專利名稱：核酸分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在多孔支持物上使用的核酸擴增方法，此外還涉及使用該方法進行核酸提取、擴增和檢測的完整系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
近來，對DNA測試的需求正在提高。為了滿足這樣的需求，亟待開發(fā)簡單和緊湊的系統(tǒng)，借助這種系統(tǒng)可以連續(xù)地進行從樣本提取、擴增核酸并對這種擴增進行檢測。
對于酶和血液成分的生物化學(xué)分析，已經(jīng)開發(fā)了基于干燥化學(xué)(drychemistry)的簡單的固相測試系統(tǒng)(參見，例如專利文件1)。在這種系統(tǒng)中，在基質(zhì)中以干燥狀態(tài)提供反應(yīng)所必需的試劑，從而隨著添加的樣本的濕氣的應(yīng)用而發(fā)生反應(yīng)，所述濕氣充當(dāng)溶劑。在基于干燥化學(xué)的測試系統(tǒng)的情況中，僅通過將微量的樣本點到固相上就可以容易地測量目標(biāo)成分。因而，由于這種系統(tǒng)具有實際應(yīng)用價值，已被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域。
然而，為了將上述干燥化學(xué)系統(tǒng)應(yīng)用于核酸測試，需要克服一些障礙。首先，核酸提取、擴增和檢測已經(jīng)通過不同的系統(tǒng)方便地進行了。因而，難以將這些系統(tǒng)整合到單個系統(tǒng)中。特別是，復(fù)雜的高溫循環(huán)對于通過PCR等進行的核酸擴增是必需的。此外，試劑例如模板核酸、酶、底物和引物必需高度自由地加入反應(yīng)系統(tǒng)。因而，總的來說固相反應(yīng)系統(tǒng)不適合于核酸測試。
同時，也有一些涉及下述方法的報道，其中可使核酸吸附到由無紡布、濾紙、羥磷灰石等制成的過濾物上，通過LAMP法擴增(參見專利文件2和3)。根據(jù)這種方法使核酸吸附到固相支持物上并向其添加LAMP反應(yīng)溶液來進行核酸擴增。
LAMP法是由本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)的核酸擴增方法，它不需要PCR所必需的復(fù)雜的溫度控制。因而，可以以很高的擴增效率合成具有特別的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的長鏈擴增產(chǎn)物(由相同鏈上間隔地反向的重復(fù)組成)(參見，非專利文件1和專利文件4)。本發(fā)明的發(fā)明人還報道了在親水性基質(zhì)上檢測核酸擴增的方法，包括使核酸沉淀劑與LAMP擴增產(chǎn)物結(jié)合(參見專利文件5)。然而，這種方法的目的是解決關(guān)于雜交分析時B/F分離的難題。因此，這種方法不是為了建立一種系統(tǒng)，借助這種系統(tǒng)能夠在固相上連續(xù)地進行核酸提取、擴增和檢測。
JP Patent Publication(Kokai)No.5-80049 A(1993)[專利文件2]JP Patent Publication(Kokai)No.2004-201607 A[專利文件3]WO03/6650[專利文件4]WO00/28082[專利文件5]日本專利公開(Kokai)No.2004-141159 A[非專利文件1]Tsugunori Notomi et al.，″Loop-mediatedisothermal amplification of DNA，″Nucleic Acids Res.，vol.28，No.12e63，(2000)發(fā)明內(nèi)容在過去的研究中，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)建立了一種技術(shù)，其中在固相上進行樣本的核酸提取，使得目標(biāo)核酸被引入到固相上。本發(fā)明人還建立了一種方法，其中將LAMP產(chǎn)物-聚乙烯亞胺(ポリエチレンイミン)(PEI)復(fù)合物提供到固相上從而進行序列特異性檢測。因而，如果有可能在固相上發(fā)生LAMP反應(yīng)，提取、擴增和檢測的所有步驟都可以在固相上進行，由此可以構(gòu)建用于核酸分析的完整系統(tǒng)。
具體而言，本發(fā)明的目的是構(gòu)建用于核酸分析的完整系統(tǒng)，由此使提取、擴增和檢測核酸的步驟都能夠在固相支持物上進行。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證實了通過加熱已經(jīng)施加了微量LAMP反應(yīng)溶液的一小片濾紙到預(yù)定溫度，即發(fā)生LAMP反應(yīng)。進一步的，證實了通過將LAMP反應(yīng)溶液分為幾個成分，將這些成分施加到多片濾紙上，將這些紙片相互重疊，即發(fā)生LAMP反應(yīng)。根據(jù)這些結(jié)果，他們進行了關(guān)于完整系統(tǒng)的模型實驗，所述完整系統(tǒng)組合了固相提取方法、固相LAMP反應(yīng)和固相PEI檢測。從而，成功地檢測了目標(biāo)核酸。由此完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明涉及核酸分析方法，包括向多孔支持物添加含核酸的樣本，所述多孔支持物預(yù)先含有用于核酸擴增的試劑，然后進行目標(biāo)核酸的擴增。
根據(jù)如上所述的方法，有可能在上述多孔支持物上連續(xù)地進行自含核酸樣本的核酸提取、目標(biāo)核酸的核酸擴增反應(yīng)、以及檢測核酸擴增反應(yīng)或其產(chǎn)物。
在這種情況下，在初始階段，多孔支持物可以進一步含有用于核酸提取的試劑和用于核酸檢測的試劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法是核酸分析方法，包括在由兩個或多個層構(gòu)成的多孔支持物上進行以下步驟1)使用含有用于核酸提取的試劑的多孔支持物層提取核酸；2)使用含有用于核酸擴增的試劑的多孔支持物層進行目標(biāo)核酸的核酸擴增反應(yīng)；以及3)使核酸探針與核酸擴增反應(yīng)的產(chǎn)物雜交，使核酸沉淀劑作用于已經(jīng)產(chǎn)生的雜交物以形成凝集物，使用獲得的凝集物檢測樣本中的目標(biāo)核酸。
根據(jù)如上所述的方法，在初始階段，所述多孔支持物可以含有核酸沉淀劑和/或核酸探針。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述多孔支持物可以由兩個或多個多孔支持物構(gòu)成，所述多孔支持物在初始階段含有用于核酸擴增的試劑、用于核酸提取的試劑和/或用于核酸檢測的試劑。
