專利名稱：生物傳感器設(shè)備及使用方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)作為部分繼續(xù)申請(qǐng)要求2002年3月21日提交的名稱為“直接免疫傳感器測(cè)定”的美國申請(qǐng)系列號(hào)10/105,050和2004年4月22日提交的名稱為“免疫傳感器”的10/830,841的優(yōu)先權(quán)，在此全文引入這兩篇文獻(xiàn)作為參考。
背景技術(shù)：
已經(jīng)采用了常規(guī)生化傳感器，包括基于免疫測(cè)定的系統(tǒng)來報(bào)道多種分析物的存在和/或濃度。免疫測(cè)定通常分為兩類競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定和夾心測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中，將測(cè)試樣品中的抗原與抗原-探針復(fù)合物(通常稱作報(bào)道復(fù)合物)混合，然后混合物競(jìng)爭(zhēng)與抗體的結(jié)合。探針可以是放射性同位素、熒光團(tuán)、或發(fā)色團(tuán)。在夾心免疫測(cè)定中，測(cè)試樣品中的抗原與抗體結(jié)合，然后第二抗體-探針復(fù)合物與抗原結(jié)合。在這些現(xiàn)有技術(shù)的測(cè)定方法中，通常需要一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。洗滌步驟在測(cè)定程序中導(dǎo)入了復(fù)雜性，并且會(huì)產(chǎn)生生物危險(xiǎn)的液體廢物。
免疫測(cè)定通常給用戶提供了最常通過簡單目測(cè)(如顏色改變)獲得的定性結(jié)果(如“是/否答案”)，或諸如抗原濃度的定量結(jié)果。大多數(shù)定量方法涉及昂貴的設(shè)備組，如閃爍計(jì)數(shù)器(用于監(jiān)測(cè)放射性)、分光光度計(jì)、分光熒光計(jì)(參見，例如美國專利No.5,156,972)、表面等離子共振儀(參見，例如美國專利No.5,965,456)，等等。因此，開發(fā)便宜和簡單的、足夠適用于家庭或野外使用的免疫測(cè)定是有利的。所述生物傳感器優(yōu)選不需要離心、稀釋、移液、洗滌或定時(shí)步驟，并且將產(chǎn)生很少的廢物。
發(fā)明概述此處公開了用于檢測(cè)目的分析物和/或?qū)δ康姆治鑫镞M(jìn)行定量的生物傳感器裝置和方法。在一種實(shí)施方案中，提供了一次性的測(cè)定裝置，用于檢測(cè)流體樣品中的靶分析物，該裝置包含反應(yīng)室，其中放置了固定的結(jié)合靶和探針綴合物(conjugate)。當(dāng)將樣品導(dǎo)入反應(yīng)室中時(shí)，在固定的結(jié)合靶、探針綴合物和/或靶分析物(如果存在)之間發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。在一種示例的實(shí)施方案中，如果存在靶分析物，其導(dǎo)致與固定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的探針綴合物的量改變?？梢栽跈z測(cè)室中檢測(cè)這種改變。
固定的結(jié)合靶、探針綴合物和靶分析物可以包括多種公知的配體。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，固定的結(jié)合靶、探針綴合物和靶分析物可以包括抗原或抗體、激素或神經(jīng)遞質(zhì)和受體、底物或變構(gòu)效應(yīng)物和酶、凝集素和糖、DNA或RNA結(jié)構(gòu)，如適體和它們的結(jié)合種類(包括其它DNA或RNA種類或結(jié)合蛋白)、蛋白、生物素和親和素或鏈親和素系統(tǒng)、酶和它們的底物和抑制劑、脂質(zhì)結(jié)合系統(tǒng)，及其組合。為了促進(jìn)對(duì)此處描述的裝置和方法的理解，將在下文描述免疫配體，裝置將被稱作免疫傳感器或生物傳感器。
一方面，上文提到的檢測(cè)室包括電極和電化學(xué)試劑。例如，檢測(cè)室中的電化學(xué)反應(yīng)可以用于確定反應(yīng)室中結(jié)合的探針綴合物的量是否由于靶抗原的存在而增加或減少。電化學(xué)反應(yīng)也可以用于基于檢測(cè)室中的探針綴合物的濃度而確定分析物(如靶抗原)濃度。
在一種實(shí)施方案中，固定的結(jié)合位點(diǎn)包括適于結(jié)合于靶抗原的抗體，探針綴合物包括適于結(jié)合于結(jié)合的靶抗原的抗體。如果靶抗原存在于流體樣品中，固定的結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合于靶抗原上的一個(gè)位點(diǎn)，探針綴合物可以結(jié)合于靶抗原上的另一個(gè)位點(diǎn)。因此，流體樣品中靶抗原的存在導(dǎo)致了反應(yīng)室中結(jié)合的探針的量增加和檢測(cè)室中探針綴合物的量減少。
在另一種實(shí)施方案中，固定的結(jié)合位點(diǎn)包括靶抗原，探針綴合物包括適于結(jié)合于靶抗原的抗體。當(dāng)將樣品導(dǎo)入反應(yīng)室時(shí)，如果存在靶抗原，它將與探針綴合物結(jié)合。結(jié)果，流體樣品中靶抗原的存在導(dǎo)致反應(yīng)室中與固定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的探針綴合物的量減少，可以移動(dòng)到檢測(cè)室的未結(jié)合的探針綴合物的量增加?？梢酝ㄟ^檢測(cè)室中的電化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)結(jié)合的探針綴合物的減少和/或?qū)Y(jié)合的探針綴合物的減少進(jìn)行定量。相反，固定的結(jié)合位點(diǎn)可以包括抗體，探針綴合物可以包括靶抗原。流體樣品中靶抗原的存在將相似地導(dǎo)致反應(yīng)室中結(jié)合的探針綴合物的量減少。
一方面，固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物在反應(yīng)室中混合?；蛘?，固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物分開放置。例如，固定的結(jié)合位點(diǎn)可以位于干燥在反應(yīng)室表面的磁珠上。當(dāng)將液體樣品導(dǎo)入反應(yīng)室中時(shí)，可以用磁場(chǎng)保持磁珠和固定的結(jié)合位點(diǎn)不移動(dòng)到檢測(cè)室中。
在此處公開的另一種實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)流體樣品中的靶抗原的方法。該方法可以包括將樣品送遞到包括反應(yīng)室和檢測(cè)室的生物傳感器裝置的步驟。使樣品與固定的結(jié)合位點(diǎn)和位于反應(yīng)室中的探針綴合物反應(yīng)。然后將樣品轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室，該方法進(jìn)一步包括對(duì)檢測(cè)室中的探針綴合物進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)的步驟。檢測(cè)步驟使得用戶能夠基于在檢測(cè)室中檢測(cè)的探針綴合物水平確定樣品中是否存在靶抗原。該方法也可以包括基于從檢測(cè)室接受的電信號(hào)對(duì)樣品中的靶抗原進(jìn)行定量的步驟。
