專利名稱：一種豬圓環(huán)病毒2型遺傳標(biāo)記毒株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新毒株，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒2型遺傳標(biāo)記毒株及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。本病于1997年在加拿大首次證實(shí)，相繼歐、美、亞各洲許多國(guó)家均有本病發(fā)生的報(bào)道。我國(guó)豬群也普遍有本病流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成巨大危害(朗洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)等.斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征血清抗體檢測(cè).中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30(3)3-5.)，除PMWS外，豬皮炎與腎炎綜合征、增生性壞死性肺炎、豬呼吸道綜合征、繁殖障礙、先天性顫抖、胎兒心肌炎及腸炎等疾病也證實(shí)與PCV2感染有關(guān)。PCV2是一種圓形小顆粒病毒，直徑17nm，呈二十面體對(duì)稱，無(wú)囊膜，基因組由單股負(fù)鏈閉環(huán)DNA組成，含1767或1768堿基。基因組包括2個(gè)大的開放閱讀框架(ORFs)，ORF1基因編碼病毒復(fù)制酶(Replicase)，ORF2基因編碼病毒衣殼蛋白(Capsid)。病毒感染的致病性主要與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用有關(guān)，可導(dǎo)致全身性淋巴細(xì)胞壞死，引起淋巴細(xì)胞耗損和巨噬細(xì)胞減少，引發(fā)機(jī)體免疫抑制，增加對(duì)各種病原體的易感性。
目前，PCV2感染引起的PMWS及相關(guān)疾病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，病毒感染產(chǎn)生的免疫抑制能夠?qū)е卢F(xiàn)有疫苗免疫失敗，造成多種病原混感，并使疫病流行更加嚴(yán)重。采用疫苗免疫已成為控制PCV2相關(guān)疾病的關(guān)鍵，是減少經(jīng)濟(jì)損失的有效方法。采用疫苗免疫已成為控制PCV2相關(guān)疾病的關(guān)鍵，是減少經(jīng)濟(jì)損失的有效方法。由于該病毒在體外培養(yǎng)毒價(jià)低，給疫苗的研制造成一定困難。
對(duì)于構(gòu)建PCV2感染性分子克隆，目前主要采取兩種策略一是將病毒基因組克隆，再進(jìn)行雙基因組順式連接，在重組質(zhì)粒上形成一個(gè)完整的病毒基因組調(diào)控單元，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得感染性病毒；另一種是將病毒單基因組克隆到質(zhì)粒上，經(jīng)酶切及凝膠電泳回收，進(jìn)行自我環(huán)化形成模擬自然病毒基因組結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲取病毒。研究表明，上述兩種方法均能成功獲得感染性病毒。比較而言，前者可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好；后者因凝膠純化與自我環(huán)化等環(huán)節(jié)不易控制，使感染性分子克隆轉(zhuǎn)染率不高，可重復(fù)性不好。
最近，F(xiàn)enaux等(fenaux M，Opriessing T，Halbur PG，et al.Immunogenicity andpathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)and nonepathogenic PCV1 in weanling pigs[J].J Virol，2003，77(20)11232-11243.Fenaux M，Opriessing T，Halbur PG，et al.A chimeric porcine circovirus(PCV)with the immunogenic PCV type 2(PCV2)cloned into the genomic backbone of thenonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs[J].JVirol，2004，78(12)6297-6303；Fenaux M，Opriessnig T，Halbur PG，et al.Two amino acidmutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus(PCV2)enhanced PCV2replication in vitro and attenuated the virus in vivo[J].J Virol.2004，78(24)13440-6)報(bào)道了利用PCV1與PCV2基因組ORF2編碼衣殼蛋白區(qū)替換構(gòu)建了嵌合型分子克隆，豬體接種試驗(yàn)證明其致病性減弱，并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生PCV2衣殼蛋白抗體，可產(chǎn)生免疫保護(hù)效果，但病毒在體外培養(yǎng)的情況尚未見后續(xù)報(bào)道。