在一個實施方案中，用于核酸擴增的試劑可以分別保持在兩個或多個多孔支持物內(nèi)，在進行擴增時，使這些多孔支持物相互接觸。例如，引物和其他用于核酸擴增的試劑可以分別保持在不同的多孔支持物中。同樣，聚合酶和其他用于核酸擴增的試劑可以分別保持在不同的多孔支持物中。或可選擇地將聚合酶、引物和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物中。在上述方法中，優(yōu)選將聚合酶以干燥的狀態(tài)保持在所述多孔支持物內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述核酸擴增反應(yīng)優(yōu)選LAMP反應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使用的多孔支持物由選自濾紙、尼龍膜、纖維素酯、纖維素、無紡物、紡織品、棉花、聚氨基甲酸酯和燒結(jié)塑料的至少一種材料制成。
此外，可以使用的核酸沉淀劑是選自羥磷灰石、聚乙烯亞胺、硫酸魚精蛋白、聚-L-賴氨酸和二乙氨乙基葡聚糖的至少一種。
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于連續(xù)進行核酸提取、擴增和檢測的核酸分析系統(tǒng)，這種系統(tǒng)至少包括一個多孔支持物，所述多孔支持物在初始階段含有用于核酸擴增的試劑、用于核酸提取的試劑和/或用于核酸檢測的試劑。
在所述多孔支持物所含有的試劑的實例包括，但不限于i)引物或標(biāo)記的引物；ii)核酸探針或標(biāo)記的探針；iii)核酸沉淀劑；iv)DNA聚合酶；和v)用作DNA聚合酶的底物的核苷酸或標(biāo)記核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠連續(xù)進行核酸提取、擴增和檢測的固相系統(tǒng)。本發(fā)明的系統(tǒng)可以在臨床實踐或?qū)嶒炇抑袑崿F(xiàn)簡單的DNA分析或DNA測試，作為相對于干燥化學(xué)的核酸分析的應(yīng)用實例。
附圖的簡要說明附

圖1顯示了濾紙上的LAMP反應(yīng)的示意圖。
附圖2顯示了濾紙上的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(CK20鈣熒光素?zé)晒鈾z測)。
附圖3(A)和3(B)顯示了濾紙上的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(PSA鈣熒光素?zé)晒鈾z測)。附圖3(A)顯示了濾紙上的鈣熒光素?zé)晒獾哪繙y檢測的結(jié)果(1和2濾紙方法(陰性)；3和4濾紙方法(陽性)；5溶液方法(陰性)；和6溶液方法(陽性))。附圖3(B)顯示了濾紙上的擴增反應(yīng)溶液的3％瓊脂糖電泳分析的結(jié)果(1和2濾紙方法(陰性)；3和4濾紙方法(陽性)；5溶液方法(陰性)；和6溶液方法(陽性))。
附圖4(A)和4(B)顯示了基于兩片法和Bst濾紙方法的組合、在濾紙上的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(PSA鈣熒光素?zé)晒鈾z測)。附圖4(A)顯示了濾紙上的鈣熒光素?zé)晒獾哪繙y檢測的結(jié)果(上段濾紙方法；下段溶液方法)。在上段和下段中，最左側(cè)的兩個條帶來自相互重疊的無Bst的濾紙片，最右側(cè)的兩個條帶來自相互重疊的含有Bst的濾紙片。附圖3(B)顯示了使用擴增反應(yīng)溶液的3％瓊脂糖電泳的結(jié)果(1和2濾紙方法(陰性)；3和4濾紙方法(陽性)；5溶液方法(陰性)；和6溶液方法(陽性))。
附圖5(A)和5(B)顯示了基于兩片法和引物濾紙方法的組合、在濾紙上的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(PSA鈣熒光素?zé)晒鈾z測)。附圖5(A)顯示了濾紙上的鈣熒光素?zé)晒獾哪繙y檢測的結(jié)果(上段濾紙方法；下段溶液方法)。在上段和下段中，最左側(cè)的兩個條帶來自相互重疊的無引物的濾紙片(陰性)，最右側(cè)的兩個條帶來自相互重疊的含有引物的濾紙片(陽性)。附圖5(B)顯示了使用擴增反應(yīng)溶液的3％瓊脂糖電泳的結(jié)果(1和2濾紙方法(陰性)；3和4濾紙方法(陽性)5溶液方法(陰性)；和6溶液方法(陽性))。
附圖6(A)和6(B)顯示了根據(jù)三片法在濾紙上的LAMP反應(yīng)的結(jié)果(HCV轉(zhuǎn)錄RNA鈣熒光素?zé)晒鈾z測)。附圖6(A)顯示了在濾紙上鈣熒光素?zé)晒獾哪繙y檢測的結(jié)果(1和2三片濾紙方法(陰性)；3和4三片濾紙方法(陽性)；5一片濾紙方法(陰性)；6一片濾紙方法(陽性)；7溶液方法(陰性)；和8溶液方法(陽性))。附圖6(B)顯示了使用擴增反應(yīng)溶液的3％瓊脂糖電泳的分析結(jié)果(1和2三片濾紙方法(陰性)；3和4三片濾紙方法(陽性)；5一片濾紙方法(陰性)；6一片濾紙方法(陽性)；7溶液方法(陰性)；和8溶液方法(陽性))。
附圖7顯示了在濾紙上進行的提取、擴增和檢測的結(jié)果(1HBV樣本擴增的結(jié)果；2HCV樣本擴增的結(jié)果；3陰性對照(不含有HBV目標(biāo)核酸))。
附圖8顯示了基于三片濾紙方法、5μl溶液反應(yīng)和25μl通常規(guī)模的反應(yīng)的HBV樣本擴增的結(jié)果。在圖中，符號“△”(Paμer_20)的三條線代表三片濾紙方法的測量結(jié)果，符號“○”的三條線代表5μl(5μl 20)溶液反應(yīng)的測量結(jié)果，符號“□”(25ul_20)的三條線代表25μl一般尺度反應(yīng)的測量結(jié)果。并且，沒有符號的兩條線(對于Paper_N、5μl_N和25μl_N)代表對照的測量結(jié)果。
附圖9顯示了根據(jù)使用一片法在濾紙上(PSA)的PCR反應(yīng)的電泳分析結(jié)果(M100-bp ladder；1濾紙方法(陰性)；2模板DNA106拷貝/試管(濾紙方法(陽性))；3模板DNA 108拷貝/試管(濾紙方法(陽性))；4溶液方法(陰性)；5模板DNA 106拷貝/試管(溶液方法(陽性))；和6模板DNA 108拷貝/試管(溶液方法(陽性))。
本說明書包含作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的特愿2004-252767的說明書中所公開的內(nèi)容。
