專利名稱：涂布膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及往微孔膜(Membranen)涂布含有固體的反應(yīng)性薄膜(film)的方法，因此涉及生產(chǎn)的膜和含有它們的診斷單元。
定性或定量分析測定流體成分，特別是諸如血液之類的體液成分時常常采用所謂的縛載體試驗。在這些試驗中，試劑，特別是專門的檢測試劑和輔助試劑在適當(dāng)?shù)墓腆w載體層中被包埋或固定。這些層稱之檢測元件。讓該液體樣品與這些檢測元件接觸，測定相應(yīng)的分析物。一般而言，有目標(biāo)分析物，特別有顏色變化，這種顏色變化可以采用目視方法或使用儀器，通常采用反射光度法進(jìn)行分析時，該液體樣品與最初以干燥形式存在并被該樣品再溶解的這些試劑進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生一種信號，其信號可以采用光學(xué)方法或電化學(xué)方法進(jìn)行監(jiān)測。其它的檢測方法例如是以電化學(xué)方法和檢測電荷、電位或電流變化為基礎(chǔ)的方法。
與通常的實驗室試驗相反，由于這些檢測試劑最初是以干燥形式存在的，縛載體試驗通常也稱之“干化學(xué)試驗”。
干化學(xué)試驗的試驗元素或試驗載體通常呈測試條形式，它們基本上由塑料材料制成的伸長載體層組成，檢測元素固定在它們的上面作為試驗區(qū)域。然而，人們還知道設(shè)計成正方形或長方形干膠片的試驗載體。
一般而言，采用干化學(xué)測試條進(jìn)行血液中低分子分析物的光度檢測包括分離干涉光度測量的紅血球。
分析物檢測需要的酶通常位于耐水的不溶薄膜中，在該薄膜中由成膜劑構(gòu)成的疏水基質(zhì)含有全部或至少一些檢測試劑(即基本上酶和指示劑系統(tǒng))，樣品穿過這些試劑并且在這些試劑中進(jìn)行生色反應(yīng)。采用各種各樣的確定涂布法(例如刮刀涂布)在非吸收的機械穩(wěn)定的載體材料(例如像由雙酚A聚碳酸酯制成的Pokalon箔)上涂敷這些薄膜。
術(shù)語成膜劑表示能涂布成機械穩(wěn)定的耐水試劑層的聚合物(例如Propiofan，丙酸乙烯酯塑料分散體)。
此外，這些反應(yīng)性薄膜通常含有溶脹劑。溶脹劑是水溶性聚合物，它們充分地影響涂料軟膏的粘性，這會造成這些試劑在耐水層的疏水部分區(qū)域中細(xì)分散，并且促使樣品滲透到該層中(實例是海藻酸鹽、Keltrol、Gantrez、Eudragit等)。
添加填料(還稱之薄膜致孔劑)可能對“致孔度”，從而對分析物滲透到反應(yīng)性薄膜的能力有正影響(參見例如US 4 312 834)。填料是水不溶性的、非膨脹的、易潤濕的細(xì)無機或有機顆粒，它們不能使光光學(xué)散射或只是輕微光學(xué)散射，并且甚至能使相對大的分子(例如呈脂蛋白形式的脂類)，甚至細(xì)胞(例如紅血球)滲透到耐水薄膜中。填料實例是白堊、纖維素、硅藻土(Diatomeenerde)、Celatom、硅藻土(Kieselgur)、硅酸等。
在第一代的血糖測試條中(例如Boehringer Mannheim的“Hmoglukotest”20-800，還參見US 3 630 957)，除了檢測化學(xué)之外，反應(yīng)性薄膜僅含有成膜劑(Propiofan)和溶脹劑(海藻酸鹽)。在這些非常密實，即沒有致孔的耐擦薄膜的情況下，紅血球不能滲透到反應(yīng)性薄膜中，盡管特別諸如葡萄糖之類的血液低分子量成分實際上能穿透。因此，分開的血液分離是不必要的。打算測量血糖的血滴簡單地直接涂敷在測試條反應(yīng)性薄膜上。該血滴在反應(yīng)性薄膜上培育一分鐘后，擦去血液，再反應(yīng)一分鐘后，可以從前面已涂敷血液的這條同側(cè)讀出顯色時間作為分析物濃度的度量。
因此，第一次可能直接檢測全血中的葡萄糖。由于這些反應(yīng)性薄膜不含有任何填料，它們僅允許低分子量的易溶于水的分析物，例如葡萄糖緩慢滲透，并不能檢測大而疏水的分子(例如像膽固醇(CHOL)、HDL(高密度脂蛋白，即更高密度的脂蛋白)、三酸甘油酯(TG)、肌酸激酶(CK)等)。