附圖簡述從以下詳細(xì)說明，結(jié)合附圖，可以更全面理解本發(fā)明，在附圖中

圖1是此處公開的生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案的頂視圖；圖2是圖1的生物傳感器沿著線A-A′的剖視圖；圖3是此處公開的生物傳感器的另一個(gè)實(shí)施方案的頂視圖；圖4A是圖3的生物傳感器沿著線A-A′的剖視圖；圖4B是圖3的生物傳感器沿著線B-B′的剖視圖；圖4C是圖3的生物傳感器沿著線C-C′的剖視圖；以及圖4D是圖3的生物傳感器沿著線D-D′的剖視圖。
發(fā)明詳述此處描述了生物傳感器裝置和使用方法。在一種實(shí)施方案中，傳感器包括反應(yīng)室和檢測(cè)室。結(jié)合于目的分析物或與目的分析物相關(guān)的種類的固定的結(jié)合位點(diǎn)位于反應(yīng)室內(nèi)。該室中還有可以在檢測(cè)室中檢測(cè)的探針種類，其可以與能夠結(jié)合于固定的結(jié)合位點(diǎn)的種類綴合，或可以結(jié)合于與固定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的種類。這在下文中稱作探針綴合物。探針綴合物和固定的結(jié)合位點(diǎn)使得樣品中目的分析物的存在改變了探針綴合物和固定的結(jié)合位點(diǎn)之間的相互作用。例如，當(dāng)存在時(shí)，分析物可以阻斷探針綴合物與固定的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合?；蛘?，分析物可以提供探針綴合物的結(jié)合位點(diǎn)，從而增加結(jié)合的探針綴合物的量。在任意一種實(shí)施方案中，分析物的存在改變了反應(yīng)室中結(jié)合的探針綴合物的量。
反應(yīng)室的排列可以是這樣的，其使得探針綴合物結(jié)合反應(yīng)發(fā)生到需要的程度后，將來自反應(yīng)室的液體轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室，與它一起轉(zhuǎn)移游離的探針綴合物，留下結(jié)合的探針綴合物。在檢測(cè)室中，可以檢測(cè)游離探針綴合物的量。例如，可以用檢測(cè)室中的電極對(duì)檢測(cè)室中探針綴合物的水平進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。如果靶分析物存在/不存在，可以確定電化學(xué)反應(yīng)，和/或基于檢測(cè)室中探針綴合物的量確定靶分析物的濃度。
圖1和2中舉例說明的生物傳感器20的第一種實(shí)施方案包括檢測(cè)室28和反應(yīng)室22，檢測(cè)室28包含電化學(xué)電池，反應(yīng)室22包含固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物?？梢酝ㄟ^形成延伸通過電阻間隔材料36的片材的孔而制備檢測(cè)室28和反應(yīng)室22?？梢詫?duì)孔成形，使得它限定反應(yīng)室22和檢測(cè)室28以及樣品室22、28之間的樣品通道38的側(cè)壁。通過將孔從反應(yīng)室22的近端24延伸到傳感器20的邊緣37，也形成的樣品入口25。在一種實(shí)施方案中，片材36的厚度限定了反應(yīng)室22和檢測(cè)室28的高度，并且室可以具有相等的高度。根據(jù)該實(shí)施方案，檢測(cè)室中的毛細(xì)作用力必須高于反應(yīng)室中的毛細(xì)作用力。這可以通過修飾反應(yīng)室和/或檢測(cè)室的表面或通過給檢測(cè)室添加諸如此處公開的填充材料而實(shí)現(xiàn)。
在另一種實(shí)施方案中，反應(yīng)室22的高度大于檢測(cè)室28的高度。例如，可以通過將多個(gè)內(nèi)部片材32、34、36和/或外部密封片材42、46層疊在一起而制備高度大于檢測(cè)室28的反應(yīng)室22。例如，在圖2中，傳感器20的中間片材36具有限定上述反應(yīng)室22和檢測(cè)室28的側(cè)壁的孔。中間片材36夾在一個(gè)或多個(gè)額外的層32、34之間，額外的層32和34具有僅僅相應(yīng)于反應(yīng)室22的孔。至于檢測(cè)室28，層32和34限定室的端壁60、62(即，頂面和底面)。在該實(shí)施方案中，檢測(cè)室的端壁60和62包含可以通過連接工具進(jìn)行電連接的電極54和52，以測(cè)量電路。電極在下文中更詳細(xì)地描述。
一方面，可以通過連接端66使電極52和54與儀表(未示出)連接。連接端使儀表(未示出)通過導(dǎo)電軌(未示出)與檢測(cè)室28中的電極52和54電連通。與連接區(qū)66連接的儀表能夠在檢測(cè)室28中的電極52和54之間施加電位，并且檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電信號(hào)。
在使用中，用戶首先通過樣品入口25將樣品導(dǎo)入傳感器的第一個(gè)室，即反應(yīng)室22?？梢栽诿?xì)作用或芯吸作用的影響下將樣品牽引到反應(yīng)室中。反應(yīng)室可以包括一個(gè)開放到大氣中的通氣孔26，使得由樣品排出的氣體可以逃逸。樣品將被牽引到第一個(gè)室中，直到填充到達(dá)反應(yīng)室通氣孔26，在此將停止填充。選擇反應(yīng)室22的體積，以便至少等于，優(yōu)選大于檢測(cè)室28的體積。
圖1中有陰影線的圓表示刺穿層32、34和/或36，但不刺穿層42和46的孔30。由于最初不刺穿層42和46，檢測(cè)室28的通向大氣的唯一開口是通過開放到反應(yīng)室22的通道38。因此，當(dāng)反應(yīng)室22填充了樣品時(shí)，空氣截留在反應(yīng)室28中，其基本上阻止填充樣品。在樣品首先接觸檢測(cè)室28的開口38和其接觸開口38的遠(yuǎn)側(cè)之間的時(shí)間中，小量樣品可以進(jìn)入檢測(cè)室28。但是，一旦樣品將開口38到達(dá)檢測(cè)室28之間完全潤濕，不再發(fā)生檢測(cè)室28的填充。
通氣孔56到大氣的開口使得截留在檢測(cè)室28中的空氣可以逃逸，從而使得檢測(cè)室28可以用來自反應(yīng)室22的反應(yīng)的樣品填充?？梢砸远喾N方式打開通氣孔56，例如，通過刺穿裝置的外層，通過去除裝置外層的一部分，和/或通過撕去裝置的一部分。
當(dāng)打開通氣孔時(shí)，由于與存在于反應(yīng)室22中的毛細(xì)作用力相比，檢測(cè)室28中的毛細(xì)作用力增加，反應(yīng)的樣品將被牽引進(jìn)入檢測(cè)室28。在一種實(shí)施方案中，通過合適地涂布檢測(cè)室28的表面，或更優(yōu)選地通過選擇檢測(cè)室28的毛細(xì)作用距離，使其小于反應(yīng)室22的該距離，提供增加的毛細(xì)作用力。在這種實(shí)施方案中，毛細(xì)作用距離定義為室的最小尺寸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，反應(yīng)和/或檢測(cè)室中的毛細(xì)作用力可以通過改變多種因素而產(chǎn)生。薄室中的毛細(xì)作用力討論于例如名稱為“防止毛細(xì)作用或芯吸作用填充裝置的取樣不足的方法”的美國專利.6,823,750，在此全文引入該文獻(xiàn)作為參考。
