結(jié)果組合，用于評估心臟病癥。兩種抗心肌肌4丐蛋白抗體及心肌月幾4丐蛋白的存在可以進(jìn)一步指示具有急性冠月永合并癥的復(fù)發(fā)疾病，如ACS。若在個體樣品中對于抗心肌肌釣蛋白抗體及利尿鈉肽或利尿鈉肽相關(guān)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)升高值，則這可以視為提示既往心肌損傷情況，如過往心月幾梗死。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)升高水平的抗心肌肌鉀蛋白抗體指示疾病的嚴(yán)重性，并且尤其指示該患者在未來患有充血性心力衰竭的增高風(fēng)險。與抗心肌肌釣蛋白抗體一起用在本發(fā)明的標(biāo)志物組中的優(yōu)選炎癥才示志物是急'l"生炎癥才示志4勿及戶斤i胃近炎癥才示志物(proximalinflammatorymarker)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的急性炎癥標(biāo)志物包括C反應(yīng)性蛋白(CRP)、血纖蛋白原、D-二聚體、血清淀粉狀蛋白A(SAA)、妊娠相關(guān)多肽A(PAPP-A)、細(xì)胞間粘附分子(例如ICAM-1、VCAM-1)、IL-1-P、IL-6、IL-18/IL-18b;TNF-oc;髓過氧化物酶(MPO);TF;單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1);P-選擇素；E-選擇素；血小板活化因子乙?；饷?PAF-AH);血管性血友病因子(vWF)。在本發(fā)明方法中使用的優(yōu)選急性炎癥標(biāo)志物是CRP、血纖蛋白原、D-二聚體和SAA，其中更優(yōu)選使用CRP和D-二聚體。C反應(yīng)性蛋白(CRP)C反應(yīng)性蛋白(CRP)是參與宿主防御的含21kDa亞基的同五聚體Ca^結(jié)合性急性期蛋白。CRP合成由IL-6誘導(dǎo)，并且間接地由IL-1誘導(dǎo)，因?yàn)镮L-1可以觸發(fā)肝竇狀隙中的枯否氏細(xì)胞合成IL-6。CRP的正常血漿濃度在卯％健康群體中是<3(ig/ml(30nM)并且在99%健康個體中是<10ng/ml(100nM)。血漿CRP濃度可以例如通過同質(zhì)分析模式(homogeneousassayformat)或ELISA測量。C反應(yīng)性蛋白祐^見為進(jìn)展性全身炎癥的標(biāo)志物。目前，可以以極高靈敏度測量CRP,可以可靠地檢測到1-3mg/l血液的CRP-值。在該范圍內(nèi)的測量稱作高靈敏性CRP或hs-CRP測量，也優(yōu)選地在本發(fā)明方法中使用。血纖蛋白原血纖蛋白原(又叫做因子I)是在第4號染色體上編碼并由肝細(xì)胞合成的340kD蛋白質(zhì)。它由兩個相同亞基構(gòu)成，每個亞基含有通過二石危鍵連接的三條不同多肽鏈(otA、PB、yG)。凝血酶將血纖肽A和B從血纖蛋白原中切下，導(dǎo)致形成由三對鏈cx、P和y構(gòu)成的不溶性血纖蛋白單體的鏈。異常血纖蛋白原血癥是與產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性異常血纖蛋白原有關(guān)的疾病。已經(jīng)描述了與出血素質(zhì)有關(guān)的超過250種結(jié)構(gòu)變體(Ebert，R.F.,CRCPress，BocaRaton,1991)。這些變體大多顯示受損的凝血酶催化性血纖肽釋放，或受損的血纖蛋白聚合作用。血纖蛋白原的一些變體與血栓形成素質(zhì)而非出血素質(zhì)有關(guān)，并且這已經(jīng)歸咎于纖溶酶原或組織纖溶酶原激活物對異常血纖蛋白原分子的受損結(jié)合作用。升高的血纖蛋白原水平可以指示進(jìn)展性感染或炎癥。D-二聚體D-二聚體是具有約200kDa分子量的交聯(lián)的血纖蛋白降解產(chǎn)物。D-二聚體的正常血漿濃度是<150ng/ml(750pM)。D-二聚體的血漿濃度在患有急性心肌梗死和不穩(wěn)定心絞痛的患者中升高，但是在穩(wěn)定型心絞痛患者中不升高(Hoffmeister、H.M.等,Circulation91(1995)2520-2527)。D-二聚體的血漿濃度也會在血凝固和血纖蛋白裂解激活有關(guān)的任何狀況(包括中風(fēng)、手術(shù)、動脈粥樣硬化、創(chuàng)傷和血栓性血小板減少性紫癜)期間升高。