專利名稱：一種檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種基因芯片，尤其涉及一種檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，屬生物芯片和診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
急性呼吸道感染是世界范圍的常見病、多發(fā)病，其主要原因是由流感和其他各種呼吸道病毒引起，常見的是流感病毒(甲、乙、丙各型)、鼻病毒、腺病毒、冠狀病毒、合胞病毒等。其臨床表現(xiàn)相似，如鼻炎、流涕、鼻塞、咳嗽、輕度咽炎、全身發(fā)熱等癥狀。由于可能的病原種類很多，而病毒的分離培養(yǎng)不僅周期長，技術(shù)上也比較困難，用免疫學(xué)檢測方法也很難快速確定病原體，因此其病原檢測一直存在困難。
近十幾年來，分子生物學(xué)方法，特別是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的檢測方法在病毒檢測領(lǐng)域得到迅猛發(fā)展，成為病毒檢測的一項革命性技術(shù)。PCR技術(shù)檢測方法不僅速度快、靈敏度高、而且有時可以同時檢測數(shù)種病毒。然而，這些技術(shù)都還存在一些無法彌補的缺陷。
生物芯片是指通過微細加工技術(shù)及超分子自組裝技術(shù)，在固體芯片表而構(gòu)建的微分析單元和系統(tǒng)，具有信急含量大、操作簡便、工作效率高等特點。近年來，生物芯片作為高新技術(shù)的代表之一，得到了迅速發(fā)展，技術(shù)日趨成熟，在生物檢測、醫(yī)學(xué)檢驗、疾病診斷、藥物篩選和生物體內(nèi)微量成分分析等方發(fā)揮著十分重要的用途。
目前，基因芯片技術(shù)用于臨床研究日趨增多，特別是用于診斷一些微生物病原體的感染。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)相比，基因芯片技術(shù)最大的特色在于其高通量檢測，這是日前所有病毒檢測技術(shù)都未曾解決的?，F(xiàn)有的病毒芯片檢測技術(shù)，絕大部分只能針對一類病毒，通過特定引物來擴增病毒樣品，然后通過芯片雜交來確定亞型，但是通過基因芯片來同時檢測幾種病毒及其亞型，鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本實用新型要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，該芯片利用基因芯片技術(shù)，可通過一次檢測獲得所有病毒信息，甚至包括以前未曾發(fā)現(xiàn)的新病毒或新變異株。
本實用新型的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層組成，其特征在于，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～2個；每涂層區(qū)的點涂層平行垂直排列，橫為五排，縱為九列；所述點涂層包括14組42個呼吸道病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)，1組3個點涂層空白對照區(qū)。
其中，所述的醛基化修飾層是指在未經(jīng)任何化學(xué)修飾的玻璃片裸片上覆蓋有醛基化層。
其中，所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm～77mm×25mm～27mm；厚度為0.6mm～2.0mm。
其中，所述的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層的大小，可以根據(jù)點直徑、點個數(shù)和點間距的變化而變化。
其中，優(yōu)選的實施方式是所述的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層區(qū)的點直徑為0.15mm，點間距為0.5mm，在一張玻璃基片上設(shè)置1個涂層區(qū)。(如圖1所示)。
在上述的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片中，所述點涂層中14組呼吸道病毒的寡核苷酸探針是人副流感病毒1(Human Parainfluenza I)特異性檢測探針人副流感病毒2(Human Parainfluenza 2)特異性檢測探針人副流感病毒3(Human Parainfluenza 3)特異性檢測探針人冠狀病毒229E(Human coronavirus 229E)特異性檢測探針甲型流感病毒4(Influenza A virus 4)特異性檢測探針甲型流感病毒5(Influenza A virus 5)特異性檢測探針乙型流感病毒RNA-4(Influenza B virus RNA-4)特異性檢測探針丙型流感病毒(Influenza C)特異性檢測探針人呼吸道合胞體病毒(Human respiratory syncytial virus)特異性檢測探針人鼻病毒(Human rhinovirus)特異性檢測探針人鼻病毒16(Human rhinovirus 16)特異性檢測探針人腺病毒2型(Human adenovirus type 2)特異性檢測探針柯薩奇病毒A9(Coxsackievirus A9)特異性檢測探針人柯薩奇病毒A(Human Coxsackievirus A)特異性檢測探針?biāo)鳇c涂層中1組空白對照的空白點樣液是3×SSC。
本實用新型中探針的設(shè)計原則是盡可能選取每個病毒家族的最保守序列作為檢測探針。將每個病毒基因組利用軟件分成有25nt重疊的70nt長的寡核苷酸片段，利用BLASTN排序分析每個70nt長的寡核苷酸片段與同家族(或同組)病毒的同源性，選取同源程度最高的片段作為該病毒的檢測探針。通過同源雜交，可以盡可能多地檢測到同家族內(nèi)未知的或未測序的病毒。
此外，在本實用新型中對待檢樣品的擴增方法也做了改進。一般病毒芯片檢測技術(shù)，都是設(shè)計特定的病毒相關(guān)引物，將病毒特定序列進行擴增。因此，對于病原未知的樣品根本無從下手。而本實用新型中所用的方法是待檢樣品先通過由帶擴增標(biāo)簽的隨機引物(5’-GTTTCCCAGTAGGTCTCNNNNNNNN)在聚合酶催化下進行2次隨機延伸，使其兩端帶上擴增標(biāo)簽，再由相應(yīng)的擴增引物(5’-GTTTCCCAGTAGGTCTC)進行PCR擴增，其結(jié)果相當(dāng)于把待檢樣品中所有的DNA(或RNA)序列進行了平行擴增。因此，象呼吸道感染的樣品，不管是流感病毒，還是鼻病毒或腺病毒感染，用這兩個引物都可以得到擴增，最后都有可能通過雜交檢測出來。因此，與以往的芯片檢測技術(shù)相比，檢測范圍有了很大的擴增。