圖3-4D舉例說明了生物傳感器120的第二個(gè)示例的實(shí)施方案，其包括三個(gè)室。該免疫傳感器除了反應(yīng)室122和檢測(cè)室128外，還包括填充室107。傳感器120可以由上文所述的多層形成，包括，例如，密封層142、下層134、間隔層136，和上層132。一方面，每層包含絕緣材料，而上層和下層132、134額外包括如下文更詳細(xì)討論的導(dǎo)電膜。通過去除傳感器中不同點(diǎn)的層的部分，形成填充室107、反應(yīng)室122和檢測(cè)室128。此外，暴露上層和下層132、134上的部分導(dǎo)電膜，提供了用于進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)的電極152、154，并且提供了用于將傳感器與儀表電連接的電接觸區(qū)101、102、103。
填充室107從患者或用戶接受樣品，并且提供了用于填充其它兩個(gè)室的樣品儲(chǔ)存器。反應(yīng)室122和檢測(cè)室128與填充室107處于流體連通。為了輔助流體在各室間移動(dòng)，檢測(cè)室128可以包括最初關(guān)閉的通氣孔130。樣品在反應(yīng)室中反應(yīng)后，打開通氣孔130，這樣檢測(cè)室128中的空氣可以通過通氣孔出去，使得來自反應(yīng)室122的液體進(jìn)入檢測(cè)室。如上文針對(duì)通氣孔56的討論，通氣孔130可以以多種方式打開，包括刺穿裝置、去除外層和/或撕下裝置的一部分(即，沿著穿孔撕開)。
傳感器可以包括使得與下電極152電連接的電連接點(diǎn)101和使得與上電極154電連接的電連接點(diǎn)102、103。虛線106表示限定上層132上的上電極154的導(dǎo)電膜中的斷開處。該斷開處是通過在鋪展導(dǎo)電膜時(shí)對(duì)其定型，或通過在制造過程中建立斷開處而制成。該斷開處可以通過對(duì)膜進(jìn)行刮擦，將膜的部分刮掉，對(duì)膜進(jìn)行化學(xué)蝕刻，對(duì)膜進(jìn)行激光消融，或其它公知方法制成。導(dǎo)電膜中斷開處106的部分作用是通過使檢測(cè)室中的導(dǎo)電涂層與反應(yīng)室中的該涂層電絕緣而限定條帶的活性電極區(qū)。這是有利的，因?yàn)樗梢苑乐乖驹诜磻?yīng)室中的導(dǎo)電膜上流動(dòng)的電信號(hào)影響測(cè)試結(jié)果。
傳感器120也可以包括接觸點(diǎn)103，其使得用戶能夠電連接與反應(yīng)室122接觸的導(dǎo)電膜的一部分。當(dāng)反應(yīng)室122填充樣品時(shí)，監(jiān)測(cè)接觸點(diǎn)103，使得能夠檢測(cè)到信號(hào)，該信號(hào)指示給儀表，條帶成功填充并且可以開始測(cè)試順序。為了采用圖3-4D中示出的本發(fā)明的實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)該目的，可以在接觸點(diǎn)101與下導(dǎo)電膜進(jìn)行電連接，在接觸點(diǎn)103與反應(yīng)室中的上導(dǎo)電膜進(jìn)行電連接。然后可以在兩個(gè)連接點(diǎn)(101，103)之間施加電位，并且監(jiān)測(cè)電流、電壓和/或電阻，以便確定樣品何時(shí)進(jìn)入反應(yīng)室。該電位可以是直流電位或可以是隨時(shí)間改變的電位，如交流電位或具有交替極性的方波電位脈沖。通過監(jiān)測(cè)由于電位的施加而流動(dòng)的電流，或需要通過預(yù)定電流的電壓，我們可以獲得反應(yīng)室中的導(dǎo)電膜何時(shí)開始變濕的指示。
用于電接觸帶有下導(dǎo)電膜的下層134的連接區(qū)101可以通過將下層134延伸通過間隔層136和上層132而形成。接觸區(qū)102是通過去除層134和136的部分以暴露上層132的一部分而形成。接觸區(qū)103是通過如圖4D中所示去除下層134和間隔層136的一部分而類似地形成(圖3中的D-D′剖視)。
填充室107可以通過去除下層134和間隔層136的部分，但使上層132和密封層142保持完整而形成。密封層142可以粘附于層134的外表面，并且與層134和136以及層132中的切斷部分的側(cè)面一起形成能夠通過毛細(xì)作用將樣品牽引到其中的毛細(xì)管道。圖4A中舉例說明了該管道(圖3中的A-A′剖視)。
反應(yīng)室122是通過除去間隔層136的一部分，但使層134和132保持完整而形成的。這形成了毛細(xì)間隙，其中毛細(xì)間隙的高度小于填充室122的高度。這使得毛細(xì)作用力能夠通過毛細(xì)作用將液體從填充室122牽引到反應(yīng)室128中。反應(yīng)室的小高度可以允許在反應(yīng)室中相對(duì)迅速地混合各成分。一方面，反應(yīng)室122在條帶的側(cè)緣打開，使得能夠通氣，而液體填充反應(yīng)室。
檢測(cè)室是以與反應(yīng)室122相似的方式形成的，是通過去除間隔層136的一部分同時(shí)使層134和132保持完整而形成的。最初，檢測(cè)室128在一端開口到反應(yīng)室122，但沒有其它開口。
通過去除上層132(或下層134)的部分或?qū)⑵浯檀?，將通氣?30引入檢測(cè)室128。圖4B示出的層146(圖3中的B-B′剖視)可以層壓到條帶的上表面，以便拆開開口。或者，如果去除上層134的一部分，可以刺穿/去除密封層142，以打開通氣孔130。
當(dāng)液體樣品填充反應(yīng)室122(作為填充過程的一部分)時(shí)，它將渡過檢測(cè)室128的開口。因此，當(dāng)液體填充反應(yīng)室122，使得它流過檢測(cè)室128的開口時(shí)，空氣截留在檢測(cè)室128中，防止進(jìn)一步的液體進(jìn)入。這使得液體能夠保留在反應(yīng)室122中，而結(jié)合反應(yīng)能夠進(jìn)行。預(yù)定的時(shí)間后，當(dāng)反應(yīng)室122中可能存在的任何結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行到需要的程度時(shí)，通過刺穿工具刺穿(或去除/撕下)層142或146，使得空氣逃選出檢測(cè)室128，這樣液體從反應(yīng)室122轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室128。檢測(cè)室的橫斷尺寸使得毛細(xì)作用能夠填充反應(yīng)室。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，此處描述的免疫傳感器可以具有多種可選擇的構(gòu)型，例如，傳感器的形狀、室的數(shù)目、電極構(gòu)型和/或電接觸點(diǎn)的放置。例如，說明多種可選擇的傳感器實(shí)施方案的其它傳感器裝置公開于與本申請(qǐng)一起提交的名稱為“用于電化學(xué)分析的方法和設(shè)備”的美國申請(qǐng)中，在此全文引入該美國申請(qǐng)作為參考。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，盡管舉例說明的傳感器采用通氣孔來控制室間的液體流動(dòng)，也考慮其它的液體引導(dǎo)實(shí)施方案。例如，可以去除或打開反應(yīng)室和檢測(cè)室之間的物理屏障，使流體能夠在室之間流動(dòng)。此處描述的傳感器也可以包括泵元件，使流體通過裝置運(yùn)動(dòng)。