D-二聚體在纖維蛋白溶酶所致的蛋白水解性血塊溶解后立即釋放進(jìn)入血流。D-二聚體的血漿濃度在患有不穩(wěn)定心絞痛的患者中可以超過2Mg/ml(Gurfinkel,E.等，Br.HeartJ.71(1994)151-155)。血漿D-二聚體是血纖蛋白裂解的特異性標(biāo)志物并且提示存在與急性心肌梗死和不穩(wěn)定心絞痛有關(guān)的前血栓形成性狀態(tài)。近炎癥標(biāo)志物是位于上游的大分子，即接近或處在疾病事件的致病起源處。尤其是，它們在冠l^心臟損傷的部位內(nèi)、優(yōu)選地在動務(wù)^斑塊部的風(fēng)險并且與斑塊破裂及血栓形成的可能性有關(guān)。近炎癥標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且非限制性實(shí)例包括妊娠相關(guān)多肽A(PAPP-A)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP，例如MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-9、-10、-11、-12)和脂蛋白結(jié)合的磷脂酶A2(Lp-PLA2)。優(yōu)選的近炎癥標(biāo)志物是PAPP-A、MMP-9和Lp-PLA2。最優(yōu)選的近炎癥標(biāo)志物是PAPP-A和Lp-PLA2，尤其PAPP-A。妊娠相關(guān)性血漿蛋白-A(PAPP-A)妊娠相關(guān)性血漿蛋白-A(PAPP-A)屬于鋅金屬蛋白酶的金屬鋅蛋白(metzincin)超家族。PAPP-A的分子量是187kDa。人妊娠相關(guān)性血漿蛋白A(PAPP-A)切割胰島素樣生長因子(IGF)結(jié)合蛋白-4(IGFBP-4),造成該蛋白質(zhì)對IGF-I和IGF-II的親和力顯著下降。通過這種機(jī)制，PAPP-A在幾個系統(tǒng)(包括人卵巢系統(tǒng)和心血管系統(tǒng))中充當(dāng)IGF生物活性的調(diào)節(jié)物。最近研究表明PAPP-A也可以是急性冠狀動樂:M宗合征的新候選標(biāo)志物(Bayes-Genis,A.,N.Engl.J.Med.345(2001)1022-1029)。該項(xiàng)研究中的數(shù)據(jù)顯示當(dāng)與穩(wěn)定型心絞痛患者或?qū)φ帐茉囌弑容^時，PAPP-A水平在不穩(wěn)定心絞痛或急性心肌梗死患者中顯著升高。脂蛋白結(jié)合的磷脂酶A2(Lp-PLA2)脂蛋白結(jié)合的磷脂酶A2(Lp-PLA2)是主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的50kDa的Ca不敏感性脂肪酶。這種酶主要位于人血漿中的低密度脂蛋白(LDL)上。它與分泌性磷脂酶A2(sPLA2)區(qū)別明顯。Lp-PLA2的水平不受急性全身性感染病癥的影響。臨床研究已經(jīng)顯示Lp-PLA2與動脈粥樣硬化相關(guān)。還發(fā)現(xiàn)升高的血漿水平與CHD及缺血性中風(fēng)風(fēng)險關(guān)聯(lián)。在臨床前動物研究中，對該酶的抑制減弱炎癥過程并延緩動脈粥樣硬化疾病進(jìn)展。高半胱氨酸循環(huán)性總高半胱氨酸的濃度是葉酸鹽和維生素B12不充足狀態(tài)的敏感標(biāo)志物。升高的高半胱氨酸濃度與增加的血管病風(fēng)險有關(guān)?？偢甙腚装彼釢舛鹊膮⒖挤秶?第5和第95百分位數(shù))最近已被確定(Selhub,J.,等，Ann.Intern.Med.131(1999)331-339)。將高的總高半胱氨酸濃度定義為超過參考樣品的性別特異性第95百分位數(shù)的總高半胱氨酸濃度。血清總高半胱氨酸濃度的參考范圍是年齡依賴性的；這些范圍對于年齡12-19歲的男性參與者是4.3-9.9微摩爾/L并且對于年齡12-19歲的女性參與者是3.3-7.2微摩爾/L，并且對年齡60歲或更高齡的男性是5.9-15.3微摩爾/L,并且對于年齡60歲或更高齡的女性是4.9-11.6微摩爾/L。將高的高半胱氨酸濃度定位為對男性參與者至少11.4微摩爾/L并且對于女性參與者至少10.4微摩爾/L。脂連蛋白脂連蛋白是主要由脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的含226個氨基酸的蛋白質(zhì)。脂連蛋白的水平似乎反映胰島素敏感度并涉及脂肪貯備及動脈硬化。就臨床用途而言，幾種不同的預(yù)期用途正在討i侖和/或研究中。