專利名稱：妊娠炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷檢驗(yàn)的制作方法
妊娠炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷檢驗(yàn) 本發(fā)明涉及孕婦炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷檢驗(yàn)。
先兆子癇是母體及圍產(chǎn)期發(fā)病和死亡的重要原因。盡管其有相關(guān) 流行病學(xué)的影響，但該疾病的完整的發(fā)病機(jī)制還不清楚，強(qiáng)調(diào)其具有 多因素病因。典型地發(fā)生于妊娠晚期的先兆子癇的典型臨床表現(xiàn)，包 括高血壓、蛋白尿和不同程度的缺血性外周器官損傷，可能是胚胎著 床的復(fù)雜過(guò)程的晚期現(xiàn)象。滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)母體側(cè)與胎兒側(cè)的相互 作用中螺旋動(dòng)脈的重構(gòu)不足被推測(cè)為胎盤(pán)功能不全的一個(gè)原因。這會(huì) 導(dǎo)致炎癥因子在母體體循環(huán)中不發(fā)揮作用(dismission)。內(nèi)皮功能障礙 己經(jīng)被假設(shè)為對(duì)妊娠的過(guò)度母體炎癥反應(yīng)的一部分。先兆子癇中的補(bǔ) 體激活、活化的循環(huán)白細(xì)胞、活性氧釋放增加和各種炎性細(xì)胞因子水 平的升高都與這一假設(shè)相符。
子癇出現(xiàn)在少數(shù)先兆子癇病例的晚期，其特征為具有與先兆子癇 相同的癥狀，并另外伴有驚厥。子癇是危及母體生命的病癥。
目前，還沒(méi)有能夠提供對(duì)這些病狀的早期診斷的診斷檢驗(yàn)。
因此提供對(duì)患先兆子癇和/或子癇的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法是長(zhǎng) 期以來(lái)的需求。
長(zhǎng)正五聚蛋白PTX3(以下簡(jiǎn)稱為"PTX3")是新近被描述的炎性分 子，其屬于公知的C-反應(yīng)蛋白(CRP)的同一家族。PTX3在細(xì)胞來(lái)源、 分子誘導(dǎo)物和生成動(dòng)力學(xué)方面與CRP不同。其表達(dá)于不同的炎癥細(xì)胞， 如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和接觸炎性刺激的成纖維細(xì)胞中。 通常，PTX3的血漿水平在內(nèi)毒素休克、膿毒血或其它炎性病癥中顯著200680049896.6
說(shuō)明書(shū)第2/7頁(yè)升高。
PTX3由血管壁元件(element)以高水平合成，與血管生長(zhǎng)因子 FGF2結(jié)合并在在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)其活動(dòng)。PTX3的血漿水平在包括心 肌梗死和小血管炎在內(nèi)的血管功能障礙中升高。
我們現(xiàn)在驚訝地發(fā)現(xiàn)孕婦PTX3血漿水平與這些婦女患先兆子癇 以及最終患子癇的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
因此，本發(fā)明的總體目的在于提供母體患炎性內(nèi)皮功能障礙的檢 測(cè)或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法，所述方法包括評(píng)估采自孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正 五聚蛋白PTX3的血漿水平。
更具體地，本發(fā)明的目的在于提供孕婦患先兆子癇和子癇的診斷 或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法，所述方法包括評(píng)估采自孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正五 聚蛋白PTX3的血漿水平。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供孕婦患先兆子癇和子癇的早期診斷
或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法。所述方法包括評(píng)估采自妊娠早期(i)和/或中期(n)
孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正五聚蛋白PTX3的血漿水平。
根據(jù)本發(fā)明的進(jìn)一步的目的，PTX3的血漿水平與疾病嚴(yán)重度相 關(guān)，因此本發(fā)明的方法提供了患輕型或重型內(nèi)皮功能障礙的診斷或風(fēng) 險(xiǎn)評(píng)估的途徑。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的還在于提供孕婦患IUGR(宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩)的診 斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法，所述方法包括評(píng)估所述孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正 五聚蛋白PTX3的血漿水平。
實(shí)驗(yàn)部分
按照下述標(biāo)準(zhǔn)從孕婦中征集患者44例正常妊娠；33例預(yù)先診斷 的妊娠合并先兆子癇；24例妊娠合并IUGR。孕周通過(guò)末次月經(jīng)周期的
起始日期和妊娠20周前進(jìn)行的超聲波檢查來(lái)確定。