本發(fā)明的免疫傳感器包括上文描述的電極52、152和4、154。在某些實(shí)施方案中，可以使用除附圖中舉例說明的相對(duì)關(guān)系之外的電極構(gòu)型，例如，并列關(guān)系或錯(cuò)位關(guān)系。電極的大小可以是相同或基本相似的，或可以是不同的大小和/或不同的形狀。電極可以包含相同的導(dǎo)電材料或不同的材料。電極構(gòu)型、間隔和構(gòu)造或制作的其它變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
在一種實(shí)施方案中，電極以平行相對(duì)的關(guān)系安裝，距離小于或等于500、450、400、350、300、250或200微米，更優(yōu)選是大約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50微米-大約75、100、125、150或175微米。但是，在某些實(shí)施方案中，可能優(yōu)選的是電極間隔大于500微米，例如，600、700、800、900或1000微米，或甚至大于1、2、3、4或5毫米。
至少一個(gè)電極可以是傳感電極，即，在抗氧化情況下對(duì)還原的氧化還原劑的量敏感的電極，或在氧化劑情況下對(duì)氧化的氧化還原劑的量敏感。在電位測(cè)量傳感器的情況下(其中傳感電極的電位指示存在的分析物水平)，存在作為參比電極的第二電極，其提供參比電位。在電流測(cè)量傳感器的情況下(其中傳感電極的電流指示樣品中的分析物水平)，存在至少一個(gè)其它的電極，其作為對(duì)電極使電路完整。第二電極也可以作為參比電極?；蛘?，額外的電極(未示出)可以行使參比電極的功能。
一方面，限定電極52、152、54、154的導(dǎo)電膜可以通過粘合劑粘附于免疫傳感器的表面。合適的粘合劑包括，例如，熱活化的粘合劑、壓力敏感的粘合劑、熱固性的粘合劑、化學(xué)固性的粘合劑、熱融性粘合劑、熱流粘合劑等。在替代的方面，通過將用合適的導(dǎo)電材料涂布(如通過濺射涂布或絲網(wǎng)印刷)一片電阻材料而制備導(dǎo)電膜，所述導(dǎo)電材料例如鉑、鈀、碳、氧化銦；氧化錫、混合的氧化銦/氧化錫、金、銀、銥，其混合物等。適于用作電極的材料應(yīng)當(dāng)與傳感器20、120中存在的試劑相容。合適的電阻材料包括，例如，聚酯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烴，其混合物等。
用于免疫傳感器中的試劑，如固定的抗體/抗原、探針連接的抗原/抗體、緩沖液、介質(zhì)、酶底物等可以支持在反應(yīng)室22、122的壁上，或在包含在室內(nèi)的獨(dú)立支持物上、在基質(zhì)內(nèi)，或可以是自我支持的。如果試劑支持在室壁或電極上，可以通過采用本領(lǐng)域公知的印刷技術(shù)，如噴墨印刷、絲網(wǎng)印刷、平版印刷等施加化學(xué)物質(zhì)。在替代的實(shí)施方案中，將含有試劑的溶液施加到室內(nèi)的表面上，并且干燥。
在此處描述的免疫傳感器的另一種實(shí)施方案中，免疫種類和/或電化學(xué)試劑可以支持在一種或多種置于傳感器中的獨(dú)立支持物上，和/或包含在其中。合適的獨(dú)立支持物包括，但不限于，網(wǎng)孔材料、非編織的片材、纖維填料、大孔膜、燒結(jié)粉末，和/或珠子。獨(dú)立支持物的優(yōu)點(diǎn)包括表面積增加，這使得更多的固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物包含在反應(yīng)室22、122中。在一種實(shí)施方案中，將固定的抗體和/或探針綴合物干燥到支持材料上，然后將支持材料置于反應(yīng)室中?；蛘撸瑢⒐潭ǖ慕Y(jié)合位點(diǎn)或探針綴合物摻入支持材料上，將其它成分支持在反應(yīng)室壁上。在另一種實(shí)施方案中，反應(yīng)室壁是多孔的，其中摻入了固定的結(jié)合位點(diǎn)和/或探針綴合物。這是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的，即采用大孔膜形成反應(yīng)室壁，并且將膜敷在反應(yīng)室周圍以防止樣品滲漏到需要的區(qū)域外。
合適的獨(dú)立支持物包括諸如網(wǎng)孔材料、非編織片材和包括聚烯烴、聚酯、尼龍、纖維素、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、其混合物等的纖維填充材料的材料。合適的大孔膜可以由包括聚砜、聚偏二氟乙烯、尼龍、乙酸纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、其混合物等的聚合材料制備。
在一種實(shí)施方案中，固定的結(jié)合位點(diǎn)和/或探針綴合物支持在珠子上。所述珠子可以包含聚合材料，如瓊脂、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯，任選包裹了磁性材料(如γFe2O3和Fe3O4)。選擇珠子的材料，以便給抗體提供合適的支持。合適的珠子可以包括挪威的Dynal Biotech of Oslo以商標(biāo)DYNABEADS出售的那些。任選地，可以包含磁鐵，以便將磁珠保持在反應(yīng)室中，防止它們移動(dòng)到檢測(cè)室中。例如，固定的結(jié)合位點(diǎn)可以位于反應(yīng)室內(nèi)的磁珠上。
用傳感器確定抗原存在與否如上文的討論，傳感器20、120可以包括固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物。盡管以下說明是參照?qǐng)D2的傳感器作出的，它明顯地也適用于傳感器120。
在一種實(shí)施方案中，固定的結(jié)合位點(diǎn)44是要檢測(cè)的抗原的抗體，并且探針綴合物50是連接于要檢測(cè)的抗原的酶或要檢測(cè)的抗原的假抗原。
抗體44可以吸附或以其它方式固定在其上，使得它們?cè)跍y(cè)試過程中不離開反應(yīng)室。任選地，在將抗體44施加在反應(yīng)室的內(nèi)表面上之后，可以施加設(shè)計(jì)用于防止蛋白與該表面的非特異性結(jié)合的試劑(未示出)。本領(lǐng)域公知的所述試劑的實(shí)例是牛血清白蛋白(BSA)。也可以將非離子型表面活性劑用作所述試劑，如Rohm & Haas ofPhiladelphia，Pa.生產(chǎn)的TRITON X100或ICI Americas of Wilmington，Del生產(chǎn)的TWEEN。優(yōu)選地，選擇的非離子型表面活性劑不使蛋白變性。
與抗體間隔開的是探針綴合物50(酶連接的抗原)。用于探針綴合物50的合適的酶包括但不限于葡萄糖氧化酶和葡萄糖脫氫酶。酶連接的抗原50可以沉積在反應(yīng)室內(nèi)，沉積的方式是當(dāng)被樣品潤濕后它可以釋放到樣品中。例如，酶連接的抗原50可以在反應(yīng)室內(nèi)的表面上干燥，使得酶連接的抗原50和反應(yīng)室之間僅僅存在弱鍵。一方面，選擇酶連接的抗原50的溶解速度，使得在樣品填充反應(yīng)室的時(shí)間中探針綴合物溶解在樣品中。以此方式，酶連接的抗原50可以在填充后均勻分布在反應(yīng)室的區(qū)域中。