US6,461,821描述并對脂連蛋白作為關(guān)節(jié)硬化標(biāo)志物的用途提出權(quán)利要求?？扇苄訡D40配體(sCD40L)已經(jīng)建議sCD40L作為炎癥標(biāo)志物(Aukrust,P.等，Circulation100(1999)614-620)并且因此指示發(fā)生冠脈心臟事件的風(fēng)險。在WO03/040691中，已經(jīng)將sCD40L描述為炎癥的全身性標(biāo)志物。最近，也已經(jīng)討論sCD40L并將其描述為心肌病的候選標(biāo)志物。Heeschen,C.等，N.Engl.J.Med.348(2003)1104-1111指出sCD40L可能作為急性冠狀動脈綜合征中的標(biāo)志物而使用。sCD40L尤其與血小板活化、血小板聚集和血栓擴(kuò)大有關(guān)，代表如此風(fēng)險，即已經(jīng)變脆弱的斑塊會破裂，導(dǎo)致可引起左心室功能紊亂(LVD)、充血性心力衰竭(CHF)和死亡的可逆性血管閉塞(UAP)或不可逆性血管閉塞(AMI)。膽固醇膽固醇同時是類固醇、脂和醇。它存在于全部身體組織的細(xì)胞膜中并且在全部動物的血漿內(nèi)運(yùn)輸。大部分膽固醇并不來源于攝入，而是內(nèi)部合成的。膽固醇在眾多生物化學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，但是其與心肌疾病的相關(guān)最為知名。膽固醇在其與蛋白質(zhì)結(jié)合的嚢泡中流經(jīng)血液。這種膽固醇-蛋白質(zhì)包裝物叫做脂蛋白。脂蛋白是高密度或低密度的，這取決于脂蛋白相對于脂肪具有多少蛋白質(zhì)。具有比脂肪更多的蛋白質(zhì)的脂蛋白叫做高密度脂蛋白(HDL)。具有比蛋白質(zhì)更多的脂肪的脂蛋白叫做低密度脂蛋白(LDL)。高密度脂蛋白膽固醇有時候稱作"好"膽固醇。HDL膽固醇通過在血液中與LDL膽固醇結(jié)合并攜帶它返回肝臟以處理而幫助從身體中除去LDL膽固醇。高水平的HDL膽固醇似乎降低發(fā)生心臟疾病和中風(fēng)的風(fēng)險。低密度脂蛋白膽固醇有時候稱作"壞"膽固醇。LDL膽固醇聚集在動脈內(nèi)壁內(nèi)并且常常促進(jìn)斑塊形成。LDL膽固醇從總膽固醇、HDL和三酰甘油水平中計(jì)算。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實(shí)施方案中，測定了LDL膽固醇或HDL對LDL的比率并且將它們作為標(biāo)志物組的部分而用來評估個體發(fā)生心月幾病的風(fēng)險。髓過氧化物酶髓過氧化物酶是存在于白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞中的溶酶體酶。髓過氧化物酶使用過氧化氫將氯化物轉(zhuǎn)化成次氯酸的酶。產(chǎn)生的次氯酸與細(xì)菌反應(yīng)并摧毀細(xì)菌。在眾多炎癥病理學(xué)如嚢性纖維化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，嗜中性粒細(xì)胞也造成組織損傷。當(dāng)動脈發(fā)炎并且具有易于破裂的脂肪沉積物時，也產(chǎn)生髓過氧化物酶。動脈中的炎癥可以產(chǎn)生血液凝塊并最終導(dǎo)致心臟病發(fā)作或中風(fēng)。髓過氧化物酶^^見為有前景的心臟標(biāo)志物。通過測量血液中的髓過氧化物酶水平，有可能預(yù)測某人在后續(xù)6個月中是否有心臟病發(fā)作或死亡的風(fēng)險(BaldusS.等，Circulation108(2003)1440-1445)。胎盤生長因子(P1GF)胎盤生長因子(P1GF)是多肽生長因子和血小板衍生性生長因子家族的成員，但是與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)更相關(guān)。P1GF-1僅作為極微弱促分裂原對某些內(nèi)皮細(xì)胞類型發(fā)揮作用或作為有效化學(xué)引誘物對單核細(xì)胞發(fā)揮作用。P1GF-1的體內(nèi)生理功能仍在爭論。在幾個報(bào)告中，通過使用不同分析法顯示P1GF-1不是內(nèi)皮細(xì)胞的有效促分裂原并且沒有體內(nèi)血管生成性。最近由一位研究人員證實(shí)，來自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的P1GF-1在CAM測定法中并且在兔角膜試驗(yàn)中具有血管生成性。