本發(fā)明人也曾進(jìn)行過(guò)類似研究，然而構(gòu)建的嵌合型病毒在體外培養(yǎng)傳代未獲成功，這可能與兩種病毒基因編碼區(qū)替換后改變病毒復(fù)制酶的功能有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種帶有遺傳標(biāo)記的豬圓環(huán)病毒2型新毒株。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種帶有遺傳標(biāo)記的豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2)毒株，命名為PCV2/PE；保藏號(hào)是CGMCC No.1617；保藏地點(diǎn)是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期是2006年2月9日。
本發(fā)明以臨床PMWS病豬分離的PCV2野生型毒株為材料，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建病毒基因組感染性分子克隆，通過(guò)引物設(shè)計(jì)替換堿基的方式，通過(guò)引物設(shè)計(jì)替換堿基，在病毒基因組內(nèi)插入SalI制性內(nèi)切酶位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得帶有遺傳標(biāo)記的新毒株。
本發(fā)明在構(gòu)建病毒感染性分子克隆時(shí)，在基因組ORF1編碼區(qū)末端替換2個(gè)堿基，形成一個(gè)SalI限制性內(nèi)切酶切序列。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中未改變基因編碼閱讀框架和氨基酸序列，從而保證了重組病毒復(fù)制酶的功能和對(duì)細(xì)胞的感染性。由于本發(fā)明新毒株基因組內(nèi)插入一個(gè)SalI酶切位點(diǎn)，采用PCR與限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析法可將本發(fā)明毒株與野生型病毒相區(qū)分。
本發(fā)明所構(gòu)建的PCV2/PE毒株，細(xì)胞傳代初期不產(chǎn)生CPE，基本與野生型病毒感染細(xì)胞結(jié)果相似。隨著細(xì)胞培養(yǎng)傳代次數(shù)的遞增，病毒適應(yīng)性增強(qiáng)，PCV2/PE株的繁殖能力顯著提升。新毒株經(jīng)細(xì)胞連續(xù)傳60代，體外培養(yǎng)增殖性能穩(wěn)定，毒價(jià)可達(dá)106.6TCID50/ml，具備疫苗種毒的基本要求。第60代病毒培養(yǎng)物以5％接種量感染細(xì)胞陽(yáng)性率可達(dá)50％以上。當(dāng)病毒繁殖達(dá)到一定水平時(shí)，感染細(xì)胞出現(xiàn)肥大、變圓、折光性改變等現(xiàn)象。通過(guò)病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性傳代，能夠顯著提高病毒繁殖能力，大量病毒在細(xì)胞內(nèi)蓄積使宿主細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的病變。
采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)、免疫電鏡、核酸序列分析表明，在本發(fā)明病毒感染細(xì)胞中檢出病毒特異抗原，其抗原性、病毒形態(tài)學(xué)及基因序列與親本毒株一致。取本發(fā)明病毒培養(yǎng)物經(jīng)靜脈和滴鼻途徑接種35日齡抗體陰性仔豬4頭，接種后表現(xiàn)出體溫升高、進(jìn)行性消瘦、被毛粗糙及體表淋巴結(jié)腫脹癥狀，迫殺后多種臟器中均能檢測(cè)到病毒抗原與核酸。
將本發(fā)明PCV2/PE株作毒種，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝，獲得病毒培養(yǎng)物，病毒培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)甲醛滅活，與佐劑乳化即得滅活疫苗，疫苗免疫效力試驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的滅活疫苗具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)效力。
此外，利用本發(fā)明PCV2/PE毒株的病毒培養(yǎng)物采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)法可以準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)出樣品血清中PCV2抗體，為豬圓環(huán)病毒2型流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)提供了一種有效技術(shù)手段。
總之，本發(fā)明新毒株為豬圓環(huán)病毒2型的致病性、致病機(jī)理、疫苗免疫及分子診斷等研究開辟了一條新途徑。


