專利名稱：：mTOR途徑治療診斷學(xué)的制作方法mTOR途徑治療診斷學(xué)本申請(qǐng)要求2005年10月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/727,510的權(quán)益，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)參考整體并入本文。
背景技術(shù)：
：人腫瘤依賴于基于有缺陷蛋白質(zhì)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程來(lái)生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移，所述細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程由翻譯后修飾(例如蛋白質(zhì)磷酸化)驅(qū)動(dòng)。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)也是大多數(shù)現(xiàn)有及計(jì)劃中的分子靶向抑制劑的靶標(biāo)。一個(gè)例子是HERCEPTIN---種可以阻斷乳腺癌中超活性表皮生長(zhǎng)因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的藥物。只有此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過(guò)表達(dá)且活化的患者對(duì)該治療有反應(yīng)。病人護(hù)理中一個(gè)迫切的重要需求是鑒別將會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療有反應(yīng)的患者以及鑒定將需要更具攻擊性的治療措施的患者。這些更具攻擊性的措施幾乎總是伴隨著發(fā)病率的提高，因此不會(huì)在未確證時(shí)先驗(yàn)性地選擇使用。例如，患有淋巴結(jié)陰性乳腺癌并且其腫瘤上具有雌激素受體的女性適合進(jìn)行他莫昔芬治療。但是，有約30-40%的女性對(duì)他莫昔芬治療無(wú)反應(yīng)，她們需要更具攻擊'性的治療(例如芳香酶抑制劑(aromataseinhibitor,AI))。但是，芳香酶抑制劑與中度至重度的骨損失有關(guān)，因此給予所有女性AI治療是不可接受的?？梢詫?duì)治療的結(jié)局和反應(yīng)進(jìn)行區(qū)分的生物標(biāo)記對(duì)于這類例子將非常有益。這一難題對(duì)于幾乎所有其它的人類癌癥均普遍存在將對(duì)標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)的人群和預(yù)后較差的人群區(qū)分開(kāi)來(lái)?；虮磉_(dá)分析已經(jīng)顯示出了產(chǎn)生針對(duì)結(jié)局的預(yù)后特征的能力；但是，這些終點(diǎn)僅限于簡(jiǎn)單的分類。所述特征無(wú)法告訴醫(yī)師如何治療無(wú)反應(yīng)者組；它僅能用于判斷誰(shuí)將會(huì)有反應(yīng)而誰(shuí)將不會(huì)有反應(yīng)。相反，蛋白質(zhì)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鐠分析可提供預(yù)后特征，并且重要的是，可提供有關(guān)采用何種療法來(lái)治療無(wú)反應(yīng)者組的信息。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)組圖是基于藥物靶標(biāo)本身構(gòu)建的。另外，基因表達(dá)分析中對(duì)許多基因進(jìn)行分析是很復(fù)雜的，通常包括使用算法和廣泛的計(jì)算機(jī)分析，并且不反映蛋白質(zhì)藥物靶標(biāo)的活化狀態(tài)或功能狀態(tài)?；虮磉_(dá)與信號(hào)途徑蛋白質(zhì)的磷酸化無(wú)關(guān)。圖l顯示了橫紋肌肉瘤樣品組的特征。(圖1A)通過(guò)反相蛋白質(zhì)微陣列評(píng)價(jià)兩個(gè)獨(dú)立的研究組(1A組和1B組)，以得到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)狀態(tài)的譜圖。(圖1B)橫紋肌肉瘤研究組1A和1B的存活分析。通過(guò)Kaplan-Meier存活估計(jì)顯示，來(lái)自兩個(gè)不同類研究組的總存活(Overallsurvival,OAS)和無(wú)復(fù)發(fā)存活(recurrencefreesurvival,RFS)均無(wú)顯著差異(OAS對(duì)數(shù)秩(log-rank)p=0.2111，RFSp=0.5824)。(圖1C)組織學(xué)分型未顯示研究組之間的顯i差異(Kaplan-MeierOAS對(duì)數(shù)秩p=0.4103,RFSp=0.4312)。圖2顯示了橫紋肌肉瘤研究組1A的探索性數(shù)據(jù)分析。(圖2A)歸一4匕蛋白質(zhì)終點(diǎn)的無(wú)參照(unsupervised)Bayesian聚類分斗斤(歹1)表明有兩個(gè)主要的腫瘤聚類(行)。在(圖2B)中，這些聚類顯示出與臨床參數(shù)無(wú)關(guān)。通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)所述兩個(gè)聚類進(jìn)行比較，p>0.05。圖3顯示了橫紋肌肉瘤樣品組1A的反相蛋白質(zhì)微陣列激酶途徑譜分析結(jié)果。(圖3A)4EBP1和4EBP1Thr37/46證明了研究組1A中非存活者與存活者狀態(tài)的分離的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。(4EBP1威爾科克森單因素卡方0.0064,df=l，n=32)，非存活者平均值4EBP1=82.4，平均值標(biāo)準(zhǔn)誤=11.48;存活者平均值4EBP1=145.61，平均值標(biāo)準(zhǔn)誤=14.89;(4EBP1Thr37/46卡方0.0135,df=l,n=33))。(圖3B)決策樹分析表明4EBP1是研究組1A中存活的鑒別物，因此，計(jì)算了對(duì)于4EBP1的Kaplan-Meier存活估計(jì)。Kaplan-Meier曲線表明，相比于4EBP1水平相對(duì)低的樣品(黑線)，相對(duì)高水平的4EBP1(灰線)與總存活(對(duì)數(shù)秩p〈0.0177，11=32[—個(gè)樣品的數(shù)據(jù)不可用)和無(wú)復(fù)發(fā)存活(p=0.0370)具有顯著的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性。圖4顯示了橫紋肌肉瘤樣品組IB的反相蛋白質(zhì)微陣列激酶途徑鐠分析結(jié)果。(圖4A)在IB組中通過(guò)對(duì)數(shù)秩分析對(duì)AktSer473(OASp<0.001，RFSp<0.0009)、(圖4B)elF4GSerl108(OASp<0.0017，RFSp<0.0072)、(圖4C)4EBP1Thr37/46(OASp<0.0110,RFSp<0.0106)以及(圖4D)p70S6Thr389(OASp<0.0085,RFSp<0.0296)進(jìn)行的Kaplan-Meier存活分析顯示了總存活和無(wú)復(fù)發(fā)存活均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性?；揖€表示所示蛋白質(zhì)終點(diǎn)相對(duì)高的水平，黑線表示相對(duì)低的水平。(圖4E)通過(guò)反相蛋白微陣列對(duì)橫紋肌肉瘤樣品組1B評(píng)價(jià)的蛋白質(zhì)終點(diǎn)(n存活者狀態(tài)，B非存活者狀態(tài))。通過(guò)威爾科克森單因素分析發(fā)現(xiàn)4EBP1Thr37/46(p<0.0348)、GSK3a/pTyr279/216(p<0.0348)、elF4GSer1108(p<0.0196)、AktSer473(p<0.0227)、Bak(p<0.0321)以及p70S6Thr389(p<0.0373)與總存活具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的^目關(guān)性(平均值士SEM)。圖5顯示橫紋肌肉瘤樣品組1B中的IRS-1細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。(圖5A)IRS-1反饋回路圖。通過(guò)Akt的正反饋回路以及通過(guò)mTOR和p70S6的負(fù)>^饋回路均通過(guò)IRS-1ser612調(diào)控IRS-1。(圖5B)樣品組1B中IRS-l/Akt/mTOR途徑蛋白質(zhì)的非^^lt分析(表1B)。對(duì)于樣品組1B所評(píng)價(jià)的所選促存活和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的SpearmanRho表。(圖5C)相比于來(lái)自非存活者狀態(tài)的患者的腫瘤(p=0.7358)，SpearmanRho非#^分析顯示了來(lái)自存活者狀態(tài)患者的肺瘤中IRS-1Ser612與mTORSer2448之間的相關(guān)性(p=0.0027)。(圖5D)相比于來(lái)自非存活者狀態(tài)患者的肺瘤樣品(p=0.1827)，在來(lái)自存活者狀態(tài)患者的肺瘤樣品中發(fā)現(xiàn)了IRS-1Ser612與p70S6Thr389之間類似的相關(guān)性(p=0.00004)。圖6顯示小鼠異種移植物模型中力鏡紋肌肉瘤胂瘤生長(zhǎng)的CCI-779抑制。(圖6A)異種移植物處理模型的胖瘤組織中mTOR途徑下游底物磷酸化的時(shí)間依賴性CCI-779抑制。與肌動(dòng)蛋白相比，CCI-779在無(wú)關(guān)肌肉和腫瘤組織中均抑制mTOR途徑底物pS6Ser235/236和4EBP1Thr70的磷酸化。(圖6B)CCI-779在Rh30和RD小鼠異種移植物模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)。將來(lái)自Rh30腺泡狀細(xì)胞系或RD胚胎型細(xì)胞系的0.2ml總體積中2xl(^個(gè)細(xì)胞/小鼠原位(orthotopically)注射到SCID褐色小鼠模型的左后J3^f腸肌內(nèi)。一周后，將小鼠分配至對(duì)照(n=8)或CCI-779處理組(11=8)。對(duì)于Rh30和RD異種移植物而言，CCI-779處理組中游標(biāo)卡尺所測(cè)量的紳瘤體積均小于僅^f吏用載體的組，-▲-RD對(duì)照，J-Rh30加CCI畫779，——Rh30對(duì)照，隱-X—RD加CCI-779,(RDp=0.00008;Rh30p=0.0002，Student'st檢驗(yàn))。(圖6C)在30天中每三天以20mg/kg/IP施用CCI-779。將來(lái)自Rh30和RD小鼠異種移植物肺瘤或無(wú)關(guān)肌肉的蛋白質(zhì)提取物用CCI-779或載體處理30天，通過(guò)Western印跡分析S6和4EBP1砩酸化。CCI-779在Rh30和RD的肌肉和腫瘤細(xì)胞中均抑制4EBP1的蜂酸化。圖7顯示肺腺癌腫瘤樣品的劃分分析(partitionanalysis)。圖8顯示對(duì)肺癌進(jìn)行的通過(guò)p4EBPl切點(diǎn)(cutpoint)進(jìn)行分組的分析物關(guān)聯(lián)存活擬合。圖9顯示對(duì)肺癌進(jìn)行的通過(guò)p4EBPlpAKTser473切點(diǎn)進(jìn)行分組的分析物關(guān)聯(lián)存活擬合。圖10顯示對(duì)乳腺癌進(jìn)行的通過(guò)p4EB-Pl切點(diǎn)進(jìn)行分組的分析物關(guān)聯(lián)存活擬合；存活者僅來(lái)自LN-亞組。圖11顯示對(duì)乳腺癌進(jìn)行的LN+A^的劃分分析，表面以p70S6作為主要的分離組分。圖12顯示對(duì)乳腺癌進(jìn)行的來(lái)自所有病例(LN-和LN+)的存活曲線。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供例如用于治療癌癥的組合和方法，其基于評(píng)估一個(gè)或多個(gè)mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成員的活化狀態(tài)以及與此途徑互聯(lián)(interconnect)的基因及其編碼產(chǎn)物的活化狀態(tài)。因?yàn)楸景l(fā)明的診斷測(cè)定僅需要測(cè)定少數(shù)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)，所以該測(cè)定易于實(shí)施，不需要復(fù)雜的基于計(jì)算機(jī)的分析。本發(fā)明涉及例如預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑的反應(yīng)和/或受試者預(yù)后的方法，和/或用于在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括在來(lái)自該受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量至少一個(gè)mTOR途徑成員和/或至少一個(gè)互聯(lián)多肽途徑成員相比于基線值的磷酸化狀態(tài)，其中所述磷酸化狀態(tài)水平相比于基線值的升高表明該受試者是所述化療劑的無(wú)反應(yīng)者和/或預(yù)后差。本文所使用的"對(duì)化療劑的反應(yīng)"指對(duì)常規(guī)化療劑(例如本文其它地方所列舉的)的反應(yīng)。