專利名稱：：H5n1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，更具體說是一種釆用超聲乳化改性制備的量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感病毒單抗或多抗進(jìn)行檢觀啲方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：禽流行性感冒(簡稱禽流感，avianinfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，被國際獸疫局定為A類傳染病，其中H5N1亞型禽流感是近年來爆發(fā)的最為頻繁一種高致病性禽流感，給家禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也威脅著人類的生命健康。隨著我國也發(fā)現(xiàn)了人感染禽流感的病例，高致病性禽流感的防控工作尤為重要。禽流感的控制關(guān)鍵在于建立快速診斷禽流感病毒的方法，而現(xiàn)有的禽流感診斷技術(shù)不能滿足我國高致病性禽流感的快速診斷的需要，因此,建立快速診斷禽流感技術(shù)已成為我國預(yù)防和控制高致病性禽流感的當(dāng)務(wù)之急。對禽流感的快速檢測是控制該病的根本前提。由于禽流感的臨床癥狀和病理變化因感染禽的種類、齡期、病程長短、并發(fā)感染情況及感染毒株力等的不同而有所不同，因此，禽流感的癥狀一直依賴于病原的分離鑒定。目前禽流感的診斷的主要是通過病毒分離和血清學(xué)試驗(yàn)檢測病毒或是檢測感染雞的抗體進(jìn)行鑒定。其中血清學(xué)診斷包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、血凝(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(NI)、中和試驗(yàn)(NT)、免疫熒光技術(shù)(IFT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等六種檢測方法。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR方法也逐漸應(yīng)用于禽流感的檢測。現(xiàn)有技術(shù)的不足之處在于1.病毒的分離鑒定是診斷AI的一種可靠方法，但病毒分離培養(yǎng)耗時(shí)長，至少需7d,不利于快速診斷和免疫程序的合理制定，難以勝任對高致病性AI快速診斷的需要。2.瓊脂擴(kuò)散(AGP)試驗(yàn)進(jìn)行病毒抗原性特異性試驗(yàn)，此法雖然簡單易行，但敏感性較差，易出現(xiàn)假陽性。在進(jìn)行HA實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)先出去非特異性非凝集抑制因子。血凝實(shí)驗(yàn)(HA)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)特異性好，但其過程繁瑣費(fèi)時(shí)，但其操作相對繁瑣，同時(shí)必須具備一定血凝效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)病毒和新鮮制備的紅細(xì)胞。血清學(xué)檢査對最后確診有回顧性的診斷價(jià)值，一般只能在發(fā)病23周甚至更長時(shí)間才能有抗體陽性出現(xiàn)。神經(jīng)氨酸酶試驗(yàn)(NI)試驗(yàn)比HI試驗(yàn)復(fù)雜得多，一般的診斷實(shí)驗(yàn)室不能完成，應(yīng)由專門從事禽流感檢測的參比實(shí)驗(yàn)室完成。中和試驗(yàn)(NT)是一種比較敏感而特異的血清學(xué)方法，但是其操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)料，臨床幾乎不用。3.ELISA是近年來發(fā)展得較為成熟的一種方法，敏感性較高，缺點(diǎn)是試驗(yàn)的敏感性受樣本質(zhì)量的影響很大。陰性結(jié)果并不表明未感染禽流感病毒，只能解釋為未檢出。免疫熒光技術(shù)(IF)即熒光抗體(fluoresentantibody,FA)技術(shù)，是鑒定和定位流感病毒感染細(xì)胞中特異性的抗原，主要是流感病毒的核蛋白(NP)或基質(zhì)蛋白(MP抗原)。禽流感病毒的檢測通常采用的是直接熒光法，這種方法用于診斷具有快速、簡便和敏感等特點(diǎn)，但是有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性(非特異性熒光)，間接免疫熒光技術(shù)也可以用來檢測NP及MP抗原與抗體的反應(yīng)，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進(jìn)行裂解。4.RT-PCR方法是一種敏感特異的方法，靈敏度要高于ELISA，由于該技術(shù)條件要求高，且田間樣本復(fù)雜多變,干擾大,樣本處理難，因此大規(guī)模檢測比較困難。納米量子點(diǎn)(quantumdot,QD)又可稱為半導(dǎo)體納米微晶體(semiconductornanocrystal)，是一種由II-VI族或III-V族元素組成的穩(wěn)定的、溶于水的、尺寸在220nm之間的納米晶粒。目前研究較多的是CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。近年來，半導(dǎo)體量子點(diǎn)由于其獨(dú)特的性質(zhì)越來越受到人們的重視，其研究內(nèi)容涉及物理、化學(xué)、材料、生物等多學(xué)科，已成為一門新興的交叉學(xué)科。量子點(diǎn)由于粒徑很小，電子和孔穴被量子限域，連續(xù)能帶變?yōu)榫哂蟹肿咏Y(jié)構(gòu)的分立能級結(jié)構(gòu)。因此光學(xué)行為與一些大分子很相似，可以發(fā)射熒光。與傳統(tǒng)的熒光染料相比，量子點(diǎn)有很多優(yōu)點(diǎn)無機(jī)微晶能夠承受多次的激發(fā)和光發(fā)射，而有機(jī)分子卻會(huì)分解.持久的穩(wěn)定性可以讓研究人員更長時(shí)間地觀測細(xì)胞和組織，并毫無困難地進(jìn)行界面修飾連接。量于點(diǎn)最大的好處是有豐富的顏色。生物體系的復(fù)雜性經(jīng)常需要同時(shí)觀察幾種組分，如果用染料分子染色，則需要不同波長的光來激發(fā)，而量于點(diǎn)則不存在這個(gè)問題，使用不同大小(進(jìn)而不同色彩)的納米晶體來標(biāo)記不同的生物分子。使用單一光源就可以使不同的顆粒能夠被即時(shí)監(jiān)控。并且從紫外線到紅光，量子點(diǎn)有廣泛的激發(fā)光譜范圍，能夠用量子點(diǎn)的大小和成分來調(diào)節(jié)激發(fā)光譜。同時(shí)量子點(diǎn)具有狹窄對稱的熒光發(fā)射譜峰，這樣就可以同時(shí)使用不同光譜特性的量子點(diǎn)，而發(fā)射光譜不出現(xiàn)重疊。因此，納米量子點(diǎn)作為一種新型的熒光標(biāo)記材料，在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越受到了關(guān)泛的關(guān)注,特別是在臨床診斷方法取得了長足的進(jìn)展。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種可用于標(biāo)記抗體進(jìn)行生物檢測的新型水溶性羧基化納米量子點(diǎn)。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供超聲乳化改性制備量子點(diǎn)的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，包括如下步驟(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備水溶性羧基化納米量子點(diǎn)；(3)納米量子點(diǎn)標(biāo)記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(4)樣品測定。所述(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠；獲得免疫脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞；篩選陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)行培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株；將雜交瘤細(xì)胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以體外誘生腹水法獲得含單克隆抗體的腹水；采用辛酸-飽和硫酸胺法濃縮和純化腹水獲得單克隆抗體。所述(1)制備和純化H5N1型禽流感多克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原，免疫新西蘭大白兔；10天后心臟采血，分離血清；飽和硫酸銨粗提多抗；DEAE-纖維素層析過柱后純化的IgG置透析袋中，用固體聚乙二醇包埋進(jìn)行濃縮獲得多克隆抗體。