專利名稱：一種分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液分離鑒定檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種分離鑒定血液中 有核紅細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
血樣品分離成為各種細(xì)胞組分，就需要相應(yīng)地調(diào)節(jié)血樣的處理/加工技 術(shù)。將全血樣品分離成為其各種細(xì)胞組分的常規(guī)方法是用離心的方法。雖然 此種方法是有效的，但是需要花很大的勞動(dòng)、效率相當(dāng)?shù)投倚枰萌斯?lái) 控制血樣中的細(xì)胞部分。有核紅細(xì)胞的分離，是基因分析的開(kāi)端，也是較為困難的步驟之一。現(xiàn) 如今各國(guó)學(xué)者們己經(jīng)嘗試了各種不同的方法來(lái)分離有核紅細(xì)胞，但仍未找到直接、可靠、高效率的分離途徑。在試圖用化學(xué)藥劑來(lái)進(jìn)行血樣中的細(xì)胞部分的此種分離時(shí)，由于種種原 因，結(jié)果始終是不能令人完全滿意的。更準(zhǔn)確地說(shuō)，細(xì)胞種群在活體內(nèi)或體 外的生活強(qiáng)度和生存性，均取決于保持一種與保存實(shí)際細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞中的 化學(xué)平衡一致的準(zhǔn)確生理環(huán)境。細(xì)胞膜的滲透性和運(yùn)送特性可控制細(xì)胞中的 化學(xué)平衡。生理環(huán)境的改變又可以誘發(fā)細(xì)胞膜的應(yīng)答或改變。細(xì)胞膜應(yīng)答在性質(zhì)上是"防御性的"；也就是說(shuō)，細(xì)胞膜的生理應(yīng)答是適合于保持細(xì)胞中 的化學(xué)平衡，因此是延續(xù)和不間斷細(xì)胞的生存性現(xiàn)在已充分認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞只 能在一定的限度范圍內(nèi)耐受此種理想生理環(huán)境的改變;而且，還認(rèn)識(shí)到如果 超過(guò)此種限度，細(xì)胞就會(huì)遭到永久性的損傷。在本技術(shù)領(lǐng)域中還進(jìn)一步認(rèn)識(shí) 到，此種生理環(huán)境的改變(即，稀釋介質(zhì)的毒性-即使是用蒸餾水)可影響 細(xì)胞的溶血作用。目前獲取有核紅細(xì)胞的途徑主要有兩條:①直接獲取。利用有核紅細(xì)胞 表面抗原如CD71, GPA, CD36等作為標(biāo)記，通過(guò)磁激活細(xì)胞分選法(magneticactivated sorting, MACS)或焚光激活細(xì)胞分選法(fluorescenceactivated cell sorting, FACS)技術(shù)獲取有核紅細(xì)胞，或利用血液中Y珠蛋白鏈作為標(biāo)記， 通過(guò)免疫組織化學(xué)等方法直接識(shí)別后，顯微操作獲取。②間接獲取。以顯微 操作法最具代表性，先染色，從形態(tài)上識(shí)別，借助高倍顯微操作捕獲單個(gè)有 核紅細(xì)胞，再應(yīng)用于基因分析。直接獲取法成本高，或特異性不強(qiáng)，易受污 染，或操作繁瑣，技術(shù)要求高，其可靠性、實(shí)用性受到置疑，難以推廣應(yīng)用。 間接獲取法可有效避免污染，隨著單細(xì)胞PCR技術(shù)的發(fā)展，該法被視為獲 取有核紅細(xì)胞較理想的途徑。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是建立一種快速有效的分離鑒定血液中有 核紅細(xì)胞的方法，便于顯微操作，能夠高效、準(zhǔn)確地獲取有核紅細(xì)胞進(jìn)行后 續(xù)的細(xì)胞鑒定及基因分析。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的 方法，包括以下步驟(一) 配制試劑(1 )多聚賴氨酸工作液多聚賴氨酸儲(chǔ)備液與雙蒸水1: 10充分混合， 氣泡消失后備用；(2 ) PH 7,4含0.5%BSA的O.Olmol/L PBS:氯化鈉6.5gNa2HP04.12H20 4gNaH2P04.2H20 0.35g加雙蒸水800ml,調(diào)節(jié)PH值至7.4,雙蒸水補(bǔ)至1000ml, 0.01 mol/LPBS,高壓滅菌后，加入5gBSA，40。C保存；(3 )含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L的堿性細(xì)胞裂解液 400 mmol/L KOH1 ml lmol/LDTT 100 ul 滅菌注射用水850ul，充分混合，0.22(im微孔過(guò)濾器過(guò)濾后分裝, -2(TC保存?zhèn)溆茫?二) 制備防脫膠玻片(1)載玻片的預(yù)處理將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來(lái)水清潔干凈，烘干，置于硫酸清潔液中浸泡24小時(shí)以上，自來(lái)水沖洗過(guò)夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95°/0乙 醇浸泡24小時(shí)，雙蒸水沖洗3遍，烤干，15磅高壓滅菌20min ; (2)多聚賴氨酸包被載玻片 將預(yù)處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10 20秒，分散架于 玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存?zhèn)溆茫?三) 選擇有核紅細(xì)胞染色方法；(四) 顯微操作法獲取血液中有核紅細(xì)胞。 