此術(shù)語(yǔ)不包括對(duì)本文所述新類型癌癥抑制劑(mTOR途徑或本文所述的互聯(lián)途徑之一的抑制劑)的反應(yīng)。本文所使用的"受試者"包括任何患有癌癥的動(dòng)物。合適的受試者(患者)包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物或?qū)櫸?例如貓或狗)。非人靈長(zhǎng)類以及優(yōu)選地人患者也包括在內(nèi)。蛋白質(zhì)的"磷酸化狀態(tài)"指所述蛋白質(zhì)的磷酸化程度(總量)。這包括蛋白質(zhì)中發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)(例如合適的Ser、Thr或Tyr氨基酸殘基)數(shù)以及在氨基酸鏈上任意給定受體位點(diǎn)的磷酸化水平。本文所使用的"基線值，，指同一蛋白質(zhì)在正常的非癌癥或未刺激受試者中的磷酸化水平。蛋白質(zhì)磷酸化量的增加可反映該蛋白質(zhì)中發(fā)生磷酸化的合適氨基酸殘基(例如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)數(shù)量的增加或者特定氨基酸殘基磷酸化頻率的提高。例如，基線值包括參照標(biāo)準(zhǔn)，其中預(yù)定的閾值(或閾值范圍)確定所測(cè)量的磷蛋白(phosphoprotein)量或該蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)是否高于"正常"值。在本文中，術(shù)語(yǔ)閾值水平和基線值可互換使用。對(duì)于每個(gè)已測(cè)定磷酸化水平的蛋白質(zhì)，該值可對(duì)細(xì)胞中的總蛋白進(jìn)行歸一化；或者對(duì)組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)(來(lái)自看家基因)例如肌動(dòng)蛋白的量進(jìn)行歸一化；或者可將磷蛋白的量與其非磷酸化對(duì)應(yīng)物的量進(jìn)行比較。"互聯(lián)"多肽途徑可以來(lái)自Akt途徑、IRS途徑，或者它可以是另一個(gè)互聯(lián)多肽，例如pRb,Akt的底物(例如GSK3)，或者凋亡調(diào)節(jié)物(例如Bak)?？梢詼y(cè)量所述途徑之一的任何個(gè)體成員或者其組合的砩酸化狀態(tài)。例如，如果至少一個(gè)mTOR途徑成員代碼為"A"，至少一個(gè)Akt途徑成員代碼為"B"，至少一個(gè)IRS途徑成員代碼為"C"，那么所測(cè)定的罅酸化狀態(tài)可以是A;B;C;A+B;A+C;B+C;或A+B+C。所述途徑成員可以為如Akt激酶、mTOR、4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、elF隱4E或elF-4G、PTEN、PDKl、GSK3p、TSCl/2、ILK、Gabl/2、p27Kipl、FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或者CHK1。本文的其它地方標(biāo)出了具體的砩酸化殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制劑結(jié)合FKB12。本發(fā)明的另一個(gè)方面是如上所述的方法，其是一種治療方法，其中進(jìn)一步地，如果未觀察到該途徑成員的磷酸化狀態(tài)相對(duì)于其基線值顯著提高，則用常規(guī)化療方法治療該受試者。本發(fā)明的另一個(gè)方面是如上所述的方法，其是一種治療方法，其中進(jìn)一步地，其中如果觀察到該途徑成員的磷酸化量相對(duì)于其基線值顯著提高，則對(duì)該受試者施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑的抑制劑。本文所使用的"顯著"提高意為使用本領(lǐng)域公知的適當(dāng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化，通常其概率值小于由隨機(jī)變異導(dǎo)致的變化的小于5%。本文所使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式，除非另外明確指出。例如，如上文所使用的"所測(cè)試途徑的成員"包括該途徑的2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多成員。類似地，"所述途徑的抑制劑"包括多個(gè)抑制劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，常規(guī)化療劑可與所述抑制劑組合施用于受試者。常規(guī)化療劑可以與mTOR成員或互聯(lián)途徑成員的抑制劑一起(同時(shí))施用；或者在mTOR/互聯(lián)途徑成員的抑制劑施用后的適當(dāng)時(shí)間施用(例如在磷酸化水平降低到"正常"水平之后)。在本發(fā)明的一些方面中，在施用抑制劑之后測(cè)量所述途徑成員的磷酸化狀態(tài)；和/或所施用抑制劑的量有效降低所述途徑成員的磷酸化量。本發(fā)明的另一個(gè)方面是使用化療劑在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其改進(jìn)包括，如果在來(lái)自受治受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑的成員磷酸化提高，則施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑的抑制劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面是治療化療劑抗性或難治性癌癥的方法，其包括如果在來(lái)自受治受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑的成員磷酸化提高，則施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑的抑制劑。在本發(fā)明的一個(gè)治療方法中，可在化療之前測(cè)量磷酸化，當(dāng)在來(lái)自受治受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到所述途徑的成員的磷酸化提高時(shí)，則將該抑制劑與治療劑組合施用以治療癌癥。在本發(fā)明的治療方法中，可使用針對(duì)選自以下的至少一個(gè)成員中磷酸化位點(diǎn)的抗體來(lái)測(cè)量該途徑成員的磷酸化例如PI3激酶、Akt激酶、mTOR、4E-BPl/PHAS-l、p70s6k、elF-4E和elF-4G。所述癌癥可以是例如乳腺癌、橫紋肌肉瘤或者肺癌(例如非小細(xì)胞肺癌)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述樣品包括轉(zhuǎn)移的細(xì)胞；和/或它與PTEN功能的喪失和/或突變和活化的Akt無(wú)關(guān)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑反應(yīng)和/或該受試者預(yù)后的方法，其包括在來(lái)自受治受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量Akt/mTOR途徑(或互聯(lián)基因以及它們編碼的多肽)中至少一個(gè)成員的量或磷酸化狀態(tài)的變化，其中水平的升高表明該受試者是對(duì)該化療劑的無(wú)反應(yīng)者和/或預(yù)后差。本發(fā)明的另一個(gè)方面是在有此需要的受試者中使用化療劑治療橫紋肌肉瘤的方法，其改進(jìn)包括當(dāng)在來(lái)自所治療受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到4EBP1Thr37/46、elF-4Gserl108和/或p70S6Thr389處磷酸化提高時(shí)施用CCI-779。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑反應(yīng)和/或該受試者預(yù)后的試劑盒，其包含一種或多種用于檢測(cè)mTOR途徑至少一個(gè)成員、Akt途徑至少一個(gè)成員和/或IRS途徑至少一個(gè)成員或者其組合的磷酸化狀態(tài)的試劑。所述試劑可以是例如所述蛋白質(zhì)的磷酸化形式的特異性抗體。所述試劑盒可包含適用于本領(lǐng)域已知的有標(biāo)簽方法或無(wú)標(biāo)簽方法的試劑，以使用質(zhì)鐠或電泳遷移來(lái)測(cè)量罅酸化位點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于治療有此需要的受試者的藥物組合物或試劑盒，其包含mTOR途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個(gè)成員的抑制劑或其組合。藥物組合物包含可藥用栽體。所述藥劑或試劑盒還可包含可與本發(fā)明抑制劑^i合施用的化療劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于治療患有化療劑抗性或難治性癌癥的受試者的藥物組合物或試劑盒，其包含mTOR途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個(gè)成員的抑制劑或其組合。所述藥物組合物或試劑盒還可包含可與所述抑制劑聯(lián)合施用或依次施用的化療劑。mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括任何參與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的成員或組分。它們包括但不僅限于mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)；也稱為FRAP、RAFT1或RAPT1)、RAPTOR(iriTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白)、4E漏BP1/PHAS-1、p70s6k、TSC(結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體)、4E畫BP1/PHAS-1、p70s6k、elF-4E、elF-4G和/或elF4E復(fù)合體。與mTOR途徑互聯(lián)(相互作用)的基因(或其編碼產(chǎn)物)包括但不僅限于Akt途徑的成員[例如Akt、PI3激酶、PTEN(磷酸酶和張力蛋白同系物)和FKBP12；IRS途徑的成員[例如IRS-1和胰島素生長(zhǎng)因子(insulingrowthfactor,IGF)受體，包括IGF-R1、IGF-Rp和IGF-Ral;以及其它相關(guān)途徑的成員[例如pRb(腫瘤抑制基因，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白)；Akt的底物例如GSK3;以及凋亡調(diào)節(jié)物，例如Bak]。本文中這些途徑(包括與mTOR途徑的成員相互作用多肽)有時(shí)總稱為"mTOR或互聯(lián)多肽途徑。"優(yōu)選的超磷酸化(例如超過(guò)正常)的活化成員及其發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)包括如4E-BP1Thr37/46;eIF-4Eserll08;AKTser473;p70s6kThr389等等?？刹鹏迵?jù)本發(fā)明使用它們中的一個(gè)或多個(gè)。上述基因的核苷酸和M酸序列是公知的，并且可常規(guī)地測(cè)定和從多種已知數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。參見(jiàn)例如www.ncbi.nlm.nih.gov。mTOR或互聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化可使用任何已知方法測(cè)量，例如能夠測(cè)量總磷酸化蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)磷酸化程度的方法。合適的測(cè)定有比色測(cè)定、免疫測(cè)定(例如免疫組織化學(xué)、ELISA等)、基于熒光讀數(shù)的測(cè)定、懸浮珠測(cè)定等許多類型。例如，可使用反相蛋白質(zhì)微陣列(reversephaseproteinmicroarray，RPMA)進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)量(例如測(cè)量磷酸化蛋白質(zhì))。參閱如Nishizuka等(2003)iVoc.7V"rf爿cfld雄,14229-14239。適用于這些測(cè)定的抗體是市售的，或者可常規(guī)地制備，包括針對(duì)該多肽的磷酸化和非磷酸化形式的抗體。(特別有用的是已經(jīng)開(kāi)發(fā)成特異性識(shí)別激酶底物的磷酸化亞型的抗體。)另夕卜，可使用Western印跡、ELISA測(cè)定、免疫沉淀和質(zhì)譜以及其它一些常規(guī)測(cè)定來(lái)評(píng)估(例如mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑成員的)磷酸化水平和/或程度。合適的方法包括可在非常小的樣品中(例如約200個(gè)細(xì)胞)監(jiān)測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)的方法?；蛘?，可使用適于大樣品(例如約20000-25000個(gè)細(xì)胞)的方法。當(dāng)在得自受試者的癌癥樣品中觀察到mTOR途徑(或互聯(lián)途徑)中至少一個(gè)成員的磷蛋白總量或磷酸化程度提高時(shí)，可以施用mTOR抑制劑(或互聯(lián)途徑的抑制劑)。