兩種不同的蛋白質(zhì)可以通過人P1GF基因差異性剪接而產(chǎn)生P1GF-1(131個氨基酸的天然鏈)和P1GF-2(152個氨基酸的天然鏈)。這兩種促分裂原是分泌性蛋白質(zhì)，不過P1GF-2可以與肝素以高親和力結(jié)合。P1GF-1是同二聚體，然而P1GF的制備物在SDS凝膠上顯示某些異質(zhì)性，這取決于變動的糖基化程度。全部二聚體形式具有相似的生物學(xué)特征。有充分證據(jù)說明存在VEGF與P1GF之間的異二聚體分子并且它們有生物學(xué)活性。與P1GF相關(guān)的蛋白質(zhì)是具有約53%同源性的VEGF。缺血修飾的白蛋白觀察到心肌缺血導(dǎo)致鈷對白蛋白較低的金屬結(jié)合能力(=缺血修飾的白蛋白或IMA),這種觀察導(dǎo)致開發(fā)了最近符合FDA要求的白蛋白-鈷結(jié)合性(ACB)試驗(yàn)。ACB試驗(yàn)是測量人血清中缺血修飾的白蛋白(IMA)的定量分析。原則上，添加至血清中的鈷不與IMA的氨基末端結(jié)合，使得更多游離鈷與二硫蘇糖醇反應(yīng)并且在來自局部缺血患者的樣品中形成更深的顏色。目前，該測定法可用在多種臨床化學(xué)平臺上。需要遵循具體的預(yù)分析要求，包括避免使用含螯合劑的收集管，在2.5小時內(nèi)開展測定分析或在-20。C以下冷凍，并避免樣品稀釋。此外，當(dāng)血清白蛋白濃度<20g/L或〉55g/L或存在升高的乳酸鹽或氨濃度時，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎解釋ACB檢z瞼結(jié)果。增加的IMA值可以存在于例如患有癌癥、感染、末期腎病、肝病和腦缺血的患者中。幾項(xiàng)臨床研究已經(jīng)評估了ACB測定法在心臟病患者中的表現(xiàn)，大部分是4企馬全I(xiàn)MA在評估局部缺血中的作的額外標(biāo)志物。在優(yōu)選實(shí)施方案中本發(fā)明方法在看起來健康個體的研究中實(shí)施。"看起來健康"，如本文中所用，意指以前沒有經(jīng)歷或沒有意識到以往的有害心血管事件如心肌梗死的個體。看起來健康的個體還不表現(xiàn)疾病的癥狀。換句話說，此類個體若由醫(yī)學(xué)專家檢查將以健康并且無疾病癥狀為特征。技術(shù)人員會理解，存在眾多方式使用2種或更多種標(biāo)志物的量值來改進(jìn)所研究的診斷問題。在一個相當(dāng)筒單然而卻往往有效的方法中，若樣品對研究的至少一種標(biāo)志物呈陽性，則接受為陽性結(jié)果。這例如可以是如此情況，即此時通過檢測傳染源的核酸或多肽或通過檢測針對該傳染源的抗體而診斷傳染病如AIDS。然而，標(biāo)志物的組合往往進(jìn)行數(shù)學(xué)或統(tǒng)計(jì)學(xué)評估。優(yōu)選地，將對標(biāo)志物組的標(biāo)志物(例如抗心肌肌鈣蛋白抗體和心肌肌釣蛋白水平)所測量的值以數(shù)學(xué)方式組合，并且使組合值與潛在的診斷問題建立關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，診斷問題是未來發(fā)生心肌病的相對風(fēng)險。優(yōu)選地，該相對風(fēng)險與i^康對照相比專支而給出。優(yōu)選地，1*康對照在年齡及其它協(xié)變量方面相似。標(biāo)志物值可以通過現(xiàn)有技術(shù)的任何適宜數(shù)學(xué)方法組合。用于使標(biāo)志物組合與疾病或與發(fā)生疾病風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)的公知數(shù)學(xué)方法采用下列方法，如判別分析(DA)(即線性、二次、正則化DA)、核方法(KernelMethod)(即SVM)、非參數(shù)法(即K鄰近分類法(k-Nearest-NeighborClassifiers))、PLS(偏最小二乘法)、基于樹的方法(Tree-BasedMethod)(即邏輯回歸、CART、隨才幾森4木法(RandomForestMethod)、Boosting/Bagging法)、廣義線性模型(即邏輯回歸(LogisticRegression》、基于主成分的方法(即SIMCA)、廣義加性模型、基于模糊邏輯的方法、基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方法。