專利名稱：免疫測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫測(cè)定方法，其中將免疫反應(yīng)性物質(zhì)，通常為抗體加入到樣本中以便檢測(cè)可能包含在該樣本中的指定分析物和/或?qū)ζ涠俊?br> 在大部分情況中，用于免疫測(cè)定方法中的免疫反應(yīng)性物質(zhì)為特異性抗體。然而，如果抗體為所關(guān)注的分析物，那么也可以使用抗原。
在這兩種情況中，所用的免疫反應(yīng)性物質(zhì)都能夠通過(guò)例如形成抗體-抗原復(fù)合物而與所述的分析物發(fā)生特異性相互作用。例如，可以通過(guò)在指定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行濁度測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)這類復(fù)合物(凝集)在樣品中的形成。例如，通過(guò)濁度測(cè)定法測(cè)定的凝集程度為樣品中分析物濃度的指征。
通常在分析前建立校準(zhǔn)曲線或類似曲線并且使用在濁度測(cè)定過(guò)程中獲得的值通過(guò)該曲線計(jì)算分析物的濃度。
有時(shí)在含有高濃度分析物的樣品中觀察到?jīng)]有凝集發(fā)生或僅發(fā)生減少的凝集。如果將這類樣品充分稀釋，那么會(huì)發(fā)生正常的凝集。
在高分析物濃度下凝集的缺乏或減少稱作前帶效應(yīng)或“鉤形效應(yīng)”并且與如下事實(shí)相關(guān)例如在樣品中過(guò)量的抗原導(dǎo)致形成小抗體-抗原-復(fù)合物，它們不會(huì)聚結(jié)而形成可見的凝集。一般而言，可以認(rèn)為抗原的濃度與抗體的濃度相比越高，則觀察到的信號(hào)越低。
當(dāng)抗原的遞增濃度超過(guò)了抗體群識(shí)別和結(jié)合的相對(duì)能力時(shí)，信號(hào)會(huì)衰減。這種效應(yīng)是動(dòng)態(tài)的并且代表了從抗原-抗體凝集物形成到非凝集化形式占優(yōu)勢(shì)的較高可能性之間反應(yīng)平衡的改變。
已知的免疫測(cè)定法提供了鑒定產(chǎn)生前帶效應(yīng)的樣品的不同手段。大部分已知的方法均使用在指定的時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行濁度測(cè)定來(lái)建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。例如，通過(guò)將在不同時(shí)間時(shí)從反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中獲得的值進(jìn)行比較，能夠推斷樣品中是否已經(jīng)產(chǎn)生了前帶效應(yīng)。
用于檢測(cè)前帶效應(yīng)的方法，例如披露在JP 2000221195、JP6213893或JP 6094717中，僅給出幾個(gè)實(shí)例。
目前，免疫測(cè)定方法的方案提供了將其中檢測(cè)到陽(yáng)性前帶效應(yīng)的樣品(前帶陽(yáng)性樣品)稀釋，并且使用稀釋的樣品進(jìn)行新的分析。然而，當(dāng)分析物的濃度未知時(shí)，通常必須進(jìn)行系列稀釋以便找到指定樣品的正確稀釋比。這類系列稀釋存在缺陷，因?yàn)樗鼈冃枰獣r(shí)間來(lái)進(jìn)行測(cè)試并且分析結(jié)果，還需要分析儀器的空間和另外的試劑和樣品材料。
因此，本發(fā)明的目的在于提供簡(jiǎn)化對(duì)前帶陽(yáng)性樣品的檢驗(yàn)的方法。
該目的通過(guò)權(quán)利要求1的方法實(shí)現(xiàn)。
與已知的方法類似，本發(fā)明的方法也包括下列步驟-通過(guò)將樣本與能夠特異性結(jié)合分析物的免疫反應(yīng)性物質(zhì)，尤其是抗體混合制備測(cè)定樣品；-使樣品于指定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)；-例如，通過(guò)濁度測(cè)定法測(cè)定涉及免疫反應(yīng)性物質(zhì)與分析物在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的相互作用的信號(hào)；和-基于不同的時(shí)間時(shí)測(cè)定的信號(hào)檢查在樣品中是否已經(jīng)產(chǎn)生前帶效應(yīng)并且據(jù)此標(biāo)記前帶陽(yáng)性的樣品。