可常規(guī)地測(cè)定總蛋白量或磷酸化蛋白量的增加。例如，可使用參照標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)預(yù)定的閾值(或閾值范圍)確定所測(cè)蛋白質(zhì)的量是否高于"正常"值。本文中這樣的閾值有時(shí)稱為基線值。另外，可通過(guò)強(qiáng)度來(lái)確定該量，此時(shí)使用評(píng)分強(qiáng)度來(lái)確定受試者的Akt/mTOR途徑是否被活化。(例如，使用1至5評(píng)分系統(tǒng)，其中5是最高，高于3的強(qiáng)度表示途徑活化)。本發(fā)明的一些方面可用作預(yù)后和/或診斷，以預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑的反應(yīng)和/或預(yù)后。這樣的方法可包括在來(lái)自所治療受試者的癌組織或自細(xì)胞樣品中測(cè)定mTOR和/或互聯(lián)途徑中至少一個(gè)成員的量和/或磷酸化狀態(tài)的改變，其中水平的升高表明所述受試者對(duì)通常用于治療該癌癥的化療劑是無(wú)反應(yīng)者和/或預(yù)后差。Akt/mTOR抑制劑包括但不限于以下各項(xiàng)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-激酶)抑制劑的實(shí)例包括但不限于例如塞來(lái)考昔及其類似物，例如OSU-03012和OSU-03013(例如Zhu等(2004)Owic^及^.M(12):4309畫18);3-脫氧-D-肌醇類似物(例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0040192770;Meuillet等(2004)0w"/.11,513-27，2004)，例如PX-316;2，-取代，3，-脫氧-磷脂酰-肌醇類似物(例如Tabellini等(2004)丑r.義好"e廳^/.126(4),574-82);稠合的雜芳基衍生物(美國(guó)專利號(hào)6,608,056);3-(咪唑并[l,2-a吡啶-3-基)衍生物(例如美國(guó)專利號(hào)6,403,588和6,653,320);Ly294002(例如Vlahos等(1994)/C7ie附.269(7),5241-5248);喻喳淋_4-酮衍生物，例如IC486068(例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0020161014;Geng等(2004)0，4893-99);3-(異)芳氧基取代苯并(b)噻吩衍生物(例如WO04108715;以及WO04108713);綠色木霉素(viridin),包括半合成綠色木霉素，例如PX-866(乙酸(lS,4E，10R，llR,13S,14R)-[4-二烯丙基氨基亞甲基-6-羥基-l-甲氧基甲基-10，13-二甲基-3,7，17-三氧代-1，3,4，7,10，11,12,13，14，15，16，17-十二氫國(guó)2-氧雜-環(huán)戊[a菲-ll-基酯)(例如Ihle等(2004)Afo/C"""/"T7^r.2(7)，763-72;美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0020037276;美國(guó)專利5,726,167);和渥曼青霉素及其衍生物(例如美國(guó)專利號(hào)5,504,103;5,480,906，5,468,773;5,441,947;5,378,725;3,668,222)。Akt激酶(也已知為蛋白激酶B)抑制劑的例子包括但不限于例如Akt-l畫l(抑制Aktl)(Barnett等(2005)必/oc/ie附./，巡(Pt.2)，399-408);Akt-l畫l,2(抑制Akl和2)(Barnett等(2005)丄巡(Pt.2),399-408);API畫59CJ畫Ome(例如Jin等(2004)/C朋c^2i,1808-12);l-H-咪唑并[4,5-c吡啶基化合物(例如WO05011700);吲哚-3-甲醇及其衍生物(例如美國(guó)專利號(hào)6,656,963;Sarkar和Li(2004)J淑r.1^(12Suppl)，3493S-3498S);艱立福辛(perifosine)(例如干擾Akt膜定位；Dasmahapatra等(2004)C"/f"r及dM(15)，5242-52,2004);磷脂酰肌醇醚脂質(zhì)類似物(例如Gills和Dennis(2004)fx/^W."rwgs,込787-97)^曲西立濱(TCN或API-2或NCI標(biāo)識(shí)符NSC154020;Yang等(2004)^，4394-9)。mTOR抑制劑的例子包括但不限于例如FKBP12增強(qiáng)劑；雷帕霉素及其衍生物，包括CCI-779(坦西莫司(temsirolimus))，RAD001(依維莫司(Everolimus);WO940卯10)和AP23573;雷帕霉素類似物(rapalog),例如WO98/02441和WO01/14387中公開(kāi)的,例如AP23573、AP23464或AP23841;40-(2-羥乙基)雷帕霉素;40-[3-羥基(羥甲基)甲基丙酸酯-雷帕霉素(也稱為CC1779)、40-表-(四唑基)-雷帕霉素(也稱為ABT578)、32-脫氧雷帕霉素、16-戊炔基氧基-32(S)-二氫雷帕霉素以及WO05005434/>開(kāi)的其它衍生物；在USP5，258，389、WO94/090101、WO92/05179、USP5,118,677、USP5,118,678、USP5,100,883、USP5，151，413、USP5,120,842、WO93/111130、WO94/02136、WO94/02485、WO95/14023、WO94/02136、WO95/16691、WO96/41807、WO96/41807和USP5,256，790中/〉開(kāi)的衍生物；含有磷的雷帕霉素衍生物(例如WO05016252);4H-l-苯并吡喃-4-酮衍生物(例如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/528,340)。IRS途徑抑制劑的例子包括但不限于以下使用中和抗體、拮抗肽或者選擇性激酶抑制劑NVP-ADW742對(duì)IGF-1R的特異性抑制已被證明對(duì)多種腫瘤細(xì)胞類型具有活性。蛋白酶體抑制劑、MG132和乳胞素(lactacystin)抑制IRS-1的磷酸化。蛋白酶體抑制劑可調(diào)控IRS-1的酪氨酸磷酸化以及下游的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、iNOS和NO供體誘導(dǎo)IRS降解。IRS-1的絲氨酸磷酸化受KB激酶復(fù)合體抑制劑的調(diào)控。毒胡蘿卜素(Thapsingargin)下調(diào)IRS-1。PKC途徑和Akt抑制劑包括卡弗他丁C(calphostinC)、星形孢菌素(Staurosporine)和LY294002。STI571是與未發(fā)明途徑相關(guān)的cKit途徑的另一抑制劑。臨床前或臨床應(yīng)用的化合物實(shí)例包括如AP23573、AP23841、CCI-779和RAD001。無(wú)論其機(jī)制如何，任何腫瘤或癌癥均可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療。這包括任何器官的肺瘤或癌癥，所述器官包括但不限于例如結(jié)腸、胰腺、乳腺、前列腺、骨、肝、腎、肺、睪丸、皮膚、胰腺、胃、前列腺、卵巢、子宮、頭頸、血細(xì)胞、淋巴等?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的癌癥包括但不限于腦瘤、乳腺癌、骨肉瘤(例如骨肉瘤和尤因肉瘤)、支氣管癌前病變、子宮內(nèi)膜癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、惡性血液病、肝細(xì)胞癌、何杰金病、腎瘤、白血病、平滑肌瘤、脂肪肉瘤、淋巴瘤、Lhermitte-Duclose病、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、惡性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移癌、多發(fā)性骨髓瘤、髓樣化生、骨髓白細(xì)胞綜合征、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌(例如晚期、晚期難治性)、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、皮膚扁平上皮癌。乳腺癌的例子包括但不限于侵襲性導(dǎo)管癌、侵襲性小葉癌、原位導(dǎo)管癌以及原位小葉癌。呼吸道癌癥的例子包括但不限于小細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、支氣管腺癌和胸膜肺母細(xì)胞瘤。腦癌的例子包括但不限于腦干和下丘腦(hypophtalmic)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、小腦和大腦星形細(xì)胞瘤、髄母細(xì)胞瘤、室管膜瘤以及神經(jīng)外胚層和松果體腫瘤。雄性生殖器官腫瘤包括但不限于前列腺和睪丸的癌癥。雌性生殖器官癌癥包括但不限于，子宮內(nèi)膜、宮頸、卵巢、陰道和外陰的癌癥以及子宮肉瘤。消化道腫瘤包括但不限于肛門、結(jié)腸、結(jié)腸直腸、食管、膽嚢、胃、胰腺、直腸、小腸和唾液腺的癌癥。尿道腫瘤包括但不限于膀胱、陰莖、腎、腎盂、輸尿管和尿道癌癥。眼癌包括但不限于眼內(nèi)黑色素瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。肝癌的例子包括但不限于肝細(xì)胞癌(帶有或不帶纖維板層變異的肝細(xì)胞癌)、膽管癌(肝內(nèi)膽管癌)以及混合型肝細(xì)胞膽管癌。皮膚癌包括但不限于扁平細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、惡性黑色素瘤、默克細(xì)胞皮膚癌和非黑色素瘤皮膚癌。頭頸癌包括但不限于喉、下咽、鼻咽和/或口咽癌，以及唇和口腔癌。淋巴瘤包括但不限于AIDS相關(guān)淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、何杰金病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴瘤。肉瘤包括但不限于軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病以及毛細(xì)胞白血病。還可從本發(fā)明中排除一些癌癥，例如與以下相關(guān)的癌癥PTEN功能喪失；突變和活化的Akt(例如無(wú)PTEN的腫瘤和具有ras突變的腫瘤)；或者已鑒定為導(dǎo)致癌癥的主要致病基因或多肽的mTOR或互聯(lián)抑制途徑中的其它突變。治療方法可包括A:測(cè)量肺瘤樣品中mTOR信號(hào)途徑和/或互聯(lián)的其它信號(hào)途徑的活化狀態(tài)?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)上游和下游信號(hào)正調(diào)控和負(fù)調(diào)控的途徑成員的磷酸化(和/或總量)來(lái)評(píng)估活化。B:基于信號(hào)途徑活化模式，施用阻斷所述途徑活化的治療以作為獨(dú)立療法或者作為新輔助療法或組合療法方案中的療法。本發(fā)明的一個(gè)方面是利用mTOR途徑磷酸化蛋白質(zhì)成員的癌癥診斷或預(yù)后檢測(cè)。分析物實(shí)例在本文其它部分討論。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如實(shí)施例中所示，mTOR途徑或互聯(lián)途徑的活化可預(yù)測(cè)接受過(guò)當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)處置的肺癌、乳腺癌和橫紋肌肉瘤患者的結(jié)局。例如，磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)mTOR、4EBP1、E1F4G、E1F4E和p70S6可與結(jié)局相關(guān)。未觀察到其它途徑的活化也這樣相關(guān)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，相比于無(wú)mTOR活化的患者，mTOR途徑活化(證據(jù)為mTOR下游底物的磷酸化水平)的患者具有較短的存活期、無(wú)疾病間隔或者其它治療成功的度量。這種標(biāo)準(zhǔn)處置將包括手術(shù)、化療和雌激素受體療法(乳腺)。因?yàn)檫@些腫瘤類型代表了來(lái)自于不同微環(huán)境的完全不同的病理譜系(pa仇ologicallineage)，因此預(yù)計(jì)此發(fā)現(xiàn)將可用于其它腫瘤類型或由其產(chǎn)生的肺瘤干細(xì)胞，包括癌癥結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腦癌、甲狀腺癌、腎癌以及肉瘤纖維肉瘤、血管肉瘤和黑色素瘤等。本發(fā)明的一些方面還包括治療患有癌癥的受試者，所述受試者已變成化療抗性或難治性。后者意為之前對(duì)至少一種化療有反應(yīng)，接觸到該藥劑之后，在使用這些藥劑進(jìn)行后續(xù)治療后顯示沒(méi)有或僅有弱抗癌(例如抗增殖反應(yīng)，例如沒(méi)有或僅很弱地抑制肺瘤生長(zhǎng))效果的患者。因此，在成功使用化療劑治療患者之后，后續(xù)治療卻顯示沒(méi)有或幾乎沒(méi)有效果，則所述癌癥可描述為該藥劑難治性或抗性。所述方法包括鑒別這樣的患者，然后確定其mTOR途徑活化是否升高。這一群體可通過(guò)mTOR抑制劑(或者下游、上游、或上下游互聯(lián)途徑的抑制劑)進(jìn)行治療。