所述(3)納米量子點(diǎn)標(biāo)記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體的方法為制備醛基化玻片；利用交聯(lián)劑EDC和sulfo-NHS采用共價(jià)鍵連接的方法進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記。玻片由于樣品不易在其表面滲透和擴(kuò)散以及它的疏水性，特別是熒光背景低便于熒光觀察等特點(diǎn)，因而被我們作為此課題研究中實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的載體。將玻片表面進(jìn)行醛基化是在玻片表面固定蛋白最常用的途徑。采用氨基硅烷和戊二醛先后進(jìn)行氨基化和醛基化反應(yīng)，在玻片表面形成活化的醛基，活化的醛基與蛋白質(zhì)的氨基縮合反應(yīng)，形成共價(jià)鍵的方法從而在玻片表面固定蛋白質(zhì)。所述制備醛基化玻片是指將玻片用洗液(K2Cr0720g+濃H2S04350ml+H2040ml)浸泡過夜，然后用大量的去離子水沖洗，6(TC烘干2h后，將玻片浸入5。/。APTES的乙醇溶液中作用60min進(jìn)行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，將玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L,pH8.0)溶液中進(jìn)行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后備用。EDC和量子點(diǎn)表面的羧基反應(yīng)生成?；愲澹；愲逶谒芤褐腥菀姿?，又生成羧基產(chǎn)物。如果在溶液中加入sulfo-NHS，?；愲寰蜆O易和sulfo-NHS反應(yīng)，生成具有胺反應(yīng)活性的sulfo-NHS酯，sulfo-NHS酯與抗體表面的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺，從而進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記。根據(jù)條件試驗(yàn)，我們最后確定的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的實(shí)驗(yàn)條件為偶聯(lián)劑EDC和sulfo-NHS的最佳使用濃度為2.OmM和5.OmM,量子點(diǎn)的濃度為3.0mM，抗體與量子點(diǎn)最佳的比例為3:1，抗體標(biāo)記的最佳pH值為7.5，最佳的反應(yīng)時(shí)間為2h。所述利用交聯(lián)劑EDC和sulfo-NHS采用共價(jià)鍵連接的方法進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記是指在1.5ml的印pendorf中加入lml的活化緩沖液(0.1MMES，0.5MNaCl,P服.0)，然后加入加入適量的EDC和sulfo-NHS溶液；再在溶液中加入20ul量子點(diǎn)溶液，不停地混合溶液，室溫下反應(yīng)20min;加入1.4ul(20mM)2-巰基乙醇在室溫下反應(yīng)10min，得到活化的量子點(diǎn)溶液；在活化的量子點(diǎn)溶液中，加入lml含適量H5N1型禽流感抗體的PBS溶液(0.01M，pH7.5)，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.5，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；4000，離心分離1分鐘，除去小分子和未反應(yīng)完全的抗體；用5ml去離子水溶解沉淀,重復(fù)對量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感單克隆抗體溶液進(jìn)行溶解/沉淀2次，最后用2ml去離子水溶解沉淀，4'C保存。所述(4)樣品測定的方法為在醛基化的玻片表面滴加待檢樣品尿囊液，37°C孵育2h;用洗滌玻片3次，每次5min;然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37i:孵育45rain;用0.01M，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min后，加入量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感抗體，37"孵育45min，用0.01M，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min;室溫下晾干后在熒光顯微鏡下觀察，判斷樣品的陰陽性。一種可用于標(biāo)記抗體進(jìn)行生物檢測的新型水溶性羧基化納米量子點(diǎn)，采用如下方法制備得到。制備水溶性羧基化納米量子點(diǎn)的方法，包括如下步驟(1)制備CdSe核殼量子點(diǎn)；(2)制備CdSe/CdS核殼量子點(diǎn)；(3)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點(diǎn)；(4)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)；(5)超聲乳化改性量子點(diǎn)?，F(xiàn)在通常使用的量子點(diǎn)表面都被大量有機(jī)溶劑分子包覆而呈疏水性，而生物大分子或者藥物一般是溶解或分散在水溶液中的，所以量子點(diǎn)與它們既不能充分接近更不能直接7有效的結(jié)合，因此要得到穩(wěn)定的熒光探針，大多先要將量子點(diǎn)表面進(jìn)行修飾。利用Zn、Cd等IIB族原子與硫原子之間有效的鍵合作用，用帶巰基的雙功能分子，如巰基羧酸類、二硫蘇糖醇(DTT)、硫代膽堿等取代QDs表面的有機(jī)分子，以使其從疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性，然后通過另一端的功能基團(tuán)可以與生物大分子連接，這種方法簡單、重復(fù)性好。但由于使用的是小分子作為連接物，修飾以后原有的有機(jī)分子對量子點(diǎn)的保護(hù)和穩(wěn)定作用得不到有效的替代，所以穩(wěn)定性不好。用雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)雖然所得的量子點(diǎn)粒徑較小，但是此種方法純化比較困難，且環(huán)境不友好。乳化有利于形成微膠囊的形成，然而，假如只是簡單的機(jī)械攪拌，所形成的微膠囊體系不夠穩(wěn)定。超聲作用有助于乳化且可以形成氣穴，維持乳液穩(wěn)定。所以我們采用超聲乳化的方法來實(shí)現(xiàn)水溶性改性。采用的超聲乳化改性制備的量子點(diǎn)具有方法創(chuàng)新性，高分子層較厚且嚴(yán)實(shí)致密，能更好的保護(hù)量子點(diǎn)，避免環(huán)境介質(zhì)滲入而造成量子點(diǎn)的發(fā)光性能的破壞如光降解，光漂白，以及Cd離子的滲出而產(chǎn)生毒性；該方法純化簡單，只需離心，而一般水溶性改性(通過疏水作用自組裝改性)需要過膜—濃縮一凝膠過濾一再濃縮等步驟；采用0/W法，有機(jī)溶劑用量少，省時(shí)節(jié)能，環(huán)境友好；疏水作用自組裝修飾的納米粒子表面不光滑，而超聲乳化制備的納米粒子表面光潔，不容易引起非特異性吸附，能更好的應(yīng)用在生物檢測方面。本文研制出了CdSe/CdS核殼量子點(diǎn)，并采用超聲乳化的方法對量子點(diǎn)迸行了水溶性改性，建立了納米量子點(diǎn)用于H5N1型禽流感病毒的檢測方法。此檢測方法檢測速度快，從樣品的處理到出結(jié)果只需4個(gè)小時(shí)。檢測結(jié)果穩(wěn)定，熒光不易發(fā)生淬滅，檢測過的樣本在數(shù)十天后仍可觀察結(jié)果。并且量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感抗體的方法十分簡單，只需簡單離心就可對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化。而傳統(tǒng)的抗體的熒光素標(biāo)記方法需要反應(yīng)過夜，標(biāo)記產(chǎn)物還需要透析法或?qū)游龇ㄟM(jìn)行純化，整個(gè)過程耗時(shí)，且操作繁瑣。該方法對雞胚尿囊液檢測最高稀釋度為10"6，與雞胚病毒分離的靈敏度基本相當(dāng)，高于RT-PCR的檢測靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是納米量子點(diǎn)應(yīng)用于H5N1型高致病性禽流感檢測的診斷方法，該方法快速、穩(wěn)定、便于高通量檢測、條件要求低、操作簡便，易于推廣，具有操作簡單、快速和靈敏度高等特點(diǎn)。該方法的建立將為我國高致病性禽流感的監(jiān)測和診斷提供了一種有效的手段，在進(jìn)出口檢疫上具有良好的推廣和應(yīng)用前景。