一方面，可以選擇酶連接的抗原50和抗體44的相對(duì)量，使得抗體44相對(duì)于酶連接的抗原50是過量的。一方面，過量限定為當(dāng)與樣品中要檢測(cè)的抗原分子的數(shù)目相比時(shí)，過量是小的。
這樣，當(dāng)樣品填充反應(yīng)室時(shí)，酶連接的抗原50與樣品混合。然后使酶連接的抗原50與抗體44接觸足夠的時(shí)間。由于存在過量的抗體44，如果樣品中不存在抗原，那么基本上所有的，或大部分酶連接的抗原50將結(jié)合于抗體44，因此有效固定。如果樣品中存在靶抗原，靶抗原將接觸并結(jié)合抗體44，阻斷至少一些酶連接的抗原50與抗體44的結(jié)合。因此，當(dāng)樣品中存在靶抗原時(shí)，在反應(yīng)步驟末，酶連接的抗原50(或至少其可測(cè)量的部分)將在樣品中保持可移動(dòng)，并且可以移動(dòng)到檢測(cè)室中。相反，如果樣品中不存在靶抗原，則酶連接的抗原50將固定在48反應(yīng)室中(或樣品中保持可移動(dòng)的量的至少可測(cè)量的減少)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，過量的抗體44不是必須的，或者，酶連接的抗原50和抗體44的相對(duì)量是相同的，或可以存在過量的酶連接的抗原50。
在第二種實(shí)施方案中，固定的結(jié)合位點(diǎn)44是可以結(jié)合于靶抗原上的位點(diǎn)的抗體，探針綴合物50包括與能夠結(jié)合于結(jié)合的靶抗原的抗體偶聯(lián)的酶。采用固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物的抗體的優(yōu)點(diǎn)是，靶結(jié)合試劑可以在制造條帶的過程中緊密混合并一起干燥。結(jié)合靶必須擴(kuò)散的距離可以更短，其可能縮短進(jìn)行測(cè)定所需要的時(shí)間。
當(dāng)樣品進(jìn)入反應(yīng)室時(shí)，反應(yīng)室中固定的結(jié)合位點(diǎn)可以結(jié)合于目的分析物上的一個(gè)位點(diǎn)。探針綴合物可以包括第二抗體，其與連接于固定的結(jié)合位點(diǎn)的靶抗原上的第二位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)含有目的分析物的樣品填充反應(yīng)室時(shí)，探針綴合物和固定的結(jié)合位點(diǎn)與樣品混合，目的分析物在一個(gè)位點(diǎn)與探針綴合物結(jié)合，在第二個(gè)位點(diǎn)與固定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。因此，分析物形成固定一部分探針綴合物的連接物，其中固定的部分可以用于檢測(cè)樣品中分析物的存在和/或?qū)ζ錆舛冗M(jìn)行定量。例如，可以通過觀察轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室中的游離探針綴合物的量的減少而對(duì)固定的探針綴合物的量進(jìn)行定量。
在另一實(shí)施方案中，固定的結(jié)合位點(diǎn)44可以是靶抗原，探針綴合物50可以包括與能夠結(jié)合目的分析物的抗體偶聯(lián)的酶。優(yōu)選地，固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物在反應(yīng)室中是分開放置的，以防止或減少在導(dǎo)入樣品前的任何反應(yīng)。
當(dāng)含有靶抗原的樣品填充反應(yīng)室時(shí)，樣品中的靶抗原可以結(jié)合探針綴合物(抗體)，減少結(jié)合于固定的結(jié)合位點(diǎn)(抗原)的探針綴合物的量。因此，靶抗原的存在與否改變反應(yīng)室中探針綴合物的量。固定的部分可以用于檢測(cè)樣品中分析物的存在和/或?qū)ζ錆舛冗M(jìn)行定量。例如，可以通過觀察轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室中的游離探針綴合物的量的減少而對(duì)固定的探針綴合物的量進(jìn)行定量。
一方面，固定的結(jié)合位點(diǎn)和/或探針綴合物結(jié)合于珠子。例如，固定的結(jié)合位點(diǎn)(抗原)可以位于干燥在反應(yīng)室的一個(gè)表面上的珠子上，并且探針綴合物(抗體)可以干燥在反應(yīng)室的另一個(gè)表面上。珠子可以是磁珠，以便通過磁場(chǎng)防止離開反應(yīng)室。當(dāng)樣品填充反應(yīng)室時(shí)，樣品中的抗原結(jié)合探針綴合物的抗體，并且防止固定的結(jié)合位點(diǎn)(抗原)結(jié)合探針綴合物，從而使探針綴合物保持游離，以便轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室中。
如上文所述，珠子可以具有使得當(dāng)樣品轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室時(shí)它們將保留在反應(yīng)室中的特征。例如，順磁珠可以沿施加的磁場(chǎng)的場(chǎng)力線排列，使它們被磁場(chǎng)維持，由此防止隨樣品轉(zhuǎn)移到檢測(cè)室?？梢酝ㄟ^諸如電磁鐵的任何合適的裝置施加磁場(chǎng)，或者，在替代的實(shí)施方案中，當(dāng)需要使電力消耗最少時(shí)，可以通過永磁鐵施加磁場(chǎng)。在一種實(shí)施方案中，可以以特定方式放置磁鐵，使它們與反應(yīng)室中探針綴合物的位置和反應(yīng)室中順磁珠的位置更近。采用這種排列，珠子在磁場(chǎng)的影響下將傾向于向探針綴合物移動(dòng)，并且與其混合。一旦珠子移動(dòng)到探針綴合物并與其混合，施加的磁場(chǎng)將傾向于防止珠子移動(dòng)到具有更低濃度的磁場(chǎng)線的位置，因此，珠子將通過磁場(chǎng)固定在反應(yīng)室中。
無論固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物的構(gòu)型如何，樣品在反應(yīng)室內(nèi)反應(yīng)后，反應(yīng)的樣品將移動(dòng)到檢測(cè)室。這可以在樣品導(dǎo)入反應(yīng)室后在預(yù)定的時(shí)間發(fā)生。例如，可以設(shè)定預(yù)定的時(shí)間，使得存在足夠的時(shí)間使基本上所有的探針綴合物發(fā)生結(jié)合。一方面，可以由用戶手工計(jì)算樣品在反應(yīng)室中的存留時(shí)間?；蛘?，可以通過與傳感器電接觸的儀表進(jìn)行電子計(jì)算。
在一種實(shí)施方案中，通過電極監(jiān)測(cè)樣品在反應(yīng)室中的存留時(shí)間。例如，在圖1和2的傳感器中，當(dāng)樣品填充反應(yīng)室22時(shí)，樣品將潤濕檢測(cè)室28的一小部分，即通向反應(yīng)室22的開口38處。電極52和54可以置于檢測(cè)室28中，使得在填充反應(yīng)室22的過程中電極52和54的每一個(gè)的至少一部分被樣品接觸，使得樣品的存在將聯(lián)通電極52和54，并且產(chǎn)生可以用于引發(fā)定時(shí)裝置的電信號(hào)。在另一種實(shí)施方案中，如圖3和4的傳感器所示，與下電極和接觸區(qū)101一起使用的分開的電接觸(接觸點(diǎn)103)可以檢測(cè)反應(yīng)室中樣品的存在。
