專利名稱：作為多種疫苗候選物的保守性內(nèi)核脂多糖表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸類細(xì)菌性病原體脂多糖(LPS)，其包括所述LPS的內(nèi)核寡糖部分的一個或多個表位。本發(fā)明鑒別出在獸類細(xì)菌性病原體的一些致病分離株的LPS上表達(dá)的保守性表位，所述致病分離株包括但不限于胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，Ap)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica，Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)。
背景技術(shù)：
細(xì)菌性病原體是商業(yè)農(nóng)場運(yùn)作中經(jīng)濟(jì)損失的很大原因，也是極大范圍的動物群體(包括人類)的健康問題的很大原因。與獸類疾病有關(guān)的三種最常見的細(xì)菌性病原體為溶血性曼氏桿菌(溶血性巴氏桿菌，Mh)、胸膜肺炎放線桿菌(Ap)和多殺性巴氏桿菌(Pm)。Mh主要是牛和羊的病原體，Ap是豬病原體，Pm是多個物種包括家禽、家畜和豬的病原體，同時也是狗和貓咬傷人類導(dǎo)致感染的致病因子。總之，它們可引發(fā)疾病，導(dǎo)致動物飼養(yǎng)業(yè)的極大經(jīng)濟(jì)損失。
當(dāng)前的措施包括使用菌苗或者簡單修飾的活菌株作為疫苗。由于效果不夠好，并且不良作用出現(xiàn)幾率較高，這些方法并不完全令人滿意。
目前沒有哪一種疫苗可以提供針對這三個菌種——Mh、Ap和Pm導(dǎo)致的感染的跨菌種保護(hù)。針對這些致病菌的疫苗極有用處。對付由Mh引起的疾病的疫苗方法仍然主要是基于菌苗和活減毒株。最近的活疫苗中引入了分泌或者提取的Mh抗原，如神經(jīng)氨酸酶、白細(xì)胞毒素、唾液糖蛋白酶、外膜以及未識別的蛋白。白細(xì)胞毒素在常規(guī)上一直是主要的亞單位疫苗候選物，但使用表達(dá)非毒性白細(xì)胞毒素的突變株進(jìn)行免疫接種在小牛激發(fā)模型(calf challenge model)中仍然部分有毒，并且白細(xì)胞毒素與莢膜多糖聯(lián)合使用時不能產(chǎn)生防護(hù)性免疫應(yīng)答。相比而言，LPS已顯示出可穩(wěn)定白細(xì)胞溶解活性，所以基于LPS和去毒白細(xì)胞毒素的聯(lián)合疫苗可帶來希望[Li，J.，and K.D.Clinkenbeard.1999.Infect.Immun.672920-2927]。
目前對付由Ap引起的疾病的疫苗方法是基于活減毒株，它們中含有高度不穩(wěn)定的Apx毒素，該毒素可誘導(dǎo)防護(hù)所需的中和抗體。這些Apx毒素形成了針對Ap的主要亞單位疫苗的基礎(chǔ)，但似乎只能誘導(dǎo)部分臨床防護(hù)。有人提出將粘附素(包括LPS的核心OS)作為改善的疫苗候選物[VanOverbeke I.，et al.2003.J.Vet.Med.B.Infect.Dis.Vet.PublicHealth.50289-293]。目前預(yù)防豬Pm病的疫苗由類毒素和體細(xì)胞抗原如莢膜和外膜蛋白組成。巴斯德(Pasteur)首先表明Pm可引起雞的禽霍亂，目前對該病的防護(hù)手段是利用Pm減毒株。然而一般來說，由于該免疫應(yīng)答仍然是血清型限制的，不能提供對其他血清型的交叉保護(hù)，所以這種手段受到極大限制。然而已經(jīng)表明Pm的LPS在感染的免疫中起部分作用。