技術(shù)人員會毫無問題地選擇適宜的方法以評估本發(fā)明的標(biāo)志物組合。優(yōu)選地，在使本發(fā)明的標(biāo)志物組合例如與不存在或存在心朋j疾病或與發(fā)生心臟病癥風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)中所用的方法選自DA(即線性、二次、正則化判別分析)、核方法(即SVM)、非參數(shù)法(即K鄰近分類法)、PLS(偏最小二乘法)、基于樹的方法(即邏輯回歸、CART、隨機(jī)森林法、助推法(BoostingMethod))或廣義線性模型(即邏輯回歸)。涉及這些統(tǒng)計(jì)方法的細(xì)節(jié)在如下文獻(xiàn)中找到Ruczinski，I.,J.的ComputationalandGraphicalStatistics12(2003)475-511;Friedman,J.H.,RegularizedDiscriminantAnalysis,JASA84(1989)165-175;Hastie，T.等，TheElementsofStatisticalLearning,SpringerSeriesinStatistics,2001;Breiman,L.等，Classificationandregressiontrees,WadsworthInternationalGroup,Belmont/California(1984);Breiman,L.,MachineLearning45(2001)5-32;Pepe,M.S.，TheStatisticalEvaluationofMedicalTestsforClassificationandPrediction,OxfordStatisticalScienceSeries,28(2003)和Duda,R.O.等,PatternClassification,WileyInterscience,第二版(2001)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是對潛在的生物標(biāo)志物組合使用優(yōu)化的多變量臨界值并且例如區(qū)分具有低度、中度和高度的發(fā)生心肌病風(fēng)險的患者。在這種類型的多變量分析中，標(biāo)志物不再是獨(dú)立的，而形成標(biāo)志物組。診斷方法的精確度最佳地由其接收者操作特性曲線(ROC)(具體見Zweig,M.H.,和Campbell,G.,Clin.Chem.39(1993)561國577)描述。ROC曲線是在所觀察數(shù)據(jù)的全部范圍上連續(xù)變動判斷閾值而產(chǎn)生的全部靈敏度/特異性對的曲線。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的臨床性能取決于其診斷精確性或正確地將受試者分類至臨床相關(guān)性亞組內(nèi)的能力。診斷精確性測量了檢驗(yàn)法正確區(qū)分所研究受試者的兩種不同狀況的能力。此類狀況例如分別是健康與疾病或良性與惡性疾病。在每種情況下，ROC曲線通過將靈敏度對1-特異性在判斷閾值完整范圍上作圖而描繪兩種分布間的重疊。在y-軸上是靈敏度或真陽性分?jǐn)?shù)[定義為(真陽性檢驗(yàn)結(jié)果數(shù))/(真陽性檢驗(yàn)結(jié)果數(shù)+假陰性檢驗(yàn)結(jié)果數(shù))]。這也已經(jīng)稱作在疾病或狀況存在下的陽性。它完全從受影響的亞組中計(jì)算。在x-軸上是假陽性分?jǐn)?shù)，或l-特異性[定義為(假陽性結(jié)果數(shù))/(真陰性結(jié)果數(shù)+假陽性結(jié)果數(shù))]。其為特異性指標(biāo)并且完全從不受影響的亞組中計(jì)算。因?yàn)檎骊栃苑謹(jǐn)?shù)和假陽性分?jǐn)?shù)通過使用來自兩個不同亞組的檢馬t結(jié)果而完全獨(dú)立地計(jì)算出來，因此ROC曲線獨(dú)立于樣品中的疾病流行率。ROC曲線上的每個點(diǎn)代表與特定判定閾值相對應(yīng)的靈敏度/l-特異性對。可完全區(qū)分(在結(jié)果的兩個分布中無重疊)的檢驗(yàn)具有通過左上角的ROC曲線，其中真陽性分?jǐn)?shù)是1.0或100%(完全靈敏度)并且假陽性分?jǐn)?shù)是0(完全特異性)。對于無區(qū)分(對于兩個組，結(jié)果分布相同)檢驗(yàn)的理論曲線是從左下角至右上角的45°對角線。大部分的曲線落在這兩種極端之間。