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制。凡是依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖l為三種不同粒徑大小的CdSe/CdSQDs的吸收光譜(a)和熒光光譜(b)。圖2為巰基乙酸修飾CdSe/CdS油溶性量子點(diǎn)的紫外吸收光譜。圖3為雙親性高分子材料自組裝改性量子點(diǎn)的TEM照片190，000X。圖4(a)是雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)的紫外吸收光譜。圖4(b)是改性后的熒光光譜。圖5為超聲乳化改性量子點(diǎn)后的TEM照片。圖6是超聲乳化改性量子點(diǎn)的紫外吸收光譜。圖7為醛基化玻片結(jié)果驗(yàn)證結(jié)果圖(a)加入羊抗兔IgG;(b)加入羊抗雞IgG。圖8為量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的反應(yīng)原理圖。圖9為沉淀離心量子點(diǎn)標(biāo)記多抗后過柱的峰形圖。圖10為沉淀離心量子點(diǎn)標(biāo)記的產(chǎn)物反應(yīng)熒光圖片。圖11為過柱純化量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感多抗產(chǎn)物圖。圖12為過柱純化各組分與抗原反應(yīng)熒光圖片。圖13為過柱純化量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感單抗圖。圖14為沉淀離心純化量子點(diǎn)標(biāo)記單抗產(chǎn)物后過柱的峰形圖。圖15a、b、c和d分別表示量子點(diǎn)標(biāo)記的H5N1型禽流感單抗檢測新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒結(jié)果圖。圖16為本發(fā)明方法和間接熒光免疫法對未感染禽流感病毒的尿囊液進(jìn)行檢測的結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式主要材料和儀器1.HT培養(yǎng)基(Sigma公司)，HATA選擇培養(yǎng)基(Sigma公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(CIBC0BRL公司)，細(xì)胞融合劑(Sigma公司)，青霉素鈉(華北制藥)，硫酸鏈霉素(華北制藥)；十二烷基磺酸鈉(SDS)(Sigma公司)，正辛酸(北京化學(xué)試劑公司)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(欣經(jīng)科生物制品有限公司)，聚乙二醇(PEG,分子量6000)(欣經(jīng)科生物制品有限公司)，凝膠過濾填料S印hadexG-200(Amershambioscience)，禽流感H5N1病毒、雞新城疫病毒(NDV)、產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒(EDS76V)為本實(shí)驗(yàn)室保存，SPF雞胚購自梅里亞動(dòng)物保健品有限公司，BALB小鼠購自北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，SP2/0細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，新西蘭大白兔購自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自動(dòng)純水機(jī)(美國PALI.CO)，二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋)，倒置顯微鏡(日本Olympus)，高速離心機(jī)(美國Optime)，酶聯(lián)檢測儀(美國ThermoLabsystems)，臺(tái)式電子天平(德國SAT0RI0VS)，恒溫水浴箱(芬蘭HETO),微孔細(xì)胞培養(yǎng)板()，電泳成套設(shè)備(美國Invitrogen)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)，centrifuge5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國印pendorf公司)；AKTABasic蛋白純化儀(AmershamBiosciences)。2.量子點(diǎn)的制備三正辛基氧化磷(TOPO，90%,Aldrich)，三正丁基磷(TBP,90%,TCI，Japan)、十八胺(ODA，90%'ACROS)、十八烯(ODE,90%,ACROS)，單質(zhì)硫(S，99.9%Aldrich)、油酸(OA，90%,Aldrich)，氧化鎘(CdO，99.5%,Aldrich)以及Se粉(lOOmesh,99.99%,Aldrich)、甲苯、乙醇，甲醇、正己垸，氯仿，二氯甲烷和丙酮均為分析純，購自天津大學(xué)科威試劑公司。UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，PJEM-IOOCXII型透射電子顯微鏡(erkinElmerInc.)，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(jì)(日立)，G2F20透射電子顯微鏡(Tecnai)，SHJM-1型數(shù)顯恒溫?cái)嚢桦姛崽?山東省鄄城福利科研儀器廠)，HettichMikro22R型冷凍離心機(jī)(JEOL公司)，電子天平ALC-100.4(北京賽多利斯天平有限公司)3.抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記EDC(l-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽，Pierce)，sulfo-NHS(sulfo-N_羥基琥珀酰亞胺，Acrose)，(3-氨甲基)三乙氧基硅烷(APTES，((3-Amin叩ropyl)，triethoxysilane，AlfaAcesar)，凝膠過濾填料Superdex200(Amershambioscience)，凝膠過濾填料s印harose6FastFlow(Amershambioscience)。UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，centrifuge5810R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國印pendorf公司)，BX51正置熒光顯微鏡(日本Olympus)，AKTABasic蛋白純化儀(AmershamBiosciences)，wd-9403f紫外透射儀(北京六一儀器廠)。4.樣品的檢測牛血清蛋白(BSA，北京化學(xué)試劑公司)，Tween-20(北京化學(xué)試劑公司)，新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒由本實(shí)驗(yàn)室留存(本發(fā)明的實(shí)施也可選取其他的同類病毒，不影響效果)。BE500恒溫培養(yǎng)箱(德國ME羅ERT)，BX51正置熒光顯微鏡(日本Olympus)。實(shí)施例l:病毒的繁殖、純化及濃縮1.病毒的繁殖取AIVH5N1病毒，作1X1(T倍稀釋，尿囊腔接種10日齡雞胚，0.2ml/枚，37。C培養(yǎng)，每日照蛋3次，淘汰24小時(shí)內(nèi)死亡的死胚，收集24-96小時(shí)仍未死亡的雞胚。放4'C冷卻，無菌收集尿囊液。2.病毒的滅活及純化(1)滅活:在收集的尿囊液中加入甲醛使其終濃度為O.1%，置于37。C生化培養(yǎng)箱中滅活。(2)差速離心4000rpm，4。C離心45分鐘，棄去沉淀。上清夜于100，OOOXg，4。C超速離心2小時(shí)，收集沉淀，以原尿囊液1/20體積的PBS(pH7.4)重懸病毒，-8(TC保存。(3)凝膠過濾用0.OIM，PH7.4的PBS作為平衡液和洗脫液。取lgS印hadexG-200，以蒸餾水煮沸30min,充分溶漲后裝柱，用平衡液充分平衡柱床。將粗提病毒裝入柱內(nèi)，待病毒液全部進(jìn)入層析柱后，關(guān)閉下口完成上樣，然后加入洗脫液進(jìn)行洗脫，控制流速為0.3ml/min，2ml/管，根據(jù)各管的OD娜值和HA價(jià)，收集符合要求的個(gè)管洗脫液。(4)洗脫液的濃縮將收集的各管洗脫液裝入透析袋，用固體聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h進(jìn)行濃縮。取出病毒濃縮液，用紫外分光光度計(jì)測定其OD加。和0D280，根據(jù)公式蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45乂0028。_0.74乂0026。,計(jì)算病毒蛋白的濃度，并測定濃縮蛋白的HA價(jià)。3.