已經(jīng)積累了相當(dāng)?shù)淖C據(jù)表明來自這些生物中每一種的LPS都可能是亞單位疫苗設(shè)計的良好候選物。已經(jīng)顯示LPS是Mh表面上可見的和主要的抗原決定簇，由A1 LPS誘導(dǎo)的mAb有助于吞噬作用而無助于補(bǔ)體介導(dǎo)的體外殺傷[Wilson，C.F.，et al.1992.Vet.Microbiol.31161-168]。
對于Pm，核糖體-LPS疫苗保護(hù)雞類免受由同源Pm菌株引起的禽霍亂感染[Phillips，M.，and R.B.Rimler.1984.Am.J.Vet.Res.451785-1789]。另外，使用LPS-蛋白復(fù)合物對小鼠進(jìn)行免疫接種，當(dāng)使用同源菌株攻擊小鼠時該免疫接種可提供100％的保護(hù)，然而當(dāng)分開使用時，該復(fù)合物的單一組分無法提供保護(hù)。來自Pm的LPS誘導(dǎo)的MAb在小鼠模型中只能提供部分保護(hù)，盡管它們具有調(diào)理吞噬作用，但在補(bǔ)體存在下不具有殺菌作用。然而在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，針對PmLPS的mAb可完全保護(hù)小鼠免受同源攻擊，并且具有殺菌作用[Wijewardana，T.G.，et al.1990.J.Med.Microbiol.33217-222]。一種模擬來自A型的LPS的抗獨(dú)特型疫苗在小鼠模型中當(dāng)其受到同源生物攻擊時可起到保護(hù)作用。
在Ap中，LPS，更具體地說是LPS的核區(qū)與該細(xì)菌的粘附能力有關(guān)。BSA與Ap血清型1 LPS連接的聯(lián)合疫苗可在同源攻擊而不能在異源攻擊后保護(hù)小鼠，來自血清型5和1的光滑型和粗糙型Ap LPS的聯(lián)合疫苗表明Ap細(xì)胞壁的糖部分在豬免疫應(yīng)答中起重要作用[Fenwick，B.，and B.I.Osburn.1986.Infect.Immun.54583-586]。
在此背景下，所感興趣的獸醫(yī)上的生物包括表面暴露的糖部分，并可考慮作為疫苗候選物。這些糖部分包括LPS和莢膜多糖。莢膜多糖是幾種糖類殘基的重復(fù)單元，并與細(xì)菌表面直接連接，而LPS由以下三個區(qū)構(gòu)成脂質(zhì)A區(qū)，它通過脂肪酸殘基將LPS分子與細(xì)菌表面相連；相對保守的核寡糖區(qū)，它將脂質(zhì)A區(qū)與第三區(qū)即可變多糖抗原(O-抗原)相連。莢膜和O-抗原多糖的菌株間異質(zhì)性通?？蓪⑺鼈儚慕?jīng)濟(jì)可行的疫苗候選物中排除，因?yàn)樗鼈冎粚ν淳暧行А７肿舆z傳學(xué)、分子結(jié)構(gòu)分析以及免疫化學(xué)的最新進(jìn)展提供了強(qiáng)有力的工具，使得我們能夠識別可作為候選物疫苗抗原的糖結(jié)構(gòu)。
脂多糖(LPS)是Mh、Ap和Pm中重要的并很有特點(diǎn)的表面暴露抗原。(如上所討論，本文使用的術(shù)語“脂多糖”和“LPS”涵蓋短鏈脂多糖和脂寡糖(LOS))。Pm菌株表達(dá)多組異質(zhì)性低分子量LPS，這些LPS在多個寡糖表位上顯示廣泛的抗原多樣性，而Mh和Ap菌株既產(chǎn)生低分子量LPS，也產(chǎn)生帶有O-抗原聚合物的常規(guī)LPS。申請人在此描述的Mh、Ap和Pm的LPS糖結(jié)構(gòu)當(dāng)以合適的形式(例如作為蛋白綴合物)呈遞給宿主免疫系統(tǒng)時，可提供一種保護(hù)性抗原的來源。在申請人的研究中，LPS被證實(shí)可用作疫苗候選物，這是因?yàn)橐馔獾刈R別出這樣一種表面表達(dá)的糖抗原，它們具有的寡糖表位在遺傳上和生理上穩(wěn)定，在此范圍的菌株中保守，在三個菌種Mh、Ap或Pm中可進(jìn)入宿主的清除機(jī)制。