(若ROC曲線完全處在45。對角線下，這通過將"陽性"標(biāo)準(zhǔn)從"大于，，反轉(zhuǎn)成"少于，，或反之而輕易修正。定性地說，曲線越靠近左上角，檢驗(yàn)的整體精確性越高。對實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的診斷精確性定量的一個合適目標(biāo)是通過單個數(shù)字表述其性能。最常見的整體衡量是ROC曲線下面積。按照慣例，這個面積總是大于0.5(若非如此，可以反轉(zhuǎn)判定尺度以使該面積大于0.5)。ROC值在1.0(兩個組的才企-驗(yàn)值完全分開)和0.5(兩個組的片企-瞼值之間沒有明顯分布差異)之間。該面積不僅取決于所述曲線的特定部分如最靠近對角線的點(diǎn)或在90%特異性時的靈敏度，還取決于整條曲線。這是對ROC曲線如何接近于完美曲線(面積=l.O)的定量說明性表述。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過測量樣品中抗心肌肌鈣蛋白抗體的濃度和心肌肌鈣蛋白水平并且使測定的濃度與發(fā)生心肌病風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)而改進(jìn)對個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險進(jìn)行評估的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過測量樣品中抗心肌肌鈣蛋白抗體的濃度和膽固醇水平并且使測定的濃度與發(fā)生心肌病風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)而改進(jìn)對個體發(fā)生心月幾病的風(fēng)險進(jìn)4亍評估的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過測量樣品中抗心肌肌鈣蛋白抗體的濃度和CRP水平并且使測定的濃度與發(fā)生心肌病風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)而改進(jìn)對個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險進(jìn)4亍評估的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過測量樣品中抗心肌肌鈣蛋白抗體的濃度和利尿鈉肽或利尿鈉肽相關(guān)標(biāo)志物的水平并且使測定的濃度與發(fā)生心肌病風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)而改進(jìn)對個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險進(jìn)行評估的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對抗心肌肌鈣蛋白抗體特異的并具有合適靈敏度的新試劑盒或測定法。本發(fā)明的優(yōu)選試劑盒包括適于測量抗所述心肌月幾4丐蛋白抗體的心肌J幾4丐蛋白和輔助試劑。的藥物治療中獲益的可能性的方法。該方法可以對患者治療以及還對臨床開發(fā)新療法具有重要意義。醫(yī)生基于對患者的預(yù)期凈益處而為患者治療選擇治療方案。凈益處來源于風(fēng)險對獲益比。本發(fā)明可以允許選擇更可能通過介入作用而獲益的個體，因此輔助醫(yī)生選擇治療方案。這可能包括使用其中預(yù)期獲益可能性增加的具有更高風(fēng)險特征的藥物。同樣，臨床研究員想要為臨床試驗(yàn)選擇極有可能獲得凈益處的群體。本發(fā)明可以幫助臨床研究員選擇此類個體。預(yù)期臨床研究員現(xiàn)在將使用本發(fā)明以確定臨床試驗(yàn)的入選標(biāo)準(zhǔn)?？剐脑聨自聨足^蛋白抗體在個體樣品中的存在可以提示炎癥過程正在進(jìn)行，這可能導(dǎo)致心臟組織的進(jìn)一步損傷。抗炎癥療法可能對于抗心肌肌鈣蛋白I抗體檢測呈陽性的患者尤其重要。心肌肌釣蛋白可以心臟手術(shù)介入期間釋放至循環(huán)中。這可能對接受心臟移植手術(shù)的患者尤其是這樣。心肌肌鈣蛋白在心臟手術(shù)期間的釋放可以觸發(fā)或可以不觸發(fā)自身抗體形成。然而一旦受誘導(dǎo)，則抗肌鈣蛋白自身抗體完全可以對患者產(chǎn)生不利影響并且可能例如與排斥移植的心臟有關(guān)。