專利名稱：一種篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清的方法及其專用多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清的方法及其專用多肽。
背景技術：
細胞內(nèi)核糖核酸(RNA)與不同的蛋白質相結合形成不同類型的核糖核蛋白(RNP)。異質性細胞核糖核蛋白(hnRNP)是其中的一類。已發(fā)現(xiàn)真核細胞中的hnRNP有20余種，它們以字母順序命名為hnRNP A-U(Krecic AM and SwansonMS.hnRNP complexescomposition，structure，and function，Curr Opin CellBiol 1999；11363-371.Gorlach M，et al.The hnRNP proteins.Mol BiolRep1993；1873-78.)。hnRNP I是近年來發(fā)現(xiàn)的hnRNP家族新成員。hnRNP I由557個氨基酸組成，分子量為59.632kDa。在過去的幾十年中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種RNP在風濕性疾病中具有抗原性，是多種風濕性疾病自身免疫反應的靶抗原。1996年，Montecucco克隆了hnRNP I的cDNA，在大腸桿菌表達出了其編碼蛋白質，并純化到了分子量為60kDa的蛋白質。他們用ELISA和免疫印跡法檢測了101例結締組織病患者和40例正常人血清，發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化癥(SSc)患者的陽性率明顯高于其它疾病患者。他們由此得出結論，抗hnRNP I抗體升高對SSc患者具有特異性(Montecucco C，et al.Identification of autoantibodies to the I protein ofthe heterogenous nuclear ribonucleoprotein complex in patients withsystemic sclerosis.Arth Rheum 1996；391669-1676)。
臨床上結締組織病(包括SSc)的診斷除了臨床癥狀和體癥外，尚需實驗室的檢驗指標作輔助。目前與SSc有關的實驗室指標由ANA、抗UlRNP抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗I與IV型膠原抗體、抗板層素抗體、抗Ku抗體、抗Th抗體、抗Scl 70抗體和抗著絲點抗體等。但其中只有Scl70抗體對SSc有一定的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清的方法及其專用多肽。
本發(fā)明所提供的篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽，是具有序列表中序列1和/或序列2的氨基酸殘基序列的多肽。
序列表中的序列1由29個氨基酸組成，名稱為hnRNP I264-292；序列表中的序列2由21個氨基酸組成，名稱為hnRNP I441-461。
上述篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽可用于篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清。
在實際應用中，可以用hnRNP I264-292和/或hnRNP I441-461作為抗原，用ELISA方法檢測待測血清中的抗hnRNP I264-292和/或hnRNP I441-461的抗體水平。如果待測血清中的酶底物顯色反應的光密度值高于X+2SD，則待測血清為系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清；所述X+2SD中，X為正常人血清中的酶底物顯色反應的光密度平均值，2SD為正常人血清中的酶底物顯色反應的光密度值的二倍標準差。
為了提高篩查效果，所述正常人血清最好為50-60例。
本發(fā)明創(chuàng)造性地用選自hnRNP I的兩個多肽篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清，為系統(tǒng)性硬化癥的診斷提供了一個新的檢驗指標。實驗證實，抗hnRNP I264-292自身抗體和抗hnRNP I441-461自身抗體在系統(tǒng)性硬化癥患者診斷中的敏感性分別為47.6％和38％，特異性分別為93.4％和91％。本發(fā)明的篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽可用于系統(tǒng)性硬化癥的輔助診斷。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、hnRNP I264-292和hnRNP I441-461在SSc患者診斷中的敏感性和特異性1、篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽的獲得根據(jù)抗體識別的是抗原分子中的B細胞表位的原則，用相應的軟件(Wonderful生物信息學系統(tǒng)軟件和DNAStar-Protein生物分析軟件)對hnRNP I分子中的可能B細胞表位作了分析，發(fā)現(xiàn)hnRNP I氨基酸序列中的264-292(序列為NVKYNNDKSRDYTRPDLPSGDSQPSLDQT，名稱為hnRNP I264-292)和441-461(序列為QLPREGQEDQGLTKDYGNSPL，名稱為hnRNP I441-461)兩個肽段可能是B細胞表位。由美國GENEMEDSYN公司合成hnRNP I264-292和hnRNP I441-461。
2、確定正常人血清的抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體的正常值的上限以hnRNP I264-292和hnRNP I441-461為抗原，用ELISA方法分別檢測血清中的抗hnRNPI264-292和hnRNP I441-461自身抗體，具體方法如下1)包被用pH9.6的包被緩沖液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸餾水至1000ml，4℃保存)分別稀釋合成的hnRNP I264-292和hnRNP I441-461至2μg/ml。96孔酶標板每孔加入100μl。置濕盒中，4℃過夜。
2)洗滌棄去孔中的液體。用含0.05％Tween-20的PBS液(含0.05％Tween-20的PBS液的配制為NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KCl 0.2g，加蒸餾水至1000ml，pH7.4，再加Tween-20 0.5ml)洗滌酶標板3次。
3)加待測血清用含10％(V/V)小牛血清的PBS液(PBS液的配制為NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KCl 0.2g，加蒸餾水至1000ml，pH7.4)稀釋血清。每孔加100μl，設復孔。每板設2個空白對照孔，加入100μl含10％(V/V)小牛血清的PBS液(PBS液的配制為NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KCl 0.2g，加蒸餾水至1000ml，pH7.4)。37℃孵育2小時。棄去孔中的液體。酶標板洗滌3次。
4)加二抗辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG用含10％(V/V)小牛血清的PBS液(PBS液的配制為NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 29g，KCl 0.2g，加蒸餾水至1000ml，pH7.4)稀釋。每孔加入100μl。37℃孵育2小時。棄去孔中液體。酶標板洗滌3次。
5)加底物液底物為鄰苯二胺(OPD)。底物液須新配制。取40mgOPD，溶于磷酸鹽-檸檬酸緩沖液中(0.1mol/L檸檬酸24.3ml，0.2mol/L磷酸鹽(Na2HPO4·12H2O)25.7ml，加水50ml，pH5.0)。用前加入30％(V/V)H2O20.15ml。配后即用，每孔加入100μl。37℃濕盒孵育15分鐘。加入2mol/L H2SO425μl終止反應。
6)檢測用酶標儀在波長492mm的條件下測定光密度OD值。正常值上限經(jīng)測定54例正常人血清確定。
正常人血清(獻血員血清，滿足獻血條件)54例。用上述方法測得的OD值以單樣本K-S檢驗分析符合正態(tài)分布(P＞0.05)。計算OD值的平均值(X)及標準差(SD)。以X+2SD為正常值的上限(表1)。表1表明，正常人血清中抗hnRNPI264-292自身抗體的正常值的上限為0.427，正常人血清中抗hnRNP I441-461自身抗體的正常值的上限為0.387。
表1用ELISA法測定血清中抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體的正常值的上限