圖1重組克隆質(zhì)粒酶切反應(yīng)鑒定。
泳道1單基因組+載體；泳道2雙基因組+載體；泳道3空載體；M為DNA標(biāo)樣。
圖2PCV2感染性分子克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞中病毒抗原的IPMA檢測(cè)。
a病毒感染細(xì)胞；b未感染細(xì)胞對(duì)照。
圖3PCR與限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析鑒別重組型與野生型PCV2。
泳道1重組型病毒PCR產(chǎn)物SalI酶切產(chǎn)生870bp和186bp兩條帶；泳道2野生型病毒PCR產(chǎn)物(1057bp)SalI酶切呈陰性；M為DMA標(biāo)樣。
圖4PCV2/PE毒株病毒粒子免疫復(fù)合物電鏡觀察。
圖5免疫組化法檢測(cè)試驗(yàn)感染豬淋巴結(jié)中病毒抗原。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明毒株的構(gòu)建1材料和方法1.1病毒、細(xì)胞、抗體、菌株及載體PCV2野生型毒株系從臨床表現(xiàn)為PMWS病豬分離獲得(劉長(zhǎng)明，張超范，危艷武等.豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株的培育和鑒定.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)會(huì)第六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集(濟(jì)南)，2005，p196-199.)PCV2陽(yáng)性豬血清(IPMA效價(jià)為3200倍)，用于病毒抗原檢測(cè)；基因克隆所用的大腸桿菌株(Top10)、載體(pUC19)及限制性內(nèi)切酶類購(gòu)自日本寶生物工程公司(Takara)；無(wú)豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)污染的豬腎傳代細(xì)胞系(PK15)由國(guó)外引進(jìn)，本室保存。
1.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 引物根據(jù)GenBank(AF201311)序列設(shè)計(jì)。PCV2-F5′-GTCGACTGTTCTGTAGCATTCTTCCA-3′，對(duì)應(yīng)序列為920～946；PCV2-R5′-GTCGACGGAGGAAGGGGGCCAGTT-3′，對(duì)應(yīng)序列為925～901。下劃線處斜體字母表示替換的堿基，構(gòu)成SalI酶切位點(diǎn)。病毒DNA提取按常規(guī)方法進(jìn)行(Liu CM，Ihara T，Nunoya T，et al.Development of an ELISA based on the baculovirus-expressedcapsid protein of porcine circovirus type 2 as antigen[J].J Vet Med Sci，2004，66(3)237-242.)，TaKaRa Ex Taq PCR試劑盒進(jìn)行病毒基因組擴(kuò)增，具體程序?yàn)轭A(yù)變性94℃ 2min，35個(gè)循環(huán)[94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5min]，延伸反應(yīng)72℃ 7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。
1.3病毒基因組克隆與測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)SalI酶切處理及凝膠電泳純化，插入到相同處理的質(zhì)粒載體pUC19 SalI酶切位點(diǎn)，方法見文獻(xiàn)(薩姆布魯克J，拉塞爾著DW(黃培堂等譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第3板，科學(xué)出版社，2002.)。373A型DNA序列儀測(cè)序(Perkin-Elmer試劑盒)，DNAsis軟件分析。
試驗(yàn)結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1.7kb，經(jīng)SalI酶切處理，克隆到pUC19載體。取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果一致，未發(fā)現(xiàn)堿基錯(cuò)配和缺失?；蚪M全長(zhǎng)1768個(gè)堿基組成，含ORF1和ORF2編碼區(qū)，序列與GenBank登錄的AF166528、NC002173、AF264843、AF027217、AF118897、AF364094和AF201897序列比較，ORF1區(qū)同源率為97.6％～99.8％，ORF2區(qū)為93.7％～98.6％，全基因組為96.2％～99.3％。