進行發(fā)明的最佳方式1.術(shù)語定義目標(biāo)核酸本說明書中術(shù)語“目標(biāo)核酸”表示待檢測的核苷酸序列或核酸分子。
多孔支持物在本說明書中術(shù)語“多孔支持物”表示多孔的親水性固相支持物。這種支持物由濾紙、尼龍膜、纖維素酯等制成。
樣本在本說明書中術(shù)語“樣本”包括任何類型的含核酸的樣品，例如血液或外周白細胞樣品，或從這種樣品提取的核酸。
核酸擴增反應(yīng)在本說明書中術(shù)語“核酸擴增反應(yīng)”包括PCR法、ICAN法、SDA法、NASBA法或LAMP法等已知的核酸擴增反應(yīng)。
用于核酸擴增的試劑在本說明書中術(shù)語“用于核酸擴增的試劑”包括核酸擴增反應(yīng)所必需的任何類型的試劑，并含有DNA聚合酶、核苷酸底物、引物、探針等等。
用于核酸提取的試劑在本說明書中術(shù)語“用于核酸提取的試劑”包括核酸提取所必需的任何類型的試劑。
用于核酸檢測的試劑在本說明書中術(shù)語“用于核酸檢測的試劑”包括核酸檢測所必需的任何類型的試劑，例如發(fā)光試劑、熒光試劑、嵌入劑或核酸沉淀劑。
引物在本說明書中術(shù)語“引物”表示與待擴增的目標(biāo)核酸特異性雜交的寡核苷酸或標(biāo)記的寡核苷酸。
核酸探針在本說明書中術(shù)語“核酸探針”表示用于目標(biāo)核酸的序列的檢測的、與目標(biāo)核酸特異性雜交的核酸片段。此外，如下所述，核酸探針可以是肽核酸或鎖定核酸。
核酸沉淀劑在本說明書中術(shù)語“核酸沉淀劑”表示吸附到核酸上以形成凝集物的試劑，例如聚乙烯亞胺。
此外，以下和在實施例中將更詳細地描述上述各術(shù)語的具體實例。
2.在多孔支持物上的核酸提取在多孔支持物上的核酸提取可以根據(jù)以下實施例3中描述的方法來進行。例如，在蛋白變性劑共存的情況下將醇類(例如，乙醇和異丙醇)添加到樣本，引起核酸沉淀，從而可以在多孔支持物上進行沉淀。
3.在多孔支持物上的核酸擴增多孔支持物上提取的核酸直接進行核酸擴增反應(yīng)。核酸擴增反應(yīng)可以根據(jù)用于核酸擴增的已知方法，例如PCR法、ICAN法、SDA法、NASBA法或LAMP法來進行。
特別地，用于本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)優(yōu)選的是LAMP反應(yīng)。LAMP(環(huán)-介導(dǎo)的等溫擴增)方法是由本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)的核酸擴增方法。根據(jù)該方法，DNA或RNA可以在等溫條件下(約65℃)以低成本快速擴增，使用兩種、四種或六種類型的特異性引物(內(nèi)部引物對、附帶外部引物對的內(nèi)部引物對，或附帶外部引物對和環(huán)引物對的內(nèi)部引物對)、具有鏈置換活性的聚合酶，和用作底物的核苷酸。LAMP法可參見參考文件Notomi，T et al.Nucleic Acids Res.28(12)e63(2000)；WO00/28082；和Eiken Chemical Co.，Ltd.的網(wǎng)站(http://www.eiken.co.jp/)的詳細描述。
根據(jù)LAMP法，在擴增產(chǎn)物的相同鏈上的多個位點，延伸反應(yīng)和擴增反應(yīng)同時進行。因而，在等溫條件下超指數(shù)(superexponentially)實現(xiàn)DNA擴增，從而可以高擴增效率地合成具有特別的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)(由相同鏈上間隔地反向的重復(fù)組成的結(jié)構(gòu))的長鏈擴增產(chǎn)物。
在LAMP法中，使用被稱為內(nèi)部引物、外部引物和環(huán)引物的特異性引物。
內(nèi)部引物是LAMP法所必需的。當(dāng)從每個模板DNA的鏈中選擇出存在于3′側(cè)的任意序列X2c和存在于相對X2c的5′側(cè)的任意序列X1c時，內(nèi)部引物從3′側(cè)到5′側(cè)按該順序包含序列X2(與上述X2c互補)和序列X1c(與上述X1c相同)。(該引物具有X1c+X2的結(jié)構(gòu)。)術(shù)語“外部引物”表示兩種引物(分別與雙鏈中的一條互補)，各具有與相對內(nèi)部引物的外側(cè)(即，模板的3′側(cè))的任意序列X3c互補的序列，并能夠與X3c退火。
通過LAMP法獲得的擴增產(chǎn)物的相同鏈上產(chǎn)生的、相互補的序列相互退火形成環(huán)時，在其3’端含有與環(huán)內(nèi)序列互補的堿基的引物稱為“環(huán)引物”。如上所述的外部引物和環(huán)引物不是LAMP法所必需的。然而，借助于這些引物，可以以改善的效率進行擴增反應(yīng)。
LAMP反應(yīng)在例如50℃到75℃、優(yōu)選的55℃到70℃進行1分鐘到10小時，優(yōu)選的5分鐘到4小時。在這種溫度下，內(nèi)部引物可以與模板核酸上與之互補的序列結(jié)合成穩(wěn)定的堿基配對，具有鏈置換活性的聚合酶可以保持酶活性。
此外，LAMP反應(yīng)優(yōu)選的在與實現(xiàn)優(yōu)選的酶反應(yīng)pH值的緩沖劑、維持酶的催化活性和退火所必需的鹽和酶保護劑共存下進行。進一步的，根據(jù)需要使用熔解溫度(Tm)調(diào)節(jié)物等等來進行反應(yīng)。所使用的這種緩沖劑的實例包括具有中性-弱堿性緩沖作用的Tris-HCl?？梢愿鶕?jù)使用的DNA聚合酶來調(diào)節(jié)pH值?？梢猿浞值靥砑佑糜诒３置富钚院驼{(diào)整DNA熔解溫度的鹽的實例包括KCl、NaCl和(NH4)2SO4。使用的酶保護劑的實例包括牛血清白蛋白和糖類。此外，一般可以使用的熔解溫度調(diào)節(jié)物的實例包括甜菜堿、脯氨酸、二甲基亞砜和甲酰胺。
可以用充分標(biāo)記的物質(zhì)來標(biāo)記內(nèi)部引物或核苷酸底物。標(biāo)記的物質(zhì)的實例包括熒光染料(例如，F(xiàn)ITC和ROC)、酶、蛋白質(zhì)、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(例如，DNP)、生物素和DIG(地高辛)。
4.多孔支持物上的目標(biāo)核酸檢測根據(jù)已知的方法使用標(biāo)記的核酸探針、熒光試劑等等，可以容易地在多孔支持物上檢測擴增的目標(biāo)核酸。使用核酸探針和核酸沉淀劑的方法是特別優(yōu)選的，因為籍此可方便地通過目測確認擴增產(chǎn)物。
(1)核酸探針用于檢測的核酸探針是具有與目標(biāo)核酸的至少一部分互補的序列的寡核苷酸探針。它的鏈長度一般約5到50個堿基，優(yōu)選的約10到30個堿基。