所述步驟(三)可以進(jìn)一步包括以下步驟 單密度梯度離心法收集有核血細(xì)胞① 血液與等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混勻，輕輕疊加于淋巴 細(xì)胞分離液上，使兩者形成一個(gè)清晰的界面，1800r/min水平離心20min, 吸取白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層，移至預(yù)先用PBS濕潤(rùn)的潔凈玻璃離心管中；② 加入2倍以上0.5 %BSA的O.01mmol/L PBS洗滌細(xì)胞，1500r/min水 平離心10min，棄上清，重復(fù)三次；③ 用0.01 mmol/L PBS稀釋細(xì)胞至適合濃度后涂片，自然干燥。 所述步驟(三)可以進(jìn)一步包括以下步驟 采用瑞氏-吉姆薩染色法對(duì)有核血細(xì)胞染色① 玻片置于染片架上，滴加3 5滴瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液，使其 迅速覆蓋標(biāo)本1 min ;② 滴加緩沖液5-10滴，吸耳球?qū)?zhǔn)玻片吹氣，使緩沖液與染液充 分混合，染色5-10min;③ 雙蒸水沖洗，晾干。所述步驟(三)可以進(jìn)一步包括以下步驟 采用聯(lián)苯胺染色法對(duì)有核血細(xì)胞染色① 玻片置于1。/o聯(lián)苯胺曱醇溶液中浸泡2min ;② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2，使其與1%聯(lián)苯胺曱醇溶液 之容積比為1:50，混勻，玻片繼續(xù)浸泡l-2min;③ 雙蒸水充分沖洗，晾干； (D蘇木素復(fù)染。
所述步驟(四)可以進(jìn)一步包括以下步驟① 制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識(shí)別有 核紅細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)；② 在有核紅細(xì)胞周?chē)渭?0~20ul的0.25Q/。蛋白酶K,使之從玻片-上松懈，用顯微操作器單個(gè)吸??；③ 將吸取到的細(xì)胞移至盛有2.5ul堿性細(xì)胞裂解液的PCR專用薄壁反 應(yīng)管中，離心后于-2(TC低溫冰箱保存?zhèn)錄_企。所述方法可以進(jìn)一步包括以下從外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞的步驟(1) 血樣2000r/min離心10min,用吸管吸出每管中80 %的血漿；(2) 而后加入PBS進(jìn)行稀釋，此液含有一整個(gè)白細(xì)胞群，包括粒細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞；(3) 取2ml淋巴細(xì)胞分層液于離心管內(nèi)，同時(shí)用毛細(xì)吸管吸取約2ml的 細(xì)胞懸液輕輕加入分層液上；以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2000r/min，離心20min后， 可見(jiàn)分成多層，最下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，最上層是血漿；在血漿 層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層；(4) 用毛細(xì)吸管插入到單個(gè)核細(xì)胞層，吸取該層，放入另一試管中；以 Hanks液洗滌、離心。所述方法可以進(jìn)一步包括以下有核紅細(xì)胞的分離純化步驟(1) 尼龍毛柱的制備① 取尼龍毛用0.2mol/LHCl浸泡處理過(guò)夜；② 用雙蒸水洗凈HC1，置37。C烘干備用；③ 稱取90 120mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夾住； (D將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高7 8cm; ⑥將制各好的柱高壓滅菌各用；(2) 尼龍毛分離有核紅細(xì)胞① 取分離的單個(gè)核細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成400個(gè)/ml ;② 融化尼龍毛柱，以每分鐘18 ~ 20滴的速度放出Hanks液，預(yù)溫至37 °C的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱；③ 將細(xì)胞懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后，立即
加0.2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管；在37。C的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中 靜置l小時(shí)；④ 用5ml預(yù)溫至37。C的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫細(xì)胞，再用5ml預(yù)溫至37 。C的 細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈粘附的細(xì)胞；⑤ 加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置冰箱中冷卻；用4 。C預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱，每次2ml;先夾住塑料管， 用玻璃棒或金屬絲反復(fù)擠壓尼龍毛以利于粘附細(xì)胞脫落，然后再洗脫； 離心，1000rpm, IO分鐘，去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次； 計(jì)數(shù)細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸。所述方法可以進(jìn)一 步包括以下有核紅細(xì)胞的分離純化步驟1) 抗凝血?jiǎng)┮缘润w積的生理鹽水稀釋；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液與Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm,離心20min;4) 吸取云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層；5) 1000rpm,離心15min;6) 棄去上清，洗滌沉淀；7) 1000rpm,離心15min;8) 重復(fù)三次第6)、 7)步；9) 棄上清，沉淀。所述方法中使用的儀器設(shè)備可以為以下設(shè)備 RPM工1640培養(yǎng)基美國(guó)Gibc公司； 細(xì)胞分離液上海華精生物高乖日支有限公司； 血凝素PHA:廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所； P-III型倒置顯微鏡日本Nikon公司； 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板美國(guó)Corning公司； C02培養(yǎng)箱美國(guó)Forma scientific公司；DL-CJ-2N高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公 司北京分公司；0412-1型微量低速離心機(jī)上海手術(shù)器械廠。 所述方法中PBS溶液的配置方法可以為NaCL18.8g, KC10.2g， Na2HP04 3.488g，加雙蒸水至1000ml,調(diào)PH值 為7.4， 15磅高壓滅菌，4。C保存。本發(fā)明分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法能有效識(shí)別有核紅細(xì)胞，40 例樣本均能檢出有核紅細(xì)胞，檢出率100%，每例發(fā)現(xiàn)有核紅細(xì)胞2x 106~ 6xl(^個(gè)/ml。本發(fā)明聯(lián)苯胺染色后有核紅細(xì)胞易于識(shí)別，熟練的顯微操作 能迅速獲取單個(gè)有核紅細(xì)胞，為應(yīng)用單個(gè)有核紅細(xì)胞進(jìn)行基因分析打下良好 的前期基礎(chǔ)。有核紅細(xì)胞可應(yīng)用于某些基因分析和篩查。實(shí)現(xiàn)顯微操作法獲 取單個(gè)有核紅細(xì)胞進(jìn)行基因分析，首先必須從血液中識(shí)別分離有核紅細(xì)胞。本發(fā)明采用聯(lián)苯胺染色法識(shí)別有核紅細(xì)胞，借助顯微操作將其從血液中分 離，為基因分析和篩查打下基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述有核紅細(xì)胞瑞氏-吉姆薩染色圖； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述有核紅細(xì)胞聯(lián)苯胺染色圖。具體實(shí)施務(wù)式(一) 主要試劑配制1. 多聚賴氨酸工作液多聚賴氨酸儲(chǔ)備液與雙蒸水1: IO充分混合， 待氣泡消失后備用；2. 含0.5%BSA的0.01mol/L PBS(PH 7,4 )氯化鈉6.5g Na2HP04.12H20 4g NaH2P04.2H20 0.35g加雙蒸水800ml,調(diào)節(jié)PH值至7.4,雙蒸水補(bǔ)至1000ml即配 成。0.01 mol/LPBS，高壓滅菌后，加入5gBSA， 40。C保存。3. 堿性細(xì)胞裂解液(含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L )400 mmol/L KOH 1 ml lmol/LDTT 100 ul滅菌注射用水850~900ul,充分混合，0.22pm微孔過(guò)濾器過(guò) 濾后分裝，-2(TC保存?zhèn)溆谩?二) 防脫膠玻片制備
l.載玻片的預(yù)處理將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來(lái)水清潔千凈，烘干，置于疏酸清潔液中浸泡24小時(shí)以上，自來(lái)水沖洗過(guò)夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95% 乙醇浸泡24小時(shí)，雙蒸水沖洗3遍，烤干，15磅高壓滅菌20min. 2.多聚賴氨酸包被載玻片將預(yù)處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10~20秒，分散 架于玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存?zhèn)溆谩?(三)有核紅細(xì)胞染色方法的選擇 從外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞(1) 血樣2000r/min離心10min,用吸管吸出每管中絕大部分血漿；(2) 而后加入PBS進(jìn)行稀釋，此液含有一整個(gè)白細(xì)胞群，包括粒細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞；(3) 取2ml淋巴細(xì)胞分層液于離心管內(nèi)，同時(shí)用毛細(xì)吸管吸取約2ml 的細(xì)胞懸液輕輕加入分層液上。