8、多種結締組織病患者血清抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體的陽性率比較按照步驟2的ELISA方法測定多種自身免疫性疾病患者血清抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體。兩者的OD值分別高于0.427和0.387為陽性(表2)。
表2各種結締組織病患者血清抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體的陽性率比較

注**，SSc與其它疾病的差異為P＜0.01*SSc與其它疾病的差異為P＜0.05在上述比較中，SSc的病例數(shù)為42，非SSc的病例數(shù)為223。把SSc和非SSc患者血清抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體陽性和陰性的患者數(shù)分別列于表3和表4。
表3血清抗hnRNP I264-292自身抗體陽性和陰性的SSc和非SSc患者數(shù)

表4血清抗hnRNP I441-461自身抗體陽性和陰性的SSc和非SSc患者數(shù)

按下列公式計算出抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體在SSc患者診斷中的敏感性和特異性敏感性＝(a/a+c)×100％特異性＝(d/b+d)×100％陽性預測值＝(a/a+b)×100％陰性預測值＝(d/c+d)×100％抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體在SSc患者中的敏感性和特異性結果如表5。
表5抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體在SSc患者中的敏感性和特異性

抗hnRNP I264-292和hnRNP I441-461自身抗體的相關性用卡方檢測，pearson’s R值為0.823，P＜0.001，表明兩者在統(tǒng)計學上顯著相關(表6)。

序列表<160>2<210>1<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Asn Val Lys Tyr Asn Asn Asp Lys Ser Arg Asp Tyr Thr Arg Pro Asp1 5 10 15Leu Pro Ser Gly Asp Ser Gln Pro Ser Leu Asp Gln Thr20 25<210>2<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Gln Leu Pro Arg Glu Gly Gln Glu Asp Gln Gly Leu Thr Lys Asp Tyr1 5 10 15Gly Asn Ser Pro Leu20
權利要求
1.篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽，是具有序列表中序列1和/或序列2的氨基酸殘基序列的多肽。
2.權利要求1所述的篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽在篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述應用中，以權利要求1所述的篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽作為抗原，用ELISA方法檢測待測血清中的抗所述篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽的抗體水平。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述抗體水平檢測中，如果待測血清中的酶底物顯色反應的光密度值高于X+2SD，則待測血清為系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清；所述X+2SD中，X為正常人血清中的酶底物顯色反應的光密度平均值，2SD為正常人血清中的酶底物顯色反應的光密度值的二倍標準差。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述正常人血清為50-60例。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清的方法及其專用多肽。本發(fā)明的篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清專用多肽，是具有序列表中序列1和/或序列2的氨基酸殘基序列的多肽。篩查系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清的方法，是用具有序列表中序列1和/或序列2的氨基酸殘基序列的多肽作為抗原，用ELISA方法檢測待測血清中的抗具有序列表中序列1和/或序列2的氨基酸殘基序列的多肽的抗體水平。如果待測血清中的酶底物顯色反應的光密度值高于X+2SD，則待測血清為系統(tǒng)性硬化癥疑似患者血清；所述X+2SD中，X為正常人血清中的酶底物顯色反應的光密度平均值，2SD為正常人血清中的酶底物顯色反應的光密度值的二倍標準差。
文檔編號G01N33/53GK1811432SQ200610001779
公開日2006年8月2日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權日2006年1月25日
發(fā)明者于孟學, 朱立平, 薛靜, 李永哲, 高楊, 趙智賢 申請人:中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院, 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所, 北京博奧生物芯片有限責任公司