在檢測全血分析物的干化學(xué)試驗的發(fā)展過程中，使用玻璃纖維毛分離紅血球(其中參見US 4 816 224)，特別是與含有填料的開孔反應(yīng)性薄膜一起使用(例如Roche Diagnostics的Reflotron生產(chǎn)線的測試條，以及后來Roche Diagnostics的Accutrend生產(chǎn)線的所謂“非擦拭試驗”)是一個里程碑。除了快得多的動力學(xué)之外，特別在該分析物滲透到檢測薄膜中、酶反應(yīng)以及顏色反應(yīng)方面，這些試驗上層結(jié)構(gòu)還能檢測相對大的疏水分子(例如CHOL、HDL、TG等)。
然而，玻璃纖維毛技術(shù)缺陷是可用血漿體積與使用血液體積的比(在下文中也稱之血液/血漿產(chǎn)率)相對不利。此外，在氧化性分析物檢測(即在指示劑存在下使用分析物氧化酶的分析物檢測和使用過氧化物酶生成過氧化氫的反應(yīng)中，該指示劑在這個過程中由(一般無色)還原形式變成(一般有色)氧化形式)的情況下，把氧供給反應(yīng)性薄膜被證明是有限的，特別是在所謂的堆疊結(jié)構(gòu)(分離紅血球的玻璃纖維毛和反應(yīng)性薄膜構(gòu)成堆疊復(fù)合材料；把該血樣涂敷到玻璃纖維毛上，它滲透玻璃纖維毛，同時紅血細(xì)胞與以這種方式生成的血清或血漿滲透到下面的反應(yīng)性薄膜層中，在那里進(jìn)行實際檢測和指示劑反應(yīng)，然后由與涂敷血液位置相反的堆疊復(fù)合材料一側(cè)可以觀察到這個反應(yīng))，因此只是可能在頂端獲得有限的測量范圍。
因此，為了減少血液體積，最近一代測試條使用血液分離膜(例如參見EP-A 0 654 659)或非常薄的單層或雙層薄膜(參見US 5 536 470和US 6 036 919)。這樣膜基系統(tǒng)的血液/血漿產(chǎn)率比在使用玻璃纖維技術(shù)的情況下有利得多。下面將闡明兩個膜基系統(tǒng)。
US 5 536 470公開了由薄膜層組成的試驗場。把全血樣品涂敷到該薄膜層的一面上。由沒有紅血球的相反面可以檢測出顯色反應(yīng)，而紅血球能從樣品涂敷面滲透到檢測面?？梢栽谕该鬏d體(例如箔)上或在膜上涂布這種薄膜層。因此，在US 5 536 470中公開的薄膜起到將血液(有色物)分離與檢測層結(jié)合起來的作用。高比例的顏料對于實現(xiàn)前一功能(血液(有色物質(zhì))分離)是必不可少的，即顏料含量是在這種情況下以該成膜糊劑的固體含量計至少30重量％。高成膜劑含量對于保證含有高比例顏料的這樣薄膜層的機械穩(wěn)定性也是必需的。顏料與成膜劑的重量比應(yīng)大致相同。如果可能，在這些薄膜層中應(yīng)該沒有惰性填料(即所謂的薄膜致孔劑)，或者如果有這些惰性填料，那么它們應(yīng)該僅僅非常少量(總固體含量的10％以下)地存在于該成膜糊劑中，因為否則不再保證該薄膜層的血液-分離性能。然而，由于成膜糊劑至多10％的低填料含量，US 5 536 470公開的薄膜致孔不足以能使大的疏水分析物(例如脂類)滲透。
在使用于透明箔上薄的雙層薄膜進(jìn)行葡萄糖檢測的情況下，第一層(即直接處在該箔上的層)是反應(yīng)性薄膜，除了酶-指示劑系統(tǒng)外，它含有成膜劑、溶脹劑和光學(xué)透明填料(例如Transpafill，Degussa的硅酸鋁鈉)。與濕化學(xué)光度計試驗類似，透明的第一層類似地構(gòu)成在其中進(jìn)行光度分析檢測的比色皿。貼在第一層上的第二層含有高比例的高折射顏料(例如二氧化鈦)，同時分配薄膜致孔劑或填料。把血液直接涂敷到第二層上，從試驗條的相對面通過在第一層中的透明載體箔進(jìn)行光度檢測。
光學(xué)不透明的、致孔少的第二層在這種情況下完成雙重功能。一方面，作為血液-分離薄膜，它阻止紅血球滲透到反應(yīng)第一層里，而另一方面，它光反射不讓通過第一層，防止紅血球的紅色從發(fā)光直到檢測面。
這樣一種體系與采用玻璃纖維毛分離紅血球相比的優(yōu)點是，檢測低分子分析物時需要的樣品體積少，而動力學(xué)快。
這種雙層結(jié)構(gòu)的缺陷是疏水大分子(例如脂蛋白、膽固醇、三酸甘油酯、HDL等)不能通過分離血液第二層擴散，因此不能在第一層進(jìn)行檢測。
因此，一個可選方案是使用血液分離膜。血液分離膜(即由全血得到血漿或血清的膜)是很不對稱的膜(通常聚醚或聚醚砜，例如Pall Co.的BTS-SP-300、Spectral Diagnostics的PrimeCareX或者SG)，即膜孔徑不均勻，而是有致孔和窄孔面。一般而言，把血液涂敷到膜的更多致孔面。該樣品物質(zhì)穿過其膜時，這些紅血球被阻止在錐形孔中(參見EP 0 654 659)。