Mh、Ap和Pm的LPS分子的糖區(qū)為宿主免疫系統(tǒng)進(jìn)行識別提供了靶標(biāo)。確定其結(jié)構(gòu)對于理解Mh、Ap和Pm的LPS的生物學(xué)及其在細(xì)菌毒力中的作用是很關(guān)鍵的。Mh、Ap和Pm的LPS包括分子的異質(zhì)性混合物，所述分子由可變的寡糖部分、膜錨定的脂質(zhì)A部分以及在某些Mh和Ap菌株的情況下還有聚合的O-抗原構(gòu)成?；诒疚乃枋龅膶?shí)驗(yàn)，開發(fā)了Mh、Ap和Pm的LPS的結(jié)構(gòu)模型，該結(jié)構(gòu)模型由保守的四-庚糖基-二-葡糖基內(nèi)核部分組成，該部分通過磷酸化酮脫氧辛酸殘基(Kdo)附著于脂質(zhì)A部分，并且發(fā)現(xiàn)它在目前所研究過的每一菌株中均存在并且是保守的。
從結(jié)構(gòu)分析中明顯看出，這三個菌種中絕對保守的最大結(jié)構(gòu)如以下結(jié)構(gòu)I所示。
結(jié)構(gòu)I其中Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，Hep是庚糖，Glc是葡萄糖，P是磷酸酯，脂質(zhì)A(Lipid A)是去毒的。
為了將抗原用作疫苗開發(fā)，必須滿足四條重要的標(biāo)準(zhǔn)。即候選抗原的免疫原性表位一定要i)遺傳上穩(wěn)定；ii)在這些菌種的所有臨床上相關(guān)的菌株中均保守；iii)可進(jìn)入(體外及體內(nèi))宿主免疫機(jī)制；以及iv)能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)保護(hù)性抗體。
本發(fā)明已經(jīng)鑒別出顯示滿足大部分這些標(biāo)準(zhǔn)的保守性LPS糖表位。
i)遺傳穩(wěn)定性在三個菌種的基因組菌株(兩個Pm株，一個Mh株，兩個Ap株)中，已鑒別出涉及保守性內(nèi)核寡糖生物合成的基因。這些菌種顯示的不同的外核變異所涉及的基因已被發(fā)現(xiàn)是變化地存在的，這些數(shù)據(jù)已經(jīng)使用每一菌種的基因組菌株和其他菌株的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)確證。然而結(jié)構(gòu)和遺傳分析(見表A)均表明內(nèi)核結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上是保守的，這是由于總是存在已知負(fù)責(zé)內(nèi)核生物合成的基因。
表A.獸類病原體的保守性內(nèi)核LPS的糖基轉(zhuǎn)移酶

獸類病原體基因組菌株中的保守性內(nèi)核糖基轉(zhuǎn)移酶

*使用來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)菌株WK-20(Rd)的內(nèi)核LPS糖基轉(zhuǎn)移酶對獸類病原體基因組進(jìn)行Blast運(yùn)算后獲得的e值，其中除了lbgB使用的是來自Pm70基因組的PM1144。
基因組數(shù)據(jù)獲自Baylor College of Medicine，Houston(Mh)；Department of Microbiology and Immunology，Laboratory for Genomicsand Bioinformatics，Oklahoma University Health SciencesCenter(Pm-3480 and Ap1)；Institute for Biological Sciences，National Research Council，Ottawa，Canada(Ap5)；ComputationalBiology Centre，University of Minnesota(Pm70).