與已知的方法大不相同，本發(fā)明提供了將不同的校準(zhǔn)曲線或單一校準(zhǔn)曲線的不同部分用于計(jì)算分析物濃度，這取決于樣品是否為前帶陽(yáng)性的。
與僅使用一種校準(zhǔn)曲線的已知技術(shù)相比，本發(fā)明的方法使用了兩種不同的校準(zhǔn)曲線或系統(tǒng)，一種用于前帶陽(yáng)性樣品，而另一種用于剩余的樣品。
令人意外地發(fā)現(xiàn)，例如對(duì)含有高濃度的產(chǎn)生前帶效應(yīng)的分析物的樣品進(jìn)行濁度測(cè)定仍然可再現(xiàn)地產(chǎn)生在前帶范圍內(nèi)的針對(duì)不同濃度的濃度依賴值。
因此，能夠建立特定的校準(zhǔn)曲線，它們至少能夠?qū)η皫ш?yáng)性樣品中的分析物濃度進(jìn)行近似的計(jì)算。
可以直接取用于前帶陽(yáng)性樣品的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的濃度值或?qū)⑺鼈冇糜谟?jì)算正確的稀釋比。
最好的是，本發(fā)明的方法避免了對(duì)前帶陽(yáng)性樣品的再檢驗(yàn)，例如，在其中近似的結(jié)果仍然可以滿足試驗(yàn)的醫(yī)學(xué)要求的情況下。如果認(rèn)為再檢驗(yàn)是必要的，那么對(duì)于前帶陽(yáng)性樣品獲得的濃度值是如此精確，以致于在不進(jìn)行系列稀釋的情況下將樣品正確稀釋到標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍是可能的。
本發(fā)明的方法僅需要例如選擇正確的校準(zhǔn)曲線用于計(jì)算分析物濃度。這是通過(guò)分析反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)來(lái)完成的。這使得分析更為便捷。
本發(fā)明的免疫測(cè)定法適用于所有已知的使用和不使用粒子增強(qiáng)的凝集或血細(xì)胞凝集試驗(yàn)。
優(yōu)選本發(fā)明的方法使用濁度測(cè)定技術(shù)來(lái)測(cè)定例如抗體與抗原之間的相互作用。然而，也可以使用能夠?qū)λ鱿嗷プ饔眠M(jìn)行定量并且承擔(dān)前帶效應(yīng)的其它技術(shù)，例如化學(xué)發(fā)光、酶免疫測(cè)定法、熒光或比濁法，僅給出一些實(shí)例。由于此原因，盡管本文主要涉及濁度測(cè)定，但是本發(fā)明不應(yīng)限于應(yīng)用這種技術(shù)。
可以通過(guò)本發(fā)明方法分析的典型的樣本為，例如血液、血清或尿。一般而言，任何的體液或組織提取物均應(yīng)被術(shù)語(yǔ)可以在免疫測(cè)定法中檢驗(yàn)的樣本所涵蓋。
典型的反應(yīng)時(shí)間在30秒到10分鐘之間改變。
可以通過(guò)使用分光光度計(jì)或比濁計(jì)進(jìn)行濁度測(cè)定。所用的波長(zhǎng)取決于該測(cè)定。一般而言，可以在340nm-800nm范圍內(nèi)最佳地測(cè)定凝集。
在本發(fā)明中可以使用檢測(cè)樣品中的前帶并且據(jù)此標(biāo)記樣品的任何已知的方法。
本發(fā)明的方法如果在能夠檢測(cè)樣品的前帶效應(yīng)的自動(dòng)化分析儀中使用，那么是特別有利的?？梢詫⒃摲治鰞x的程序設(shè)定為從一種標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換到另一種校準(zhǔn)曲線，條件是例如它可以獲得樣品為前帶陽(yáng)性的信息。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以規(guī)定將免疫反應(yīng)性物質(zhì)固定在微粒上，例如尤其是固定在聚合物珠，例如乳膠珠上。然而，可以分別用于普通免疫測(cè)定法或微粒增強(qiáng)的光散射凝集測(cè)定法的任何粒子都是適宜的。與直接凝集相比的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)使用與微粒偶聯(lián)的免疫反應(yīng)性物質(zhì)提高測(cè)定的靈敏度。