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，自身抗心肌肌鈣蛋白抗體將尤其輔助心臟手術(shù)后的患者隨訪，并且優(yōu)選地是心臟移植隨訪。與對這類自身抗體檢測不呈陽性的患者相比較，產(chǎn)生抗肌鈣蛋白抗體的心臟移植患者可能需要額外的或不同的治療。提供以下實(shí)施例以輔助理解本發(fā)明，而本發(fā)明的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書中描述?？衫斫獾氖强梢栽谒龇椒ㄖ羞M(jìn)行調(diào)整而不脫離本發(fā)明的精神。實(shí)施例1檢測抗心肌肌4丐蛋白抗體的一般方法為了檢測血清抗心肌肌釣蛋白T或肌4丐蛋白I抗體，可以使用如下測定法微量滴定平板的孔首先用小鼠抗心肌肌鈣蛋白T或I單克隆抗體包被。在第二個步驟中，相應(yīng)的抗原即心肌肌鈣蛋白T或I與抗體結(jié)合。通過溫育適度稀釋的血清樣品與結(jié)合的肌鈣蛋白抗原，能夠與孔內(nèi)肌4丐蛋白結(jié)合的血清抗體會與該肌釣蛋白結(jié)合。結(jié)合的血清抗體隨后可以通過合適的檢測抗體如抗人IgG過氧化物酶綴合物而檢測。技術(shù)人員熟知合適的封閉及洗滌步驟。實(shí)施例2;險測人血清樣品中的抗心肌肌鈣蛋白I抗體微量滴定板MaxiSorp⑧平底96孔平板(Nunc訂單號44-2404)的孔用抗心肌肌4丐蛋白I抗體包被。在包被緩沖液(K).lMNaHC〇3,Sigma訂單號S-51761,34mMNa2C03;Sigma訂單號S-7795,pH9.5)內(nèi)的0.5pg/ml抗體濃度上以100pl/孔在4°C包^皮過夜。用PBS/Tw(石舞酸鹽緩沖鹽水，NaClSigma訂單號S-5886,氯化鉀Sigma訂單號P-4504,磷酸鈉，Sigma訂單號S-5136,磷酸二氫鉀，SigmaP-5655,含0.05%Tween20Roth訂單號9127.1)洗滌兩次(每孔每次洗滌300(il)。為封閉非特異性結(jié)合作用，全部孔接受300pi含1%明膠(冷水魚皮，Sigma訂單號G-7765)的PBS。溫育在室溫進(jìn)4亍3小時?？兹缟嫌肞BS/Tw洗滌。試驗(yàn)孔接受100(il肌鈣蛋白1溶液(在樣品稀釋液=含0.1%Tween20⑧和1。/o牛血清白蛋白(BSA,Sigma訂單號A-9647)的PBS中的3pg/ml)。對照孔接受100pi樣品稀釋液。溫育在室溫(RT)進(jìn)行2小時。孔如上用PBS/Tw洗滌。將人血清在樣品稀釋液內(nèi)l:20稀釋并且在步驟2中進(jìn)一步稀釋。在室溫下一式兩份將每孔100pl稀釋的血清分別在試驗(yàn)孔以及對照孔中溫育90分鐘?？兹缟嫌肞BS/Tw洗滌。隨后向每孔添加100pl的在樣品稀釋液中1:10,000稀釋的檢測抗體(辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗人IgG單克隆抗體-BDPharmingen產(chǎn)品編號555788)并溫育1小時，隨后如上所述洗滌。與孔結(jié)合的過氧化物酶活性通過使用100pl/孔BlueStarTMB-HRP-底物(DiarectAG,產(chǎn)品編號DIA91000)如供應(yīng)商所述檢測。反應(yīng)在45分鐘后通過添加100jil/孑L0.3MH2S04J.T.Baker訂單號6057而終止。使用550nm作為參考波長通過SLTSpectraII,Tecan記錄在450nm處的消光。對于試-瞼孔內(nèi)的雙次測量以及對于對照孔內(nèi)的雙次測量計(jì)算中位數(shù)值。校正的OD結(jié)果通過從相應(yīng)檢測孔的中位數(shù)中減去對照孔的中位數(shù)以便彌補(bǔ)非特異性結(jié)合作用而計(jì)算。大于0.2光密度值的校正OD值視為陽性。結(jié)果在表l中匯總。表1:抗肌4丐蛋白I抗體檢驗(yàn)結(jié)果樣品來源陽性樣品數(shù)/樣品總數(shù)HOCM(月巴厚梗阻性心肌病)5/7DCM(擴(kuò)張性心肌病)6/13ICM(缺血性心肌病)5/13對照(無已知的心功能障礙)0/4可以見到，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)顯著數(shù)量的患有各種類型心肌病的患者在其樣品中具有抗心肌肌鈣蛋白I抗體。這清楚表明抗心肌肌鈣蛋白抗體的存在可以代表心肌疾病的標(biāo)志。