ii)結(jié)構(gòu)保守性到目前為止申請人所研究的每個菌株中，此四-庚糖基-二-葡糖基部分總是包含于下列結(jié)構(gòu)元件(結(jié)構(gòu)II)中

結(jié)構(gòu)II其中-R是H或者磷酸乙醇胺(PEtn)，P是磷酸酯，R’和R″是H或者寡糖鏈延伸，優(yōu)選不包括β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)，R是Ap中可變的O-抗原，Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，脂質(zhì)A(Lipid A)是去毒的。
表B獸類病原體溶血性曼氏桿菌(Mh)、胸膜肺炎放線桿菌(Ap)和多殺性巴氏桿菌(Pm)的LPS的核寡糖中保守區(qū)和可變區(qū)的結(jié)構(gòu)。

對于Pm來說，庚糖殘基HepIV是L-α-D構(gòu)型。同樣在Pm中，HepI的6位的α-葡萄糖殘基在少數(shù)糖型中缺失，同時伴隨有Kdo殘基的結(jié)構(gòu)不同，此時Kdo的4位上不是P-R，而是第二個Kdo殘基。
第一個庚糖殘基(HepI)是唯一一個在所有三個菌種Ap、Mh和Pm中顯示從該殘基發(fā)生核寡糖延伸的庚糖殘基。外核延伸從HepIV殘基進(jìn)一步伸長。在所有菌種中均未觀察到從HepII或HepIII的核寡糖延伸。在Ap血清型5中發(fā)現(xiàn)了從HepIII殘基發(fā)生的O-抗原延伸[St.Michael，F(xiàn).et.al.2004，Carbohydr.Res.，3391973-1984]，未顯示出Mh中O-抗原附著于核心OS的位置。Pm中未觀察到抗原聚合物重復(fù)單元。已經(jīng)顯示四個基因涉及Ap血清型1中的O-抗原的生物合成，包括rfbP和rfbU，它們的突變會產(chǎn)生沒有O-抗原的Ap菌株[Labrie，J.et al.2002，J.Endotox.Res.，827-38]。所有三個菌種的內(nèi)核均可被磷酸乙醇胺殘基進(jìn)一步取代，可以在Pm菌株P(guān)m70的HepII殘基的3位，也可以在所有菌種AP、Mh和Pm中的Kdo-P殘基。在Pm中，少數(shù)種類LPS糖型顯示出具有兩個Kdo殘基而不是Kdo-P或者Kdo-P-PEtn部分，第二個Kdo殘基的存在同時伴有內(nèi)核α-Glc殘基的缺失。在所研究的三個菌種的內(nèi)部和它們之間都觀察到外核變異。在Ap血清型1中，使用NMR對外核延伸進(jìn)行完全地結(jié)構(gòu)表征，顯示寡糖延伸(1S)-GalaNAc-(1-4，6)-α-Gal-(1-3)-p-Gal的末端含有少見的開鏈N-乙酰半乳糖胺。該結(jié)構(gòu)還可從血清型9和11的質(zhì)譜中推知。在Ap血清型2中，發(fā)現(xiàn)HepIV殘基在4位被β-Glc殘基二取代，在6位被D，D-α-HepV殘基二取代。在Ap血清型5中，只有D，D-α-HepV殘基取代HepIV。在Mh中觀察到與在Ap血清型5中所發(fā)現(xiàn)的相似的外核延伸，其中第二個D，D-α-HepV殘基本身在7位被β-Gal殘基取代。在Pm中，對兩個血清型1菌株VP 161和X73的研究揭示了異常的外核延伸，其中HepIV殘基在4和6位被β-Gal殘基對稱取代，它們本身又在3位被磷酸膽堿部分單取代，或者除了磷酸膽堿殘基，在β-Gal殘基的6位還具有磷酸乙醇胺殘基(X73)。對基因組測序菌株P(guān)m70的另一項(xiàng)研究再一次表明HepIV殘基在4和6位被二取代。在4位被β-葡萄糖殘基取代，在6位被不常見的戊多糖α-GalNAc-(1-3)-β-GalNAc-(1-3)-α-Gal-(1-4)-β-Gal-(1-4)-β-Glc取代。
iii)可達(dá)性既然該內(nèi)核結(jié)構(gòu)在這三個菌種中總是表達(dá)，所以弄清以下問題非常重要，即是否該內(nèi)核結(jié)構(gòu)表位總是可接近的并且在構(gòu)象上是保守的，而不管外核、O-抗原和其他細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如何變異。為實(shí)現(xiàn)此目的，該保守性結(jié)構(gòu)需要被加工成末端結(jié)構(gòu)，并將糖基轉(zhuǎn)移酶靶向該末端，以暴露該結(jié)構(gòu)。利用Pm菌株P(guān)m70的完全基因組序列以及對該菌株LPS結(jié)構(gòu)的完全的了解(見實(shí)施例3)，可幫助實(shí)驗(yàn)中識別負(fù)責(zé)Pm70 LPS結(jié)構(gòu)的生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶。也包括第二個Pm菌株(P-3480)、兩個Ap菌株(血清型1和5)和一個Mh菌株(血清型A1)這些其他基因組序列，并利用生物信息學(xué)方法識別發(fā)生誘變的靶基因。選擇Mh菌株A1進(jìn)行誘變研究，這是由于在該生物中存在的O-抗原的量與Ap相比較低，因而不會干擾隨后的免疫研究。如下所示，在a)Mh菌株A1和b)Ap血清型1中均鑒別出候選糖基轉(zhuǎn)移酶。
