專利名稱：一種測定丙型肝炎病毒總核心抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒抗原檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及丙型肝炎病毒總核心抗原的檢測方法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)感染人體后，有接近半數(shù)人會發(fā)展成慢性肝炎，其中部分病人最終發(fā)展為肝硬化和肝癌。迄今為止尚未有預(yù)防丙型肝炎的疫苗問世，也沒有治療的特效藥物，因此早期診斷仍是防止HCV傳播的有效手段。
丙型肝炎病毒(HCV)的檢測對于丙型肝炎的早期診斷和指導(dǎo)臨床治療具有重要意義，人感染HCV后存在一個相當(dāng)長時間的病毒血癥陽性而血清抗體陰性時期，被稱之為檢驗血清陽轉(zhuǎn)期前的“窗口期”。這一時期HCV復(fù)制活躍，具有很強(qiáng)的感染性，“窗口期”內(nèi)進(jìn)行輸血、注射等醫(yī)學(xué)治療手段都極有可能造成HCV感染，從而引起疾病傳播。
研究表明，HCV RNA的存在才是病毒復(fù)制的標(biāo)志。定性檢測HCV RNA主要采用RT--PCR技術(shù)，但是由于PCR技術(shù)需要嚴(yán)格干凈的工作環(huán)境和較高的實驗技巧，而且PCR操作過程較易發(fā)生交叉感染導(dǎo)致假陽性，故其應(yīng)用受到了很大限制。2001年Ortho公司推出了檢測HCV核心抗原ELISA試劑盒，經(jīng)大量臨床效檢評價，約87％的HCV RNA陽性樣品中含有可檢測到的HCV核心抗原，國內(nèi)湖南景達(dá)生物工程有限公司也推出了商業(yè)化的游離核心抗原檢測試劑盒，經(jīng)過對2.75萬獻(xiàn)漿員進(jìn)行連續(xù)兩年的HCV感染狀況追蹤，確診了11例HCV感染者，HCV核心抗原診斷試劑較HCV抗體檢測試劑對HCV感染的陽性檢測時間提前19～68天，平均縮短39.3天。該方法操作簡便且與現(xiàn)有的儀器設(shè)備有較好的兼容性。
然而一旦體內(nèi)產(chǎn)生了抗體，血清陽轉(zhuǎn)后抗核心抗原抗體與HCV-cAg之間便可形成抗原抗體復(fù)合物，其檢測的敏感性就大大降低了。因此迫切需要尋求一種高靈敏度的總核心抗原檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種測定丙型肝炎病毒總核心抗原的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，顯著提高總核心抗原檢測的靈敏度。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)預(yù)處理液配方為0.3％TritonX100，1.5％SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL。取待測血清標(biāo)本100μl，加入預(yù)處理液50μl，充分混合后于56℃孵育30min。
(2)采用丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，每孔先后加入樣品稀釋液100μl、經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本100μl，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明的技術(shù)方案能產(chǎn)生以下技術(shù)效果包括Triton-x100和SDS在內(nèi)的預(yù)處理液影響Ig分子的可變區(qū)，尤其是超變區(qū)的構(gòu)型，減低其與抗原的結(jié)合機(jī)會，有效促進(jìn)了抗原抗體復(fù)合物的解離。其中的SDS作用于病毒顆粒并在一定溫度下振蕩，加速了病毒顆粒的裂解，使核心抗原得以充分曝露。結(jié)果表明其陽性檢出率高達(dá)83％，較游離核心抗原22.2％的檢測率有了很大的提高。此外，總核心抗原檢測法還具有很高的特異性


圖1北京佑安醫(yī)院18例門診病例PCR檢測結(jié)果1陽性對照，2陰性對照，3-18樣品檢測結(jié)果具體實施方案實施例一游離核心抗原測定、總核心抗原測定及PCR測定三種檢測方法的結(jié)果比較。
本發(fā)明共涉及75例血清標(biāo)本，其中50份標(biāo)本為中南大學(xué)湘雅醫(yī)院門診病例，為單項轉(zhuǎn)氨酶升高或臨床懷疑肝臟疾病患者，18份為北京佑安醫(yī)院門診病例，7例為湖南省岳陽市第二醫(yī)院門診病例。
1、采用丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)(參見公開號CN1877330申請文件)，以酶標(biāo)儀450nm波長測各孔OD值，臨界值為二陰性對照值的平均值+0.06，反應(yīng)孔的OD值大于臨界值即判斷為陽性。
2、取待測血清標(biāo)本100μl，加入預(yù)處理液50μl，預(yù)處理液為0.3％Triton-x100，1.5％SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL?；旌虾?6℃孵育30分鐘，采用丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，以酶標(biāo)儀450nm波長測各孔OD值，臨界值為二陰性對照平均值+0.06，反應(yīng)孔的OD值大于臨界值即判斷為陽性。