1.4感染性分子克隆的構(gòu)建 全長(zhǎng)基因組重組質(zhì)粒，先行ScaI完全酶切(pU19載體上單酶切位點(diǎn))，再進(jìn)行SalI部分酶切(插入基因組兩側(cè)酶切位點(diǎn))。凝膠電泳回收含單基因組的長(zhǎng)臂(3506bp)和另一含單基因組短臂(2689bp)，凝膠純化含病毒全長(zhǎng)基因組與載體長(zhǎng)臂和短臂的兩條泳帶，用T4連接酶連接獲得一個(gè)載體上順式連接2個(gè)病毒基因組，將兩者連接后獲得含雙基因組順式排列的重組質(zhì)粒(pUC/PCV2+)，酶切鑒定結(jié)果見圖1。
1.5重組質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 用純化的感染性分子克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000(Invitrogen)，按廠家說(shuō)明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃5％CO2培養(yǎng)72h后收獲病毒培養(yǎng)物，按10％接種量同步加入到新消化的細(xì)胞懸液中，37℃靜置培養(yǎng)24h形成單層，按Tischer方法進(jìn)行D-氨基葡萄糖處理(Tischer I，Peters D，Rasch R，et al.Replication of porcine circovirusinduction by glucosamine andcell cycle dependence[J].Arch Virol，1987，9639-57.)，病毒培養(yǎng)，經(jīng)3次凍融后繼代。
1.6標(biāo)記病毒的拯救 用含雙基因組重組質(zhì)粒(pUC/PCV2+)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，IPMA檢測(cè)病毒抗原。病毒感染的陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕紅色(圖2a)，未感染病毒細(xì)胞對(duì)照呈陰性反應(yīng)(圖2b)。陽(yáng)性細(xì)胞呈點(diǎn)式分布，主要聚中在細(xì)胞核區(qū)及細(xì)胞質(zhì)區(qū)。結(jié)果表明，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功獲得新毒株(命名PCV2/PE)，它與野毒株具有相同的抗原性。
1.7重組病毒的鑒定 采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)，進(jìn)行病毒感染細(xì)胞抗原和病毒含量測(cè)定，免疫電鏡法鑒定病毒形態(tài)學(xué)，具體方法見文獻(xiàn)(劉長(zhǎng)明，張超范，危艷武等.豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株的培育和鑒定.中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)會(huì)第六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集(濟(jì)南)，2005，p196-199；劉長(zhǎng)明，陸月華，張超范等.豬圓環(huán)病毒2型重組Cap蛋白在昆蟲桿狀病毒中的表達(dá).中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)會(huì)第六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集(濟(jì)南)，2005，p200-202.)。
1.8遺傳標(biāo)記毒株與野生型病毒核酸鑒別試驗(yàn)采用引物P1和P2分別對(duì)本發(fā)明人工構(gòu)建的毒株(PCV2/PE)和野生型毒株(PCV2/LG)基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)位于SalI酶切位點(diǎn)兩側(cè)，P15’-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3；P25’-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3。擴(kuò)增目的基因片斷長(zhǎng)為1057bp，PCR反應(yīng)條件同1.2。產(chǎn)物經(jīng)SalI酶切可獲得870bp和189bp兩個(gè)片斷；野生型病毒基因組無(wú)SalI酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物不變，野生型病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切反應(yīng)呈陰性，PCR產(chǎn)物不變(圖3)。由此可見，采用PCR方法可將本發(fā)明遺傳標(biāo)記毒株與野生型病毒相鑒別。
實(shí)施例2 用本發(fā)明毒株制備滅活疫苗用PCV2/PE毒株作毒種，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝，獲得病毒培養(yǎng)物，病毒含量達(dá)到1×106.0TCID50/ml以上。病毒培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)甲醛滅活，與優(yōu)質(zhì)佐劑乳化制備成滅活疫苗。按獸藥生物制品規(guī)程要求進(jìn)行了半成品與成品疫苗的檢驗(yàn)，用檢驗(yàn)合格制品進(jìn)行下述臨床試驗(yàn)。