在樣品進(jìn)入反應(yīng)室后的預(yù)定時(shí)間，認(rèn)為完成了測(cè)試的免疫反應(yīng)階段。然后，可以將通氣孔30、120開放到大氣。例如，可以用儀表中的螺線管活化的針頭刺穿覆蓋通氣孔的層。刺穿可以由儀表自動(dòng)進(jìn)行或由用戶手工進(jìn)行，例如，用戶將針頭插入通過覆蓋通氣孔的層。
任選放置于檢測(cè)室28、128中的是干燥的試劑64，其包含酶底物和介質(zhì)，能夠與探針綴合物的酶部分反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。如果存在酶底物和介質(zhì)，它們可以是足夠的量，以便通過存在的酶量確定與酶底物一起存在的任何酶的反應(yīng)速度。例如，如果酶是葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶，則將合適的酶介質(zhì)和酶底物，如葡萄糖(如果沒有存在于樣品中)置于反應(yīng)室28、128中。在一種替代的實(shí)施方案中，將足量的葡萄糖置于檢測(cè)室28、128中，使得進(jìn)入的樣品中葡萄糖水平的任何改變都不會(huì)顯著改變酶反應(yīng)速度。也可以引入緩沖液，以輔助調(diào)節(jié)檢測(cè)室28、128中樣品的pH。在一種實(shí)施方案中，鐵氰化物是合適的介質(zhì)。其它合適的介質(zhì)包括二氯靛酚和過渡金屬與含氮雜芳種類之間的復(fù)合物。此外，可以加入促進(jìn)電子更有效從酶轉(zhuǎn)移到鐵氰化物種類的第二介質(zhì)，如phenazine ethosulphate和/或2，3-二甲氧基-5-甲基-p-苯醌。酶底物、介質(zhì)、第二介質(zhì)和緩沖試劑64可以足量存在，使得酶與酶底物的反應(yīng)速度受到存在的酶濃度的限制。
當(dāng)填充檢測(cè)室28、128時(shí)，將試劑64溶解于樣品中。探針綴合物的酶成分與酶底物和介質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生還原的介質(zhì)。該還原的介質(zhì)在檢測(cè)室28、128中作為陽極的電極上電化學(xué)氧化，產(chǎn)生電流。在一種實(shí)施方案中，該電流隨時(shí)間改變的速度用作反應(yīng)的樣品中酶的存在和存在的酶量的指示物。如果電流的改變速度小于(或大于)預(yù)定的閾值，則表明反應(yīng)的樣品中不存在顯著量(或存在顯著量)的探針綴合物50，表明存在(或不存在)原始樣品中存在的抗原。相反，大于(或小于)預(yù)定閾值的電流改變速度可以用于表明樣品中缺乏(或存在)抗原。在一種實(shí)施方案中，電流的改變速度用于得出最初存在于樣品中的抗原的相對(duì)量的測(cè)量值。例如，電流的改變速度可以用于確定探針綴合物濃度，其可以與樣品中抗原的濃度相關(guān)聯(lián)。
用蜂毒肽作為探針在一種實(shí)施方案中，可以將包含抗原-蜂毒肽復(fù)合物的探針連接的抗原干燥在上文所述的反應(yīng)室壁上。檢測(cè)室可以包含介質(zhì)，該介質(zhì)包括脂質(zhì)體或脂質(zhì)泡中的鐵氰化物。如果抗原-蜂毒肽復(fù)合物到達(dá)脂質(zhì)體，它們將爆裂，并且釋放鐵氰化物。這導(dǎo)致信號(hào)的迅速放大，即，小量的游離抗原與抗原-蜂毒肽復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，并且導(dǎo)致高濃度的鐵氰化物。
將辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶用于電化學(xué)測(cè)定中常規(guī)ELISAs用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)作為量熱測(cè)定中的酶。但是，開發(fā)了使這兩種酶都能用于電化學(xué)測(cè)定的底物。在該實(shí)施方案中，Ap可以與磷酸對(duì)氨基苯酯一起使用，HRP可以與四硫富瓦烯一起使用。
以下非限定性的實(shí)施例說明了本發(fā)明的原則和實(shí)施。本發(fā)明范圍和精神內(nèi)的許多其它實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。
實(shí)施例進(jìn)行了對(duì)全血中的人C反應(yīng)蛋白的示例的免疫傳感器測(cè)定，其中采用包被了人C反應(yīng)蛋白的磁珠。
將C反應(yīng)蛋白(CRP)與1.5微米的羧化BioMag磁珠(Cat noBM570；Bangs Laboratories，Indianapolis In，USA)共價(jià)結(jié)合。用pH 5.2的50mM MES(嗎啉代乙磺酸(Sigma-Aldrich，St Louis，MO USA))緩沖液將21.9mg珠子(1ml)洗滌4次，這是通過用該緩沖液溫育，并且用磁鐵將珠子聚集在試管側(cè)面，2分鐘后用轉(zhuǎn)移移液管除去緩沖液。第4次洗滌后，將珠子懸浮在終體積0.34ml的50mM MES中。加入40ul100mg/ml EDAC(Sigma，St Louis，MO USA)，5分鐘后，加入溶于磷酸緩沖液(Hytest，Turku Finland)中的450ug CRP。在室溫下將珠子再溫育30分鐘。按照上文所述用磁鐵聚集珠子，以除去未結(jié)合的CRP。然后通過在含有20mM Tris(2-氨基-2-羥甲基)-1，3丙二醇)、0.15M氯化鈉pH 7.4(TBS)和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich，StLouis，MO USA)的緩沖液中溫育30分鐘而封閉珠子，然后通過磁聚集在相同的緩沖液中洗滌4次。將珠子儲(chǔ)存在含0.05％疊氮化鈉(Sigma-Aldrich，St Louis，MO USA)的TBS/BSA中。
葡萄糖脫氫酶/抗體綴合物根據(jù)O Sullivan等(Anal.Biochem.100 100-108 1979)描述的方法，用試劑MBS(M-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)完成葡萄糖脫氫酶(重組大腸桿菌酶；Kiikoman Corporation，Chiba，Japan)GDH和單克隆抗體4C28克隆C2(Hytest，Turku Finland)的綴合。
在該實(shí)施例中，MBS與GDH上的氨基反應(yīng)，并且純化MBS-GDH中間體。然后使SMCC-GDH復(fù)合物上的馬來酰亞胺基團(tuán)與抗體的鉸鏈區(qū)上的游離巰基反應(yīng)，所述游離巰基是通過與還原劑鹽酸半胱胺反應(yīng)而導(dǎo)入的。