結(jié)果取200ml尿囊液進(jìn)行純化，差速離心，以初體積的1/20的PBS蟲懸沉淀，紫外分光光度計(jì)測定其0D2s。和OD加。，并根據(jù)公式病毒蛋白濃度(mg/ml)二(1.45XOD28。_0.74X0D260)X稀釋倍數(shù)，計(jì)算得到病毒蛋白的含量為1.3564mg/ml。凝膠過濾后，共收集洗脫液20管(l.Oml/管)，根據(jù)ATAKBASIC蛋白純化儀顯示的各收集組分的0D28。，合并OD，處于第一個(gè)縫的各管，共得到lOml，用固定乙二醇(PEG，分子量6000)包埋，10h后體積為1.5ml。用紫外分光光度計(jì)測得濃縮病毒蛋白濃度為2.6859mg/ml。血凝試驗(yàn)結(jié)果表明，所獲得的病毒濃縮液的HA價(jià)為1:211。實(shí)施例2:制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體l.小鼠免疫程序用實(shí)施例l純化濃縮的病毒作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠。共免疫四次，第一次免疫用等量氟氏佐劑完全乳化，第二次和第三次免疫加等量的氟氏不完全佐11劑，第四次不加佐劑。每次免疫間隔2周。每次免疫的病毒劑量為每只小鼠150yg,免疫途徑為頸背部下多點(diǎn)注射。第四次免疫2周后尾哺采血測定血清的HA價(jià)，若血清效價(jià)合理，融合前三天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，用不加佐劑的病毒抗原經(jīng)腹腔注射。2.雜交瘤細(xì)胞的建立(1)SP2/0細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前24-48h將SP2/0細(xì)胞分瓶擴(kuò)大培養(yǎng),融合前6h,棄去瓶中培養(yǎng)液，換上新液。融合時(shí)，選擇形態(tài)良好、呈對數(shù)生長的SP2/0細(xì)胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于50ml離心管內(nèi)，1500rpra離心3min，用5mlDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮沉淀，再離心一次，然后用DEME重新懸浮后計(jì)數(shù)備用。(2)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備將未經(jīng)免疫的ICR小鼠眼球放血處死；將處死的小鼠置75%酒精中浸泡5min，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，置于無菌腰盤中；剝離小鼠皮膚，無菌取出脾臟，放入盛有10mlDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，剔出結(jié)締組織，并輕輕漂洗；將睥臟移入另一盛有10mlDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平面皿中，用滅菌的鈍頭反復(fù)夾取積壓睥臟，充分釋放其中的脾細(xì)胞；將含有脾細(xì)胞的DMEM移入離心管內(nèi)，1500rpm離心3min，棄上清；用10mlDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸沉淀，吸吹均勻，1500rpm，離心3min:棄上清。此步驟重復(fù)2-3次；沉淀用10mlHAT選擇培養(yǎng)基懸浮備用。(3)免疫脾細(xì)胞的制備在強(qiáng)化免疫72h后，將免疫小鼠摘除眼球放血并分離血清作為抗體陽性對照；免疫脾細(xì)胞的制備同上述飼養(yǎng)細(xì)胞的制備過程；最后，沉淀用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮計(jì)數(shù)備用。(4)細(xì)胞融合分別取2.4X108個(gè)脾細(xì)胞和含有6.0X107個(gè)SP2/0細(xì)胞的懸液，加入到一只50ml離心管內(nèi)，輕輕混勻；1500rpm離心3min，將上清盡量棄去;用手掌輕輕震動(dòng)管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻成糊狀；用移液管吸取lml細(xì)胞融合劑，使移液管尖部接觸細(xì)胞，緩緩加入融合劑，使細(xì)胞與融合劑充分接觸，控制在60s加完；加入25mlDMEM液終止細(xì)胞融合劑的作用，方法如下第1分鐘緩緩加入lmlDMEM液，第2分鐘加入4mlDMEM液，然后在3分鐘內(nèi)加入20mlDMEM液;將離心管置于37。CC02培養(yǎng)箱靜置5min;1500rpra/min離心3min,棄上清，用105mlHAT選擇培養(yǎng)基融合細(xì)胞，將制備好的10ml飼養(yǎng)細(xì)胞懸液全部加入，輕輕將細(xì)胞混合均勻；將懸浮細(xì)胞液滴入到6塊96孔板中，每孔200ul，置于37°C0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；融合第二天，用HAT選擇培養(yǎng)基半量換液，融合后第四天，再用HAT選擇培養(yǎng)基半量換液一次，第八天改用HT選擇培養(yǎng)基半量換液。每天記錄細(xì)胞生長情況。(5)獲得陽性雜交瘤細(xì)胞用血凝試驗(yàn)(HI)進(jìn)行檢測。先用4單位AIVH5亞型血凝抗原檢測，對于陽性孔，再用8單位血凝抗原檢測一次，篩選強(qiáng)陽性孔。所用的血球?yàn)?.5%(V/V)濃度的雞紅血球，直接對上清液原液進(jìn)行HI檢測；篩選待融合后的細(xì)胞克窿生長到覆蓋細(xì)胞孔底部面積的1/10時(shí)，用確立好的HI方法對其培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測。對于用8單位血凝抗原檢測呈陽性的細(xì)胞孔，及時(shí)進(jìn)行克??；4單位血凝抗原檢測呈陽性，而8單位抗原檢測呈陰性的細(xì)胞，換上細(xì)胞凍存液，放入-8(TC冰箱保存。(6)陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆(采用有限稀釋法)克隆的當(dāng)天制備飼養(yǎng)細(xì)胞，制備過程如前所述，將制備好的飼料細(xì)胞懸液加入到96孔板中，100ul/孔；將檢測為強(qiáng)陽性的細(xì)胞孔用吸管輕輕吸使細(xì)胞分散均勻，吸至lml含20%胎牛血清的DMEM液中，取少量懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)樹；用HT選擇培養(yǎng)液稀釋陽性雜交瘤至20個(gè)/ml、10個(gè)/ml、5個(gè)/ml;將稀釋好的細(xì)胞懸液加到有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，100ul/孔，每一種稀釋度加到32孔；每天觀察細(xì)胞的生長情況。第四天用HT選擇細(xì)胞培養(yǎng)液半量換液；待孔中細(xì)胞液變黃進(jìn)行檢測；選擇僅有一個(gè)克隆上生長的陽性孔再次進(jìn)行克隆化，直至陽性克隆達(dá)到100%;獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株后，及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。3.細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇(1)細(xì)胞的凍存選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，輕輕將細(xì)胞從瓶壁上吹下；1500rpm離心3rain，棄上清；用凍存液將細(xì)胞沉淀懸浮，分裝于細(xì)胞凍存管內(nèi)，L5ml/管，加蓋封嚴(yán)，注明細(xì)胞代號；將凍存管置于無水乙醇的小燒杯內(nèi)，于4"C冰箱靜置2h后轉(zhuǎn)入-8(TC冰箱過夜，再將之移入液氮罐內(nèi)長期保存。(2)細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮管裝中取出凍存管，迅速放入37X:水浴中，輕輕晃動(dòng)使其盡快融化；1500rpm離心3rain，棄上清；用含20%血清的DMEM液將沉淀懸浮，移入細(xì)胞瓶，置C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4.