本實用新型中所用的檢測技術(shù)，由于引物是隨機引物，就靈敏度而言，肯定不如傳統(tǒng)的采用特異引物擴增的芯片技術(shù)靈敏度高，但是，基于傳統(tǒng)PCR擴增技術(shù)的芯片檢測，與一般的PCR技術(shù)一樣，由于靈敏度過高和PCR產(chǎn)物污染等原因，存在假陽性問題。而本實用新型中所用的引物是隨機引物，擴增過程中是將樣品中所有RNA平行擴增，并未將某一病毒片段過度富集，因此，出現(xiàn)假陽性概率會比基于傳統(tǒng)PCR技術(shù)的芯片檢測方法低得多。


圖1本實用新型所述檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片的直觀圖，其中，1為玻璃基片；2為涂層區(qū)。
圖2本實用新型所述檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片的點涂層探針排布圖，其中，所述點涂層區(qū)排布為A1，A2，A3為人副流感病毒1特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；A4，A5，A6為人副流感病毒2特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；A7，A8，A9為人副流感病毒3特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；B1，B2，B3為人冠狀病毒229E特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；B4，B5，B6為甲型流感病毒4特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；B7，B8，B9為甲型流感病毒5特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；C1，C2，C3為乙型流感病毒RNA-4特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；C4，C5，C6為丙型流感病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；C7，C8，C9為人呼吸道合胞體病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；D1，D2，D3為人鼻病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；D4，D5，D6為人鼻病毒16特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；D7，D8，D9為人腺病毒2型特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；E1，E2，E3為柯薩奇病毒A9特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；E4，E5，E6為人柯薩奇病毒A特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；E7，E8，E9為空白對照點涂層區(qū)。
具體實施方式
實施例1下面結(jié)合圖1所述檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片的直觀圖以及圖2所述檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片的點涂層探針排布圖對本實用新型的內(nèi)容作進一步闡述本實用新型的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層組成，其中，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片，形狀是長方形，面積是25.4mm×76.2mm，厚度為1.2mm；所述點涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1個，所述涂層區(qū)的點涂層平行垂直排列，橫為五排，縱為九列；所述點涂層包括14組42個呼吸道病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)，1組3個點涂層空白對照區(qū)；具體為
A1，A2，A3為人副流感病毒1特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；A4，A5，A6為人副流感病毒2特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；A7，A8，A9為人副流感病毒3特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；B1，B2，B3為人冠狀病毒229E特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；B4，B5，B6為甲型流感病毒4特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；B7，B8，B9為甲型流感病毒5特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；C1，C2，C3為乙型流感病毒RNA-4特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；C4，C5，C6為丙型流感病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；C7，C8，C9為人呼吸道合胞體病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；D1，D2，D3為人鼻病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；D4，D5，D6為人鼻病毒16特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；D7，D8，D9為人腺病毒2型特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；E1，E2，E3為柯薩奇病毒A9特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；E4，E5，E6為人柯薩奇病毒A特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)；E7，E8，E9為空白對照點涂層區(qū)。