實(shí)際上，可以利用任何與本文所述類似的軟件介導(dǎo)的標(biāo)志(flagging)過(guò)程適用于表現(xiàn)出“鉤形效應(yīng)”反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的任何免疫測(cè)定檢測(cè)方法。這包括絕大多數(shù)的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定法，其中的一些已經(jīng)使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器系統(tǒng)(Ref Clin Chem Lab Med.1999 Apr；37(4)471-6)得到檢測(cè)。
另一個(gè)實(shí)施方案提供了一旦證實(shí)了樣品為前帶陽(yáng)性的，就在不同設(shè)置下對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步處理。
例如，可以規(guī)定在不同于用于正常樣品的波長(zhǎng)的波長(zhǎng)下對(duì)前帶陽(yáng)性的樣品進(jìn)行濁度測(cè)定。如上所述，樣品中的前帶化因由于離解的凝集物占優(yōu)勢(shì)的可能性增加而形成的復(fù)合物的量減少所導(dǎo)致?？梢栽跍y(cè)定步驟期間或在隨后的測(cè)定中進(jìn)行波長(zhǎng)的改變。在某些情況下，在試驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象酷似樣品的前帶化，但實(shí)際上是由形成的復(fù)合物的大小增加導(dǎo)致的。由于這些復(fù)合物因亞適Debeye或Mie-樣光散射效應(yīng)而也許不會(huì)適當(dāng)?shù)卦跍y(cè)定波長(zhǎng)下干擾，所觀察到的效應(yīng)與如果這是由形成的復(fù)合物的大小減小導(dǎo)致的情況相似。因此，如果波長(zhǎng)也增加，那么在這些條件下對(duì)信號(hào)進(jìn)行更定量的測(cè)定是可能的。
除所述的波長(zhǎng)的改變之外，對(duì)前帶陽(yáng)性樣品使用不同的反應(yīng)時(shí)間或溫育溫度也是可能的。
在下文中，將通過(guò)參照如下附圖的實(shí)施例來(lái)解釋本發(fā)明。


圖1顯示了標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。
圖2顯示了前帶校準(zhǔn)曲線。
圖3顯示了通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線計(jì)算的濃度值與通過(guò)前帶校準(zhǔn)曲線重新計(jì)算的值(加框的部分)之間的比較。
實(shí)施例生成兩種校準(zhǔn)曲線。使用具有覆蓋線性范圍的濃度的微白蛋白材料生成標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線(參見圖1)。使用在該測(cè)定的前帶區(qū)中濃度下的材料生成第二種校準(zhǔn)曲線。將這條第二種校準(zhǔn)曲線用作“前帶校準(zhǔn)曲線”(參見圖2)。在圖1和圖2中，底線表示用于校準(zhǔn)的樣品的不同濃度(按mg/l計(jì))。在左側(cè)，表示了在340nm的波長(zhǎng)和800nm的第二波長(zhǎng)下取得的OD(光密度)-信號(hào)。
為了證實(shí)本發(fā)明方法的可靠性，使用含有不同濃度微白蛋白(人尿白蛋白)的樣本進(jìn)行免疫測(cè)定。作為免疫反應(yīng)性物質(zhì)，使用了濃度約為0.5mg/l的山羊抗-人白蛋白抗體。
將樣本與抗體混合并且在約5分鐘內(nèi)在340nm的第一波長(zhǎng)和800nm的第二波長(zhǎng)下對(duì)樣品進(jìn)行濁度測(cè)定。
結(jié)果如圖3中所示。底線表示在測(cè)定的樣品中微白蛋白的不同濃度(按mg/l計(jì))。在左側(cè)表示了使用標(biāo)準(zhǔn)和前帶校準(zhǔn)曲線計(jì)算的實(shí)際回收率。
圖3中曲線的第一部分(0-2200mg/l)代表可以通過(guò)使用圖1的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線計(jì)算濁度測(cè)定的OD-值而獲得的濃度值。該曲線顯示了5-300mg/l的線性范圍，代表了可以獲得可靠結(jié)果的正常測(cè)定范圍。高于300mg/l時(shí)值的可靠計(jì)算不再是可能的。
從大約2200mg/l的樣品濃度開始，樣品開始顯示出前帶效應(yīng)。對(duì)這些樣品而言，將圖2中所示的前帶校準(zhǔn)曲線用于重新計(jì)算結(jié)果。重新計(jì)算的結(jié)果如圖3中曲線的加框部分所示?？梢钥闯鍪褂们皫?zhǔn)曲線重新計(jì)算結(jié)果，獲得了仍然近似地相當(dāng)于樣品濃度的濃度值。無(wú)論如何，重新計(jì)算的結(jié)果如此接近實(shí)際樣品濃度以致于在不進(jìn)行系列稀釋的情況下正確稀釋至5-300mg/l的濃度是可能的。