以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2000r/min,離心20min 后，可見(jiàn)分成多層，最下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，最上層是血漿。在 血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層；(4) 用毛細(xì)吸管插入到單個(gè)核細(xì)胞層，吸取該層，放入另一試管中； 以Hanks液洗滌、離心，最后配制成適當(dāng)?shù)募?xì)月包濃度。有核紅細(xì)胞分離純化 l)尼龍毛柱的制各① 取尼龍毛用0.2mol/LHCl浸泡處理過(guò)夜；② 用雙蒸水洗凈HC1，置37。C烘干各用；③ 稱取90 120mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夾?。虎?將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約7 8cm;⑥ 將制各好的柱高壓滅菌各用； (2)尼龍毛分離有核紅細(xì)胞① 取分離的單個(gè)核細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成400個(gè)/ml ;② 融化尼龍毛柱，以每分鐘18~20滴的速度放出Hanks液，預(yù)溫至37
°c的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。③ 將細(xì)胞懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管；在37。C的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中 靜置1小時(shí)；④ 用5ml預(yù)溫至37t:的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫細(xì)胞，再用5ml預(yù)溫至37。C的 細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈粘附的細(xì)胞。⑤ 加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置水箱中冷卻；用4 。C預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱，每次2ml。先夾住塑料管， 用玻璃棒或金屬絲反復(fù)擠壓尼龍毛以利于粘附細(xì)胞脫落，然后再洗脫； 離心，1000rpm， IO分鐘，去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次； 計(jì)數(shù)細(xì)月包，用細(xì)月包培養(yǎng)液將細(xì)月包重懸； 儀器1. RPM工1640培養(yǎng)基(干粉):美國(guó)Gibc公司2. 細(xì)胞分離液((Ficoll):上海華精生物高乖日支有限公司3. 血凝素PHA ( 1 0mg/支):廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所4. P-III型倒置顯微鏡日本Nikon公司5. 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板:美國(guó)Corning公司6. C02培養(yǎng)箱美國(guó)Forma scientific 7>司7. DL-CJ-2N高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái):哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公 司北京分公司8. 0412-1型微量低速離心機(jī):上海手術(shù)器械廠PBS溶液:NaCL 18.8g， KCl 0.2g， Na2HP04 3.488g,加雙蒸水至1000ml, 調(diào)PH值為7.4, 15磅高壓滅菌，4'C保存。用Ficoll密度梯度離心法分離血樣中的有核紅細(xì)胞，具體步驟如下 1 )抗凝血?jiǎng)┮缘润w積的生理鹽水稀釋；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液與Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm，離心20min;4) 吸取云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層；5) 1000rpm,離心15min;6) 棄去上清，洗滌沉淀； 7) 1000rpm,離心15min;8) 重復(fù)一次第6)、 7)步； 9)棄上清，沉淀。單密度梯度離心法收集有核血細(xì)胞① 血液與等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混勻，輕輕疊加于淋巴 細(xì)胞分離液上，1吏兩者形成一個(gè)清晰的界面，1800r/min水平離心20min, 吸取白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層，移至預(yù)先用PBS濕潤(rùn)的潔凈玻璃離心管中。② 加入2倍以上0.5 % BSA的0.01mmol/L PBS洗滌細(xì)胞，1500r/min水 平離心10min,棄上清。重復(fù)一次。③ 用0.01 mmol/L PBS稀釋細(xì)胞至適合濃度后涂片，自然干燥。 有核血細(xì)月包染色方法(1) 瑞氏-吉姆薩染色法① 玻片置于染片架上，滴加3~5滴瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液，使其 迅速覆蓋標(biāo)本，約1 min 。② 滴加緩沖液5 10滴，吸耳球?qū)?zhǔn)玻片吹氣，使緩沖液與染液充 分混合，染色5 10min。③ 雙蒸水沖洗，晾干。(2) 聯(lián)苯胺染色法① 玻片置于P/。