上述圓形點涂層直徑為0.15mm，點間距為0.5mm，點涂層微陣列的面積為3.2mm×6.4mm。
實施例2本實用新型所述檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片的制備及應(yīng)用探針序列設(shè)計和合成根據(jù)文獻合成序列，長度均為60mer，合成時對3’端進行C6臂氨基修飾(上海生物工程公司)。
芯片構(gòu)建寡核苷酸探針用3 X SSC溶解到50umol/l，用PixSys 5500PAWorkstation(Carte-sian)點樣儀點到醛基化玻片(上海百傲生產(chǎn))上，直徑為150um.排列見圖2。
制備完畢后用0.1％SDS洗，水洗，晾干待用。
探針標(biāo)記①病毒培養(yǎng)和病毒RNA提取病毒培養(yǎng)上清取自臨床，用QTAGEN的Spin virus kit抽提病毒RNA(按說明書操作)，最后用30ul水洗脫。
②逆轉(zhuǎn)錄、擴增與標(biāo)記取10ul病毒RNA提取液.加入1ul 0.2ul/ml PrimerD(GTTTC-CCAGTAGGTCTCNNNNNNNN)，混勻，離心后70℃，5min，迅速冷至0℃后，離心，加入相應(yīng)緩沖液、RNA抑制劑(Fermentas.RevertAid First strand cDNA synthesiskit)及dNTPs(終濃度為1mmol/l)，混勻，離心后25℃，5min，加入1ul.M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶并補水至總體積為20ul，混勻，離心后25℃，10min，42℃，60min。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，95℃，3min，再冷至10℃，加入5 U Sequencenase 2.0(AmershamBioscience)，混勻二離心后25℃，5min，37℃，8min；70℃滅活10min。
PCR擴增參照文獻方法，50ul的PCR反應(yīng)體系中，取5ul，上述反應(yīng)產(chǎn)物為模板，加入擴增引物E(GTTTCCCAGTAGGTCTC)按下列參數(shù)擴增94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，40℃，30s，50℃，30s退火，72℃，延伸60s，進行40個循環(huán)后，補入1 U Taq酶，繼續(xù)20個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用QIANGEN PCR Purification Kit純化，最后用30ul水洗脫。
探針熒光標(biāo)記取10ul PCR產(chǎn)物，加入1ul 0.2ug/ul.隨機九聚物(上海生物工程公司)，混合后沸水浴變性3min，迅速冷至0℃，在50ul體系中加入9 U Klenowminus酶(Promega)，1ul 1mol/l Cy5dCTP(Amersham Bioscience)，1ul 1mmol/ldCTP，5ul 1mmol/l dCAP、dGTP、dTTP混合物，加入酶緩沖液和水至終體積50ul，混勻，離心后42℃，120min。反應(yīng)產(chǎn)物用QIANGEN PCR Purification Kit純化，最后用30ul水洗脫。
雜交與掃描雜交方法參照文獻并作適當(dāng)調(diào)整取5ul標(biāo)記產(chǎn)物，加入5ul 2 X雜交液(6XSSC.0.2％SDS.5XDenhart溶液，10mg/ml，鮭魚精DNA)，沸水浴變性3min，迅速冷至0℃，取10ul滴于點樣區(qū)，蓋上蓋玻片防止揮發(fā)(不要有氣泡)，放入雜交倉，置于濕盒內(nèi)，55℃雜120min。
結(jié)束后分別用0.1％SDS和水洗滌并干燥，將芯片置ScanArray 5000(GeneralScanning，Tnc.)中，在特定區(qū)域上掃描。
實驗結(jié)果顯示可以看出在芯片的相應(yīng)探針位置都有很強的陽性雜交信號，而且不同亞型之間基本沒有假陽性信號，表明用此種方法可以廣譜地鑒定出流感病毒及其相關(guān)的亞型。
權(quán)利要求1.一種檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層組成，其特征在于，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～2個；每涂層區(qū)的點涂層平行垂直排列，橫為五排，縱為九列；所述點涂層包括14組42個呼吸道病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)，1組3個點涂層空白對照區(qū)。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的醛基化修飾層是指在未經(jīng)任何化學(xué)修飾的玻璃片裸片上覆蓋有醛基化層。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的玻璃基片是長方形，面積是73mm～77mm×25mm～27mm；厚度為0.6mm～2.0mm。
4.如權(quán)利要求1或3所述的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層的大小，可以根據(jù)點直徑、點個數(shù)和點間距的變化而變化。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層區(qū)的點直徑為0.15mm，點間距為0.5mm，在一張玻璃基片上設(shè)置1個涂層區(qū)。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測呼吸道病毒的玻璃基因芯片，由玻璃基片和陣列式分布于基片之上的呼吸道病毒的寡核苷酸探針與空白對照的點涂層組成，其中，所述的玻璃基片是表面有醛基化修飾層的玻璃片；所述點涂層的形狀為圓形，涂層區(qū)設(shè)1～2個；每涂層區(qū)的點涂層平行垂直排列，橫為五排，縱為九列；所述點涂層包括14組42個呼吸道病毒特異性檢測探針點涂層檢測區(qū)，1組3個點涂層空白對照區(qū)。本實用新型的芯片可通過一次檢測獲得所有病毒信息，甚至包括以前未曾發(fā)現(xiàn)的新病毒或新變異株。
文檔編號G01N33/551GK2901314SQ200620083508
公開日2007年5月16日 申請日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者常宏文, 張海龍, 劉麗芹, 馬建峰 申請人:山東大學(xué)