特別地，當(dāng)使用核酸沉淀劑時，特別優(yōu)選的是這種探針具有相對短的鏈。核酸沉淀劑具有易于吸附到長鏈核酸的性質(zhì)。因此，為了實現(xiàn)良好的B/F分離而防止沉淀劑吸附到釋放的探針，一般而言核酸探針具有相對短的鏈?zhǔn)潜匦璧?。然而，不考慮探針長度，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，例如通過調(diào)節(jié)核酸沉淀劑反應(yīng)的溫度到接近探針的Tm，可以實現(xiàn)良好的B/F分離。
可以用充足的標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記如上所述的核酸探針。標(biāo)記的物質(zhì)的實例包括熒光染料(例如FITC和ROC)、酶、蛋白質(zhì)、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(例如，DNP)、生物素和DIG(地高辛)。此外，這種核酸探針可以是肽核酸(Nielsen，P.E.et al.，Science 254，1497-1500(1991))或鎖定核酸(WO99/14226和日本專利公開(Kohyo)2002-521310 A)。
(2)核酸沉淀劑用于本發(fā)明的核酸沉淀劑沒有特別的限制，只要它吸附于核酸以形成凝集物即可。然而，選擇性地與長鏈核酸而不是短鏈核酸結(jié)合的沉淀劑是優(yōu)選的。具體地，已知的核酸沉淀劑的實例包括表面活性劑、二羥基苯、十二烷基硫酸鈉、二異丁基磺基琥珀酸鈉、十四烷基硫酸鈉、二羥基苯、Sarkosyl、含SO4、PO4、Cl或HCOO的堿金屬鹽和銨鹽。根據(jù)本發(fā)明，其優(yōu)選的實例是羥磷灰石、聚乙烯亞胺、硫酸魚精蛋白、聚-L-賴氨酸和二乙氨乙基葡聚糖(DEAE葡聚糖)。聚乙烯亞胺的特別優(yōu)選的實例具有約40或更低的聚合度。
根據(jù)這種性質(zhì)來確定所使用的核酸沉淀劑的濃度和數(shù)量。例如，對于具有14的聚合度的聚乙烯亞胺來說，優(yōu)選的濃度是約0.1到2M，優(yōu)選的數(shù)量是每25μl反應(yīng)溶液約4到200μg。
根據(jù)這種沉淀劑的性質(zhì)來確定適合于核酸沉淀劑的反應(yīng)溶液的pH值。然而，一般地，pH值優(yōu)選的是6到10。這是因為當(dāng)反應(yīng)溶液的pH值過高時探針不太可能與核酸雜交。另一方面，當(dāng)反應(yīng)溶液的pH值過低時核酸質(zhì)子化引起B(yǎng)/F分離低下。
此外，根據(jù)這種沉淀劑的性質(zhì)還可確定添加核酸沉淀劑時反應(yīng)溶液的離子強度。然而，一般地，離子強度優(yōu)選的是0.15mol/l或更低。當(dāng)離子強度過高時，沉淀劑和核酸之間的靜電相互作用被抑制，導(dǎo)致凝集物的不充分形成。
進一步的，添加核酸沉淀劑時的溫度優(yōu)選的約20℃到70℃。并且，該溫度可以與核酸擴增時的恒定溫度相同。
(3)使用核酸沉淀劑的檢測如上所述的核酸探針和核酸沉淀劑可以添加到經(jīng)歷了擴增的多孔支持物，或它們可以在初始階段點樣到多孔支持物的適當(dāng)?shù)奈稽c上。當(dāng)在初始階段將核酸探針添加到多孔支持物、隨后進行擴增反應(yīng)時，如上所述的擴增步驟和雜交步驟可以幾乎同時發(fā)生。擴增產(chǎn)物與核酸探針的雜交條件沒有特別的限制。然而，一般地，雜交在50℃到70℃進行5分鐘。
就固相上的移動性而言，由擴增核酸、核酸探針和核酸沉淀劑構(gòu)成的凝集物明顯不同于釋放的核酸。因此，它們可以容易地相互分離。
通過標(biāo)記核酸探針或擴增產(chǎn)物可以容易地檢測凝集物。檢測包括定性檢測和定量檢測。例如，是否存在目標(biāo)序列等的定性檢測可以通過目測凝集物來容易地進行。同時，根據(jù)使用商業(yè)上可獲得的設(shè)備，例如“Polarion”熒光平板讀取器(TECAN)測量信號強度，可以進行定量檢測。
5.核酸分析系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明，提供了用于連續(xù)進行核酸提取、擴增和檢測的核酸分析系統(tǒng)，其包括至少一個多孔支持物，所述多孔支持物在初始階段含有用于核酸擴增的試劑、用于核酸提取的試劑和/或用于核酸檢測的試劑。
多孔支持物含有的試劑的實例包括，但不特別限于i)引物或標(biāo)記的引物；ii)核酸探針或標(biāo)記的核酸探針；iii)核酸沉淀劑；iv)DNA聚合酶；和v)用作DNA聚合酶的底物的核苷酸或標(biāo)記的核苷酸。
對LAMP擴增而言，期望的是，上述引物進一步含有外部引物和/或環(huán)引物或標(biāo)記的環(huán)引物，以及內(nèi)部引物。
此外，如上所述，核酸沉淀劑優(yōu)選的是選自由羥磷灰石、聚乙烯亞胺、硫酸魚精蛋白、聚-L-賴氨酸和二乙氨乙基葡聚糖的至少一種。
進一步的，本發(fā)明的系統(tǒng)可以作為試劑盒提供，其包含熔解溫度調(diào)節(jié)物(例如，甜菜堿和三甲胺N-氧化物)、可以獲得酶反應(yīng)的優(yōu)選條件的緩沖液，和/或根據(jù)需要檢測合成反應(yīng)產(chǎn)物所必需的其他試劑。
本發(fā)明的系統(tǒng)可以以一定方式構(gòu)建，從而用于核酸擴增的試劑分別保持在兩個或多個多孔支持物內(nèi)，在使用(或擴增)時使它們相互接觸。這種系統(tǒng)的實例包括，其中引物和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物內(nèi)的系統(tǒng)；其中聚合酶和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物內(nèi)的系統(tǒng)；和其中聚合酶、引物和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物內(nèi)的系統(tǒng)。在這些系統(tǒng)中，考慮到維持穩(wěn)定性，優(yōu)選聚合酶以干燥狀態(tài)保持在多孔支持物內(nèi)。
實施例以下參考實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限于此。
除非另作說明，實施例中所用的LAMP反應(yīng)溶液和測試材料如下(1)LAMP反應(yīng)溶液 LAMP反應(yīng)溶液的基本組分Tris-HCl(pH8.8)20mMKCl10mM(NH4)2SO410mMMgSO48mMTween200.1％Betain 0.8M