單克隆抗體的制備(采用體外誘生腹水法)挑選經(jīng)產(chǎn)Balb/c小鼠，腹腔注射滅菌石蠟油0.5ml/只；10-14天后，將雜交瘤細(xì)胞吹打下來，1500rpm離心3min，棄上清，用5mlDMEM重新懸浮，計(jì)數(shù)備用；每只小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞106個(gè)；7-IO天后，可見小鼠腹部明顯增大，采集腹水；將腹水3000rpm離心10min，收集上清，-2(TC保存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體的濃縮及純化(采用辛酸-飽和硫酸胺法)取腹水10ml，加入0.06M醋酸鈉-醋酸緩沖液(pH4.0)20ml(邊加邊攪拌)；用1M氫氧化鈉將腹水pH調(diào)至4.8后，邊攪拌邊加入正辛酸0.33ml,室溫?cái)嚢?0min;腹水經(jīng)6000rpm離心30min，棄沉淀，上清用1M氫氧化鈉將pH調(diào)至7.2，邊加邊攪拌，緩慢加入等體積的飽和硫酸銨，攪拌30min后，經(jīng)6000rpm/min離心30min后，棄去上清，沉淀溶于6mlPBS中；緩慢加入4ml飽和硫酸銨胺，并不斷攪拌，30min后，6000rpm/min離心30min，將沉淀溶于適量PBS中，移至透析袋中進(jìn)行透析。6.單克隆抗體的鑒定(1)HI價(jià)測定將收集的腹水3000rpm，10min離心處理，棄掉雜質(zhì)，測定HI價(jià)。(2)ELISA效價(jià)的測定包被以差速離心提純的H5病毒作為包被抗原，用包被液稀釋，100"1/孔，4。C過夜；洗滌甩干包被液，以洗滌液洗滌3次，3min/次；加入封閉液，100yl/孔，37°C2h.甩干，同上洗滌；加二抗用PBS將HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG按工作濃度稀釋，100iil/孔，37°C60min.甩干，同上洗滌；加底物每孔加入新鮮配制的底物溶液，100ul/孔，37°C，15min。g:終止液每孔加入100yl1MH2S0J冬止反應(yīng)；讀數(shù)自動(dòng)酶聯(lián)檢測儀檢測各孔的0D280。抗原包被濃度和抗體稀釋度的測定將包被抗原作l:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560稀釋，小鼠陽性和陰性血清作l:2500、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000稀釋，間接ELISA法測定各孔0D655，方陣法確定抗原最佳稀釋度。(3)單克隆抗體ELISA效價(jià)測定將腹水從l:IO起作倍比稀釋，按確定的間接ELISA方法測定其效價(jià)。(4)交叉試驗(yàn)分別用H7、H9、NDV、EDS76V的血凝抗原對腹水做HI交叉反應(yīng)。有HI反應(yīng)的判為有交叉反應(yīng)，無HI反應(yīng)的判為無交叉反應(yīng)。(5)單抗重鏈、輕鏈分子量的測定采用SDS-PAGE檢測單抗分子量，腹水的辛酸-飽和硫酸銨純化產(chǎn)物作電泳樣品。濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%。7.單抗的鑒定結(jié)果經(jīng)測定，做制備的禽流感H5亞型單克隆抗體的HI效價(jià)為1:211，ELISA效價(jià)為106。針對H7和H9的血凝抑制活性，只對H5具有血抑活性，說明所制備的抗體為抗H5亞型禽流感血凝素的特異性單抗。用辛酸-飽和硫酸胺法純化單抗，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在約50KD和27KD處各有一條明顯的條帶，重鏈約為50KD，輕鏈約為27KD。實(shí)施例3:制備和純化H5N1型禽流感多克隆抗體1.用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原，免疫3只健康的體重在2kg左右成年雄性新西蘭大白兔，免疫程序如表l。前三次免疫每次間隔2周，第三次免疫后10d耳緣靜脈采血，分離血清，用瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)檢測兔血清的效價(jià)，若瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1:16以上，用不加佐劑的濃縮的重組蛋白自耳靜脈緩慢注射加強(qiáng)免疫l次，10d后心臟采血，分離血清，用于兔抗AIVH5亞型的重組蛋白的IgG的提取。表1兔免疫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.多克隆抗體的提純(1)飽和硫酸銨粗提取20ml血清，加生理鹽水20ml，再加入飽和硫酸銨溶液10ml，使成20%的硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，充分混勻后，靜置30min。3000rpm離心20min，棄沉淀。在上清液中加入再加入飽和硫酸銨30ml，使成50%硫酸銨溶液，充分混勻，靜置30min。3000rpm離心20min，泣上清。于沉淀中加入20ml生理鹽水，使之溶解，再加飽和的硫酸銨溶液10ml，充分混勻后，靜置30in。3000rpm離心20min，棄上清，重復(fù)溶解/沉淀2-3次，用10ml生理鹽水溶解沉淀。在生理鹽水中4r透析過夜，中間換液數(shù)次(用線的BaCl檢査透析液中的SO/'，直到無S0/—為止)。離心去沉淀，上清液即為粗提的IgG，將粗提的IgG溶解于PBS(0.OIM，pH7.2)中用于過柱。(2)DEAE-纖維素層析過柱用0.0175M，pH6.7的PBS作為平衡液和洗脫液。取適量的DEAE-纖維素于0.5M的氫氧化鈉溶液中，浸泡lh，不時(shí)攪拌，用布氏漏斗抽濾，用蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液接近中性為止。再將纖維素浸泡于0.5M的HC1中，同樣抽濾至中型，再將纖維素浸泡于0.5M的NaOH中，同樣處理，洗至中型。然后進(jìn)行平衡、裝柱、上樣后進(jìn)行洗脫。連接洗脫瓶，打開柱下口開始洗脫，用20%的磺基硫酸鈉檢査，開始產(chǎn)生白色沉淀時(shí)收集洗脫液，直到收集液中無蛋白質(zhì)為止，即為純化的IgG。將提純的IgG置透析袋中，用固體聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h進(jìn)15行濃縮；測定蛋白的濃度。3.多克隆抗體測定經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定其濃度為2.8345mg/ml。實(shí)施例4:水溶性羧基化量子點(diǎn)的制備1.CdSe核殼量子點(diǎn)的制備取O.1429g硒粉，溶于lml十八烯和1.2mlTBP(三辛基磷)，密封保存?zhèn)溆谩Ｔ谌谄恐蟹Q取0.3mmo1氧化鎘，0.4ml油酸和4ml十八烯，在氬氣氛圍中保持30min后加熱至氧化鎘完全溶解。稱取0.5gT0P0(三辛基氧化磷)，于室溫下加入上述混合溶液中。再通氬氣45min后，混合溶液加熱至260°C,快速加入已經(jīng)制備好的硒溶液，反應(yīng)2min后，繼續(xù)攪拌冷卻至室溫。制備好的CdSe量子點(diǎn)用丙酮沉淀、洗滌兩遍后，溶于三氯甲烷中備用。2.CdSe/CdS核殼量子點(diǎn)的制備稱取51.9mg氧化鎘，溶于0.4ml油酸和10ml十八烯中。通氬氣30min后，混合溶液加熱至270°C，此時(shí)溶液呈淡黃透明狀，冷卻到室溫備用。稱取硫粉12.8mg，溶于10ml十八烯中，通氬氣30min后，混合溶液加熱至170°C，溶液呈黃色透明狀，冷卻到室溫備用。取2mlCdSe核量子點(diǎn)，加5ml十八烯，十八胺、TOPO各0.5g于燒瓶中，通氬氣40min后，加熱至10(TC，保持10min以除去多余的三氯甲垸，再加熱到220°C,此時(shí)保持系統(tǒng)穩(wěn)定。按照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算出制備每層量子點(diǎn)所需要CcT、S2—的量。先逐滴加入第一層所需的鎘溶液，待8min后，加入第一層所需的硫溶液，25min后，再加入第二層所需的鎘溶液，同樣待8min后，加入第二層所需的硫溶液。制備好的CdSe/CdS量子點(diǎn)用丙酮沉淀、洗滌兩遍后，避光密封保存在冰箱中待用。3.納米量子點(diǎn)的表面修飾(1)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點(diǎn)CdSe/CdS油溶性量子點(diǎn)先用丙酮洗滌三次，離心分離取沉淀，再用氯仿溶解分散CdSe/CdS油溶性量子點(diǎn)。取過量巰基乙酸加入到CdSe/CdS油溶性量子點(diǎn)氯仿溶液中，避光攪拌6小時(shí)，油溶性量子點(diǎn)表面的TOPO/TOP有機(jī)小分子大都就被水溶性的巰基乙酸分子所替代，從而實(shí)現(xiàn)油溶性量子點(diǎn)的水溶性化。反應(yīng)6小時(shí)后，離心取沉淀，再用PBS溶解分散，再離心，反復(fù)三次以除去過量的巰基乙酸和其他有機(jī)分子。(2)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)取適量的油溶性量子點(diǎn)粉末和雙親性三嵌段高分子溶解在3:1的氯仿/乙醇溶液中。攪拌數(shù)小時(shí)以除去氯仿有機(jī)溶劑。當(dāng)氯仿被除去后(聞不到氯仿氣味時(shí))，加入適量的PBS緩沖溶液，再超聲分散3分鐘。所得到的溶液再過0.22um膜以除去大量未結(jié)合的高分子，過膜后溶液變得光學(xué)透明。