1.IgG鉸鏈區(qū)二硫化物的還原37℃下用1ml溶液與6mg鹽酸半胱胺(Sigma-Adrich，St Louis，MO USA)一起溫育90分鐘，所述溶液含有溶于緩沖液中的2mg/mlMab C2，所述緩沖液含有0.1M磷酸鈉pH 7.4；0.15M NaCl和2.5mMEDTA(反應(yīng)緩沖液)。通過將混合物施加到在反應(yīng)緩沖液中平衡的脫鹽柱(PD-TO；Amerscham)，并且在相同的緩沖液中繼續(xù)洗脫而終止反應(yīng)。收集0.5毫升的級(jí)分，將含有大多數(shù)蛋白的三個(gè)級(jí)分合并。在合并后使該材料立即與馬來酰亞胺活化的酶反應(yīng)。假定1mg/ml抗體C2的溶液在280nm的吸光度是1.35，從而確定蛋白濃度。
2.酶的馬來酰亞胺活化在將2mg GDH溶于1.0ml反應(yīng)緩沖液的同時(shí)，加入50ul含有溶于DMSO的7.6mg/ml MBS(Pierce Rockford Ill USA)的溶液，并且37℃下溫育30分鐘。通過將混合物施加到在反應(yīng)緩沖液中平衡的脫鹽柱(PD-TO；Amerscham)，并且在相同的緩沖液中繼續(xù)洗脫而終止反應(yīng)。收集0.5毫升的級(jí)分，將含有大多數(shù)蛋白的三個(gè)級(jí)分合并。
3.抗體與酶的綴合以1mg Ab比0.9mg GDH的比例將還原的IgG和馬來酰亞胺反應(yīng)的GDH混合在一起，4℃下溫育過夜。通過以下步驟終止反應(yīng)加入6mg鹽酸半胱胺并且在室溫下再溫育15分鐘，然后將1.5ml等分物施加到分開的、用含有20mM Tris和0.15M氯化鈉pH 7.4(TBS)的緩沖液平衡的脫鹽柱，并且在相同的緩沖液中繼續(xù)洗脫。合并每個(gè)柱的含有最高濃度蛋白的三個(gè)0.5ml的級(jí)分。加入氯化鈣到1mM的終濃度，疊氮化鈉到0.1％的終濃度，PQQ到0.05mg/ml的終濃度。使用前在4℃儲(chǔ)存綴合物。
C反應(yīng)蛋白的常規(guī)免疫測(cè)定也通過常規(guī)酶免疫測(cè)定確定樣品中的CRP水平。所有溫育都是在室溫下進(jìn)行。
用溶于TBS緩沖液中的50ul 10ug/ml多克隆抗體C2包被Immulon 11微量滴定板的孔，在室溫下持續(xù)60分鐘。通過倒置和輕敲板子而除去未結(jié)合的抗體，然后用含有0.1％TWEFN 20(聚氧乙烯山梨聚糖一月桂酯；Sigma-Adrich，St Louis，MO USA)的200ul TBS緩沖液洗滌孔4次。
然后將50ul已知的標(biāo)準(zhǔn)物或通常在TBS/TWEEN中稀釋100-1000倍的含有未知量CRP的樣品加入每個(gè)孔，再溫育1小時(shí)。然后通過上文描述的洗滌過程除去未結(jié)合的抗原。隨后加入溶于TBS/TWEEN的50ul 220ng/ml的生物素化的C6抗體溶液，再溫育60分鐘。洗去未結(jié)合的第二抗體后，加入50ul neutravidin-辣根過氧化物酶的1/1000稀釋液(Pierce Rockford Ill USA)，使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行15分鐘。最后，洗滌除去未結(jié)合的酶后，通過加入ABTS底物(Pierce Rockford Ill USA)檢測(cè)結(jié)合的酶。
通過以下方法進(jìn)行抗體C6的生物素化。將2毫克單克隆抗體C6(Hytest，Turku Finland)溶于1ml 50mM重碳酸鈣，與29ul溶于二甲亞砜(Sigma)的生物素N羥基琥珀酰亞胺酯(Pierce)的1mg/ml溶液反應(yīng)。在偶然振蕩的條件下使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘。通過將混合物施加到在含有20mM Tris(2-氨基-2-羥甲基)-1，3丙二醇)、0.15M氯化鈉pH 7.4(TBS)的緩沖液中平衡的脫鹽柱(PD-10；Amerscham)，并且在相同的緩沖液中繼續(xù)洗脫而終止反應(yīng)。收集0.5毫升的級(jí)分，將含有大多數(shù)蛋白的三個(gè)級(jí)分合并。將材料在4℃儲(chǔ)存。假定1mg/ml C6溶液在280nm的吸光度是1.2，從而通過吸光度確定蛋白濃度。
傳感器條帶按照如下構(gòu)建傳感器條帶
1)電極由178um厚的Melinex組成，其上濺射涂布了一層金。金涂層的表面電阻是8-12ohms/sq。
2)用0.3mM 2-巰基乙磺酸的溶液涂布電極20秒，然后通過噴氣干燥。該程序使電極保持親水，并且減少空氣攜帶的烴和其它污染物導(dǎo)致的污垢。
3)用箔材處理將化學(xué)物質(zhì)(如上文描述的試劑)的條帶干燥到電極上。將箔材轉(zhuǎn)移通過固定的刀片，該刀片在工作電極的表面產(chǎn)生刻痕，并且輔助限定工作電極的區(qū)域。然后將該箔材轉(zhuǎn)移通過連接于注射泵的兩個(gè)鈍尖的不銹鋼移液針頭，使以下物質(zhì)沉積-電化學(xué)試劑(鐵氰化物、葡萄糖等)，使其覆蓋刻痕，和-位于刻痕另一側(cè)的抗體-酶綴合物，距離電化學(xué)試劑大約1-2mm。
4)用紅外線干燥器和熱空氣在50攝氏度干燥化學(xué)物質(zhì)條帶。
5)用旋轉(zhuǎn)壓切工具在間隔物中壓切出反應(yīng)室和檢測(cè)室形狀。
6)將間隔物層壓到電極上，層壓的方式使得抗體-酶綴合物位于反應(yīng)室中，電化學(xué)試劑位于檢測(cè)室中。
7)用凸/凹模具組將填充室沖壓到雙層中。
8)將結(jié)合于順磁珠的抗原梳刷到分開的電極膜上。
9)然后將具有順磁珠的電極鍵合到來自步驟(6)的雙層，其方式使得抗原-珠條帶與反應(yīng)室中的抗體-酶綴合物相對(duì)。
10)用凸/凹模具組將每個(gè)傳感器中的通風(fēng)孔沖壓到三層中。
11)用“魔力膠帶”(3M)覆蓋通風(fēng)孔和填充室的開口側(cè)。
12)使三層的箔材一體化(singulated)，以產(chǎn)生工作電極。
GDH的電化學(xué)檢測(cè)溶液中含有溶于緩沖液中的5mg/ml 2，3二甲氧基-5-甲基1，4-苯醌(Adrich，WI USA)、326mg/ml鐵氰化鉀、400mM葡萄糖，所述緩沖液含有0.26mg/ml檸康酸(Sigma)和13.3mg/ml檸康酸二鉀。
綴合物含有400ug/ml GDH的溶液在含有1mM氯化鈣、10mg/ml BSA、0.26mg/ml檸康酸、13.3mg/ml檸康酸二鉀和10mg/ml蔗糖的溶液中稀釋到100ug/ml。
磁珠溶液中含有5mg/ml CRP包被的珠子、100mg/ml蔗糖、1mM氯化鈣、0.26mg/ml檸康酸(Sigma)和13.3mg/ml檸康酸二鉀。
樣品制備將血細(xì)胞比容為42％，血漿濃度為1ug/ml CRP的正常肝素化全血用于以下實(shí)驗(yàn)。(CRP血液)。在100ul全血中加入10ul溶于磷酸緩沖液中的2.5mg/ml CRP溶液。在另一個(gè)100ul樣品中加入10ul磷酸緩沖液作為對(duì)照。
測(cè)試程序在填充室(圖3的107)中加入大約5ul血液。使血液流入填充室107和反應(yīng)室122，在接近檢測(cè)室128的入口時(shí)停止。血液使來自反應(yīng)室122壁的綴合物溶解并且與磁珠相互作用，所述磁珠由于反應(yīng)室122下的磁鐵的存在被牽引到反應(yīng)室底部。沒有添加CRP時(shí)，大多數(shù)綴合物將能夠結(jié)合磁珠。
溫育40秒后，刺穿圖3中的通氣孔130。這使血液與未結(jié)合的GDH綴合物一起流過刻痕線(106)進(jìn)入檢測(cè)室，在此開始了在檢測(cè)室中電極間流動(dòng)的電流的測(cè)量。在接下來的45秒中測(cè)量由檢測(cè)室中GDH的存在產(chǎn)生的電流。下面的結(jié)果是對(duì)照血液或含有250ug/ml CRP的血液的六次重復(fù)樣品。它們顯示了填充檢測(cè)室128后5秒和45秒時(shí)以μA表示的電流。5秒和45秒的電流差異用作樣品中CRP濃度的量度。