聯(lián)苯胺曱醇溶液中浸泡2min 。② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2,使其與1%聯(lián)苯胺甲醇溶液 之容積比為1:50,混勾，玻片繼續(xù)浸泡l~2min.③ 雙蒸水充分沖洗，晾干。④ 蘇木素復(fù)染。(四)顯微操作法獲耳又血液中有核紅細(xì)胞①制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識(shí)別 有核紅細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)。② 在有核紅細(xì)胞周?chē)渭?0~20ul的0.25。/。蛋白酶K，使之從玻片 上松懈，用顯微操作器單個(gè)吸取。③ 將吸取到的細(xì)胞移至盛有2.5 ul堿性細(xì)胞裂解液的PCR專用薄壁反 應(yīng)管中，離心后于-2(TC低溫冰箱保存?zhèn)錂z。
結(jié)果一、 有核紅細(xì)胞的富集單密度梯度離心分離出的細(xì)胞含有90%以上的淋巴細(xì)胞，少量單核 細(xì)胞和有核紅細(xì)胞等等。二、 有核紅細(xì)胞染色如圖l所示，為本發(fā)明實(shí)施例所述有核紅細(xì)胞瑞氏-吉姆薩染色圖。 其中，瑞氏-吉姆薩染色為IOOO倍光鏡下有核紅細(xì)胞胞質(zhì)呈紫藍(lán)色，胞核呈 深藍(lán)色，400倍光鏡下有時(shí)難以與其它細(xì)胞尤其是淋巴細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。如圖2所示，為本發(fā)明實(shí)施例所述有核紅細(xì)胞聯(lián)苯胺染色圖。其中， 有核紅細(xì)胞聯(lián)苯胺染色光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)有核紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，蘇 木素復(fù)染后胞核呈藍(lán)色，明顯區(qū)分于其它細(xì)胞，識(shí)別效果優(yōu)于瑞氏-吉姆薩 染色。有核紅細(xì)胞4企出率40例樣本均能檢出有核紅細(xì)胞，檢出率100 % ,每例發(fā)現(xiàn)有核紅細(xì)胞2 ~ 6個(gè)/ml，共獲取157個(gè)。外周血中單個(gè)核細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體 積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同。紅細(xì)胞和多核粒細(xì)胞密度較大，為1.090 左右，而單個(gè)核細(xì)胞密度為1.075 - 1.090,血小板為1.030~ 1.035。如果利 用一種密度介于1.075 ~ 1.092之間而近于等滲的溶液(分層液)做密度梯度離 心，就能將各種不同密度的血細(xì)胞進(jìn)行分離。本發(fā)明的分離介質(zhì)是密度為 1.077的淋巴細(xì)胞分離液，水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的 液體和細(xì)胞帶，與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界 面中，呈白膜狀。用本發(fā)明方法分離的細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95%，細(xì) 胞獲得率達(dá)80%以上。用顯微操作法分離有核紅細(xì)胞時(shí)，識(shí)別是一個(gè)關(guān)鍵步驟?，F(xiàn)有技術(shù)中常 用瑞氏-吉姆薩染色識(shí)別有核紅細(xì)胞，然而，使用現(xiàn)有技術(shù)的方法，有核紅 細(xì)胞在富集過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了多次洗滌、離心，制片后細(xì)胞均有不同程度的變 形、皺縮，用上述染色在400倍光鏡下不易辨認(rèn)有核紅細(xì)胞，分離難度大。 紅細(xì)胞中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過(guò)氧化物酶樣的活性，能使過(guò)氧化氬
釋放出新生態(tài)氧，將無(wú)色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變成棕色化合物。因 此，本發(fā)明采用聯(lián)苯胺染色，將有核紅細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色，再進(jìn)行蘇木素復(fù)染，使胞核著色成藍(lán)色，400倍光鏡下能清楚識(shí)別，結(jié)合熟練的顯微操作 技術(shù)，即能迅速、準(zhǔn)確地捕獲單個(gè)有核紅細(xì)胞。本發(fā)明檢驗(yàn)方法檢出率100%， 40例樣本均能檢出有核紅細(xì)胞，檢出率 100%,每例發(fā)現(xiàn)有核紅細(xì)胞2x l06~6x 106個(gè)/ml，出現(xiàn)頻率高。使用本發(fā)明方法分離鑒定血液中的有核紅細(xì)胞，檢測(cè)費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)單， 聯(lián)苯胺染色一蘇木素復(fù)染后有核紅細(xì)胞在400倍光鏡下識(shí)別效果優(yōu)于瑞氏-吉姆薩染色，鏡下能更快速搜捕到目的細(xì)胞，更便于后期顯微操作法捕獲有 核紅細(xì)月包。使用本發(fā)明鑒定方法，聯(lián)苯胺染色后顯微操作法能高效、準(zhǔn)確地識(shí)別并 獲取單個(gè)有核紅細(xì)胞，結(jié)合全基因組擴(kuò)增技術(shù)，可應(yīng)用于基因分析技術(shù)。