所得到的過膜溶液再用超濾管濃縮到一定濃度后再過凝膠色譜柱，進(jìn)一步除去未結(jié)合的高分子。收集組分再用超濾管濃縮到適當(dāng)濃度以備用。(3)超聲乳化改性取合適摩爾比的油溶性量子點(diǎn)/三嵌段高分子，溶解在二氯甲烷中。溶解完全后，用潔凈干燥的lml注射器移取量子點(diǎn)/高分子溶液。稱取6.Omg的F-68乳化劑溶解在去離子水中，劇烈攪拌得到均勻的乳液后放入超聲探頭下，超聲探頭伸入液面0.5cm以下，注射器針頭與超聲探頭底部并行。開動(dòng)超聲，功率50瓦，工作時(shí)間設(shè)置為5秒，間歇時(shí)間為3秒。在超聲進(jìn)行時(shí)，緩慢注入量子點(diǎn)/高分子溶液，此時(shí)溶液變?yōu)槿榘咨以谑痔嶙贤鉄粽丈湎掳l(fā)出明亮的熒光。注射完畢，迅速將乳液放在磁攪拌儀上攪拌以維持穩(wěn)定乳液狀態(tài)，且進(jìn)一步除去二氯甲烷有機(jī)溶劑。半小時(shí)后離心分離取沉淀，反復(fù)3次以除去沒有結(jié)合的高分子和F-68乳化劑分子。4.測定制得的CdSe量子點(diǎn)的紫外吸收和發(fā)射光譜如圖1所示，其吸收光譜寬且連續(xù)分布，在吸收光譜上有4個(gè)激子吸收峰，表明所得產(chǎn)物的強(qiáng)量子效應(yīng)。第一激子吸收峰尖銳，且隨著粒徑變大而紅移。發(fā)射譜窄而對稱，而且沒有長波拖尾現(xiàn)象，半峰寬只有23nm。隨著產(chǎn)物的粒徑大小不同，其發(fā)射光譜也不同，粒徑變大，其發(fā)射光譜也隨之紅移。如此狹窄的譜峰說明產(chǎn)物的粒徑分布非常狹窄(可以從HRTEM照片中看出其單分散性質(zhì))。圖2是巰基乙酸修飾CdSe/CdS油溶性量子點(diǎn)的紫外吸收光譜。從圖上可以看出，修飾后第一激子吸收峰變得平坦，第一激子吸收峰幾乎沒有偏移，說明改性后光譜特性變動(dòng)甚少。跟蹤巰基乙酸修飾后產(chǎn)物的穩(wěn)定性，修飾后的量子點(diǎn)在一周后出現(xiàn)少許沉淀物，且出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象的程度與量子點(diǎn)溶液的濃度相關(guān)，濃度越大，出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象越明顯。油溶性量子點(diǎn)表面的有機(jī)物層被親水性的巰基乙酸取代，Cd-S鍵結(jié)合的牢固程度決定了量子點(diǎn)的聚集程度。巰基乙酸修飾后，由于破壞了原有量子點(diǎn)表面化學(xué)結(jié)構(gòu)，且在空氣水溶液介質(zhì)中，巰基乙酸小分子也會(huì)由于量子點(diǎn)表面光氧化，光降解而脫離量子點(diǎn)，量子點(diǎn)濃度越大，其相互之間聚集的機(jī)會(huì)越大，從而加大沉淀的形成。雙親性高分子自組裝核心是通過疏水作用結(jié)合。油溶性量子點(diǎn)表面的T0P0/T0P均是含有8個(gè)碳原子的烷基疏水鏈，我們所采用的三嵌段高分子含有豐富的親水性羧基基團(tuán)，經(jīng)過部分羧基烷基化改性，使之連接上具有8個(gè)碳原子的辛胺。這樣通過高分子上的8碳原子與量子點(diǎn)表面的8碳原子疏水作用結(jié)合，在量子點(diǎn)表面進(jìn)行自組裝，且高分子上的羧基提供親水性，使得油溶性量子點(diǎn)水溶性化。圖3為雙親性高分子材料自組裝改性量子點(diǎn)的TEM照片190，000X。圖4a是雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)的紫外吸收光譜。高分子材料由于對光也有吸收和折射，水溶改性后第一激子吸收峰變得平坦，且最大吸收峰紅移少許，表明量子點(diǎn)表面有高分子包裹。圖4b是改性后的熒光光譜。其半峰寬基本沒有變化，但最大發(fā)射波長有紅移(585-596nm)，進(jìn)一步說明了量子點(diǎn)表面有被高分子包裹。圖5是超聲乳化改性量子點(diǎn)后的TEM照片。從圖上可以看出粒徑均勻，納米顆粒表面光滑，呈球形。且實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)的單個(gè)包裹。每個(gè)顆粒里面的小黑點(diǎn)是油溶性CdSe/CdSQDs。超聲乳化改性，可以在量子點(diǎn)表面形成比較致密嚴(yán)實(shí)的高分子層，能更好的保護(hù)量子點(diǎn)，避免環(huán)境介質(zhì)滲入而造成量子點(diǎn)的發(fā)光性能的破壞(如光降解，光漂白，以及Cd離子的滲出而產(chǎn)生毒性)；純化簡單，只需離心，而一般水溶性改性(通過疏水作用自組裝改性)需要過膜一濃縮一凝膠過濾一再濃縮等步驟。采用0/W，有機(jī)溶劑用量少，省時(shí)節(jié)能，環(huán)境友好；疏水作用自組裝修飾的納米粒子表面不光滑，而超聲乳化制備的納米粒子表面光潔，不容易引起非特異性吸附，能更好的應(yīng)用在生物檢測方面。圖6是超聲乳化改性量子點(diǎn)的紫外吸收光譜。高分子材料由于對光也有吸收和折射，水溶改性后第一激子吸收峰變得平坦，表明量子點(diǎn)表面有高分子包裹且最大吸收峰幾乎沒有變化，說明量子點(diǎn)原有的光譜特性得以保留。從改性后的熒光光譜看最大發(fā)射波長有紅移(612-619nm)，進(jìn)一步說明了量子點(diǎn)表面有被高分子包裹。實(shí)施例5:抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記1.醛基化玻片的制備將玻片用洗液(K2Cr0720g+濃H2S04350ml+H2040ml)浸泡過夜，然后用大量的去離子水沖洗，6(TC烘干2h后，將玻片浸入5%APTES的乙醇溶液中作用60min進(jìn)行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，將玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L，pH8.0)溶液中進(jìn)行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后備用。為了驗(yàn)證醛基化玻片的效果，用PAPpen在玻片上畫圈，標(biāo)記出溶液反應(yīng)的位置。在圓圈內(nèi)加入兔IgG，37。C溫孵2h，PBS-T(0.01mol/L，pH7.2，0.05%Tween20)洗滌4次，10s/次；同等條件下，再以含1%BSA的0.02mol/LPBS溶液封閉lh。雙蒸水清洗，晾干后，加入量子點(diǎn)標(biāo)記的羊抗兔IgG和量子點(diǎn)標(biāo)記的羊抗雞的IgG(如圖7所示)，孵育30min，PBS-T洗滌4次，每次10min，最后用雙蒸水沖洗，熒光顯微鏡下觀察。如圖7所示，加入羊抗兔IgG可以看見橙黃色的熒光，而加入羊抗雞的IgG沒有熒光，從而證明我們制作的醛基化玻片表面能固定蛋白，并能保持所固定蛋白的活性。2.用交聯(lián)劑EDC和sulfo-NHS，采用共價(jià)鍵連接的方法進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記參見圖8所示，EDC和量子點(diǎn)表面的羧基反應(yīng)生成?；愲?，但酰基異脲在水溶液中容易水解，又生成羧基產(chǎn)物。如果在溶液中加入sulfo-NHS，?；愲寰蜆O易和sulfo-NHS反應(yīng)，生成具有胺反應(yīng)活性的sulfo-NHS酯，sulfo-NHS酯與抗體表面的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺，從而進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記。具體的反應(yīng)條件如下(1)在lml的活化緩沖液(O.1MMES，0.5MNaCl，PH6.0)中加入0.4mg(2.OmM)EDC和1.lmg(5.OmM)sulfo-NHS。(2)在溶液中加入20ul量子點(diǎn)溶液(3.0mM)，不停地混合溶液，在室溫下反應(yīng)20min。(3)加入1.4ul(20mM)2-巰基乙醇在室溫下反應(yīng)10min，得到活化的量子點(diǎn)溶液。(4)在lml連接緩沖液(PBS,PH7.5)中加入禽流感所需標(biāo)記的(抗體與量子點(diǎn)分子數(shù)比例為3:1)。并用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.5，在室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)。(5)4000rpm離心分離1分鐘，除去小分子和未反應(yīng)完全的抗體。(6)吸去并棄置上清液。(7)用2ml去離子水溶解沉淀，用反復(fù)離心或凝膠填料S印harose6FF過濾方法純化量子點(diǎn)標(biāo)記產(chǎn)物。3.量子點(diǎn)標(biāo)記產(chǎn)物的純化(1)沉淀離心純化把反應(yīng)后的溶液14000rpm離心30min。取其沉淀，用去離子水洗滌后，用適量的PBS(PH7.4，0.01M)溶解沉淀得到量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體復(fù)合物。