如上表中所示，在對(duì)照樣品和加入了250ug/ml CRP的樣品之間存在電流改變速度的顯著差異。這樣，免疫傳感器就能夠檢測(cè)樣品中CRP的存在。
基于上文描述的實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明不限于具體顯示和描述的內(nèi)容，而是由所附權(quán)利要求指出。在此特意全文引入在此引用的所有公開文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)作為參考。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)流體樣品中的靶分析物的生物傳感器，該裝置包含包含固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物的反應(yīng)室，其中探針綴合物包含適于結(jié)合于固定的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合配偶體；包含電極的檢測(cè)室，該電極用于對(duì)檢測(cè)室中的電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)；和反應(yīng)室和檢測(cè)室之間的流體通道，其中，流體樣品中靶分析物的存在或不存在導(dǎo)致反應(yīng)室中結(jié)合的探針綴合物的量改變，該改變可以用檢測(cè)室中的電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中固定的結(jié)合位點(diǎn)是抗原，并且結(jié)合配偶體是抗體。
3.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中固定的結(jié)合位點(diǎn)是抗體，并且結(jié)合配偶體是抗原。
4.權(quán)利要求1的生物傳感器，進(jìn)一步包含適于通過毛細(xì)作用進(jìn)行填充的填充室。
5.權(quán)利要求4的生物傳感器，其中反應(yīng)室的毛細(xì)作用尺寸小于填充室的毛細(xì)作用尺寸。
6.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中檢測(cè)室包含通氣孔。
7.權(quán)利要求6的生物傳感器，其中可以通過刺穿裝置的外層而打開通氣孔。
8.權(quán)利要求6的生物傳感器，其中可以通過去除裝置外層的一部分而打開通氣孔。
9.權(quán)利要求6的生物傳感器，其中可以通過沿著穿孔撕開而打開通氣孔。
10.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中反應(yīng)室包含通向大氣的開口。
11.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中固定的免疫結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物位于反應(yīng)室內(nèi)的不同表面上。
12.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中固定的結(jié)合位點(diǎn)位于至少一個(gè)磁珠上。
13.權(quán)利要求12的生物傳感器，其中至少一個(gè)磁珠干燥在反應(yīng)室的內(nèi)表面上。
14.權(quán)利要求12的生物傳感器，進(jìn)一步包含磁鐵。
15.權(quán)利要求14的生物傳感器，其中磁鐵的放置使得在將流體樣品導(dǎo)入反應(yīng)室后所述至少一個(gè)磁珠移動(dòng)，以便與探針綴合物緊密接觸。
16.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中探針綴合物包括酶。
17.權(quán)利要求16的生物傳感器，進(jìn)一步包括介質(zhì)和酶底物。
18.用于檢測(cè)流體樣品中的靶抗原的生物傳感器，該裝置包含包含包括抗體的至少一個(gè)固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物的反應(yīng)室，所述探針綴合物包括適于結(jié)合于結(jié)合的靶抗原的抗體；包含電極的檢測(cè)室，該電極用于對(duì)檢測(cè)室中的電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)；和反應(yīng)室和檢測(cè)室之間的流體通道，其中，流體樣品中靶抗原的存在導(dǎo)致反應(yīng)室中結(jié)合的探針綴合物的量減少，該減少可以用檢測(cè)室中的電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。
19.檢測(cè)流體樣品中的靶分析的方法，該方法包括以下步驟將樣品送遞到包含反應(yīng)室和檢測(cè)室的生物傳感器中；使反應(yīng)在反應(yīng)室中固定的結(jié)合位點(diǎn)和探針綴合物之間進(jìn)行；使樣品移動(dòng)到檢測(cè)室中，對(duì)探針綴合物的水平進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，其中樣品中靶分析物的存在導(dǎo)致反應(yīng)室中檢測(cè)到的探針綴合物的量增加或減少。
20.權(quán)利要求19的方法，其中固定的結(jié)合位點(diǎn)包括靶抗原，并且探針綴合物包括適于結(jié)合靶抗原的抗體。
21.權(quán)利要求19的方法，其中探針綴合物包括酶。
22.權(quán)利要求19的方法，其中樣品通過毛細(xì)作用從反應(yīng)室移動(dòng)到檢測(cè)室。
23.權(quán)利要求19的方法，其中移動(dòng)樣品的步驟包括打開通氣孔。
24.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括基于從檢測(cè)室接受的電信號(hào)對(duì)樣品中靶抗原的量進(jìn)行定量的步驟。
全文摘要
此處公開了用于檢測(cè)目的分析物的存在的方法和裝置。生物傳感器可以包含反應(yīng)室和電化學(xué)檢測(cè)室。反應(yīng)室可以包含至少一個(gè)固定的結(jié)合位點(diǎn)和適于結(jié)合靶分析物和固定的結(jié)合位點(diǎn)中至少一個(gè)的探針綴合物，而檢測(cè)室可以包含用于檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)的電極。如果存在靶分析物，流體樣品中的靶分析物導(dǎo)致反應(yīng)室中結(jié)合的探針綴合物的量增加，這可以在反應(yīng)室中進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/26GK1975421SQ200610149310
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月21日
發(fā)明者D·賴?yán)? A·霍奇斯, R·沙特利耶 申請(qǐng)人:生命掃描有限公司