權(quán)利要求
1、 一種分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟(一) 配制試劑(1 )多聚賴氨酸工作液多聚賴氨酸儲(chǔ)備液與雙蒸水1: 10充分混合， 氣泡消失后備用；(2 ) PH 7.4含0.5%BSA的0.01mol/L PBS:氯化鈉6.5gNa2HP04'12H20 4gNaH2P04.2H200.3 5g加雙蒸水800ml,調(diào)節(jié)PH值至7.4，雙蒸水補(bǔ)至1000ml ， 0.01 mol/LPBS,高壓滅菌后，加入5gBSA, 40。C保存；(3 )含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L的堿性細(xì)胞裂解液 400 mmol/L KOH1 ml lmol/LDTT100 ul 滅菌注射用水850ul，充分混合，0.22lim微孔過(guò)濾器過(guò)濾后分裝， -20匸保存?zhèn)溆茫?二) 制備防脫膠玻片(1) 載玻片的預(yù)處理將普通載玻片用熱肥皂水洗刷，自來(lái)水清潔干凈，烘干，置于硫酸清潔 液中浸泡24小時(shí)以上，自來(lái)水沖洗過(guò)夜，雙蒸水沖洗3遍，烘干，95%乙 醇浸泡24小時(shí)，雙蒸水沖洗3遍，烤千，15磅高壓滅菌20min ;(2) 多聚賴氨酸包被載玻片 將預(yù)處理后的玻片在多聚賴氨酸工作液中上下浸蘸10-20秒，分散架于玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存?zhèn)溆茫?三) 選擇有核紅細(xì)胞染色方法；(四) 顯微操作法獲取血液中有核紅細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述步驟(三)進(jìn)一步包括以下步驟單密度梯度離心法收集有核血細(xì)胞 ① 血液與等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混勻，輕輕疊加于淋巴 細(xì)胞分離液上，4吏兩者形成一個(gè)清晰的界面，1800r/min水平離心20min， 吸取白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層，移至預(yù)先用PBS濕潤(rùn)的潔凈玻璃離心管中；② 加入2倍以上0.5 %BSA的0.01mmol/L PBS洗滌細(xì)胞，1500r/min水 平離心10min,棄上清，重復(fù)三次；③ 用0.01 mmol/L PB S稀釋細(xì)胞至適合濃度后涂片，自然干燥。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述步驟(三)進(jìn)一步包括以下步驟采用瑞氏-吉姆薩染色法對(duì)有核血細(xì)胞染色① 玻片置于染片架上，滴加3~5滴瑞氏-吉姆薩復(fù)合染色液，使其 迅速覆蓋標(biāo)本1 min ;② 滴加緩沖液5-10滴，吸耳球?qū)?zhǔn)玻片吹氣，使緩沖液與染液充 分混合，染色5 10min;③ 雙蒸水沖洗，晾千。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述步驟(三)進(jìn)一步包括以下步驟釆用聯(lián)苯胺染色法對(duì)有核血細(xì)胞染色① 玻片置于1。/。聯(lián)苯胺曱醇溶液中浸泡2min ;② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2，使其與1%聯(lián)苯胺曱醇溶液 之容積比為1:50,混勻，玻片繼續(xù)浸泡1 2min;③ 雙蒸水充分沖洗，晾干；④ 蘇木素復(fù)染。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1 - 4中任意一項(xiàng)所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的 方法，其特征在于，所述步驟(四)進(jìn)一步包括以下步驟① 制備好的玻片放置于倒置相差顯微鏡下，400倍光鏡下觀察識(shí)別有 核紅細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)；② 在有核紅細(xì)胞周?chē)渭?0~20 ul的0.25。/o蛋白酶K，使之從玻片 上松懈，用顯微操作器單個(gè)吸?。虎?將吸取到的細(xì)胞移至盛有2.5 ul堿性細(xì)胞裂解液的PCR專用薄壁反 應(yīng)管中，離心后于-2(TC低溫冰箱保存?zhèn)錂z。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述方法中進(jìn)一 步包括以下從外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞的步驟(1) 血樣2000r/min離心10min，用吸管吸出每管中80%的血漿；(2) 而后加入PBS進(jìn)行稀釋，此液含有一整個(gè)白細(xì)胞群，包括粒細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞；(3) 取2ml淋巴細(xì)胞分層液于離心管內(nèi)，同時(shí)用毛細(xì)吸管吸取約2ml的 細(xì)胞懸液輕輕加入分層液上；以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2000r/min,離心20min后， 可見(jiàn)分成多層，最下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，最上層是血漿；在血漿 層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層；(4) 用毛細(xì)吸管插入到單個(gè)核細(xì)胞層，吸取該層，；故入另一試管中；以 Hanks液洗滌、離心。