dNTPs 5.6mM[7.6mM]內(nèi)部引物 3.2μM外部引物 0.8μM環(huán)引物(LOOP引物) 1.6μMBst聚合酶 8U/試管BSA2％(酶混合物1μl/試管)[]針對HCV擴增系統(tǒng)()針對CK20或HCV擴增系統(tǒng)(2)目標(biāo)核酸、引物和標(biāo)記探針a)PSA(PSA cDNA GenBank IDM26663(克隆到pBR322中))FIP TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG(SEQ ID NO1)RIP TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG(SEQ ID NO2)F3 TGCTTGTGGCCTCTCGTG(SEQ ID NO3)R3 GGGTGTGTGAAGCTGTG(SEQ ID NO4)b)CK20(GenBank IDBC031559)FIPCAATTTGCAGGACACACCGAGATTGAAGAGCTGCGAAGTC(SEQID NO5)
BIPCTGCTGAGGACTTCAGACTGACTTGGAGATCAGCTTCCAC(SEQID NO6)F3CGACTACAGTGCATATTACAGAC(SEQ ID NO7)B3GTAGGGTTAGGTCATCAAAGAC(SEQ ID NO8)LpFGCAGTTGAGCATCCTTAATCT(SEQ ID NO9)LpBGACTGAGAGAGGAATACGTC(SEQ ID NO10)c)HCV樣本(“Nisseki”原生質(zhì)體的封裝樣本(Akita)ABC No.
62約2300KlU/ml；1.15×104拷貝/μl)FIPGGTTKATCCAAGAAAGGACCCAGTCGCCATAGTGGTCTGCGGA(SEQ ID NO11)BIPCCGCAAGACTGCTAGCCGAGGCAAGCACCCTATCAGGC(SEQ IDNO12)F3GGCGTTAGTATGAGTGTCGTAC(SEQ ID NO13)B3CATGGTGCACGGTCTACG(SEQ ID NO14)Loop RTTGGGTTGCGAAAGG(SEQ ID NO15)d)HBV樣本“Nisseki”原生質(zhì)體的封裝樣本No.7963100拷貝/ml)FIPGATAAAACGCCGCAGACACATCCTTCCAACCTCTTGTCCTCCAA(SEQ IDNO16)BIPCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGACAAACGGGCAACATACCTT(SEQ ID NO17)F3CAAAATTCGCAGTCCCCAAC(SEQ ID NO18)B3GGTGGTTGATGTTCCTGGA(SEQ ID NO19)Loop RGTTGGTTCTTCTGGACTACC(SEQ ID NO20)標(biāo)記的HBV探針(3’ROX-標(biāo)記)CAGCGATAGCCAGGACAAAG(SEQID NO21)(3)濾紙對于濾紙材料，使用切成邊長3mm的正方形或直徑4mm的圓形的定性濾紙No.1(由ToyoRoshi Kaisha，Ltd.生產(chǎn))(以下稱為“濾紙片”)。
將濾紙加入LAMP反應(yīng)溶液的實驗首先，根據(jù)以下方法在使用CK20的系統(tǒng)中檢查在LAMP反應(yīng)期間添加濾紙(纖維素)的影響。
1.實驗方法將50μl LAMP反應(yīng)溶液(表1)添加到0.2-ml PCR管中。將預(yù)先編號的濾紙片加入其中。CK20用作目標(biāo)核酸。使用熱循環(huán)儀在63℃加熱60分鐘進行LAMP擴增。使用ABI-7700(Applied Biosystems)測量鈣熒光素(FAM Dye layer)以確認是否存在擴增。
2.實驗結(jié)果附圖2顯示了結(jié)果。如附圖2所示，甚至在添加20片濾紙之后，仍確認發(fā)生了擴增反應(yīng)。因為每個濾紙片(3-mm正方形)能夠保持多達3μl的液體，20片濾紙能夠保持不低于50μl液體。也就是說，已經(jīng)確認了不僅當(dāng)添加濾紙到反應(yīng)溶液時(過量的反應(yīng)溶液)并且當(dāng)向濾紙?zhí)峁┓磻?yīng)溶液時(過量的濾紙)，均發(fā)生LAMP反應(yīng)。
濾紙上的LAMP反應(yīng)1.實驗方法添加0到20片濾紙(3-mm正方形)來進行反應(yīng)。通過使用熱循環(huán)儀將PCR管加熱到規(guī)定溫度來進行LAMP反應(yīng)。通過向其添加鈣熒光素(Dojindo Laboratories)以檢測熒光(ABI-7700(使用FAM Dyelayer)，Applied Biosystems)來確認是否存在擴增。然后，將10μlLoading Dye(6×)(Promega生產(chǎn))添加到這些濾紙片。使這些濾紙片保持5分鐘，然后進行3％瓊脂糖電泳。從而，確認目標(biāo)核酸的LAMP擴增。根據(jù)如下所述的不同的方法進行濾紙上的LAMP反應(yīng)。
1.1一片法將含有表1所列所有成分的3μl LAMP反應(yīng)溶液提供于單片濾紙，接下來進行LAMP反應(yīng)。
1.2兩片法在引物、酶、底物和鎂離子存在于單一溶液中的情況下，長期的保存可能引起引物二聚體化等非特異性反應(yīng)。故將引物或酶以及剩余的試劑在不同的濾紙上展開，必要時將其相互重疊，使用PSA系統(tǒng)檢查是否可發(fā)生LAMP反應(yīng)。
(1)引物濾紙方法將僅不含引物的3μl LAMP反應(yīng)溶液(RM1.67倍濃度)和2μl 2.5倍濃縮的引物溶液提供于獨立的濾紙片。通過使這些濾紙片互相重疊進行LAMP反應(yīng)。此外，調(diào)節(jié)每種成分的濃度以使得當(dāng)兩個濾紙片相互重疊時達到5μl的總液體體積狀態(tài)下的預(yù)定濃度。
(2)Bst濾紙方法僅不含Bst的LAMP反應(yīng)溶液(RM1.67倍濃度)(3μl)和4倍稀釋的Bst(或酶混合物)貯存液(2μl)提供給獨立的濾紙片。通過互相重疊這些片來進行LAMP反應(yīng)。此外，調(diào)節(jié)每種成分的濃度以使得當(dāng)兩個片相互重疊時達到5μl的總液體體積狀態(tài)下的預(yù)定濃度。
1.3三片法為了組合濾紙反應(yīng)方法和濾紙?zhí)崛》ǎ仨氃趲в心繕?biāo)核酸的濾紙上進行LAMP反應(yīng)。這意味著包括3片濾紙(含有目標(biāo)核酸的濾紙、RM濾紙和Bst濾紙(或酶混合物濾紙))的濾紙反應(yīng)是必需的。因此，在使用HCV的系統(tǒng)中根據(jù)以下方法實施了三片法。