(2)凝膠過濾純化和濃縮(在AKTABasic蛋白純化儀上進(jìn)行)取適量的S印harose6FF填料，用抽濾器進(jìn)行抽濾，并用蒸餾水洗滌2-3次。在濾過的填料中按l:l的體積比加入蒸餾水，混勻；把填料連續(xù)地倒如柱中，打開泵裝置，并用蒸餾水進(jìn)行洗滌，直至填料的液面位置不再下降為止，標(biāo)記此時(shí)填料的液面位置；松開柱頭，調(diào)整柱頭的位置為填料液面以下2-3mm;用0.OIM，pH7.4的PBS作用平衡液，流速為2ml/min,觀察測定的實(shí)時(shí)的0D28。值曲線，至UOD，值曲線穩(wěn)定為一條直線時(shí)停止平衡；用自動(dòng)加樣器加入量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體溶液，用0.01M，pH7.4的PBS作為洗脫液，流速為2ml/min;收集洗脫液，每管lml，直到顯示的OD，值曲線為一條平直的直線時(shí)停止收集；按照0D28。值曲線顯示的各峰的0D28。值，合并各峰的洗脫液，其中峰1的洗脫液為量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體溶液；將提純的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體溶液裝入透析袋中。用固體聚乙二醇(PEG，分子量6000)包埋10h進(jìn)行濃縮。4.結(jié)果測定(1)量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感多抗我們把最后PBS溶解沉淀得到的溶液用凝膠過濾填料s印harose6FF過柱。用PBS(O.lM,pH7.4)作為平衡液和洗脫液，得到一個(gè)尖峰，峰形如圖9所示。由此看出，沉淀離心后得到的量子點(diǎn)標(biāo)記多抗的產(chǎn)物為量子點(diǎn)標(biāo)記多抗的復(fù)合物，并通過離心去除了未連接的游離的抗體、未反應(yīng)的小分子偶聯(lián)劑以及其他的中間產(chǎn)物等。合并該峰的收集組分，在表面固定有禽流感抗原的玻片上進(jìn)行封閉和洗滌后，滴加該峰的收集組分，洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到橙黃色的熒光(如圖10)。由此看出，沉淀離心后得到的量子點(diǎn)標(biāo)記多抗的產(chǎn)物為量子點(diǎn)標(biāo)記多抗的復(fù)合物,并通過離心去除了未連接的游離的抗體、未反應(yīng)的小分子偶聯(lián)劑以及其他的中間產(chǎn)物等。合并沉淀洗滌過程中的上清液，測定D280、D260，計(jì)算上清液中游離抗體濃度，根據(jù)反應(yīng)前加入的抗體的量，由此我們計(jì)算得到抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記效率為41.83%.取量子點(diǎn)標(biāo)記后的抗體溶液，不經(jīng)過離心，直接用凝膠過濾填料s印harose6FF進(jìn)行純化，用PBS(O.1M，pH7.4)作為平衡液和洗脫液，得到的譜圖如圖11。合并峰1、峰2和峰3的收集組分，在紫外透射儀下觀察，收集的峰1組分發(fā)出橙黃色的熒光，而峰2和峰3的組分沒有發(fā)出熒光。在表面固定有禽流感H5NI抗原的玻片上進(jìn)行封閉和洗滌后，滴加各峰的收集組分，洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到加入峰l組分的玻片發(fā)出橙黃色的熒光，可以證明峰1為量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感多抗(如圖12a),而加入峰2和峰3的組分的玻片在熒光顯微鏡下沒有觀察到熒光(如圖12b、12c)，從而證明峰1組分為我們的目標(biāo)產(chǎn)物即量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感多抗復(fù)合物。分別測定峰l、峰2、峰3組分的吸光度，按照各峰收集的體積和濃度可以算出禽流感多抗的量子點(diǎn)標(biāo)記效率為42.64%。由此,我們可以看出，可以用沉淀離心和過柱的方法對量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感多抗的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化，兩種方法得到量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感多抗的效率分別為41.83%和42.64%。(2)量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感單抗我們采用了同樣的方法用制備的量子點(diǎn)標(biāo)記禽流感單抗，并分別用沉淀離心和過柱的方法對標(biāo)記的產(chǎn)物進(jìn)行了純化取峰1的組分加到表面固定有禽流感抗原的玻片上進(jìn)行封閉和洗滌后，滴加該峰的的組分，洗滌后，在熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到滴加峰1組分的玻片發(fā)出橙黃色的熒光，可以證明峰1為量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感單抗。通過沉淀離心方法得到的量子點(diǎn)標(biāo)記物，過柱以后得到一個(gè)尖峰(如圖14):通過計(jì)算，沉淀離心和凝膠過濾的方法對量子點(diǎn)標(biāo)記的多抗產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后得到量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感多抗復(fù)合物的產(chǎn)率45.38%和46.18。從上述實(shí)驗(yàn)中可以看出，通過沉淀離心和凝膠過濾的方法都可以對標(biāo)量點(diǎn)標(biāo)記禽流感的單抗和多抗進(jìn)行純化，沉淀離心得到的目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率略低于凝膠過濾，但是凝膠過濾其操作費(fèi)時(shí)，凝膠過濾后還需要濃縮，故我們采用沉淀離心的方法對量子點(diǎn)標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化。實(shí)施例6:樣品的檢測1.檢測方法在醛基化的玻片表面滴加待檢樣品尿囊液，37i:孵育2h.。用PBS(0.OIM，pH7.2)洗滌玻片3次，每次5min。然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37。C孵育45min。用PBS(0.01M，pH7.2)洗滌玻片3次，每次5min后，加入量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感抗體，37。C孵育45min，用PBS(0.OIM，pH7.2)洗滌玻片3次，每次5min，室溫下晾干后在熒光顯微鏡下觀察，判斷樣品的陰陽性。2.降低方法的非特異性研究在玻片上孵育陰性樣品后，進(jìn)行封閉和洗滌,然后加入量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感多抗和禽流感標(biāo)記的單抗，進(jìn)行以下的方法非特異性研究(1)分別加入濃度為0.5%、0.8%、1.0%和1.5%的BSA進(jìn)行封閉，研究不同濃度BSA封閉的效果。(2)實(shí)驗(yàn)濃度為O.1、0.05、0.02、0.01、0.005緩沖體系中，樣品檢測出現(xiàn)的非特異性，確定緩沖溶液的離子強(qiáng)度。(3)中Tween-20濃度的確定在PBS緩沖液中分別加入濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.2%和0.5%的Tween-20,試驗(yàn)洗滌液中Tween-20的濃度。結(jié)果通過在陰性樣品上加入不同濃度BSA的封閉效果研究，我們選定濃度為1。/oBSA作為封閉液。由于量子點(diǎn)表面修飾羧基，帶負(fù)電,所以離子強(qiáng)度過高，會(huì)引起靜電吸附，我們適當(dāng)降低了緩沖溶液的離子強(qiáng)度，以降低非特異性吸附。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，我們釆用了0.OIM、pH7.4的PBS為緩沖溶液。為了減少非特異性吸附，我們在洗滌液PBS中加入不同濃度的Tween。通過實(shí)驗(yàn)確定，我們選用0.1%的PBS-T作為洗滌緩沖液。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本方法中，用量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗其特異性要略優(yōu)于量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感多抗。