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述方法中進(jìn)一步包括以下有核紅細(xì)胞的分離純化步驟(1) 尼龍毛柱的制備① 取尼龍毛用0.2mol/L HC1浸泡處理過(guò)夜；② 用雙蒸水洗凈HC1，置37。C烘干備用；③ 稱取90- 120mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夾?。虎?將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高7 8cm;⑥ 將制各好的柱高壓滅菌各用；(2) 尼龍毛分離有核紅細(xì)胞① 取分離的單個(gè)核細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成400個(gè)/ml ;② 融化尼龍毛柱，以每分鐘18 ~ 20滴的速度放出Hanks液，預(yù)溫至37 °C的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱；③ 將細(xì)胞懸液加入尼龍毛柱中，待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后，立即 力口 0.2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管；在37匸的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中 靜置1小時(shí)；@用5ml預(yù)溫至37。C的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫細(xì)胞，再用5ml預(yù)溫至37'C的 細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈粘附的細(xì)胞；(D加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置水箱中冷卻；用4。C預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱，每次2ml;先夾住塑料管， 用玻璃棒或金屬絲反復(fù)擠壓尼龍毛以利于粘附細(xì)胞脫落，然后再洗脫； 離心，1000rpm, IO分鐘，去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次； 計(jì)數(shù)細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述方法中進(jìn)一步包括以下有核紅細(xì)胞的分離純化步驟1) 抗凝血?jiǎng)┮缘润w積的生理鹽水稀釋；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液與Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm,離心20min;4) 吸取云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層；5) 1000rpm，離心15min;6) 棄去上清，洗滌沉淀；7) 1000rpm,離心15min;8) 重復(fù)三次第6)、 7)步；9) 棄上清，沉淀。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述方法中使用的儀器設(shè)備為以下設(shè)備RPM工1640培養(yǎng)基美國(guó)Gibc公司； 細(xì)胞分離液上海華精生物高乖日支有限公司； 血凝素PHA :廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所； P-III型倒置顯微鏡日本Nikon公司； 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板:美國(guó)Coming公司； C02培養(yǎng)箱美國(guó)Forma scientific公司；DL-CJ-2N高性能無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公 司北京分公司；0412-1型微量低速離心機(jī)上海手術(shù)器械廠。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，其特征 在于，所述方法中PBS溶液的配置方法為NaCl 18.8g， KC10.2g， Na2HP04 3.488g，加雙蒸水至1000ml,調(diào)PH值 為7.4， 15磅高壓滅菌，4。C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法，包括以下步驟(一)配制試劑；(二)制備防脫膠玻片；(三)選擇有核紅細(xì)胞染色方法；(四)顯微操作法獲取血液中有核紅細(xì)胞。本發(fā)明分離鑒定血液中有核紅細(xì)胞的方法能有效識(shí)別有核紅細(xì)胞，40例樣本均能檢出有核紅細(xì)胞，檢出率100％，每例發(fā)現(xiàn)有核紅細(xì)胞2×10⁶～6×10⁶個(gè)/ml。本發(fā)明聯(lián)苯胺染色后有核紅細(xì)胞易于識(shí)別，熟練的顯微操作能迅速獲取單個(gè)有核紅細(xì)胞，為應(yīng)用單個(gè)有核紅細(xì)胞進(jìn)行基因分析打下良好的前期基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101122601SQ20071015196
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2007年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月24日
發(fā)明者孫艷萍 申請(qǐng)人:孫艷萍