實(shí)施例3 PCV2-IPMA抗體診斷試劑盒的制備及其使用方法。
取新消化的PK15細(xì)胞懸液，同步接種2.5％PCV2/PE病毒液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1、3、5、7、9、11奇數(shù)列(100μL/孔)，偶數(shù)列(2、4、6、8、10、12)為不接種病毒的健康對(duì)照細(xì)胞孔，培養(yǎng)板置37℃ 50mL/L CO2條件下培養(yǎng)48h～72h形成單層，取出后用PBS浸洗細(xì)胞孔1次，吹干后用33％丙酮-PBS液固定20min，干燥后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> PCV2-IPMA診斷試劑盒操作程序取上述方法制備的檢測(cè)反應(yīng)板置室溫預(yù)熱，用PBS浸洗1次，用0.1％明膠-PBS液按1∶25、1∶50、1∶100等2倍系列稀釋待檢豬血清，以PCV2陽(yáng)性和陰性血清作參照，每份稀釋的血清分別加入到1抗原孔和1個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔內(nèi)(100uL/孔)，置37℃濕盒孵育1.5h；PBS洗滌3次，加入1∶3000倍稀釋的SPA-HRP液(Zymed產(chǎn)品)，每孔50uL，置37℃濕盒孵育1h；PBS洗滌3次，加50uL/孔底物反應(yīng)液[3-氨基-9-乙基咪唑(AEC)為Sigma產(chǎn)品]，置室溫顯色30min，甩除底物液后用蒸餾水洗滌1次，干燥后用光學(xué)顯微鏡觀察判定結(jié)果。PCV2陽(yáng)性血清與病毒感染細(xì)胞孔染色呈棕紅色，與健康細(xì)胞對(duì)照孔應(yīng)無(wú)著色反應(yīng)者判為陽(yáng)性反應(yīng)；PCV2陰性血清與病毒感染孔和細(xì)胞對(duì)照孔均無(wú)著色反應(yīng)判為陰性，陽(yáng)、陰性對(duì)照血清均成立時(shí)判定結(jié)果有效。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明毒株感染細(xì)胞特性及病毒形態(tài)學(xué)鑒定將本發(fā)明構(gòu)建的PCV2/PE株感染PK15細(xì)胞(國(guó)外引進(jìn)，哈爾濱獸醫(yī)研究所保存)，連續(xù)細(xì)胞繼代60次。前50代基本未產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，但隨著病毒傳代次數(shù)的提升，如60代病毒培養(yǎng)物接種細(xì)胞與對(duì)照組對(duì)比，可觀察到輕微CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞肥大、變圓、折光性變化等。隨代次增加，病毒滴度逐步升高。第5、10、20、30、45和60代病毒培養(yǎng)物毒價(jià)測(cè)分別為102.5、102.7、103.5、104.7、105.5、106.6TCID50/ml。
取本發(fā)明病毒培養(yǎng)物進(jìn)行免疫電鏡鑒定，觀察到形態(tài)均一的病毒樣顆粒形成的復(fù)合物(圖4)，呈圓形顆粒，直徑約為17nm，與野生型病毒形態(tài)基本一致，未發(fā)現(xiàn)有外源病毒污染。
試驗(yàn)例2 本發(fā)明毒株感染動(dòng)物試驗(yàn)一、試驗(yàn)方法取第60代本發(fā)明病毒培養(yǎng)物(按照常規(guī)方法培養(yǎng))，經(jīng)靜脈和滴鼻途徑各1ml接種35日齡抗體陰性斷奶仔豬4頭，同設(shè)未接種對(duì)照豬2頭。隔離飼養(yǎng)，定期采血，測(cè)定體重、體溫變化，觀察臨床反應(yīng)情況。試驗(yàn)豬于接種病毒后35d迫殺，進(jìn)行病理檢查和PCR測(cè)定。
二、試驗(yàn)結(jié)果用PCV2/PE株培養(yǎng)物接種試驗(yàn)豬4頭，有2頭于接種后出現(xiàn)明顯的臨床反應(yīng)，表現(xiàn)為被毛粗糙，體表淋巴結(jié)腫大，生長(zhǎng)緩慢，皮膚丘疹等，一時(shí)體溫達(dá)41.3℃；其他試驗(yàn)豬反應(yīng)略輕。接種后35d迫殺解剖所見，試驗(yàn)組豬多種淋巴組織表現(xiàn)不同程度的腫大和充血，間質(zhì)性肺炎，腎點(diǎn)狀灰白病灶，盲腸瓣濾胞腫脹。免疫組化檢測(cè)表明，淋巴結(jié)濾胞區(qū)見有大量病毒抗原陽(yáng)性細(xì)胞(見圖5)。PCR檢測(cè)多種臟器均呈陽(yáng)性反應(yīng)，以腸淋、鼠蹊淋、頜下淋、扁桃體和脾臟病毒含量較多，心、肝、肺、腎和睪丸次之。接種后第1周起PCR檢出血清病毒血癥，第2周起IPMA檢出血清抗體。對(duì)照組豬試驗(yàn)期間未見異常，各種檢測(cè)呈陰性。
試驗(yàn)例3 本發(fā)明滅活疫苗的安全性和免疫保護(hù)效力試驗(yàn)安全性試驗(yàn)用實(shí)施例2所制備的PCV2/PE滅活疫苗，按不同劑量(0.5ml/頭、1ml/頭、2ml/頭、4ml/頭)肌肉接種25～30日齡試驗(yàn)仔豬各3頭，臨床觀察28天未見無(wú)異常反應(yīng)，證明疫苗制品對(duì)本動(dòng)物是安全的。