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用靶向mTOR或互聯(lián)途徑中特定節(jié)點(diǎn)的一種或多種抑制劑(例如mTOR或AKT特異性抑制劑)治療受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用抑制劑組合來(lái)抑制所述途徑中的多個(gè)節(jié)點(diǎn)。這有時(shí)使得可以施用毒性較低的較低劑量抑制劑，并破壞途徑中的多個(gè)點(diǎn)。這樣的方法是有用的，例如在若干蛋白質(zhì)顯示出磷酸化提高時(shí)?；颊呖勺?yōu)殡y治性或獲得抗性的化療劑實(shí)例包括如(但不限于此)烷化劑(例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、氮丙咬、環(huán)氧化物、烷基磺酸酯)、順鉑及其類似物(例如卡鉑、奧沙利賴)、抗代謝物(例如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他濱、阿糖胞苷、吉西他濱、氟達(dá)拉濱)、拓樸異構(gòu)酶相互作用劑(例如喜樹堿、伊立替康、拓樸替康、依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、柔紅霉素)、抗微管劑(例如長(zhǎng)春花生物堿類，例如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春瑞濱；紫杉烷類例如紫杉醇和多烯紫杉醇)、干擾素、白介素-2、組蛋白脫乙?；敢种苿?、單克隆抗體、雌激素調(diào)節(jié)劑(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬)、甲地孕酮、芳香酶抑制劑(例如來(lái)曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奧曲肽)、奧曲肽、抗雄激素(例如氟他胺、康士得)、激酶和酪氨酸抑制劑(例如伊馬替尼(STI571或Gleevac);吉非替尼(易瑞沙)；和埃羅替尼(特羅凱)等。參閱如Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology,第七版,Devita等,LippincottWilliams&Wilkins，2005，15、16、17和63章。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對(duì)具有不同作用機(jī)制的多種化療劑具有抗性(難治性)的受試者均顯示mTOR或互聯(lián)途徑的活化。因此可以預(yù)計(jì)，一個(gè)抗性的癌癥。實(shí)施例顯示，在動(dòng)物異種移植物模型中，施用mTOR抑制劑抑制了mTOR途徑中蛋白質(zhì)的下游磷酸化，與對(duì)照相比大幅降低了兩種不同RMS細(xì)胞系的生長(zhǎng)速率。這支持了mTOR抑制劑和互聯(lián)基因/蛋白質(zhì)抑制劑的治療有用性。因此，本發(fā)明既是預(yù)后特征也是新的藥物靶標(biāo)。這當(dāng)前被稱之為"治療診斷(theranostic)"，其中所測(cè)量的分析物同時(shí)作為診斷和治療的耙標(biāo)。目前一個(gè)這樣的例子是e-erbB2。在乳腺癌患者中測(cè)量此蛋白質(zhì)(EGF受體家族的一個(gè)成員)作為預(yù)后差患者的診斷終點(diǎn)，其本身也是藥物乾標(biāo)-用于HERCEPTIN。因此它可用于分類和靶向治療。可對(duì)活檢或者其它組織或細(xì)胞樣品(包括血樣和來(lái)自轉(zhuǎn)移部位的樣品)分析下列特異性涉及mTOR(或互聯(lián))途徑活化的終點(diǎn)總mTOR總4EBP1總EIF4G總E1F4E總p70S6褲酸化pAKT磷酸化mTOR褲酸化4EBP1磷酸化EIF4G褲酸化E1F4E磷酸化p70S6這些特定終點(diǎn)或其它途徑成員的強(qiáng)度值的組合可用于將患者分類為接受標(biāo)準(zhǔn)處置或接受mTOR抑制劑(和/或互聯(lián)途徑抑制劑)方案，例如但不限于CCI-779，雷帕霉素抑制劑。無(wú)論其作用機(jī)制如何，所述非磷酸化狀態(tài)和磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)均可根據(jù)本發(fā)明使用。因此，盡管相信所述機(jī)制是通過(guò)mTOR途徑，但是本發(fā)明不受任何使診斷治療、治療和/或預(yù)后方法獲得成功的機(jī)制限制。本文所述抑制劑可制成多種組合物，例如藥物組合物，以用于治療方法。所述藥物組合物可組裝成試劑盒。一般地，本發(fā)明的藥物組合物包含抗癌有效量的所述抑制劑。本文所使用的"抗癌有效量"是在合理的時(shí)間范圍內(nèi)足以在個(gè)體中至少產(chǎn)生治療反應(yīng)的量。例如，它可至少在可檢測(cè)程度上減輕癌癥的癥狀，或者可抑制肺瘤生長(zhǎng)，等等。所述組合物可包含載體，例如可藥用載體。"可藥用"指不在生物學(xué)或其它方面不理想的材料，即該材料可施用于受試者，而不造成任何不期望的生物學(xué)效應(yīng)或者以有害方式與包含它的藥物組合物中任何其它成分相互作用。自然，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，將選擇栽體以使得活性成分的任何降解最小化，并使得受試者中的任何有害副作用最小化。對(duì)可藥用載體及藥物組合物中其它成分的討論可參閱如Remington'sPharmaceuticalSciences,第十八版,MackPublishingCompany,1990。除了mTOR或互聯(lián)途徑成員的抑制劑之外，本發(fā)明的藥物組合物或試劑盒還可含有其它藥物(例如化療劑)。所述其它化療劑可在患者治療過(guò)程中的任意合適時(shí)間同時(shí)或依次施用.例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它化療劑可在用本發(fā)明抑制劑的治療已顯著降低受試者中mTOR途徑的活化之后施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它化療劑與mTOR等的抑制劑同時(shí)(共同)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述其它化療劑是上文所提到的受試者可變?yōu)殡y治性或獲得抗性的一種化療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用其它化療劑，其代表性實(shí)例列于表2。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，具體的劑型將部分取決于所使用的具體的本發(fā)明抑制劑或者其它化療劑以及所選的給藥途徑。因此，本發(fā)明組合物有多種合適的劑型。表2作用機(jī)制烷化劑抗代謝物植物堿:細(xì)胞毒性/抗腫瘤抗生素:拓樸異構(gòu)酶抑制劑單克隆抗體:M(藥物名)氮芥類(苯丁酸氮芥、氮芥(Chlormethine)、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖)。亞硝基脲類(卡莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星)。鉬(卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、BBR3464)。白消安、達(dá)卡巴噢、氮芥(Mechlorethamine)、丙卡巴肼、替莫唑胺、塞替派、烏拉莫司葉酸(氨甲喋呤、培美曲塞、雷替曲塞)。嘌呤(克拉屈濱、克羅拉濱、氟達(dá)拉濱、巰嘌呤、硫鳥嘌呤)。嘧啶(卡培他濱)。阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他濱紫杉烷(多烯紫杉醇、紫杉醇)。長(zhǎng)春花(長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱)。蒽環(huán)族(柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、米托蒽醌、戊柔比星)。博來(lái)審素、羥基脲、絲裂霉素拓樸替康、伊立替康、鬼臼屬(J^^gAv〃"附)(依托泊香、替尼泊苷)。阿侖單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、吉姆單抗、帕尼單抗、利妥昔單抗、曲妥珠單抗光敏劑其它氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸曱酯、卟吩姆鈉、維替泊芬阿利維A酸、六甲蜜胺、安吖啶、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、蓓薩羅丁、硼替佐米、塞來(lái)考昔、地尼白介素、埃羅替尼、雌莫司汀、吉非替尼、羥基脲、伊馬替尼、噴司他丁、馬索羅酚、米托坦、培門冬酶、維甲酸激素他莫昔芬、孕酮類適于經(jīng)口給藥的劑型可包括液體溶液，例如溶于稀釋劑(例如水、鹽水或果汁)中的有效量藥劑；膠嚢劑、囊劑或片劑，其各包含預(yù)定量的活性成分作為固體、顆?；騼龈蓡卧?；水性液體中的溶液或懸液；以及水包油乳劑或油包水乳劑。片劑形式可包括以下的一種或多種乳糖、甘露醇、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠體二氧化硅、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸以及其它賦形劑、著色劑、稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑、芳香劑以及可藥用栽體。還可將適于經(jīng)口給藥的劑型摻入合成及天然聚合物微球或者其它保護(hù)本發(fā)明藥物以防止在胃腸道中降解的材料中。適于胃腸外給藥(例如靜脈內(nèi))的劑型包括水性和非水性等滲無(wú)菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使該制劑與預(yù)期受體的血液等滲的溶質(zhì)，還包括可含有助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無(wú)菌懸液。所述劑型可存在于單位劑量或多劑量密封容器中(例如安瓿和管)，并可在凍干(低溫干燥)條件下保存，僅需在臨用前加入無(wú)菌液體載體(例如水)以用于注射。可由上述類型的無(wú)菌粉劑、顆粒劑和片劑制備即用型注射溶液和混懸液。本發(fā)明的抑制劑(單獨(dú)或者與其它化療劑組合)可制成氣霧劑以通過(guò)吸入給藥。這些氣霧劑可置于加壓的可接受推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾?中。本發(fā)明的抑制劑(單獨(dú)或者與其它化療劑組合)可制成用于透皮給藥和吸收的適當(dāng)劑型(Wallace等，1993，如上文)。還可使用透皮電穿孔或離子電滲來(lái)促進(jìn)和/或控制本發(fā)明藥劑和/或藥物組合物透過(guò)皮膚的全身遞送(例如，參閱Theiss等(1991),Afe仇F/"AC7/w.i^fl簡(jiǎn)tfo/.込353-359)。適于局部施用的劑型包括在芳香劑(通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)中包含活性成分的糖錠劑；在惰性基質(zhì)(例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)中包含活性成分的錠劑；在適當(dāng)液體栽體中包含活性成分的漱口劑；或者霜?jiǎng)?、乳劑、混懸劑、溶液劑、凝膠劑、霜?jiǎng)?、骨劑、泡沫劑、?rùn)滑劑、噴霧劑、栓劑等。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可基于將要進(jìn)行的具體應(yīng)用來(lái)選擇、改造或開(kāi)發(fā)合適或適宜的劑型。本發(fā)明抑制劑的劑量可以是單位劑型，例如片劑或膠嚢劑。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"單位劑型"指適于作為人和動(dòng)物受試者單位劑量的物理分離的單元，每個(gè)單元含有與可藥用稀釋劑、載體或賦形劑相關(guān)聯(lián)的預(yù)定量的本發(fā)明抑制劑(單獨(dú)的或與其它化療劑組合)，經(jīng)計(jì)算其量足以產(chǎn)生期望的效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地對(duì)待使用組合物的確切劑型確定合適的劑量、時(shí)間表和給藥方法，以在個(gè)體患者中實(shí)現(xiàn)期望的該藥劑抗癌有效量或有效濃度。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可通過(guò)直接或間接分析合適的患者樣品(例如血液和/或組織)而容易地確定和使用本發(fā)明化合物"有效濃度"的合適指標(biāo)。在本發(fā)明的上下文中，對(duì)動(dòng)物(特別是人)施用的本發(fā)明抑制劑或其組合物的劑量應(yīng)在合理的時(shí)間范圍內(nèi)足以在個(gè)體中至少實(shí)現(xiàn)治療性反應(yīng)(抗癌有效量)。劑量的確切量在受試者之間將有所不同，這取決于受試者的物種、年齡、體重和一般狀況、受治疾病的嚴(yán)重程度或機(jī)制、所使用的具體藥劑或栽體、其給藥模式等等。用于在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)期望的抗癌濃度的劑量將由以下因素決定所使用的具體抑制劑的效力、宿主中與該藥劑相關(guān)的藥效學(xué)性質(zhì)、所感染個(gè)體的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度以及(全身給藥時(shí))個(gè)體的體重和年齡。