杜克雷嗜血桿菌(H.ducreyi)lbgA半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的同源物[Tull ius，M.V.et al 2002，Infect.Immun.702853-2861]已通過mini-Tn10轉(zhuǎn)座子發(fā)生誘變在Ap中識別，它位于涉及核寡糖生物合成的兩個基因之間[Galarneau，C.et al 2000，Pathogenesis，1253-264]。Ap中相鄰的基因lbgB顯示出與來自杜克雷嗜血桿菌的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶的相當(dāng)大的同源性。使用Ap的lbgB基因序列對Mh基因組序列(Baylor College，Houston)進(jìn)行Blast分析，揭示出在Mh基因組序列中有兩個相鄰的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶的同源物。所識別的最佳lbgB同源物據(jù)推測為負(fù)責(zé)在第一個L-甘油-D-甘露-庚糖殘基(HepI)的延伸上添加第一個D-甘油-D-甘露-庚糖殘基(HepIV)的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶，因此我們推測，第二個同源物(我們稱為losB)是負(fù)責(zé)添加第二個D-甘油-D-甘露-庚糖殘基(HepV)的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶。
利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)使該基因發(fā)生突變，突變株產(chǎn)生的LPS經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定顯示，已經(jīng)獲得了所靶向的保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)(見實(shí)施例7)。誘導(dǎo)針對此內(nèi)核LPS結(jié)構(gòu)的mAb和pAb，以檢驗(yàn)在這些獸類病原體的一定范圍的菌株中此結(jié)構(gòu)的保守性和可達(dá)性的程度。所獲得的多克隆血清可與這三個菌種Mh、Ap和Pm中每一種的LPS和全細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。從一個融合物獲得了四種mAb(G3、G8、E8和D8)，它們特異性針對Mh全細(xì)胞上所呈現(xiàn)的內(nèi)核構(gòu)象。從另一個融合物中獲得了三種mAb(3-4、3-5和3-16)，它們能夠與Ap、Pm和Mh的所有研究過的菌株的LPS發(fā)生交叉反應(yīng)，因而建立了這三種重要的獸類病原體之間共有的保守性交叉反應(yīng)性LPS表位的可能性。由這些mAb中的四種(G3、G8、3-5和3-16)產(chǎn)生腹水，使用全細(xì)胞ELISA進(jìn)行檢測，顯示由這些mAb識別的LPS表位在全細(xì)胞上是可接近的，從而證明該保守性內(nèi)核表位在細(xì)胞表面上是可接近的。而且，mAb G3和G8在有助于被動保護(hù)，表明在體內(nèi)可接近此內(nèi)核結(jié)構(gòu)。
iv)功能性抗體含有可與所研究的菌種的LPS交叉反應(yīng)的抗體的多克隆血清，以及mAb G8和G3能夠幫助補(bǔ)體介導(dǎo)的Mh細(xì)胞的溶解。在完善的Mh感染的小鼠模型中進(jìn)行被動保護(hù)研究，顯示提供特異性針對Mh中此保守性內(nèi)核LPS結(jié)構(gòu)的mAb(G3和G8)能夠預(yù)防疾病。最后，制備了將該保守性糖結(jié)構(gòu)與載體蛋白HSA連接的聯(lián)合疫苗，使用該聯(lián)合疫苗進(jìn)行免疫接種后收集小鼠血清，發(fā)現(xiàn)該血清可與所研究的這三個菌種的LPS和全細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供適于提供免疫力的疫苗、疫苗組分及其應(yīng)用，所述免疫力涉及來自獸類細(xì)菌性病原體脂多糖(LPS)的B細(xì)胞活化分子，所述分子包括該脂多糖的內(nèi)核寡糖部分的一個或多個表位。