生理性妊娠和宮內(nèi)胎兒生長(zhǎng)正常的婦女登記為正常妊娠。此組的 排除標(biāo)準(zhǔn)是曾經(jīng)或現(xiàn)患有母體疾病，接受過(guò)可能影響妊娠結(jié)果和胎兒 生長(zhǎng)的藥物治療。胎兒生長(zhǎng)在子宮內(nèi)時(shí)由超聲波進(jìn)行記錄，并通過(guò)出
生時(shí)具有按照胎兒出生體重和孕周的意大利標(biāo)準(zhǔn)在10-90%之間的胎兒 體重來(lái)確認(rèn)。全部正常妊娠例均在第37至42周期間分娩。
母體血液樣本在妊娠的早(1)、中(n)、晚(III)期當(dāng)她們到醫(yī) 院進(jìn)行例行產(chǎn)檢時(shí)采集。妊娠合并先兆子癇或IUGR的患者的血液樣本 也在妊娠疾病的診斷時(shí)采集。母體血在空腹?fàn)顟B(tài)下從肱靜脈抽取，并 進(jìn)行離心。血漿隨后被儲(chǔ)存在-80。C直至分析。
血液樣本中PTX3血漿水平的評(píng)估
進(jìn)行PTX3的夾心ELISA。 ELISA板(96孑L; Nunc Immuno板， MaxiSorp， Nunc)用包被液(15mM碳酸鹽緩沖液，Na2C03 + NaHC03， pH9.6)稀釋的100ng/孔的大鼠抗PTX3單克隆抗體(mAb)MNB4包被， 4。C孵育過(guò)夜。用洗液(含0.05。/。Tween20的Dulbecco，s磷酸鹽緩沖液) 洗板并加入300pd 5%的奶粉以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。5(^1重組人 PTX3標(biāo)準(zhǔn)品(100pg/ml至2ng/ml)和未知樣本被加入復(fù)孔中，37°C孵育 2小時(shí)。用洗液洗3次后，加入25ng/孔的生物素偶聯(lián)的PTX3親和純 化的兔IgG， 37。C孵育1小時(shí)?？妆怀浞智逑春?，與1: 4000稀釋的 偶聯(lián)于葡聚糖主鏈(AmDex，哥本哈根，丹麥)的鏈親和素-過(guò)氧 化物酶室溫孵育l小時(shí)。孵育后洗板4次，加入100/xlTMB色原(BD， Pharmingen)。自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取405nm處的吸光度值。
免疫組化
PTX3的表達(dá)圖譜和位點(diǎn)通過(guò)剖腹產(chǎn)術(shù)時(shí)采集的正常和先兆子癇
孕婦的胎盤(pán)樣本的免疫組化法來(lái)研究。對(duì)病理學(xué)家關(guān)于樣本來(lái)源組別 的了解采用盲法。
將胎盤(pán)樣本固定在中性緩沖福爾馬林中，并包埋于石蠟中；檢查
蘇木精-伊紅染色的切片來(lái)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。對(duì)于免疫組化分析，切割
3 Mm的石蠟包埋切片并安放在在Superfrost載玻片(Bio-Optica，米蘭， 意大利)上，經(jīng)二甲苯脫臘和乙醇復(fù)水后，切片用微波爐預(yù)處理(780w， 5分鐘，2個(gè)循環(huán)，于0.01M檸檬酸緩沖液中)，并與抗人PTX3多克隆
抗體孵育2小時(shí)。使用具有3,3'-二氨基聯(lián)苯胺游離堿為色原的非生物 素過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)使反應(yīng)顯色。陰性對(duì)照不加一抗。
結(jié)果
數(shù)據(jù)用平均數(shù)土SD表示。正常妊娠與妊娠合并先兆子癇或IUGR 的數(shù)據(jù)通過(guò)非配對(duì)Student's檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行比較。p〈 0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著性。
對(duì)正常與先兆子癇妊娠在早(1)、中(n)、晚(III)妊娠期進(jìn)行 了監(jiān)控。取樣的平均孕周為分別為10.1±1.5， 20.6±3.0禾卩32.6±3.1周。 三個(gè)孕期孕婦的年齡和基礎(chǔ)體重指數(shù)(BMI)相似。
26例正常孕晚期孕婦中的9例由于臀位或曾經(jīng)經(jīng)歷剖腹產(chǎn)而采取 剖腹產(chǎn)分娩。先兆子癇孕婦的分娩顯著早于正常孕婦(32.1±3.6對(duì) 39.2±1.0孕周，p< 0.001)，且全部由于胎兒窘迫和母體適應(yīng)癥采取剖腹 產(chǎn)。先兆子癇組的胎兒及胎盤(pán)重量均顯著低于正常孕婦。
在正常孕婦中，PTX3水平在早(I) (3.09±1.92ng/ml)、中(II) (1.88±0.45ng/ml)、晚(III) (3.01±2.49ng/ml)妊娠期變化并不顯著。
先兆子癇患者顯示出明顯高于相同取樣孕周的正常孕婦的PTX3 水平(先兆子癇患者23.3±27.2ng/ml對(duì)孕晚期孕婦3.01±2.49ng/ml， p <0.001)。具有最高PTX3水平(106.55 ng/ml)的患者還罹患了子癇。
胎盤(pán)組織的免疫組化顯示出正常和先兆子癇胎盤(pán)的PTX3分布沒(méi) 有差異。在對(duì)照與研究例中，PTX3的免疫染色均主要位于絨毛干的基 質(zhì)組織中和固著絨毛中。某些終末絨毛的基體中發(fā)現(xiàn)有較低水平的免 疫染色。
臨床上的研究也己證明PTX3的血漿水平與先兆子癇的嚴(yán)重度相 關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)輕型先兆子癇患者的PTX3水平為17.7±22.5ng/ml(p< 0.001)，而嚴(yán)重先兆子癇患者的PTX3血漿水平升高至24.1±32.2ng/ml(p < 0週)。