劑量的大小還將決定于使用的具體抑制劑或其組合物所伴隨的任何有害副作用的存在情況。一般只要有可能，就期望將有害副作用保持在最小。當(dāng)給予組合治療時(shí)，所述其它化療劑例如可與抑制劑同時(shí)施用，或者按照需要交替施用。所述兩種藥物也可組合在組合物中。當(dāng)用于組合時(shí)，每種的劑量可小于它們單獨(dú)使用時(shí)的劑量。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是可用于本文所公開(kāi)的任何方法的試劑盒；這樣的試劑盒包含一種或多種本文所述抑制劑(例如用于診斷或治療方法)。例如，適用于在受試者中治療癌癥的試劑盒可另外包含可藥用載體以及任選的容器或包裝材料。本發(fā)明的試劑盒還可用于實(shí)驗(yàn)應(yīng)用等用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到適于實(shí)施任何本發(fā)明方法的試劑盒組分。任選地，所述試劑盒包含實(shí)施所述方法的說(shuō)明。本發(fā)明試劑盒任選的要素包括合適的緩沖劑、可藥用載體等、容器或包裝材料。試劑盒中的試劑可以在容器中，在其中所述試劑是穩(wěn)定的，例如是凍干形式或穩(wěn)定的液體。所述試劑還可以是單次應(yīng)用形式，例如單劑量形式。在前述和下述實(shí)施例中，所有溫度以未校正的攝氏溫度表示，除非另外指明，所有份數(shù)和百分比均以重量計(jì)。實(shí)施例實(shí)施例I.磷蛋白途徑作圖Akt/mTOR活化與兒童橫紋肌肉瘤存活負(fù)相關(guān)A.引言橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)由具有骨骼肌特征的未分化間充質(zhì)細(xì)胞引起。RMS是兒童中最常見(jiàn)的軟組織肉瘤，其包括三個(gè)組織學(xué)亞型-腺泡狀、胚胎型和葡萄狀。盡管最近在組合化療上以及腺泡狀RMS中t(2;13)(q35;ql4)和t(1;13)(p36;ql4)易位的分子認(rèn)識(shí)上有所進(jìn)展，但是患兒童橫紋肌肉瘤的所有患者的總存活仍停留在60-70%。在幾個(gè)發(fā)表的RMS治療方案研究中，總體無(wú)疾病存活率只有67%。不幸的是，無(wú)論疾病分期或組織學(xué)亞型如何，都沒(méi)有方法鑒別出33%的最初治療將注定失敗的兒童。另一方面，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療有反應(yīng)的60-70%兒童進(jìn)行得非常好，這些患者中的絕大多數(shù)目前均無(wú)疾病存活。因此，一個(gè)迫切的臨床目標(biāo)是鑒定與30-40%無(wú)反應(yīng)者RMS受試者相關(guān)的功能重要的分子網(wǎng)絡(luò)，以開(kāi)發(fā)對(duì)于這一組受試者的新治療策略。B.材料與方法1.樣品和患者數(shù)據(jù)。所有樣品(n=59)及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)獲得自具有適當(dāng)IRB許可的兒童癌癥組織(Children'sOncologyGroup,COG)的組間橫紋肌肉瘤研究(IntergroupRhabdomyosarcomaStudy,IRS)IV，D9502和D9803研究。所有樣品在液氮中速凍并保存至治療前。樣品集分為兩組，IA和1B(圖1A)。圖1B顯示兩個(gè)研究組的存活特征。在最終數(shù)據(jù)分析之前，樣品就臨床存活結(jié)局而言是匿名且盲的。代表研究組1A的樣品(圖1A)由9個(gè)速凍手術(shù)樣品和來(lái)自病理學(xué)診斷為橫紋肌肉瘤的33個(gè)不同患者的290個(gè)冷凍切片組成。此處所用的所有患者在研究開(kāi)始前均患有3期(腫瘤<5cm或區(qū)域性淋巴結(jié)累及)疾病及第III組腫瘤(治療后明顯疾病殘留)。另一組46個(gè)冷凍切片樣品及臨床數(shù)據(jù)由COG提供(圖1A，表1B)，其患者來(lái)自相同方案。在治療前進(jìn)行病理診斷。在激光捕捉顯微切割之前，由獨(dú)立的合格病理學(xué)家確認(rèn)所述診斷。組織學(xué)亞型代表腺泡狀、胚胎型、葡萄狀和混合多態(tài)型。用PixCellII(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)從組織切片中顯微切割純肺瘤細(xì)胞群。2.反相蛋白質(zhì)微陣列。對(duì)通過(guò)之前發(fā)表的方法(例如Petricoin等(2005)，/6>""/H，3614-3621;Liotta等(2003)CW/2,317-325;Sheehan等(2005)A/o/CW/尸ro^附/cs4，346-365)所產(chǎn)i的顯微切割細(xì)胞進(jìn)行裂解，并使用全細(xì)胞蛋白^裂解液如上文Sheehan等(2005)所述一式二份印制反相蛋白質(zhì)微陣列。簡(jiǎn)言之，使用裝備有500jim針的GMS417陣列儀(Affymetrix，SantaClara，CA)將所述裂解液印在背面為玻璃的硝酸纖維素陣列栽玻片上(FASTSlidesWhatman,FlorhamPark,NJ)。將每種裂解液以代表原液、1:2、1:4、1:8、1:16和陰性對(duì)照稀釋液的稀釋曲線印在載玻片上。在免疫染色之前，使用干燥劑(Drierite，W.A.Hammond,Xenia，OH)將所述載玻片保存在-2ox:。3.蛋白質(zhì)微陣列免疫染色。在自動(dòng)化載玻片染色儀上按照制造商的i兌明(AutostainerCSAkit，DAKO，Carpinteria，CA)實(shí)施免疫染色。將每個(gè)載玻片與單種第一抗體在室溫下孵育30分鐘。多克隆第一抗體為GSK3a/(JTyr279/216(Invitrogen-Biosource,Carlsbad,CA)、BCL-2、HIF畫la(BD,FranklinLakes，NJ)、4EBP1、FKHRser256、elF4E、elF4Eser209、elF4G、elF4Gserll08、IGFR-p、IRS畫l、IRS國(guó)2、IRS畫lser612、SGK、Bak、Bax、BAD、BADserl12、BADserl36、BADserl55、B-Raf，mTOR、mTORser2448、p70S6Thr389、p70S6激酶、p70S6ser371、S6激酶ser240/244、Akt、Aktser473、AktThr308、4EBP1ser65、4EBP1ser70、和4EBP1Thr37/46(CellSignalingTechnology,Danvers，MA)。將陰性對(duì)照栽玻片與抗體稀釋液孵育。第二抗體是山羊抗兔IgGH+L(1:5000)(VectorLabs,Burlingame，CA)。4.用于微陣列分析的生物信息學(xué)方法。掃描每個(gè)陣列，分析點(diǎn)強(qiáng)度，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，對(duì)陣列上的每個(gè)樣品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化的單一數(shù)值(ImageQuantv5.2，GEHealthcare,Piscataway，NJ).在固定區(qū)域上求點(diǎn)強(qiáng)度的積分。用未印點(diǎn)的鄰近載玻片背景對(duì)每個(gè)點(diǎn)計(jì)算局部區(qū)域背景強(qiáng)度。這對(duì)每個(gè)樣品得到單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，用于與陣列上每一其它點(diǎn)進(jìn)行比較。使用JMPv5.0(SASInstitute,CaryNC)進(jìn)行用于雙因素分級(jí)聚類的Ward法。使用威爾科克森雙樣品秩和檢驗(yàn)來(lái)比較兩組之間的數(shù)值。小于0.05的P值被i人為是顯著的。當(dāng)我們不能推測(cè)變量的正態(tài)分布時(shí)，我們使用非參數(shù)方法。我們使用Kaplan-Meier(對(duì)數(shù)秩)存活估計(jì)進(jìn)行單變量存活分析。5.體內(nèi)異種移植物腫瘤模型。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生研究院動(dòng)物管理及使用委員會(huì)的指導(dǎo)進(jìn)行動(dòng)物研究。雌性4-6周齡褐色-SCID小鼠購(gòu)自CharlesRiverLaboratories(Wilmington,MA)。將0.2ml稀釋劑(5%吐溫80，5%聚乙二醇400(Sigma,St丄ouis，MO))中收獲自Rh30";到左后肢的腓腸肌中，1周后將小鼠隨機(jī)分配至對(duì)照組(n=8)或CCI-779治療組(n=8)。在連續(xù)30天中每3天使用20mg/kg/IP的CCI-779(DevelopmentalTherapeuticsProgram,NationalCancerInstituteandWyeth，Madison,NJ)或僅使用載體腹膜內(nèi)處理小鼠。每3天4吏用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)，通過(guò)式V(mm3)-axbH十算腫瘤體積，其中a是最長(zhǎng)的腫瘤軸，b是最短的腫瘤軸。通過(guò)C02窒息處死所有小鼠，進(jìn)行尸檢以確認(rèn)腫瘤生長(zhǎng)。將腫瘤切下并速凍在-80t:直至分析。C.鑒定mTOR途徑的有用成員將來(lái)自34名患者的腫瘤研究組用于鑒定mTOR途徑中能夠用于以近乎完美的準(zhǔn)確性區(qū)分這34個(gè)樣品組的成員。為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，通過(guò)反相蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)分析了來(lái)自(結(jié)局和對(duì)治療的反應(yīng)不同的)26個(gè)患者的獨(dú)立且盲的腫瘤組，所述技術(shù)一次分析多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。能夠基于結(jié)局區(qū)分第一組中患者的特定蛋白質(zhì)也能夠區(qū)分第二個(gè)獨(dú)立組，示于下文表3:表3.來(lái)自對(duì)非轉(zhuǎn)移性3期橫玟肌肉瘤樣品(n=26)的反相蛋白質(zhì)微陣列的個(gè)體蛋白質(zhì)終點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)非轉(zhuǎn)移性3期^f黃紋肌肉瘤樣本11=26，d何結(jié)局的單因素分析(總存活)存活分析卡方卡方蛋白質(zhì)終點(diǎn)終點(diǎn)類型卡方概率〉卡方FFSOAS4EBP1總蛋白2.08640.14860.50800.7319化肌T7w37/"磷酸化蛋白汰柳汰柳6汰WM4EBPlThr37/46:4EBP1比值1.63270.20130細(xì)30.78874EBP1ser65磷酸化蛋白1.77780.18240,07850.15904EBP1ser65:4EBPl比值0.37350.5411NDND4EBP1Thr70磷酸化蛋白3,15380.07580.64540.9806斗EBP1Thr70:4EBPl比值O.0Q3I0.9557NDNDe!F4E總蛋白2.77780.0956汰,6eEF4Eser209磷酸化蛋白2.53610.11130.60330.2294eEF4Eser209:elF4E比值1.63830.20060.45560.2224mTOR總蛋白2.940.08640.20230,0568mTORser2448磷酸化蛋白1.50.22070.00790.0037mTORser2448:mTOR比值0.03370.85420.55450.4884p70S6總蛋白3.15380.07580.83630.6118磷酸化蛋白"35汰卿5p70S6Thr389:p70S6比值0.01670.89730.38090.3862p70S6ser371磷酸化蛋白2,5350.1113NDNDp70S6ser371:p70S6比值01.0000NDNDGSK3卩總蛋白4細(xì)00.04550.08270,0496磷酸化蛋白汰悅S0.08270.0496GSK3a/卩Tyr279/216:比值3.16050.07540.21200.0629GSK3J3Akt總蛋白4.00000.0455汰肌6汰組2磷酸化蛋白5J柳汰0"7汰。,汰卯7Aktser473:Akt比值2.41980.11980.38450.1774AktThr308磷酸化蛋白2.08640.14860.14590.0773AktThr308:Akt比值0.04940.8241NDNDelF4G總蛋白0.30590.58020.0711磷酸化蛋白沃卿7elF4Gserll08:elF4G比值0.54000,46240.99420.9403S6ser240/244磷酸化蛋白U1660.2卯7汰WW總蛋白45柳0.27630.0771Bax總蛋白2.34380.1258NDNDSGK總蛋白1.35380.2446NDNDBCL-2總蛋白3.36110馬8NDND總蛋白3.26130扁9汰柳30.0525BADserl12磷酸化蛋白0.84380.35830,60130.3275BADserll2:BAD比值0.03380.85410.43560.1696BADserl36磷酸化蛋白0.00370.95120.79950.7251BADserl36:BAD比值0.03380.8541NDNDBADserl55磷酸化蛋白3.3750.06620,58080.1999BADserl55:BAD比值0細(xì)00.8065NDNDB-Raf總蛋白0.1350.71330.64580.2437磷酸化蛋白1.77780.18240.1839汰W"總蛋白"柳汰W汰柳5汰柳2IRS-1ser612磷酸化蛋白2.73380細(xì)20.32250.0991IRS-1ser612:IRS-l比值0.35640.55050.29500.5065鵬-2總蛋白5.