干化學(xué)試驗條基本上使用兩種形式的血液分離膜。在所謂的單層結(jié)構(gòu)中，除了血液分離外，血液分離膜還實現(xiàn)檢測化學(xué)的載體功能。為了這一目的，使用含有含水指示劑和檢測系統(tǒng)的系統(tǒng)浸漬該膜(例如采用浴浸漬或縫式噴嘴計量)。
為了確保浸漬的干燥酶迅速溶解與該膜被樣品物質(zhì)迅速潤濕，通常把潤濕劑加到漫漬溶液中。
一層膜結(jié)構(gòu)的缺陷是這種膜在干燥狀態(tài)下為光學(xué)不透明的(空氣的折射率是約1.00；該膜的折射率是約1.35-1.38，即這些折射率之差是約0.35-0.38，因此該膜好像是不透明的)，但是，這種膜在濕的狀態(tài)下變得光學(xué)透明得多(水的折射率是約1.33，因此這些折射率之差僅僅約0.02-0.05)，從而在較低膜區(qū)中分離紅血球的固有顏色透過，影響光度測定結(jié)果。
往該浸漬溶液中添加白色顏料(例如二氧化鈦，折射率約2.55)可以減少或防止這種現(xiàn)象。由于光學(xué)不透明的白色顏料的粒度范圍是被反射光波長的一半(0.2-0.4μm)，所以它們在浸漬過程中可以進(jìn)入膜的孔(它的直徑典型地是0.2-10μm)中，從而使孔變得狹窄而使其堵塞，因此疏水大分子不可能或更難以進(jìn)入并通過膜。
因此，專門使用有血液分離膜的單層結(jié)構(gòu)檢測易于溶于水的小分析物(例如葡萄糖)。
雙層膜結(jié)構(gòu)可以避開單層結(jié)構(gòu)的許多問題。在這種情況下，另一種更窄孔的檢測膜吸收血液分離膜中的血漿(例如Pall公司的BiodyneA或Loprodyne＝0.2/0.45μm尼龍膜)，所述的膜與血液分離膜鄰近。在這種情況下，光學(xué)不透明的白色顏料不是必要的。而且，第二個膜中的檢測系統(tǒng)并不與血分離系統(tǒng)直接接觸，該系統(tǒng)特別在脂質(zhì)試驗方面能使用易溶解脂質(zhì)，還具有溶血作用的潤濕劑。
但是，雙層結(jié)構(gòu)的缺陷是復(fù)雜、昂貴的試驗配置。生產(chǎn)過程對機械測試條聯(lián)合裝置要求高，因為如果可能應(yīng)該保證無間隙地緊密接觸，以使血清或血漿可以由血液分離膜進(jìn)入檢測膜中。該系統(tǒng)的內(nèi)在缺陷是由于檢測膜孔較窄，試驗結(jié)構(gòu)潤濕緩慢，與單層結(jié)構(gòu)相比血液/血漿產(chǎn)率不利以及更慢的動力學(xué)。
因此，總之，現(xiàn)有技術(shù)方法的缺陷是含有高比例填料的開放檢測膜尤其對于檢測疏水大分子是必不可少的，但是僅僅這樣的開放檢測膜不能保證光學(xué)分析測試條將干擾血液組分分離(首先是紅血球、血紅蛋白)。相反地，合適的血液分離系統(tǒng)(薄膜、膜)能使疏水大分子滲透，即使完全，那么僅僅達(dá)到不充分的程度。基本上適合檢測疏水大分子的系統(tǒng)(例如玻璃纖維毛與開放檢測薄或兩層膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合)只是不充分地解決這個問題，因為它們生產(chǎn)復(fù)雜，易于干擾，其試驗性能不是最令人滿意的(需要大量的血、有限的測量上限或緩慢的反應(yīng)動力學(xué))。
本發(fā)明的目的是消除這些缺陷。特別地，本發(fā)明的目的是提供干化學(xué)試驗裝置(及其相應(yīng)的生產(chǎn)方法)，該裝置能從盡可能少量的全血中檢測生物樣品中作為脂蛋白配合物存在的疏水大分子，特別地脂類，其中將紅血球分離整合到該裝置中，達(dá)到檢測反應(yīng)的快速動力學(xué)。
通過本發(fā)明的主題達(dá)到該目的。
本發(fā)明涉及根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，涉及根據(jù)權(quán)利要求10所述的可以采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的微孔膜，根據(jù)權(quán)利要求11所述的使用在反應(yīng)性薄膜中含有相對高比例填料(以成膜劑計)的所述薄膜涂布的微孔膜，和根據(jù)權(quán)利要求16所述的含有本發(fā)明膜的診斷單元(Mittel)。本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方案是從屬權(quán)利要求的主題。