3、采用亞培abotte生產(chǎn)的試劑盒，取50μl被檢血清樣品，分別加入200μl試劑A，50μl試劑B，用混勻器混勻至無顆粒狀態(tài)，14000rpm離心5min；取出上清85μl，加入等體積試劑C并混勻，14000rpm離心10min；輕輕將液體全部倒掉，在濾紙上沾干殘留部分；加入75％預(yù)冷酒精400μl，充分混勻，14000rpm離心5min；輕輕倒掉液體，在濾紙上沾干殘留部分，酒精燈上快速烘干。
取28μl的PCR Mix I，加入RT-Enzyme Mix2μl混勻，取30μl分別加于PCR管中，4000rpm離心1min；37℃保溫30min。然后按下列參數(shù)進(jìn)行第一次PCR94℃，5分鐘預(yù)變性，然后進(jìn)入94℃、30s，50℃、30s，72℃、30s循環(huán)，共30個循環(huán)，最后72℃，5min。接著進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增取第一次反應(yīng)物1.2μl，22.5μl的PCR Mix II，Tap DNA聚合酶0.5μl，加入到新編號PCR管中混勻，4000rpm離心1min左右。按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃/5min，然后進(jìn)入94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s循環(huán)，共30個循環(huán)，最后72℃、5min。
實驗結(jié)果(參見表1)表明在75例被檢測的血清標(biāo)本中，經(jīng)PCR測定HCV-RNA陽性為36人，經(jīng)丙型肝炎核心抗原試劑盒測定游離抗原陽性為8人，采用總抗原測定陽性為27人，所有丙型肝炎核心抗原測定陽性標(biāo)本均為PCR陽性，在PCR陰性病例中無丙型肝炎核心抗原檢測陽性者。
表1丙型肝炎病毒核心抗原檢測方法與PCR檢測方法結(jié)果

北京佑安醫(yī)院18例標(biāo)本中，10例RT-PCR測定為陽性(參見圖1)，其中例7、8、9游離抗原檢測法測定為陽性；總抗原測定法測定有9例陽性，均與RT-PCR結(jié)果相符，僅例14總抗原測定法測定為陰性而RT-PCR測定為陽性。
實施例二總核心抗原測定與定量熒光PCR測定的結(jié)果比較采用總核心抗原測定法及常規(guī)定量熒光PCR方法，涉及的50例血清標(biāo)本來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，以復(fù)制數(shù)＞0.5×103判定為陽性，經(jīng)定量熒光PCR檢測出陽性標(biāo)本24例，總抗原測定陽性標(biāo)本16例，結(jié)果見表2，其中“+”表示為陽性，“-”表示為陰性。結(jié)果顯示熒光定量PCR在病毒復(fù)制數(shù)＞106時利用核心總抗原測定均可測出病毒感染。
在50個病例中，無一例是酶聯(lián)免疫陽性而RT-PCR或定量PCR陰性的，由此說明核心總抗原的檢測試劑還具有很高的特異性，而且和PCR檢測的陽性率接近，適合在不具備RT-PCR、熒光定量PCR檢測條件的中小醫(yī)院推廣使用。
表2丙型肝炎病毒核心抗原和熒光定量PCR檢測結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種測定丙型肝炎病毒總核心抗原的方法，其特征在于包括如下步驟(1)預(yù)處理液配方為0.3％Triton×100，1.5％SDS和0.1M、pH8.0的Tris-HCL。取待測血清標(biāo)本100μl，加入預(yù)處理液50μl，充分混合后于56℃孵育30min。(2)采用丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，每孔先后加入樣品稀釋液100μl、經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本100μl，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)。
2.一種測定丙型肝炎病毒總核心抗原的方法，其特征在于步驟(1)中可以采用Triton×114、吐溫80等非離子型表面活性劑代替。
3.一種測定丙型肝炎病毒總核心抗原的方法，其特征在于步驟(3)中采用丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒為湖南景達(dá)生物工程有限公司產(chǎn)品，專利公開號為CN1877330。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定丙型肝炎病毒總核心抗原的方法，包括在檢測前利用蛋白變性劑和非離子型表面活性劑對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，再采用丙型肝炎病毒核心抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒進(jìn)行檢測。本發(fā)明的預(yù)處理能影響Ig分子的可變區(qū)，尤其是超變區(qū)的構(gòu)型，減低其與抗原的結(jié)合機(jī)會，同時能有效促進(jìn)抗原抗體復(fù)合物的解離，使核心抗原得以充分曝露。該方法的陽性檢出率和PCR陽性檢出率接近，同時具有操作簡單、高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，適于在臨床推廣使用。
文檔編號G01N33/569GK101017172SQ20071003450
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日
發(fā)明者劉俊, 王志耘, 歐陽蘭香 申請人:湖南景達(dá)生物工程有限公司