在另 一 項(xiàng)臨床研究中，評(píng)估了患有IUGR(宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩)的孕婦的 PTX3的水平。使用與之前的研究相同的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。這類IUGR患者的 PTX3水平被確定為7.7±12.4ng/ml(p< 0.05)。
上述結(jié)果與先兆子癇作為對(duì)妊娠的過(guò)度母體炎癥反應(yīng)的一部分代 表了內(nèi)皮功能障礙的臨床表現(xiàn)的意見(jiàn)相符。不受任何理論限制，孕晚 期先兆子癇的臨床表現(xiàn)可能是胚胎著床的復(fù)雜過(guò)程的晚期現(xiàn)象。這種 內(nèi)皮功能障礙會(huì)導(dǎo)致如細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子(TNF-a、 IL-1)的炎癥因子 在母體體循環(huán)中的激活和不發(fā)揮作用(dismission)。
因此本發(fā)明提供了母體患炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的 方法，其包括在第一步中檢測(cè)采自孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正五聚蛋白 PTX3的血漿水平。
尤其是，所述母體炎性內(nèi)皮功能障礙為先兆子癇和/或子癇。 另一實(shí)施方案中，所述炎性內(nèi)皮功能障礙為IUGR(宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩)。 身體樣本可在整個(gè)孕期過(guò)程中采取。但為對(duì)患所述疾病提供早期 診斷或評(píng)估其患病風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選用于進(jìn)行本發(fā)明的診斷方法的身體樣本 是在孕早期和/或孕中期采集的樣本。
PTX3的血漿水平可按照上述的ELISA檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。然而，也
可使用任何其它公知的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。
所述ELISA檢驗(yàn)包括
i )用包被液(優(yōu)選pH9.6的緩沖液)稀釋的大鼠抗PTX3單克隆抗 體(mAb)MNB4(優(yōu)選100ng/孔的量)包被ELISA板；
ii) 在冷藏溫度(優(yōu)選約4。C)孵育所述板；
iii) 用洗液(優(yōu)選含0.05%Tween20的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液)清 洗所述板；
iv) 加入適于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)的量的5%的奶粉溶液；
v) 加入所述的身體樣本，并于35-40。C孵育1-3小時(shí)；
vi) 加入生物素偶聯(lián)的PTX3親和純化的兔IgG，在步驟v )所述條 件下孵育；
vii) 加入l:4000稀釋的偶聯(lián)于葡聚糖主鏈的鏈親和素-過(guò)氧化物酶
并孵育；
viii) 加入TMB色原，并用自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取405nm處的吸光度值。
本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括將按照所述的第一步檢測(cè)得到的PTX3 血漿水平數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的正常妊娠群體的PTX3血漿水平 數(shù)據(jù)相比較的第二步。 一般地，發(fā)現(xiàn)對(duì)于正常妊娠群體約3ng/ml的血 漿水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有顯著性的。
用于指示對(duì)患先兆子癇、子癇或IUGR的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的PTX3 血漿水平一般在約3 ng/ml以上。
優(yōu)選地，約10ng/ml以上的PTX3血漿水平被考慮作為先兆子癇和
/或子癇的指標(biāo)或風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志，而約6ng/ml以上的PTX3血漿水平被考慮 作為IUGR的指標(biāo)或風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。
更具體地，高達(dá)40ng/ml的PTX3血漿水平指示為輕度先兆子癇的 風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志或者指示對(duì)輕度先兆子癇的診斷；高達(dá)60ng/ml的PTX3血漿 水平指示為重度先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志或者指示對(duì)重度先兆子癇的診 斷；70ng/ml以上，優(yōu)選80ng/ml以上的PTX3血漿水平指示為子癇的 風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志或者指示對(duì)子癇的診斷。