往微孔膜涂布含有固體的反應(yīng)性薄膜的本發(fā)明方法，其特征在于該膜首先進(jìn)行潤濕，然后把含有固體的反應(yīng)性薄膜涂敷在它仍是潮濕的膜上。
含有固體的反應(yīng)性薄膜是耐水的、不溶于水的薄膜，它們在成膜劑的疏水基體中含有所有或至少一些檢測試劑。除了實際的檢測化學(xué)，它通常含有酶、輔酶、介質(zhì)、指示劑或指示劑系統(tǒng)等，反應(yīng)性薄膜可以含有耐水成膜劑、膜致孔劑和任選地光阻擋顏料(后者用于降低光透明度)和本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它組分(潤濕劑、溶脹劑等)。
根據(jù)本發(fā)明，考慮無機或有機材料，特別地微粒材料作為薄膜致孔劑(也稱作填料)。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員本身知道這樣一些薄膜致孔劑。例如，如本文前面已經(jīng)提到的，不溶于水的、非膨脹的、易潤濕的細(xì)無機或有機顆粒是合適的，這些顆粒不散射光或只是輕微散射光，甚至能使較大的分子(例如呈脂蛋白形式的脂類)，甚至細(xì)胞(例如紅血球)迅速滲透到耐水薄膜中。填料的實例是白堊、纖維素、硅藻土(Diatorneenerde)、Celatom(硅藻土)、Kieselgur(硅藻土)、硅酸等。已證明Celatom和kieselgur特別適用于本發(fā)明的目的。
特別地，根據(jù)本發(fā)明，考慮能形成機械穩(wěn)定的、耐水的試劑層的有機聚合物作為成膜劑。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員本身知道這樣一些成膜劑。例如，如本文前面已經(jīng)提到的，丙酸乙烯酯-塑料-分散體，例如Propiofan、Eudragit(丙烯酸樹脂分散體)、Mowiol(一種聚乙烯醇)等是合適的。
根據(jù)本發(fā)明，把該反應(yīng)性薄膜涂布在微孔載體層上，這個微孔載體層也可以稱之微孔膜。特別地，全血用作樣品材料時，當(dāng)該膜具有血液分離性能時，即能將全血樣品中的有色成分(首先是紅血球、血紅蛋白)保留下來，因此得到全血的血漿和血清時是有利的。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員本身知道這樣一些膜。實例是聚醚或酸醚砜膜，它們優(yōu)選地是不對稱的。這些膜的實例是BTS SP 300(Pall)、Prime Care X或SG(Spectral Diagnostics)。
根據(jù)本發(fā)明，已證明有利的是在使用這種涂料膏涂布微孔膜形成反應(yīng)性薄膜之前使該微孔膜潤濕，并且在它還處于潮濕狀態(tài)時進(jìn)行這種涂布。特別有利的是在反應(yīng)性薄膜潤濕后，即如果可能在同一個處理步驟中直接涂布反應(yīng)性薄膜涂料。
如果把反應(yīng)性薄膜涂布到還沒有預(yù)潤濕的膜上，即涂布到干膜上，得到了涂布反應(yīng)性薄膜的血液分離膜，如所預(yù)期的，這些膜阻止了紅血球。涂到該膜上的反應(yīng)性薄膜充滿了血漿。原則上，可以觀察到取決于分析物量的彩色顯影。但是，分析血液樣品時，特別地如果該分析物是大分子或疏水分子(CHOL、TG、HDL等)時，涂有反應(yīng)性薄膜的干膜只是具有次最優(yōu)的結(jié)果。在這種情況下，這種反應(yīng)性薄膜中彩色顯影程度比預(yù)期的小得多。
但是，含有脂類的血漿直接涂布到這個反應(yīng)性薄膜上，即沒有利用該膜預(yù)先將血液從全血中分離出來，得到期望的彩色顯影。如果首先讓同樣的樣品通過干的涂布血液分離膜，盡管確保反應(yīng)性薄膜被血漿潤濕，但還是幾乎沒有色彩顯影。這個實驗發(fā)現(xiàn)得出，涂布含有填料的相對開放的薄膜會大大降低疏水大分子在該膜中的滲透性這個推測。