術(shù)P汰W790.05440.1843IRS-1ser612:IRS-2比值0.08580.76960.54020,7813總蛋白"572汰組50親7IRS-1ser612:IGFR-p比值0.21730.64110.05780.1192性能最佳的預(yù)測(cè)物均屬于mTOR途徑。D.RMS腫瘤組1A的探索性數(shù)據(jù)分析分析前通過(guò)激光捕捉顯微切割(LCM)來(lái)富集腫瘤細(xì)胞，以確保用于分析的細(xì)胞來(lái)自癌細(xì)胞群內(nèi)，而不被非癌細(xì)胞污染(Petricoin等(2005)，如上文；Emmert-Buck等(1996)5W騰g274,998-1001)。對(duì)于研究組1A(n=33)首先選出15個(gè)特異性信號(hào)轉(zhuǎn)S白(圖2A)用于反相蛋白質(zhì)微陣列分析。15個(gè)蛋白質(zhì)終點(diǎn)的無(wú)參照分級(jí)聚類分析顯示了兩個(gè)主要的腫瘤類別一個(gè)聚類具有Akt/mTOR活化/磷酸化，另一個(gè)聚類具有相對(duì)低水平的信號(hào)(圖2A)。從COG獲得臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)之后，根據(jù)患者年齡、性別、原發(fā)部位、組織學(xué)、侵襲和淋巴結(jié)累及特征通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)來(lái)比較這兩個(gè)聚類(圖2B)。盡管沒(méi)有任何特征達(dá)到p<0.05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但是患有腦膜旁(parameningeal，PM)頭頸原發(fā)部位腫瘤的患者包含62%的聚類l，而聚類2具有27%的PM原發(fā)腫瘤患者(Fisher精確檢驗(yàn)p=0.06)。另外，聚類2含有73%的腺泡狀肺瘤，而聚類1具有62%的胚胎型腫瘤(Fisher精確檢驗(yàn)p一.06)。通常，患有眼眶或非腦膜旁部位的胚胎型RMS腫瘤的患者具有最佳的預(yù)后。這兩個(gè)聚類與通常公認(rèn)的RMS相關(guān)的預(yù)后/臨床因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們接著將蛋白質(zhì)分析物值與COG提供的研究組IA的無(wú)疾病存活和總存活臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。在從COG獲得臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)之后，出現(xiàn)了明確的腫瘤劃分。對(duì)三種蛋白質(zhì)4EBP1、磷酸化4EBP1Thr37/46和elF4E(均為Akt/mTOR途徑的組分)的決策樹分沖斤將用標(biāo)準(zhǔn)療法治療后持續(xù)完全好轉(zhuǎn)的患者從復(fù)發(fā)和死亡的患者中劃分出來(lái)。在這些終點(diǎn)中，通過(guò)威爾科克森單因素分析發(fā)現(xiàn)4EBP1和4EBP1Thr37/46各自與存活顯著相關(guān)，4EBP1(p<0.0064)和4EBP1(p<0.0135)(圖3A)。對(duì)數(shù)秩單變量存活分析(Kaplan-Meier)支持了研究組1A中4EBP1與總存活及無(wú)復(fù)發(fā)存活結(jié)局的關(guān)聯(lián)(圖3B)(OASp=0.018，RFSp=0.0370)o對(duì)于研究組1A中的無(wú)復(fù)發(fā)存活，4EBP1水平(P2=0.0074;HR=7.44;CI:1.71-32.36)顯示出作為重要的預(yù)后因素。因此，對(duì)于研究組1A(圖1-3)，Akt/mTOR途徑中的個(gè)體成員看來(lái)與存活相關(guān)。E.橫紋肌肉瘤患者的無(wú)疾病存活和總存活與Akt和mTOR途徑的磷酸化組分相關(guān)?；谘芯拷M1A中的發(fā)現(xiàn)，從COG獲得一組獨(dú)立的樣品(n=26)(1B組，圖1A)，用于分析與Akt/mTOR途徑相關(guān)的擴(kuò)展蛋白質(zhì)集合。兩個(gè)不同類樣品組(1A組和1B組)的單變量對(duì)數(shù)秩分析顯示，樣品組(OASp-0.2111,RFSp=0.5824)或組織學(xué)(OASp=0.4103，RFSp=0.4312)在總存活或無(wú)復(fù)發(fā)存活上均未顯示顯著差異(圖IB和C)。我們《象1A組中那樣通過(guò)LCM和反相蛋白質(zhì)微陣列分析了1B組。我們將終點(diǎn)數(shù)擴(kuò)展到27個(gè)，以將Akt和mTOR上游和下游的其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白包括在內(nèi)用于獨(dú)立評(píng)價(jià)途徑活化。在數(shù)據(jù)解盲之后，研究組IB的結(jié)果(圖4)證明，無(wú)疾病存活和總存活與Akt-mTOR途徑的磷酸化組分顯著相關(guān)。高水平的AktSer473、4EBP1Thr37/46、elF4GSerl108和p70S6Thr389都與總存活差及無(wú)疾病存活差顯著相關(guān)(AktSer473(OASp<0.001，RFSp<0.0009)，4EBP1Thr37/46(OASp<0.0110，RFSp<0.0106)，elF4GSerl108(OASp<0.0017，RFSp<0.0072)，p70S6Thr389(OASp<0.0085，RFSp<0.0296)(圖4A-D)。還對(duì)27種組分中的每一個(gè)單獨(dú)評(píng)價(jià)了存活與非存活狀態(tài)的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。6個(gè)終點(diǎn)(仍均為Akt/mTOR網(wǎng)絡(luò)的成員)(4EBP1Thr37、AktSer473、elF4GSerl108、p70S6Thr389、Bak和GSK3a/pTyr279/216)獨(dú)立地與存活相關(guān)(威爾科克森單因素分析4EBP1Thr37/46(p<0.0348)，GSK3a/pTyr279/216(p<0.0348)，elF4GSerl108(p<0.0196)，AktSer473(p<0.0227)，Bak(p<0.0321)，p70S6Thr389(p<0.0373))(圖4E)。F.IRS-l/Akt/mTOR反饋回路在非存活者組中失調(diào)酪氨酸磷酸化的胰島素受體底物-l(InsulinReceptorSubstrate-1,IRS-1)通過(guò)PI3K活化Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而mTOR和p70S6對(duì)IRS-l612位絲氨酸的絲氨酸磷酸化下調(diào)IRS-1酪氨酸活化。因此，IRS-1應(yīng)答于Akt/mTOR活化而受到負(fù)反饋調(diào)控(圖5A)。我們通過(guò)反相蛋白質(zhì)微陣列對(duì)研究組IB(n=26)中的肺瘤檢測(cè)了IRS-l/Akt/mTOR反饋回路的磷酸化成員的水平。盡管IRS-1Ser612的水平在存活者和非存活者之間沒(méi)有差異，但是在存活者組中IRS-1Ser612的磷酸化與mTOR在Ser2448處的磷酸化強(qiáng)相關(guān)(Spearman，sRho非參數(shù)p<0.0027)，提示了這兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件之間的聯(lián)系(圖5B)。相反，在非存活者組中相同的這兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化不相關(guān)(Spearman'sRho非參數(shù)p=0.7358)(圖5B-C)。這種與IRS-1Ser612磷酸化相關(guān)性的缺乏也存在于mTOR下游組分elF4ESer209(存活者p=0.0006，非存活者p=0.1017)和p70S6Thr389(存活者p=0.00004，非存活者p=0.1827)中(圖5B和D)。因此，在存活差的患者胂瘤中，mTOR途徑的蛋白質(zhì)對(duì)IRS-1活性的負(fù)反饋調(diào)控可能是斷開(kāi)的(disconnected).相反，在長(zhǎng)期存活患者的腫瘤中IRS-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)似乎表現(xiàn)出完好的負(fù)反饋調(diào)控(圖5A-D)。G.蛋白質(zhì)磷酸化與非磷酸化狀態(tài)的研究磷酸化是一種重要的翻譯后修飾，其作為途徑活化狀態(tài)的讀出物和激酶抑制劑靶標(biāo)而具有潛在的重要性。為了進(jìn)一步研究IRS-l/Akt/mTOR途徑中潛在的重要細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)，我們將我們的分析擴(kuò)展至包括以下其他終點(diǎn)BAD、elF4G、IRS-1、IRS-2、IGFR-p和S6ser240/244。我們對(duì)關(guān)鍵蛋白質(zhì)終點(diǎn)的磷酸化蛋白質(zhì)、總蛋白質(zhì)形式以及磷酸化形式與總形式的比值進(jìn)行了威爾科克森單因素分析和Kaplan-Meier存活分析(圖5B)。結(jié)果清楚地證明，相比于分析物蛋白的非磷酸化總形式，Akt-mTOR和相關(guān)途徑中蛋白質(zhì)終點(diǎn)的特定磷酸化形式與存活相關(guān)(p<0.05)(4EBP1Thr37/46p<0.03，p70S6Thr389p<0.0373，GSK3apY279/216p<0.348，Aktser473p<0.0227，elF4Gserl108p<0.0196)。這是一個(gè)重要的區(qū)別，因?yàn)樾盘?hào)途徑節(jié)點(diǎn)的總蛋白質(zhì)群很可能與磷酸化形式相比是過(guò)量的。磷酸化形式構(gòu)成了總蛋白質(zhì)中活躍參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)亞群。H.在小鼠異種移植模型中mTOR途徑的抑制降低肺瘤生長(zhǎng)為了驗(yàn)證我們的IRS-l/Akt/mTOR網(wǎng)絡(luò)分沖斤在功能上的重要性，我們使用了雷帕霉素類似物(已充分表征的mTOR蛋白激酶途徑抑制劑)，其中采用小鼠異種移植物處理模型。將RD胚胎型細(xì)胞或Rh30腺泡狀細(xì)胞原位注射進(jìn)褐色SCID小鼠的后肢。將這兩種不同的細(xì)胞系用于確定mTOR抑制在不同組織學(xué)肺瘤分類中的作用。雷帕霉素類似物CCI陽(yáng)779(Wyeth,Madison，NJ)劑量是20mg/kg，這對(duì)應(yīng)于目前在I期和II期臨床試驗(yàn)中施用于人的劑量(Raymond等(2004)，JC7/"il，2336-2347;Smolewski等(2006)JWc"歸rDm^12，487-494)。施用經(jīng)證實(shí)抑制mTOR下游靶標(biāo)磷酸化的CCI-779劑量極大程度地降低了橫紋肌肉瘤異種移植物的生長(zhǎng)，如在SCID-褐色小鼠模型中所測(cè)量的(Rh30異種移植組p-0.0002;RD異種移植組p=0.00008，兩組均為n=8)(圖6A-C)。通過(guò)測(cè)量4EBP1和S6核糖體蛋白(已確定的mTOR下游靶標(biāo))的褲酸化來(lái)監(jiān)測(cè)mTOR途徑的抑制。在來(lái)源于Rh30腺泡狀和RD胚胎型異種移植物的腫瘤中，CCI-779均抑制這些下游把標(biāo)的磷酸化，相應(yīng)地阻斷mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。I.討論在本實(shí)施例中，使用兩個(gè)十二年隨訪數(shù)據(jù)可用的獨(dú)立RMS腫瘤研究組，對(duì)治療或存活采取盲法進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分析。接著根據(jù)最近完成的IRSIV研究、COGD9502或進(jìn)行中的COGD9803研究治療患者。從冷凍樣品庫(kù)中隨機(jī)獲得兩個(gè)獨(dú)立的研究組(圖1A，表1A和1B)。每個(gè)研究組代表多種治療方式、組織亞型和腫瘤部位。這兩個(gè)組中腺泡狀與胚胎型組織學(xué)形態(tài)樣品的比例不同(圖1)(3，4)。盡管所述樣品組是異質(zhì)的，但兩個(gè)樣品組之間在總存活或無(wú)復(fù)發(fā)存活上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(總存活p-0.2111,無(wú)復(fù)發(fā)存活p=0.5824)(圖IB)。目前用于診斷為橫紋肌肉瘤患者的預(yù)后指標(biāo)是年齡、分期、分組、組織學(xué)和原發(fā)部位，患有來(lái)自眼眶或非腦膜旁頭頸部位的胚胎型RMS的l-8歲患者具有最佳的預(yù)后(15)。使用無(wú)參照聚類分析，我們?cè)噲D確定是否有蛋白質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特征與組織學(xué)亞型相關(guān)。對(duì)于第一研究組，首先選擇十五種特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(圖2A和3A)，因?yàn)樗鼈儤?gòu)成了多種促存活相關(guān)事件的廣泛研究。對(duì)所選磷酸化狀態(tài)進(jìn)行的多重測(cè)量提供了選定的驅(qū)動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的網(wǎng)絡(luò)中正在進(jìn)行的激酶活性事件的平均模式。