本發(fā)明還涉及用于評(píng)估身體樣本中長(zhǎng)正五聚蛋白PTX3的血漿水 平的試劑盒。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可包括包被有大鼠抗PTX3單克隆抗體 (mAb)MNB4的ELISA板。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括重組人PTX3 標(biāo)準(zhǔn)品(100pg/ml至2ng/ml)和生物素偶聯(lián)的PTX3親和純化的兔IgG。 另外，還可包括含0.05%Tween20的Dulbecco，s磷酸鹽緩沖洗液。最 后，本發(fā)明的試劑盒還可包括偶聯(lián)于葡聚糖主鏈的鏈親和素-過(guò)氧化物 酶及TMB色原。
權(quán)利要求
1.母體患炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法，其包括下述步驟a)檢測(cè)采自孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正五聚蛋白PTX3的血漿水平；b)將按照步驟a)得到的PTX3血漿水平數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的正常妊娠群體的PTX3血漿水平數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的正常妊 娠群體的PTX3血漿水平數(shù)據(jù)為約3ng/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中母體的所述炎性內(nèi)皮功能障 礙為先兆子癇和/或子癇。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中用于指示患先兆子癇或子癇的診 斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的PTX3血漿水平為約3 ng/ml以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中約10ng/ml以上的PTX3血漿水平被考慮作為先兆子癇和/或子癇的指標(biāo)或風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中70ng/ml以上，優(yōu)選80ng/ml以上的PTX3血槳水平指示對(duì)子癇的診斷或者是子癇的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中高達(dá)40ng/ml的PTX3血漿水平指示對(duì)輕度先兆子癇的診斷或者是輕度先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的方法，其中高達(dá)60ng/ml的PTX3血漿水平指示對(duì)重度先兆子癇的診斷或者是重度先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中母體的所述炎性內(nèi)皮功能障 礙為宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中6ng/ml以上的PTX3血漿水平 指示對(duì)IUGR的診斷或者是IUGR的風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l-10任一項(xiàng)的方法，其中用于進(jìn)行該診斷方法 的身體樣本采自妊娠早期和/或妊娠中期。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中，所述檢測(cè)步驟a)包括i) 用包被液稀釋的大鼠抗PTX3單克隆抗體(mAb)MNB4包被 ELISA板；ii) 在冷藏溫度孵育所述板；iii) 用洗液清洗所述板；iv) 加入適于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)的量的5%的奶粉溶液；v) 加入所述的身體樣本，并于35-40。C孵育1-3小時(shí)；vi) 加入生物素偶聯(lián)的PTX3親和純化的兔IgG，并在步驟v )的條 件下孵育；vii) 加入1: 4000稀釋的偶聯(lián)于葡聚糖主鏈的鏈親和素-過(guò)氧化物酶 并孵育；viii) 加入TMB色原，并用自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取405nm處的吸光度值。
13. 用于進(jìn)行權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的診斷方法的試劑盒，其 包括下述的1項(xiàng)或更多項(xiàng)-包被有大鼠抗PTX3單克隆抗體(mAb)MNB4的ELISA板；-重組人PTX3標(biāo)準(zhǔn)品；-生物素偶聯(lián)的PTX3親和純化的兔IgG;-含0.05%Tween20的Dulbecco，s磷酸鹽緩沖洗液；-偶聯(lián)于葡聚糖主鏈的鏈親和素-過(guò)氧化物酶；-TMB色原。
全文摘要
本發(fā)明涉及孕婦炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷檢驗(yàn)。尤其是，本發(fā)明涉及母體患炎性內(nèi)皮功能障礙的診斷或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法，其包含下述步驟a)檢測(cè)采自孕婦的血液樣本中長(zhǎng)正五聚蛋白PTX3的血漿水平；b)將按照步驟a)得到的PTX3血漿水平數(shù)據(jù)與正常妊娠群體的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的PTX3血漿水平數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101351711SQ200680049896
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者塞西莉亞·加蘭達(dá), 安德烈·多尼, 艾琳·采廷, 阿爾貝托·曼托瓦尼 申請(qǐng)人:仁愛(ài)米拉索萊有限公司