利用甘油三酸酯(TG-)試驗作為實例，可明確地表明即使膜是干涂的，也確保小的、易溶解的臨時生成的分析物中間體(例如甘油、H2O2)通過膜-反應(yīng)性薄膜復(fù)合材料的滲透性(即從上(直接在反應(yīng)性薄膜上)和從下(接觸反應(yīng)性薄膜前，把樣品涂敷到膜上并滲透這種膜)樣品涂布之間在顏色上沒有差別)。
此外，已觀察到在往吸收的非預(yù)濕潤的膜涂布含有填料和顏料的開放薄膜期間，亞穩(wěn)定的涂料膏開始分離。在涂布過程中，涂料膏的顏料和填料部分在刮刀間隙處富集。這樣造成涂層非常不均勻。
盡管已有可能通過減少涂料膏中顏料/填料的比例，往吸收的非預(yù)濕潤的膜上涂布更穩(wěn)定的涂料膏，從而得到更均勻的薄膜，但采用這種方法不利于分析物的滲透性，因為具有較低比例填料的薄膜致孔反而不高，因而分析物更不易滲透，大分析物或疏水分析物尤其不易滲透。
現(xiàn)在出乎意料地已發(fā)現(xiàn)，如果這些膜在潮濕狀態(tài)下進(jìn)行涂布，則可以往吸收的膜涂布含有固體的亞穩(wěn)定反應(yīng)性薄膜，而不會降低分析物的滲透性。
例如在一個處理步驟中首先讓這種膜通過水浴，接著使用刮刀或縫模，在該膜仍是潮濕的時把含有固體的膏涂布其上，這在技術(shù)上實施很有利。
除了增加反應(yīng)物的滲透性，一個積極的附加作用是薄膜涂布均勻得多，因為在涂布過程中，使用潮濕的膜時，含有固體的亞穩(wěn)定膏分離趨勢大大降低。更均勻的薄膜最終意味著改進(jìn)光度測定的精確度，從而濃度測定中變化系數(shù)也更低。
此外，在涂料膏中采用高比例的填料，這種方法可以用于涂布在一些膜上的致孔薄膜。
由于這種方法明顯減少了在涂布過程中反應(yīng)性薄膜組分滲透到一些膜中，這種方法因為血液分離(在膜中)和反應(yīng)性薄膜(在膜上)在空間上分開得更好，而在單層結(jié)構(gòu)中能使整體上促進(jìn)測試反應(yīng)的組分添加到反應(yīng)膜上(例如特殊的潤濕劑，它容易溶解脂蛋白與激活脂肪酶和酯酶)，同時不會由于血液分離膜中的潤濕劑而引起溶血作用。
優(yōu)選地，采用浴浸漬、開縫噴嘴浸漬或噴射方法潤濕這種膜。水或水溶液可以用于潤濕這種膜，它例如可以含有緩沖劑、潤濕劑(一般而言也稱之表面活性劑或洗滌劑)，改進(jìn)這種膜等的潤濕。
本發(fā)明的方法特別適合于涂布反應(yīng)性薄膜，其中薄膜致孔劑與成膜劑的質(zhì)量比是10∶1-1∶1。特別地，已證明薄膜致孔劑與成膜劑的質(zhì)量比5∶1-2∶1的薄膜是特別合適的。具有這樣一種質(zhì)量比的反應(yīng)性薄膜的特征在于相對大的開孔隙度，它有利于或允許疏水大分子再滲透到反應(yīng)性薄膜中。以前不可能生產(chǎn)這樣一些涂布均勻而致孔薄膜的膜。因此相應(yīng)地涂布微孔膜也是本發(fā)明的主題。
采用本身已知的方法，例如刮刀涂布、輥涂或縫模涂布，涂布這種反應(yīng)性薄膜。
除了本發(fā)明的涂布膜外，本發(fā)明的另一個主題是檢測體液成分的診斷單元，該單元包括涂有反應(yīng)性薄膜的膜。在這種背景中體液具體地是血液、血清、血漿、尿、唾液、汗等，其中血液是優(yōu)選的。待檢測成分典型地是體液中被檢測的分析物，特別是如CHOL、TG、HDL等之類的大分子和/或疏水分子，它們在血液中以脂蛋白配合物的形式存在，而且它們還包括果糖胺、肌酸激酶(CK)、谷氨酸草酸鹽轉(zhuǎn)移酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸鹽轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、淀粉酶、血紅蛋白、白蛋白。
本發(fā)明目的的優(yōu)點是本發(fā)明的方法首先能使有高含量填料(以成膜劑量計)的反應(yīng)性薄膜涂布在膜上，從而得到穩(wěn)定而均勻的開放薄膜。這些薄膜對于檢測全血中的大疏水分析物是特別有利的。這種膜實現(xiàn)了血液分離功能，即它阻止紅血球以及任選地血紅蛋白，因此血液顏色不會干擾采用光學(xué)方法進(jìn)行的后續(xù)分析物檢測。保證這種膜與檢測薄膜之間緊密接觸，因此達(dá)到血清/血漿迅速而基本上完全轉(zhuǎn)移到反應(yīng)性薄膜中。使用幾μl全血可以檢測其分析物。該涂布方法極其適合于自動過程，尤其適合于大面積生產(chǎn)涂布在一些膜上的反應(yīng)性薄膜，采用輥或帶方法同樣如此。
通過下述實施例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明。