將不含Bst和目標(biāo)核酸的3μl LAMP反應(yīng)溶液(RM1.67倍濃度)、1μl 2倍稀釋的Bst溶液(或酶混合物)和1μl任意濃度的目標(biāo)核酸溶液單獨地提供給3片濾紙。紙片相互重疊從而進行LAMP反應(yīng)。此外，以一定方式調(diào)節(jié)每種成分的濃度使得當(dāng)三個片相互重疊時達到5μl的總液體體積狀態(tài)下的預(yù)定的濃度。
2.實驗結(jié)果和論述2.1一片法附圖3顯示了使用PSA(6×10-20M)作為目標(biāo)核酸于65℃下在濾紙上進行60分鐘的LAMP反應(yīng)的結(jié)果。如附圖3所示，僅在含有目標(biāo)核酸時觀察到鈣熒光素?zé)晒狻Ｒ蚨?，確認了LAMP擴增。此外，根據(jù)3％瓊脂糖電泳分析，獲得了給定大小的階梯圖譜。因而，確認了有可能在濾紙上進行LAMP反應(yīng)。
2.2兩片法附圖4顯示了根據(jù)引物濾紙方法使用PSA(6×10-20M)作為目標(biāo)核酸于65℃下進行60分鐘的LAMP反應(yīng)的結(jié)果。此外，附圖5顯示了根據(jù)Bst濾紙方法使用PSA(6×10-20M)作為目標(biāo)核酸于65℃下進行60分鐘的LAMP反應(yīng)的結(jié)果。
根據(jù)附圖4和5，甚至在將引物和酶提供于不同的濾紙片的情況下，仍確認了通過相互重疊濾紙片發(fā)生了給定的LAMP反應(yīng)。也就是說，以及確認了引物和Bst小于濾紙的孔洞，因而它們可以自由地在濾紙片之間遷移。
這個實驗的目的是確認物質(zhì)(引物或酶)在兩片濾紙之間遷移的可能性。因而，陰性對照的反應(yīng)條件是缺乏引物或酶而不缺乏目標(biāo)核酸。(兩片之一被稱為水點(water spot)濾紙。)已知Bst可以在濾紙上穩(wěn)定地配制。因而，認為可以根據(jù)Bst濾紙方法配制LAMP試劑。同時，通過將引物提供給獨立的濾紙片，RM濾紙可以對任何系統(tǒng)方便地標(biāo)準(zhǔn)化。因此，這個例子可以應(yīng)用于同時檢測多個物品或目標(biāo)。
2.3三片法附圖6顯示了根據(jù)三片法使用HCV轉(zhuǎn)錄RNA(6×10-18M)作為目標(biāo)核酸于63℃下進行60分鐘的LAMP反應(yīng)的結(jié)果。同樣，根據(jù)三片法，確認了給定水平的LAMP擴增。因此，確認了有可能構(gòu)建一種系統(tǒng)，其中帶有已經(jīng)通過濾紙?zhí)崛〉哪繕?biāo)核酸的濾紙與其上已經(jīng)配制了LAMP試劑的兩個獨立的濾紙片重疊。
發(fā)明人已經(jīng)確認了當(dāng)使用濾紙實施核酸提取方法時，目標(biāo)核酸穿過濾紙而不承載于濾紙上，其中實施過濾操作時不利用異丙醇的的作用。這揭示了用異丙醇沉淀(或聚集)的目標(biāo)核酸的大小大于濾紙的孔洞大??；然而，溶解的目標(biāo)核酸的大小小于濾紙的孔洞大小。此外，已經(jīng)揭示了在溶解的目標(biāo)核酸和濾紙(纖維素)之間不存在吸附之類的特異性相互作用。從而，據(jù)估計，溶解的目標(biāo)核酸可以在一定程度上在濾紙片之間自由地遷移，從而在三個重疊的濾紙片中含有的溶液一同作為含目標(biāo)核酸的給定LAMP反應(yīng)溶液(即，一片法中使用的相同的溶液)起作用。
使用濾紙的完整系統(tǒng)的模型實驗根據(jù)以下方案進行了使用濾紙的完整系統(tǒng)的模型實驗。
1.實驗方法
(1)使用的樣本是已經(jīng)用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍的HCV樣本(″Nisseki″原生質(zhì)體的封裝樣本(Akita)；ABC No.；約2300 KlU/ml；1.15×104拷貝/μl)的溶液，或用正常血漿(No.39)10倍稀釋的HBV樣本(″Nisseki″原生質(zhì)體No.79的封裝樣本；63100拷貝/ml)的溶液。將100μl樣本與300μl裂解緩沖液(含68％硫氰酸胍、3％DTT和10mM Tris(pH8.0))混合，將混合物放置10分鐘。然后，向其中添加400μl的100％異丙醇，然后使用注射器過濾通過一片濾紙(直徑4mm；No.1)。
(2)使用注射器使500μl 70％乙醇通過攜帶目標(biāo)核酸的濾紙進行洗滌。
(3)將濾紙放置5分鐘除去其上的乙醇。
(4)選擇獲得的濾紙作為目標(biāo)核酸濾紙，它與RM濾紙或Bst(或酶混合物)濾紙重疊。使它們相互重疊并放入PCR管中，以63℃加熱1小時。
(5)將經(jīng)歷了上述反應(yīng)的濾紙與一片點了1.2μl含0.75M KCl、0.25M單體濃度的聚乙烯亞胺(PEI聚合度14)溶液的濾紙重疊。然后放置1分鐘。向這些濾紙?zhí)砑雍?00nM ROX標(biāo)記的HBV探針的溶液(100μl)，使探針與LAMP產(chǎn)物-PEI復(fù)合物的雜交。隨后將展開了LAMP產(chǎn)物-PEI復(fù)合物的濾紙在熒光發(fā)光器(302nm)上目測觀察。此外，在探針檢測時HCV擴增產(chǎn)物用作陰性對照(不相關(guān)的LAMP產(chǎn)物)。進一步的，不含目標(biāo)核酸的HBV擴增系統(tǒng)用作LAMP反應(yīng)時的陰性對照。
2.實驗結(jié)果和討論使用濾紙上提取的HBV作為目標(biāo)核酸，依次連續(xù)地進行了基于三片法的擴增反應(yīng)和PEI檢測(附圖7)。結(jié)果，使用實際的HBV樣本在濾紙上成功地進行了一系列遺傳測試(包括序列特異性檢測)。具體地，擴增的HBV樣本的樣品(附圖7-1)專有地展現(xiàn)了ROX的紅色熒光。在不相關(guān)的LAMP產(chǎn)物(HCV樣本FT 7-2)和陰性對照(附圖7-3)的情況下，觀察到來自濾紙的輕微的熒光。
基于上述結(jié)果，已經(jīng)揭示了有可能在濾紙等多孔固體載體上誘導(dǎo)與在液相中誘導(dǎo)的LAMP反應(yīng)的一樣的LAMP反應(yīng)。此外，還確認了，將反應(yīng)系統(tǒng)的不同成分施加于不同的濾紙片，然后將它們彼此重疊也可以產(chǎn)生LAMP反應(yīng)。這表明，有可能在濾紙上連續(xù)地進行提取、擴增和檢測的所有步驟。如果這些步驟可以組合到單個裝置上，這種方法可以應(yīng)用到用于核酸檢測(分析)的簡單和便宜的完整系統(tǒng)。
根據(jù)這項研究，已經(jīng)確認的是，使用包含濾紙作為基礎(chǔ)載體的完整系統(tǒng)，可以避免試劑的微量混合，裝置中的溶液遞送系統(tǒng)可以用簡單的載體移動系統(tǒng)來替換，可以使試劑穩(wěn)定。
三片法的敏感性1.實驗方法為了評估三片法的敏感性，通過以下基于實施例1到3的三種方法進行HBV樣本(20拷貝/試管)的擴增和檢測。