前帶校準(zhǔn)范圍的作用在于實(shí)際上將這種微白蛋白測(cè)定的范圍擴(kuò)展至少85倍(300mg/l-26000mg/l)。
權(quán)利要求
1.免疫測(cè)定方法，包括下列步驟(a)制備包括不同部分的校準(zhǔn)曲線或制備不同的校準(zhǔn)曲線，其中一個(gè)部分或一種校準(zhǔn)曲線分別覆蓋不產(chǎn)生前帶效應(yīng)的分析物濃度，而另一個(gè)部分或校準(zhǔn)曲線覆蓋產(chǎn)生前帶效應(yīng)的分析物濃度；(b)通過(guò)將樣本與能夠特異性結(jié)合指定分析物的免疫反應(yīng)性物質(zhì)，尤其是抗體混合制備測(cè)定樣品；(c)使所述樣品于指定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)；(d)測(cè)定涉及免疫反應(yīng)性物質(zhì)與樣品中的分析物在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的相互作用的信號(hào)；(e)基于步驟d中不同時(shí)間時(shí)測(cè)定的信號(hào)檢查前帶效應(yīng)是否已在樣品中產(chǎn)生并且據(jù)此標(biāo)記前帶陽(yáng)性的樣品；和(f)根據(jù)步驟d中測(cè)定的信號(hào)中的至少一種，優(yōu)選根據(jù)在反應(yīng)時(shí)間結(jié)束時(shí)取得的值，通過(guò)使用步驟a中生成的合適的曲線或曲線的一部分計(jì)算樣品中分析物的濃度，其中一種曲線或該曲線的一部分用于前帶陽(yáng)性樣品，而另一種曲線或該曲線的一部分用于剩余的樣品。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟a-f中的至少一些通過(guò)自動(dòng)化分析儀進(jìn)行。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于通過(guò)濁度測(cè)定法檢測(cè)免疫反應(yīng)性物質(zhì)與分析物之間的相互作用。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(d)中的信號(hào)為可以通過(guò)光度法，尤其是濁度測(cè)定法測(cè)定的光信號(hào)。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所用的抗體或抗原結(jié)合顆粒，尤其是聚合物珠。
6.權(quán)利要求4的方法，其特征在于根據(jù)樣品是否為前帶陽(yáng)性的，在不同條件下實(shí)施該方法。
全文摘要
免疫測(cè)定方法，包括下列步驟通過(guò)將樣本與能夠特異性結(jié)合指定分析物的免疫反應(yīng)性物質(zhì)混合制備測(cè)定樣品；使樣品于指定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)；測(cè)定涉及免疫反應(yīng)性物質(zhì)與樣品中的分析物在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的相互作用的信號(hào)；基于不同的時(shí)間時(shí)測(cè)定的信號(hào)檢查是否在樣品中已經(jīng)產(chǎn)生前帶效應(yīng)并且據(jù)此標(biāo)記前帶陽(yáng)性的樣品，且根據(jù)在反應(yīng)時(shí)間過(guò)程中測(cè)定的信號(hào)中的至少一種計(jì)算樣品中分析物的濃度，該步驟是通過(guò)使用覆蓋對(duì)前帶陽(yáng)性樣品產(chǎn)生前帶效應(yīng)的分析物濃度的校準(zhǔn)曲線或一部分校準(zhǔn)曲線以及覆蓋對(duì)剩余樣品不產(chǎn)生前帶效應(yīng)的分析物濃度的另一種校準(zhǔn)曲線或一部分校準(zhǔn)曲線進(jìn)行的。
文檔編號(hào)G01N21/00GK101055272SQ20071008586
公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者G·甘澤爾, M·卡瓦勒里, M·麥克庫(kù)斯克 申請(qǐng)人:奧林巴斯生命及材料科學(xué)歐洲有限公司