圖1表示在含有不同甘油三酸酯含量(65、207、294、494和728mg/dl)的血液樣品存在下，包括“濕涂”膜的試驗條的動力學(xué)測定過程，該圖是以相對反射率(R以％計)與時間(t以s計)進(jìn)行繪制的。
圖2表示干涂(2)膜和濕涂(1)膜的在血液樣品中不同甘油三酸酯濃度(c，mg/dl)的相對反射率(R)，。
圖中的數(shù)字和縮寫具有下述含義1 濕涂布膜的測定曲線2 干涂布膜的測定曲線R 相對反射率t 時間c 濃度實施例1往血液分離膜涂布反應(yīng)性薄膜的方法和檢測全血中甘油三酸酯的相應(yīng)試驗裝置1.涂料膏的生產(chǎn)a.)Gantrez溶液往58.5g 85毫摩爾濃度的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中添加35.5g水。添加1.7g MgSO4后，分小份添加5.2g Gantrez S 97(甲基乙烯醚和馬來酸酐的共聚物，GAF Coproration化學(xué)部)，攪拌3小時直到Gantrez完全膨脹。之后添加4.5g 32％NaOH溶液，再攪拌30分鐘后，噴入0.6g PVP(聚乙烯吡咯烷酮25,000)，再攪拌20分鐘，直到它完全溶解。接著，用32％NaOH將膏制劑的pH調(diào)整到6.7-7.0。
b.)Symperonic溶液將1.3g Symperonic F68(聚氧化乙烯-共(co)-氧化丙烯，ICI)溶于5.3g水中，同時攪拌20分鐘。
c.)往a.)描述的Gantrez溶液中添加17.0g Propiofan 70 D(50％在水中丙酸乙烯酯聚合物分散體，去單體化，BASF，Ludwigshafen源)，攪拌30分鐘后在10分鐘內(nèi)添加26.5g Celatom MW 25(硅藻土Kieselgur，CHEMAG)，再攪拌20分鐘。之后往該制劑中添加6.6g b.)描述的Symperonic溶液，再攪拌10分鐘。
d.)Refloblau溶液在避光下將1.7g Refloblau(4-(4-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-(3，5-二甲氧基-4-羥基苯基)-咪唑二鹽酸化物，RocheDiagnostics)溶于23.3g 35℃溫水中，使用磁攪拌器攪拌15分鐘。
e.)二氧化鈦/Refloblau部分制劑在避光的時候首先添加22.5g 85毫摩爾濃度的磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，使用450rpm的溶解攪拌器在5分鐘內(nèi)噴入4.3g TiO2(RN 56，Kronos Titan)，之后再攪拌5分鐘。最后在5分鐘內(nèi)把在d.)制備的25gRefloblau溶液加到TiO2懸浮液中，再攪拌30分鐘。然后把該TiO2/Refloblau部分制劑儲存在電冰箱中直到使用，同時避光。
f.)ATP溶液將1.7g ATP(三磷酸腺苷；二鈉鹽)溶于3.3g水中。
g.)DONS溶液將1.3g DONS(磺基琥珀酸二辛基鈉)溶于5.3g丙酮中。
h.)MPSC溶液將0.03g MPSC(甲苯基氨基脲)溶于0.6g 1-甲氧基-2-丙醇中，同時避光。
i.)酶溶液將下述酶(以凍干物存在)相繼地溶于15.9g 85毫摩爾濃度磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)中，其中分別稱量的酶量取決于使用該批酶的比活性40千(Kilo)單位(約1.8g)甘油激酶(嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的EC 2.7.1.30；Roche Diagnostics，Cat.No.0 717398)34千單位(約2.4g)膽甾醇酯酶(柱狀假絲酵母的EC 3.1.1.13；RocheDiagnostics，Cat.No.0 129 046)28.9千單位(約0.12g)過氧化物酶(辣根的EC 1.11.1.7；RocheDiagnostics，Cat.No.0 121 606)27.8千單位(約0.44g)L-α-甘油磷酸酯氧化酶(EC 1.1.3.21；重組體，Roche Diagnostics，Cat.No.1 582 003).