(1)三片濾紙方法5μl(RM 3μl+1/2 Bst 1μl+模板1μl)(2)溶液反應(yīng)5μl(RM 3μl+1/2 Bst 1μl+模板1μl)(3)通常規(guī)模的反應(yīng)25μl使用“FluoDia T70”熒光平板讀取器(Ex486nm和Em530nm，Otsuka Electronics Co.，Ltd)對樣品(3個試管)進行檢測。此外，充當(dāng)對照的不含樣本的樣品(2試管)按類似方式進行擴增和檢測。
2.實驗結(jié)果和討論附圖8顯示了結(jié)果。從而，對于溶液反應(yīng)來說，在3個試管中的2個觀察到擴增。因此，認為在實施例4的條件下敏感性的限度是20拷貝/試管。同時，根據(jù)三片濾紙方法，在3個試管中的3個觀察到擴增。因此，已經(jīng)確認的是，本發(fā)明的濾紙的敏感性相等于或高于溶液方法的敏感性。
濾紙上的PCR反應(yīng)根據(jù)實施例2的一片法，使用PSA(6×10-20M)作為目標(biāo)核酸，分別向每個濾紙片添加3μl的PCR反應(yīng)溶液進行PCR反應(yīng)。(擴增區(qū)具有178bp的大小。)根據(jù)表2中給出的PCR反應(yīng)溶液成分，使用PSA LAMP引物的外部引物(SEQ ID NO3和4)作為PCR引物，根據(jù)TAKARA LA Taq標(biāo)準(zhǔn)方法，進行35個95℃30秒、58℃30秒和70℃30秒的循環(huán)來實施PCR反應(yīng)。
PCR反應(yīng)溶液成分引物 各0.5μMLA Taq2.5U10×LAPCR緩沖液II 1μl25mM MgCl22.5mM2.5mM每種dNTP 各0.4mMBetain0.5MBSA 0.9％總計 10μl用10×加樣染料(loading dye)充滿經(jīng)歷了反應(yīng)的三片濾紙，隨后電泳。確認了擴增。為了比較，在類似的PCR條件下進行標(biāo)準(zhǔn)的溶液PCR。溶液PCR在10μl的范圍進行。所有的PCR產(chǎn)物進行電泳。
如附圖9中所示，同樣對于在濾紙上進行的PCR來說，確認了相應(yīng)于擴增區(qū)域的大小的條帶，其與溶液PCR的情況一樣。因此，已經(jīng)確認了與使用PCR的方法以及LAMP方法一樣，可以在濾紙上進行核酸擴增。
在此引用的所有出版物、專利和專利申請均作為參考并入本申請的說明書。
工業(yè)實用性本發(fā)明涉及用于連續(xù)進行核酸提取、擴增和檢測的簡單的核酸檢測裝置。這種裝置能夠在臨床實踐或?qū)嶒炇抑杏糜诤唵蔚腄NA分析或DNA測試。
序列表的自由文本SEQ ID NO1-人工序列的描述用于PSA的FIP引物SEQ ID NO2-人工序列的描述用于PSA的RIP引物SEQ ID NO3-人工序列的描述用于PSA的F3引物SEQ ID NO4-人工序列的描述用于PSA的R3引物SEQ ID NO5-人工序列的描述用于CK20的FIP引物SEQ ID NO6-人工序列的描述用于CK20的RIP引物
SEQ ID NO7-人工序列的描述用于CK20的F3引物SEQ ID NO8-人工序列的描述用于CK20的R3引物SEQ ID NO9-人工序列的描述用于CK20的LpF引物SEQ ID NO10-人工序列的描述用于CK20的LpR引物SEQ ID NO11-人工序列的描述用于HCV的FIP引物SEQ ID NO12-人工序列的描述用于HCV的RIP引物SEQ ID NO13-人工序列的描述用于HCV的F3引物SEQ ID NO14-人工序列的描述用于HCV的R3引物SEQ ID NO15-人工序列的描述用于HCV的環(huán)引物SEQ ID NO16-人工序列的描述用于HBV的FIP引物SEQ ID NO17-人工序列的描述用于HBV的RIP引物SEQ ID NO18-人工序列的描述用于HBV的F3引物SEQ ID NO19-人工序列的描述用于HBV的R3引物SEQ ID NO20-人工序列的描述用于HBV的環(huán)引物SEQ ID NO21-人工序列的描述用于HBV的探針序列表序列表<110>EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA<120>核酸分析方法<130>PH-2548-PCT<150>JP 2004-252767<151>2004-08-31<160>21<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>44<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于PSA的FIP引物<400>1tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210>2<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于PSA的RIP引物<400>
tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210>3<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于PSA的F3引物<400>3tgcttgtggc ctctcgtg 18<210>4<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于PSA的R3引物<400>4gggtgtgtga agctgtg17<210>5<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于CK20的FIP引物<400>5caatttgcag gacacaccga gattgaagag ctgcgaagtc 40<210>6<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于CK20的RIP引物<400>6ctgctgagga cttcagactg acttggagat cagcttccac 40<210>7<211>23
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于CK20的F3引物<400>7cgactacagt gcatattaca gac 23<210>8<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>用于CK20的LpF引物<400>9gcagttgagc atccttaatc t 21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于CK20的LpR引物<400>10gactgagaga ggaatacgtc 20