最初的無(wú)參照聚類分析不與組織學(xué)顯著相關(guān)，但是所述樣品清楚地劃分為兩個(gè)聚類，其中一個(gè)聚類顯示Akt/mTOR蛋白質(zhì)的活化(圖2A)。因此，從COG獲得臨床結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)，以進(jìn)一步研究所述蛋白質(zhì)終點(diǎn)與臨床數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。1A組的結(jié)果顯示了存活與Akt/mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo))信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白質(zhì)的活化/抑制之間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性(圖3A)?；?A組的結(jié)果，我們將此探索性分析擴(kuò)展到第二獨(dú)立樣品組的27個(gè)終點(diǎn)(圖1A，表1B)。將第二研究組中看來(lái)與存活或死亡相關(guān)的蛋白質(zhì)與Akt/mTOR激酶途徑連接在一起(13、27、28)。發(fā)現(xiàn)IRS-1(胰島素受體底物)、Akt、mTOR、4EBP1(延伸結(jié)合因子))、GSK3a/p(糖原合酶激酶-3)和p70S6的磷酸化組分與結(jié)局相關(guān)(圖4)。IRS-1、Akt和GSK3卩與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、胰島素應(yīng)答和葡萄糖代謝相關(guān)。mTOR、4EBP1和p70S6是蛋白質(zhì)翻譯的必要組分，其中4EBP1的磷酸化將4EBP1從elF4E上釋放，激活帽依賴性翻譯。已知這些途徑參與促存活調(diào)控和一組對(duì)細(xì)胞周期和凋亡具有重要性的蛋白質(zhì)的翻譯，所述重M白質(zhì)包括數(shù)個(gè)已知的癌基因，例如細(xì)胞周期蛋白D、c-myc和Hif-la。Akt/PKB(蛋白激酶B)在多種細(xì)胞功能中起中心作用，所述細(xì)胞功能包括糖原合成、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞維持存活和凋亡。盡管對(duì)于研究組1B，AktSer473與存活(p<0.02)相關(guān)，但是在1A組中它不與存活相關(guān)(p=0.2460)。這可能是由于兩個(gè)組中腫瘤組織學(xué)相對(duì)組成和原發(fā)部位的差異造成的(圖1A)。多種自分泌和旁分泌剌激(包括激素、生長(zhǎng)因子、絲裂原、細(xì)胞因子和G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑)引發(fā)4EBP1的超磷酸化以及伴隨的mTOR途徑中elF4E結(jié)合活性的喪失。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)或者下游效應(yīng)物激酶Akt的活化導(dǎo)致4EBP1的超磷酸化，影響它從elF4E上的釋放。4EBP1在多個(gè)位點(diǎn)上的磷酸化與胰島素受體途徑和PI3K途徑的連接相關(guān)。4EBP1上已鑒定出六個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在胰島素刺激后，Thr37、Thr46、Ser65和Thr70變?yōu)榱姿峄@樣的磷酸化可被雷帕霉素(mTOR抑制劑)和渥曼青霉素(PI3K抑制劑)阻斷。已經(jīng)顯示，mTOR自身以及mTOR相關(guān)激酶直接磷酸化4EBPl上的位點(diǎn)。Gingras等確定了磷酸基首先加到Thr37和Thr46上。這種引發(fā)磷酸化是結(jié)合所需其它位點(diǎn)的磷酸化所必需的。因此，由多種激酶觸發(fā)的由Thr37/46引發(fā)的多重磷酸化事件參與了4E-BP1從elF4E上的釋放。酪氨酸礴酸化的胰島素受體底物-1(IRS-1)通過(guò)PI3K活化Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，mTOR和p70S6對(duì)IRS-1(612位絲氨酸)的絲氨酸磷酸化下調(diào)IRS-1酪氨酸活化。因此，已經(jīng)提出，IRS-1應(yīng)答于通過(guò)p70S6進(jìn)行的Akt/mTOR活化而受到負(fù)反饋調(diào)控(圖5A)。我們通過(guò)非參數(shù)相關(guān)性研究了IRS-1反饋回路與Akt和mTOR途徑的相互關(guān)系(圖5B-D)。對(duì)IRS-1絲氨酸612和多個(gè)可能的相互作用蛋白的研究提供了評(píng)估與參與IRS-1負(fù)反饋調(diào)控的實(shí)際磷酸化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用的方法。好結(jié)局和差結(jié)局患者的胂瘤IRS-1ser612的平均水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4E)，提示IRS-1的上游活性水平類似。盡管好結(jié)局和差結(jié)局病例中IRS-1磷酸化平均水平相似，但是在這兩種表型中每個(gè)肺瘤的個(gè)體IRS-1磷酸化水平與Akt和mTOR途徑蛋白質(zhì)磷酸化水平之間的相關(guān)性極為不同。另一方面，在兩組中Bax、FKHRser256和4EBP1Thr70都顯著相關(guān)(圖5B)。如圖5所示，在好結(jié)局的胂瘤中IRS-1ser612與mTORser2448(p=0.00269)以及與p70S6Thr289(p=0.00004)強(qiáng)正相關(guān)(圖5B-D)。這提示了與mTOR與IRS-1之間反饋回路一致的關(guān)聯(lián)性，并且它可能在體內(nèi)狀態(tài)下存在于具有好結(jié)局的胂瘤中。這些數(shù)據(jù)支持了在差結(jié)局的腫瘤中所述反饋回路的選擇性斷開(kāi)。存活者與非存活者中IRS-Akt-mTOR互聯(lián)性的這些差異的意義是雙重的。首先，IRS-l和mTOR之間表面上缺乏互聯(lián)可破壞正常的負(fù)反饋調(diào)控。這可導(dǎo)致如我們?cè)诓罱Y(jié)局的患者腫瘤中所注意到的Akt磷酸化提高，如圖5A所示。其次，用于攻擊性腫瘤(其中所述負(fù)反饋回路不起作用)的mTOR抑制劑療法將無(wú)法引起Akt磷酸化提高。在攻擊性腫瘤中(其中mTOR通過(guò)IRS-1的負(fù)反饋調(diào)控被破壞)磷酸化Akt和mTOR的基線水平可升高，導(dǎo)致肺瘤的持續(xù)生長(zhǎng)和存活。已鑒定的4E-BP1磷酸化位點(diǎn)已知被雷帕霉素處理特異性抑制。為了驗(yàn)證我們揭示好治療結(jié)局患者中所觀察到的mTOR途徑抑制的網(wǎng)絡(luò)分析的功能重要性，我們利用了已有的雷帕霉素類似物，它們是已良好表征的mTOR蛋白激酶途徑抑制劑。這些類似物中的一些目前處于成人癌癥患者的I期和II期臨床試驗(yàn)(Raymond等(2004),如上文;Smolewski等(2006)如上文)。通過(guò)測(cè)量4EBP1和S6激酶的磷酸化狀態(tài)來(lái)監(jiān)測(cè)mTOR途徑的抑制，所述激酶是已良好確立的mTOR下游底物(13、27、28、30、31)。在來(lái)源于Rh30腺泡狀或RD胚胎型細(xì)胞的異種移植物腫瘤中，CCI-779抑制下游乾標(biāo)的預(yù)計(jì)磷酸化，相應(yīng)地阻斷mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖6)?？傊?，對(duì)治療前獲得的顯微切割人RMS臨床樣品進(jìn)行的蛋白質(zhì)途徑分析顯示，在此初步探索性分析中Akt/mTOR途徑的活化與差結(jié)局強(qiáng)相關(guān)。發(fā)現(xiàn)這一觀察在兩個(gè)獨(dú)立分析的臨床研究組之間一致。另夕卜，使用特異性靶向抑制劑CCI-779在SCID-褐色RMS異種移植物模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)，驗(yàn)證了IRS-l/Akt/mTOR途徑活化在RMS中的功能重要性。這些數(shù)據(jù)支持了這一推論，即在這一腫瘤類型中使用雷帕霉素類似物作為將差預(yù)后患者調(diào)控為較長(zhǎng)存活結(jié)局患者的潛在方法。組合治療策略可以著眼于同時(shí)阻斷上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子活化和下游mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，作為增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性RMS治療的方法。實(shí)施例II.使用反相蛋白質(zhì)微陣列進(jìn)行的肺癌磷蛋白組分析；mTOR途徑在決定非小細(xì)胞肺癌(最常見(jiàn)的肺癌類型)結(jié)局中的重要性A.材料與方法1.樣品。二十個(gè)早期肺腺癌手術(shù)樣品。肺手術(shù)切除物收集自患者，并且在手術(shù)時(shí)冷凍。(根據(jù)國(guó)家死亡指數(shù)(NationalDeathIndex)確認(rèn)患者存活)2.冷凍切片。在硅烷化栽玻片上制備8nm冷凍組織切片。3.激光捕捉顯微切割(LCM)。4吏用MolecularDevices'Pixcell或Veritas設(shè)備獲得純肺瘤細(xì)胞群.4.反相蛋白質(zhì)微陣列被印在WhatmanSchleicher和SchuellFAST栽玻片上，其中使用AffymetrixGMS417針和環(huán)型陣列儀(一式二份印制樣品，每個(gè)點(diǎn)印10下)5.免疫染色。在Dako自動(dòng)染色儀上，使用Dako催化信號(hào)擴(kuò)增化學(xué)(辣根過(guò)氧化物酶介導(dǎo)的生物素化酪胺沉積)通過(guò)發(fā)色檢測(cè)(DAB)來(lái)檢測(cè)微陣列上的特定蛋白。B.劃分分析用ImageQuantver5.2實(shí)施微陣列點(diǎn)強(qiáng)度分析，將JMP軟件用于雙因素分級(jí)聚類(Ward法)和劃分分析。結(jié)果示于下文表4和圖7。表4.用于將反相蛋白質(zhì)微陣列免疫染色的抗體探針<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>C，根據(jù)Kaplan-Mier存活曲線的RPMA分析在這個(gè)組中，基于主成分分析，通過(guò)反相陣列分析對(duì)IO名長(zhǎng)期存活患者和10名短期存活患者進(jìn)行分析。表示為Kaplan-Mier存活曲線(圖8和9)的結(jié)果再次顯示，AKT/mTOR途徑的組分被發(fā)現(xiàn)是結(jié)局的主要驅(qū)動(dòng)者。同樣地，p4EBPl和pAKT升高的患者具有顯著更短的總存活時(shí)間。實(shí)施例III.使用反相蛋白質(zhì)微陣列進(jìn)行的乳腺癌磷蛋白組分析在此實(shí)施例中，通過(guò)使用反相蛋白質(zhì)微陣列的分子網(wǎng)絡(luò)分析來(lái)分析取自ER+淋巴結(jié)陰性和淋巴結(jié)陽(yáng)性乳腺癌患者的腫瘤研究組，所示患者至少隨訪10年，并且均使用他莫西芬單一療法進(jìn)行治療。在所分析的55個(gè)磷酸化終點(diǎn)中，結(jié)局區(qū)分的大部分主成分屬于mTOR途徑。重要的是，不論淋巴結(jié)狀態(tài)怎樣，mTOR途徑組分(主要是pEBPl，還有p70S6)均可區(qū)分結(jié)局。圖10顯示才艮據(jù)p4EB-Pl分組的乘積相關(guān)存活擬合；存活僅來(lái)自LN-亞組。圖11顯示LN+群的劃分分析，其顯示p70S6為區(qū)分的主成分。圖12顯示了來(lái)自所有病例(LN-和LN+)的存活曲線。結(jié)論數(shù)據(jù)明確支持以下結(jié)論，即患有ER+乳腺癌(無(wú)論淋巴結(jié)狀態(tài)如何)并使用他莫西芬單一療法的女性的復(fù)發(fā)時(shí)間與mTOR途徑特定組分的磷酸化狀態(tài)強(qiáng)相關(guān)。這一信息可以是以下決定的基礎(chǔ)a)決定誰(shuí)應(yīng)該接受他莫西芬療法和/或b)給預(yù)測(cè)為差存活的患者亞組施用第二療法。合適的這些第二治療劑在本文別處有討論。從上述描述中，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定本發(fā)明的必要特征，并可在不脫離其構(gòu)思和范圍的情況下對(duì)本發(fā)明作出改變和修改，以使之適應(yīng)多種應(yīng)用和條件，以及以最完整的范圍應(yīng)用本發(fā)明。上述優(yōu)選的具體實(shí)施方案應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。上文和附圖中引用的所有申請(qǐng)、專利以及出版物(包括2005年10月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/727,510)的全部公開(kāi)內(nèi)容均通過(guò)參考整體并入本文。權(quán)利要求1.