因?yàn)橛扇梭w產(chǎn)生(IgG)抗體只是時間早晚問題，故這些抗體極可能可以充當(dāng)用于患心血管疾病、尤其來自心肌病的風(fēng)險4示志物。實(shí)施例3對具有或沒有抗肌鈣蛋白抗體的AMI患者的評估將AMI患者再分組為具有抗cTNI自身抗體的組和沒有抗TNI自身抗體的組。通過分別測量MI后6-24小時和6-9月后的左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)而評估疾病過程。LVEF指示心臟的泵送功能。下降的LVEF提示發(fā)生心力衰竭，而后續(xù)期間LVEF的增加提示泵送功能恢復(fù)及患者康復(fù)。初步研究的結(jié)果示于表2。表2:具有或沒有抗TNI抗體的AMI患者的LVEF的改變<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>從表2中顯而易見，LVEF的平均改變對于血液中含抗肌鈣蛋白抗體的患者呈陰性，而VEF的平均改變對于循環(huán)中不具有可檢測水平的自身抗肌釣蛋白抗體患者呈陽性(心功能改善)。權(quán)利要求1.輔助評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的方法，包括a)體外測量抗心肌肌鈣蛋白抗體和任選地一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，以及b)使在(a)中獲得的值或諸值與個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述心肌肌鈣蛋白包括肌鈣蛋白T和肌4丐蛋白I。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述心肌肌釣蛋白是肌鈣蛋白I或肌釣蛋白T。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中所述的方法，其中所述抗心肌肌鈣蛋白抗體屬于免疫球蛋白M類。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)中所述的方法，其中所述抗心肌肌釣蛋白抗體屬于免疫球蛋白G類。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中所述的方法，其中所述一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物選自心肌肌釣蛋白、利尿鈉肽或利尿鈉肽相關(guān)標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物、D-二聚體、膽固醇、高半胱氨酸、脂連蛋白、sCD40L、髓過氧化物酶、P1GF和缺血修飾的白蛋白。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述標(biāo)志物是心肌肌鈣蛋白。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述標(biāo)志物是BNP或BNP相關(guān)沖示志物。9.抗心肌肌釣蛋白抗體在評估個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險中的用途。10.試劑盒，包括心肌肌釣蛋白和適用于測量抗所述心肌肌鈣蛋白抗體的輔助試劑。全文摘要本發(fā)明涉及心肌病領(lǐng)域。本發(fā)明公開了在從個體獲得的樣品中存在的抗心肌肌鈣蛋白抗體可以作為診斷標(biāo)志物、尤其是在評估個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險中使用。描述了輔助評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險的方法，包括體外測量抗心肌肌鈣蛋白抗體和任選地一種或多種在評估個體發(fā)生心肌病風(fēng)險中有用的其它標(biāo)志物，并且使獲得的值或諸值與個體發(fā)生心肌病的風(fēng)險建立關(guān)聯(lián)。文檔編號G01N33/68GK101371144SQ200780002883公開日2009年2月18日申請日期2007年1月23日優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日發(fā)明者H·卡圖斯,K·哈勒邁耶,Z·卡亞申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司