<210>11<211>43<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HCV的FIP引物<400>11ggttkatcca agaaaggacc cagtcgccat agtggtctgc gga 43<210>12<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HCV的RIP引物<400>12ccgcaagact gctagccgag gcaagcaccc tatcaggc 38<210>13<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HCV的F3引物<400>13ggcgttagta tgagtgtcgt ac 22<210>14<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HCV的R3引物<400>14catggtgcac ggtctacg 18<210>15<211>15<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>用于HBV的FIP引物<400>16gataaaacgc cgcagacaca tccttccaac ctcttgtcct ccaa 44<210>17<211>46<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HBV的RIP引物<400>17cctgctgcta tgcctcatct tctttgacaa acgggcaaca tacctt46<210>18<211>20
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HBV的F3引物<400>18caaaattcgc agtccccaac 20<210>19<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>用于HBV的Loop R引物<400>20gttggttctt ctggactacc 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于HBV的探針<400>21cagcgatagc caggacaaag 20
權(quán)利要求
1.一種核酸分析方法，包括向含有用于核酸擴增的試劑的多孔支持物添加含核酸的樣本，使目標(biāo)核酸進行核酸擴增反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分析方法，包括在所述多孔支持物上連續(xù)地進行從樣本提取核酸、目標(biāo)核酸的擴增反應(yīng)，以及對核酸擴增反應(yīng)或其產(chǎn)物的檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的核酸分析方法，其中所述多孔支持物進一步含有用于核酸提取的試劑和/或用于核酸檢測的試劑。
4.一種核酸分析方法，包括在有兩個或以上的層構(gòu)成的多孔支持物上進行以下步驟1)利用含有用于核酸提取的試劑的多孔支持物層提取核酸；2)利用含有用于核酸擴增的試劑的多孔支持物層進行目標(biāo)核酸的核酸擴增反應(yīng)；以及3)使核酸探針與核酸擴增反應(yīng)的產(chǎn)物雜交，使核酸沉淀劑作用于產(chǎn)生的雜交物以形成凝集物，利用獲得的凝集物檢測樣本中的目標(biāo)核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的核酸分析方法，其中所述多孔支持物含有核酸沉淀劑和/或核酸探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5的任一項的核酸分析方法，其中所述多孔支持物由含有用于核酸擴增的試劑、用于核酸提取的試劑和/或用于核酸檢測的試劑的兩個或以上的多孔支持物構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述用于核酸擴增的試劑分別保持在兩個或以上的多孔支持物內(nèi)，在擴增時，使所述多孔支持物相互接觸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中引物和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中聚合酶和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中聚合酶、引物和其他用于核酸擴增的試劑分別保持在不同的多孔支持物內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求7到10的任一項的方法，其中干燥狀態(tài)的聚合酶保持在所述多孔支持物內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11任一項的核酸分析方法，其中所述核酸擴增反應(yīng)是LAMP反應(yīng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12的任一項的核酸分析方法，其中所述多孔支持物由選自濾紙、尼龍膜、纖維素酯、纖維素、無紡布、織物、棉花、聚氨基甲酸酯和燒結(jié)塑料的至少一種材料制成。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13的任一項的核酸分析方法，其中所述核酸沉淀劑是選自羥磷灰石、聚乙烯亞胺、硫酸魚精蛋白、聚-L-賴氨酸和二乙氨乙基葡聚糖的至少一個成員。
15.一種用于連續(xù)進行核酸提取、擴增和檢測的核酸分析系統(tǒng)，這種系統(tǒng)包括至少一個含有用于核酸擴增的試劑、用于核酸提取的試劑和/或用于核酸檢測的試劑的多孔支持物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于核酸分析的完整系統(tǒng)，通過它，提取、擴增和檢測核酸的步驟都能夠在單個固相支持物上進行。具體而言，本發(fā)明涉及核酸分析方法，包括向含有用于核酸擴增的試劑的多孔支持物添加含核酸的樣本，并連續(xù)地進行樣本的核酸提取、目標(biāo)核酸的擴增反應(yīng)，以及核酸擴增反應(yīng)或其產(chǎn)物的檢測。
文檔編號G01N33/566GK101048515SQ20058003734
公開日2007年10月3日 申請日期2005年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月31日
發(fā)明者森安義, 平野剛史 申請人:榮研化學(xué)株式會社