3.方法的特異性研究(1)標(biāo)記選擇的禽流感單抗或多抗，用量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體分別檢測常見的禽類病毒新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒進(jìn)行檢測，觀察是否出現(xiàn)假陽性結(jié)果，驗(yàn)證方法的特異性。(2)取一份未感染禽流感病毒的雞胚尿囊液，分別按本研究所建立的方法和間接免疫熒光法進(jìn)行檢測，在熒光顯微鏡下觀察，比較兩種方法的非特異性。結(jié)果(1)圖15a、b、c和d分別表示量子點(diǎn)標(biāo)記的H5N1型禽流感單抗檢測新城疫F48E9、IBDV、鴨瘟病毒和鴨肝炎病毒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果。證明方法的特異性較好。(2)分別按本研究建立的方法和間接熒光免疫法對未感染禽流感病毒的尿囊液進(jìn)行檢測，兩種方法檢測的結(jié)果如圖16，a為本研究建立方法的檢測結(jié)果，b為免疫熒光檢測的結(jié)果。從圖16可以看出，本研究所建立的檢測方法，其非特異性較好，沒有觀察到非特異性的熒光，而用免疫熒光方法出現(xiàn)了少量的非特異性熒光。證明此方法的特異性要優(yōu)于免疫熒光的方法。4.方法的靈敏度研究取感染的尿囊液作10倍梯度稀釋，然后用本研究所建立的方法進(jìn)行檢測，確定方法的靈敏度。結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們在檢測尿囊液時(shí)，本研究所建立的方法能檢測積胚尿囊液的最高稀釋倍數(shù)為1Q—6。5.檢測結(jié)果的穩(wěn)定性研究用本研究所建立的方法對陽性樣本進(jìn)行檢測，然后在室溫下放置l天、3天、5天、10天、15和30天后再觀察檢測結(jié)果。結(jié)果通過實(shí)驗(yàn)證明，檢測過的樣本在室溫下放置30天后仍能觀察到明亮的熒光。權(quán)利要求1.H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備水溶性羧基化納米量子點(diǎn)；(3)納米量子點(diǎn)標(biāo)記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(4)樣品測定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于所述(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原免疫8周齡Balb/c小鼠；獲得免疫脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞；篩選陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)行培養(yǎng)獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株；將雜交瘤細(xì)胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以體外誘生腹水法獲得含單克隆抗體的腹水；采用辛酸-飽和硫酸胺法濃縮和純化腹水獲得單克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于所述(1)制備和純化H5N1型禽流感多克隆抗體的方法為用純化濃縮的H5N1型禽流感病毒作為免疫抗原，免疫新西蘭大白兔；10天后心臟采血，分離血清；飽和硫酸銨粗提多抗；DEAE-纖維素層析過柱后純化的IgG置透析袋中，用固體聚乙二醇包埋進(jìn)行濃縮獲得多克隆抗體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于所述(3)納米量子點(diǎn)標(biāo)記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體的方法為制備醛基化玻片；利用交聯(lián)劑EDC和sulfo-NHS采用共價(jià)鍵連接的方法進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于所述制備醛基化玻片是指將玻片用洗液(K2Cr0720g+濃H2S04350ml+H2040ml)浸泡過夜，然后用大量的去離子水沖洗，6CTC烘干2h后，將玻片浸入5。MPTES的乙醇溶液中作用60min進(jìn)行玻片表面的氨基化，取出水洗，晾干后，將玻片浸入含5%戊二醛的PBS(0.2mol/L，pH8.0)溶液中進(jìn)行玻片的醛基化，PBS溶液清洗晾干后備用。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于:所述利用交聯(lián)劑EDC和sulfo-NHS采用共價(jià)鍵連接的方法進(jìn)行抗體的量子點(diǎn)標(biāo)記是指在1.5ml的印pendorf中加入lml的活化緩沖液(O.腦ES，0.5MNaCl，PH6.0)，然后加入加入適量的EDC和sulfo-NHS溶液；再在溶液中加入20ul量子點(diǎn)溶液，不停地混合溶液，室溫下反應(yīng)20min;加入1.4ul(20mM)2-巰基乙醇在室溫下反應(yīng)10min,得到活化的量子點(diǎn)溶液；在活化的量子點(diǎn)溶液中，加入lml含適量H5N1型禽流感抗體的PBS溶液(0.01M,pH7.5)，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.5，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)；4000rpm離心分離1分鐘，除去小分子和未反應(yīng)完全的抗體；用5ml去離子水溶解沉淀，重復(fù)對量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感單克隆抗體溶液進(jìn)行溶解/沉淀2次，最后用2ml去離子水溶解沉淀，4。C保存。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，其特征在于所述(4)樣品測定的方法為在醛基化的玻片表面滴加待檢樣品尿囊液，37"C孵育2h;用洗滌玻片3次，每次5min;然后在玻片表面滴加含5%BSA的PBS-Tween溶液，37。C孵育45rain;用0.OIM，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min后，加入量子點(diǎn)標(biāo)記的禽流感抗體，37t孵育45min，用0.OIM，pH7.2的PBS洗滌玻片3次，每次5min;室溫下晾干后在熒光顯微鏡下觀察，判斷樣品的陰陽性。8.—種水溶性羧基化納米量子點(diǎn)，其特征在于采用如下方法制備得到(1)制備CdSe核殼量子點(diǎn)；(2)制備CdSe/CdS核殼量子點(diǎn)；(3)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點(diǎn)；(4)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)；(5)超聲乳化改性量子點(diǎn)。9.一種制備水溶性羧基化納米量子點(diǎn)的方法，包括如下步驟-(1)制備CdSe核殼量子點(diǎn)；(2)制備CdSe/CdS核殼量子點(diǎn)；(3)巰基乙酸修飾CdSe/CdS量子點(diǎn)；(4)雙親性高分子疏水自組裝改性量子點(diǎn)；(5)超聲乳化改性量子點(diǎn)。全文摘要本發(fā)明公開了一種H5N1型高致病性禽流感的納米量子點(diǎn)檢測方法，屬于屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。該方法包括如下步驟(1)制備和純化H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(2)制備水溶性羧基化納米量子點(diǎn)；(3)納米量子點(diǎn)標(biāo)記H5N1型禽流感單克隆抗體或多克隆抗體；(4)樣品測定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是納米量子點(diǎn)應(yīng)用于H5N1型高致病性禽流感檢測的診斷方法，該方法快速、穩(wěn)定、便于高通量檢測、條件要求低、操作簡便，易于推廣，具有操作簡單、快速和靈敏度高等特點(diǎn)。該方法的建立將為我國高致病性禽流感的監(jiān)測和診斷提供了一種有效的手段，在進(jìn)出口檢疫上具有良好的推廣和應(yīng)用前景。文檔編號G01N33/533GK101290319SQ20071006555公開日2008年10月22日申請日期2007年4月16日優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日發(fā)明者劉全國,劉旭輝,史喜菊,津常,張兵波,李冰玲,李炎鑫,馬貴平申請人:北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;天津大學(xué)