j.)最終在攪拌下往來自c.)的Gantrez/Propiofan/Celatom的制劑里添加下述部分制劑來自g.)的6.6g DONS溶液來自f.)的5.0g ATP溶液來自e.)的51.8g TiO2/Refloblau懸浮液7.0g洗出TiO2的水/Refloblau溶液11.8g Celatom MW 25來自h.)的0.63g MPSC溶液來自i.)的20.66g酶溶液2.2g 85毫摩爾濃度磷酸鹽緩沖液洗出酶溶液。
添加各個部分溶液(Celatom例外)后，制劑攪拌5分鐘。在15分鐘內(nèi)以小部分地噴入Celatom，然后該制劑再攪拌20分鐘。
最后，全部制劑(約250g)在300g下離心20分鐘以脫氣，接著使用橡膠刷手動緩慢地使已離心沉淀的任何固體再懸浮。
然后，讓涂料膏通過140μm試驗篩，再次均化10分鐘，同時輕輕攪拌。
涂料膏具有表1列出的組成。
涂料膏的固體含量是29％。以全部固體含量計，成膜劑(Propiofan)的固體百分含量是12％。以全部固體含量計，薄膜致孔劑(Celatom)的固體百分含量是54％。薄膜致孔劑與成膜劑的比是4.5∶1。
2.往血液分離膜上涂布反應(yīng)性薄膜采用以下描述的方法，血液分離膜(BTS-SP-300型；物品編號No.955 00 12 0953，從Pall GmbH/63303 Dreieich獲得)涂布如在節(jié)1.)描述得到的涂料膏，生產(chǎn)反應(yīng)性薄膜。
a)首先把約1米長的一片膜(BTS-SP-300)拉過裝滿水的不銹鋼槽，然后用橡膠刷除去留在膜表面上過量的水。以進(jìn)料速度1.5m/min、刀距150μm將1.)的涂料膏刮涂到仍然潮的膜上。
接著以這種方式涂布的膜(下文中稱之“濕涂布膜”)在50℃干燥5分鐘。
最后，使用銑刀軸將這種膜切成4.0mm寬的細(xì)切輥。這些細(xì)切輥干燥保存直到再使用。
b)作為對比，第二片BTS-SP-300涂布相同的涂料膏，但沒有預(yù)先將膜拉過裝滿水的不銹鋼槽(下文中稱作“干涂布膜”)。
3.生產(chǎn)試驗條功能模型，測試全血中的TG在5mm寬、78mm長的載體箔(Melinex)上粘附使用雙面膠帶在兩面上涂布約200μm厚的聚酯箔(所謂的間隔層)，由此，預(yù)先借助于刻圖機(Schneidplotters)(ARISTO Graphic System；公司的Aristomat 1310型；22525 Hamburg)，以距離5.0mm將1.5mm寬、沿縱向通到后續(xù)試驗條的毛細(xì)管(毛細(xì)管長度35mm)切割，采用“輕觸裁斷(Kiss cut-Schnitt)”。將篩孔寬度250μm的5mm×25mm聚酯網(wǎng)(Sefar公司/CH-9410 Heiden的Petex 07-98/34型)粘到這個間隔片/毛細(xì)管層上，一方面形成毛細(xì)管的上邊界，另一方面保證樣品/血液從毛細(xì)管進(jìn)入疊加的分析物檢測區(qū)中。
Scrynell網(wǎng)以這樣一種方式排列在間隔層上，使得該網(wǎng)不會覆蓋第一根5mm毛細(xì)管，從而可以用作樣品涂敷區(qū)。
根據(jù)節(jié)2所述方法涂布反應(yīng)性薄膜并且利用兩個熱熔性粘合珠粘合在側(cè)面的血液分離膜，位于Scrynell網(wǎng)上(未涂布血液分離膜側(cè)朝下；反應(yīng)性薄膜朝上)。
試驗條功能模型的構(gòu)型可與EP申請No.04 023 734(申請日2004年10月5日)的實施例1和圖1所述的試驗條相比。
4.評定使用含有甘油三酸酯的血液樣品的功能模型把25μl血液涂布在試驗條功能模型上的樣品涂布區(qū)(Scrynell網(wǎng)前面的毛細(xì)區(qū))。使用反射光度計，采用帶LED的光學(xué)測量系統(tǒng)，在主波長660nm，以10秒間隔在3分鐘內(nèi)從上方(這種膜的反應(yīng)性薄膜側(cè))測定這種模型。
測定程序描述如下涂布樣品前，測量一次試驗條，同時隔絕環(huán)境光線，以得到各種未反應(yīng)的反應(yīng)性薄膜的反射率。為了接著在樣品物質(zhì)存在下的動力學(xué)測定，將以這種方式得到試驗條的“空白值”設(shè)定為100％相對反射率(R)。
涂布25μl血液后立刻開始動力學(xué)測定。以這種動力學(xué)方式得到的反射率除以各自的試驗條空白值，并以相對反射率(R，以％計)對測定時間繪圖。
圖1表示在不同甘油三酸酯含量(65、207、294、494和728mg/dl)的血液樣品存在下，以這種方式得到試驗條(含有“濕涂布”膜)的動力學(xué)測量過程，當(dāng)動力學(xué)測量的曲線時間過程表明反應(yīng)性薄膜的顏色形成在選擇的測定時間內(nèi)依賴于濃度達(dá)到反射率最小值(最大的色彩深度)時，在下面選擇該反射率最小值作為樣品中分析物濃度的度量。