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑的反應(yīng)和/或該受試者的預(yù)后的方法，和/或用于在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括在來(lái)自該受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量mTOR途徑至少一個(gè)成員和/或互聯(lián)多肽途徑至少一個(gè)成員相比基線值的磷酸化狀態(tài)；其中所述磷酸化狀態(tài)相比于基線值的水平升高表明該受試者是該化療劑的無(wú)反應(yīng)者和/或預(yù)后差。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述互聯(lián)多肽途徑成員來(lái)自Akt途徑。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述互聯(lián)多肽途徑成員來(lái)自IRS途徑。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述互聯(lián)多肽途徑成員來(lái)自除Akt或IRS途徑之外的途徑。5.權(quán)利要求l的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是mTOR途徑的至少一個(gè)成員、Akt途徑的至少一個(gè)成員、或者IRS途徑的至少一個(gè)成員或其組合的磷酸化狀態(tài)。6.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是mTOR途徑的至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。7.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是Akt途徑的至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。8.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是IRS途徑的至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。9.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是mTOR途徑至少一個(gè)成員和Akt途徑至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。10.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是mTOR途徑至少一個(gè)成員和IRS途徑至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。11.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是IRS途徑至少一個(gè)成員和Akt途徑至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。12.權(quán)利要求5的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)是mTOR途徑至少一個(gè)成員、IRS途徑至少一個(gè)成員和Akt途徑至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)反映該多肽特定的磷酸化模式。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述mTOR和/或互聯(lián)多肽途徑成員是Akt激酶、mTOR、4E國(guó)BP1/PHAS-1、p70s6k、elF-4E或elF-4G、PTEN、PDK1、GSK3p、TSC1/2、ILK、Gabl/2、p27Kipl、FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或備CHK1。15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，另外，其中如果未觀察到所述途徑成員的磷酸化狀態(tài)相比于基線值的顯著提高，則用常規(guī)化療方法治療該受試者。16.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的方法，另外，其中如^J見(jiàn)察到所述途徑成員的磷酸化狀態(tài)相比于基線值的顯著提高，那么對(duì)該受試者施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑成員的抑制劑。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述抑制劑結(jié)合FKB12。18.權(quán)利要求16的方法，另夕卜，其中將常規(guī)化療劑與所述抑制劑組合施用于該受試者。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述常規(guī)化療劑與所述抑制劑同時(shí)施用。20.權(quán)利要求18的方法，其中所述常規(guī)化療劑在施用所述抑制劑之后的合適時(shí)間施用。21.權(quán)利要求16的方法，其中在施用所述抑制劑之后測(cè)量該途徑成員的磷酸化狀態(tài)。22.權(quán)利要求16的方法，其中所施用抑制劑的量有效降低該途徑成員的磷酸化量。23.—種使用化療劑在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其改進(jìn)包括如果在來(lái)自所治療受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑成員磷酸化的顯著提高，則施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑成員的抑制劑。24.—種治療化療劑抗性或難治性癌癥的方法，其包括如果在來(lái)自所治療受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑成員磷酸化的顯著提高，則施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑成員的抑制劑。25.—種在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其包括通it^U'j要求1-14中任一項(xiàng)的方法測(cè)量mTOR途徑至少一個(gè)成員和/或互聯(lián)多肽途徑至少一個(gè)成員相比于基線值的砩酸化狀態(tài)；并且如果測(cè)量到顯著量的磷酸化提高，則施用mTOR途徑或互聯(lián)多肽途徑成員的抑制劑。26.權(quán)利要求14或16-25中任一項(xiàng)的方法，其中在化療之前測(cè)量磷酸化，并且如果在來(lái)自所治療受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)得所述途徑成員的磷酸化顯著提高，則與化療劑組合施用所述抑制劑以治療該癌癥。27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述途徑成員的磷酸化使用針對(duì)選自以下的至少一個(gè)成員的磷酸化位點(diǎn)的抗體來(lái)測(cè)量PI3激酶、Akt激酶、mTOR、4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、elF-4E和elF畫4G、PTEN、PDK1、GSK3p、TSC1/2、ILK、Gabl/2、p27Kipl、FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或ic服l。28.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。29.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是橫故肌肉瘤。30.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是肺癌。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌。32.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品包括轉(zhuǎn)移細(xì)胞，33.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥與PTEN功能的喪失和/或Akt的突變和活化無(wú)關(guān)。34.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述抑制劑是針對(duì)mTOR途徑、Akt途徑或IRS途徑的成員或其組合。35.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，徑的成員。36.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法,的成員。37.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，的成員。38.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，IRS途徑之外的互聯(lián)途徑的成員。39.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法,徑的成員和Akt途徑的成員。40.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，徑的成員和IRS途徑的成員。41.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，的成員和IRS途徑的成員。其中所述抑制劑是針對(duì)mTOR途其中所述抑制劑是針對(duì)Akt途徑其中所述抑制劑是針對(duì)IRS途徑其中所述抑制劑是針對(duì)除Akt或其中所述抑制劑是針對(duì)mTOR途其中所述抑制劑是針對(duì)mTOR途其中所述抑制劑是針對(duì)Akt途徑42.權(quán)利要求17-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述抑制劑是針對(duì)mTOR途徑的成員、Akt途徑的成員和IRS途徑的成員。43.權(quán)利要求17-42的方法，其中所測(cè)量的磷酸化狀態(tài)反映該多肽的特定磷酸化模式。44.一種預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑的反應(yīng)和/或該受試者的預(yù)后的方法，其包括在來(lái)自所治療受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量mTOR途徑至少一個(gè)成員和/或互聯(lián)多肽途徑至少一個(gè)成員的磷酸化狀態(tài)的變化，其中水平的升高表明該受試者是該化療劑的無(wú)反應(yīng)者和/或預(yù)后差。45.—種使用化療劑在有此需要的受試者中治療橫紋肌肉瘤的方法，其改進(jìn)包括，如果在來(lái)自該受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中測(cè)量到4EBP1Thr37/46、elF-4Gserl108和/或p70S6Thr389磷酸化提高，則施用CCI-779。46.—種用于預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑的^^應(yīng)和/或該受試者的預(yù)后的試劑盒，其包含用于檢測(cè)mTOR途徑至少一個(gè)成員和/或Akt途徑至少一個(gè)成員和/或IRS途徑至少一個(gè)成員或者其組合的磷酸化狀態(tài)的一種或多種試劑。47.—種藥物組合物，其包含mTOR途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個(gè)成員的抑制劑或者其組合，還包含可藥用載體。48.權(quán)利要求47的藥物組合物，其還包含可以與權(quán)利要求47的抑制劑聯(lián)合施用的化療劑。49.一種用于治療患有化療劑抗性或難治性癌癥的受試者的試劑盒，其包含mTOR途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個(gè)成員的抑制劑或者其組合。50.權(quán)利要求49的試劑盒，其還包含可與以下抑制劑聯(lián)合施用的化療劑mTOR途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或Akt途徑至少一個(gè)成員的抑制劑和/或IRS途徑至少一個(gè)成員的抑制劑或者其組合。全文摘要本發(fā)明涉及，例如預(yù)測(cè)受試者對(duì)化療劑的反應(yīng)和/或該受試者預(yù)后的方法，其包括測(cè)量來(lái)自該受試者的癌組織或癌細(xì)胞樣品中mTOR途徑的至少一個(gè)成員和/或互聯(lián)多肽途徑的至少一個(gè)成員(例如Akt途徑的成員或IRS途徑的成員)相對(duì)于基線值的磷酸化狀態(tài)，其中所述磷酸化狀態(tài)相對(duì)于基線值的水平升高標(biāo)志著所述受試者是該化療劑的無(wú)反應(yīng)者和/或預(yù)后差。本發(fā)明還描述了在有此需要的受試者中治療癌癥的方法，其中所述受試者表現(xiàn)出磷酸化狀態(tài)水平的升高，所述方法包括施用mTOR和/或互聯(lián)途徑的一種或多種抑制劑。文檔編號(hào)G01N33/68GK101421625SQ200680047736公開(kāi)日2009年4月29日申請(qǐng)日期2006年10月18日優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日發(fā)明者蘭斯·A·廖塔,埃馬努埃爾·F·彼得里科因三世,弗吉尼亞·埃斯皮納申請(qǐng)人:喬治梅森知識(shí)產(chǎn)權(quán)公司