疫苗免疫效力試驗(yàn)用實(shí)施例2所制備的PCV2/PE滅活疫苗，采用0.5ml/頭、1ml/頭、2ml/頭三種劑量免疫25～30日齡日齡仔豬，每組3頭，設(shè)未接種疫苗對(duì)照豬3頭。所有疫苗免疫后21天抗體檢測(cè)全部轉(zhuǎn)陽(yáng)，用強(qiáng)毒攻擊后檢測(cè)病毒毒血癥，計(jì)算試驗(yàn)保護(hù)率結(jié)果為，0.5ml、1ml和2ml免疫組均獲得100％保護(hù)，對(duì)照組100％發(fā)病。
試驗(yàn)例4 PCV2抗體診斷試劑盒檢測(cè)血清樣品PCV2抗體試驗(yàn)將PCV2/PE病毒培養(yǎng)物稀釋液接種于新消化的PK15細(xì)胞懸液中(2×104)，按100μL/孔分注于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同設(shè)病毒未接種對(duì)照孔，置37℃50mL/L CO2條件下培養(yǎng)形成單層，用丙酮-PBS液固定，干燥后置-20℃保存。
IPMA操作程序PBS浸洗一次，用0.1％明膠-PBS液將待檢豬血清按1∶25等2倍系列稀釋，以PCV2陽(yáng)性或陰性血清作對(duì)照，每份稀釋的血清分別加入1個(gè)抗原孔和1個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔(100uL/孔)，置37℃濕盒孵育1.5h，PBS洗滌3次，加入稀釋的SPA-HRP液(50uL/孔)，置37℃濕盒孵育1h，PBS洗滌3次，加50uL/孔底物反應(yīng)液(AEC)，置室溫現(xiàn)色30min，甩除底物液，用蒸餾水洗滌1次，用光學(xué)顯微鏡觀察判定結(jié)果。
PCV2陽(yáng)性血清與病毒感染細(xì)胞孔染色呈棕紅色，而與健康細(xì)胞對(duì)照孔無(wú)著色反應(yīng)者判為陽(yáng)性反應(yīng)；PCV2陰性血清與病毒感染孔和細(xì)胞對(duì)照孔均無(wú)著色反應(yīng)判為陰性。
結(jié)果表明，用本發(fā)明PCV2-IPMA試劑盒檢測(cè)人工感染豬血清第1周抗體檢出率為50％，第2～5周抗體檢出率為100％，同設(shè)對(duì)照組豬血清樣品檢測(cè)均為陰性。用試劑盒對(duì)黑龍江、吉林、遼寧、河北、上海等地13個(gè)豬場(chǎng)520份血清進(jìn)行了PCV2抗體檢測(cè)，8/13豬場(chǎng)抗體陽(yáng)性率大于50％，抗體陽(yáng)性率分布在57.1％～100％。綜上所述，本發(fā)明PCV2-IPMA試劑盒為流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)提供了一種新的技術(shù)手段。
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2)毒株P(guān)CV2/PE，其保藏號(hào)是CGMCC No.1617。
2.權(quán)利要求1的PCV2/PE毒株在建立斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥動(dòng)物模型中的應(yīng)用，包括用所述的PCV2/PE毒株人工感染試驗(yàn)豬。
3.權(quán)利要求1的PCV2/PE毒株在制備預(yù)防豬圓環(huán)病毒2型疫苗中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體的診斷試劑盒，其特征是含有權(quán)利要求1的PCV2/PE毒株的病毒培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種帶有分子標(biāo)記的豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2)毒株P(guān)CV2/PE，保藏號(hào)是CGMCC No.1617，還涉及該毒株的應(yīng)用。本發(fā)明以臨床分離的豬圓環(huán)病毒2型為材料，利用PCR法擴(kuò)增病毒基因組，將2個(gè)基因組順式連接插入到質(zhì)粒載體中構(gòu)建感染性分子克隆，通過(guò)引物設(shè)計(jì)替換堿基，在病毒基因組內(nèi)插入SalI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得帶有遺傳標(biāo)記的新毒株。本發(fā)明毒株經(jīng)過(guò)細(xì)胞傳代培育，病毒的繁殖能力顯著提高，具備疫苗種毒的基本要求。本發(fā)明毒株具有特有的遺傳標(biāo)記，可與親本野生型病毒相鑒別，在建立動(dòng)物感染模型，探討豬圓環(huán)病毒的致病機(jī)理、分子診斷及疫苗免疫效力的評(píng)價(jià)等方面均有重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101089177SQ200610086918
公開日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2006年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月16日
發(fā)明者劉長(zhǎng)明, 危艷武, 張超范, 陸月華, 孔憲剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所