下表2列出“濕涂布”和“干涂布”BTS-SP-300膜的相對反射率最小值(以％表示)，這些膜含有相同的反應(yīng)性薄膜，含有不同甘油三酸酯含量的血液樣品按照升序排列。
表2
如表2所示，含有“濕涂布”膜的功能模型比含有相同反應(yīng)性薄膜的“干涂布”膜，在全部測定范圍內(nèi)產(chǎn)生多得多的色彩(更低的反射率值)。
此外，這些測定值表明，在全部測定范圍內(nèi)達(dá)到的反射率范圍(即甘油三酸酯濃度65mg/dl和728mg/dl的相對反射率之差)，在38.6％REM的“濕涂布”膜比在24.1％REM的“干涂布”膜的大得多(還可參見圖2所示的曲線圖，其中1是濕涂布膜的測定曲線，2是干涂布膜的測定曲線)。
由于“濕涂布”膜的反射率范圍大得多，反射率測量與測量間的變化導(dǎo)致濃度變化低得多，從而功能模型的精度更高。
權(quán)利要求
1.往微孔膜上涂布含有固體的反應(yīng)性薄膜的方法，其特征在于首先潤濕該膜，且把含有固體的反應(yīng)性薄膜涂布到仍然潮濕的膜上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該膜分離血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于該反應(yīng)性薄膜含有成膜劑、薄膜致孔劑和任選地光學(xué)阻擋顏料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于薄膜致孔劑與成膜劑的質(zhì)量比是10∶1-1∶1。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于該反應(yīng)性薄膜在潤濕后直接涂布到膜上。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于采用浴浸漬潤濕該膜。
7.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于使用水或水溶液潤濕該膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于水或水溶液含有潤濕劑。
9.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于采用刮涂法或縫模涂布法涂布反應(yīng)性薄膜。
10.采用權(quán)利要求1-9中任一項權(quán)利要求所述方法可得到的涂布反應(yīng)性薄膜的微孔膜。
11.涂布反應(yīng)性薄膜并含有成膜劑和薄膜致孔劑的微孔膜，其特征在于薄膜致孔劑與成膜劑的質(zhì)量比是10∶1-1∶1。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的膜，其特征在于成膜劑是耐水的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的膜，其特征在于薄膜致孔劑是有機或無機顆粒材料。
14.根據(jù)權(quán)利要求11、12或13所述的膜，其特征在于該膜分離血液。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的膜，其特征在于薄膜致孔劑與成膜劑的質(zhì)量比是5∶1-2∶1。
16.檢測體液成分的診斷單元，它包括涂布根據(jù)權(quán)利要求10-15中任一項權(quán)利要求所述的反應(yīng)性薄膜的膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及往微孔膜上涂布含有固體的反應(yīng)性薄膜的方法，其中該膜首先進(jìn)行潤濕，然后將含有固體的反應(yīng)性薄膜涂布到依然潮濕的膜上。以這種方式生產(chǎn)的膜可以含有反應(yīng)性薄膜，它含有高比例的薄膜致孔劑，可以有利地用于檢測體液成分，尤其大疏水分析物的診斷單元中。
文檔編號G01N33/52GK101072625SQ200580041811
公開日2007年11月14日 申請日期2005年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日
發(fā)明者J·克萊普, D·曼戈爾德, R·勒克, T·費希爾, J·謝夫勒 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司