本文公開的內(nèi)容識別和表征了獸類細(xì)菌性病原體的一定范圍的致病分離株的LPS上表達(dá)的表位，所述致病分離株包括但不必限于胸膜肺炎放線桿菌(Ap)、溶血性曼氏桿菌(Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pm)。本文識別了適用于制備疫苗的確定的亞單位抗原。作為疫苗候選物的抗原優(yōu)選以其自然狀態(tài)呈現(xiàn)于細(xì)菌表面，以使針對該疫苗抗原的免疫應(yīng)答隨后可靶向活生物體。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并制備出所有三種生物體共有的內(nèi)核LPS。已顯示LPS在對這些獸類病原體的每一種都具有免疫力作用，如果LPS抗原在構(gòu)象上保守，那么免疫應(yīng)答可能會識別同源和異源菌株甚至菌種。
結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)表明，所有這些獸類病原體都有一個共同的保守性內(nèi)核OS結(jié)構(gòu)。因此決定探索基于LPS的疫苗的可能性。
該過程的第一步是構(gòu)建以末端暴露結(jié)構(gòu)的形式只表達(dá)保守性內(nèi)核OS表位的突變株。該研究已經(jīng)從Mh菌株A1產(chǎn)生α-1，6-D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶基因的突變體，以便以末端暴露部分的形式呈現(xiàn)保守性內(nèi)核表位。
誘導(dǎo)針對此內(nèi)核LPS結(jié)構(gòu)的mAb和pAb，以檢驗(yàn)在這些獸類病原體的一定范圍的菌株中此結(jié)構(gòu)的保守性和可達(dá)性的程度。獲得了三種mAb，它們能夠與Ap、Pm和Mh的所有研究過的菌株的LPS發(fā)生交叉反應(yīng)，因而建立了這三種重要的獸類病原體之間共有的保守性交叉反應(yīng)性LPS表位的可能性。
全細(xì)胞ELISA分析顯示，這些LPS表位可由mAb在全細(xì)胞上識別，從而證明該內(nèi)核表位在細(xì)胞表面上是可接近的。識別內(nèi)核寡糖的mAb能夠幫助補(bǔ)體介導(dǎo)的Mh細(xì)胞的殺菌性溶解。在完善的Mh感染的小鼠模型中進(jìn)行被動保護(hù)研究，顯示提供特異性針對此保守性內(nèi)核LPS結(jié)構(gòu)的mAb能夠預(yù)防疾病。最后，制備了將該保守性糖結(jié)構(gòu)與載體蛋白HSA連接的聯(lián)合疫苗，使用該聯(lián)合疫苗進(jìn)行免疫接種后收集小鼠血清，發(fā)現(xiàn)該血清可與所研究的這三個菌種發(fā)生交叉反應(yīng)。
一方面，本發(fā)明提供一種脂多糖部分，包括不含可變的外核寡糖鏈延伸的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核。
另一方面，本發(fā)明提供一種脂多糖部分，包括具有下列結(jié)構(gòu)II的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分。
結(jié)構(gòu)II其中-R是H或者磷酸乙醇胺(PEtn)，P是磷酸酯，R’和R″是H或者寡糖鏈延伸，優(yōu)選不包括β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)，R是Ap中可變的O-抗原，Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，脂質(zhì)A(Lipid A)是去毒的。
另一方面，本發(fā)明提供一種為動物宿主提供針對由Mh、Ap或Pm引起的疾病的保護(hù)的免疫原性組合物，包括上述的脂多糖部分中的一種。
另一方面，本發(fā)明提供LPS生物合成途徑中至少一種基因在制備Mh、Ap或Pm的脂多糖中的應(yīng)用，用以獲得包含上述脂多糖部分中的一種的突變株。
另一方面，本發(fā)明提供至少一種免疫原性表位在誘導(dǎo)針對Mh、Ap或Pm的功能性交叉反應(yīng)抗體中的應(yīng)用，其中所述表位包括上述脂多糖部分中的一種。
另一方面，本發(fā)明提供一種功能性抗體，該抗體針對Mh、Ap或Pm可發(fā)生交叉反應(yīng)，并且該抗體是由上述的脂多糖部分中的一種誘導(dǎo)的。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備針對Mh、Ap或Pm的功能性交叉反應(yīng)抗體的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生針對上述的脂多糖部分中的一種的抗體，(b)將抗體針對多種Mh、Ap和Pm菌株進(jìn)行測試，(c)選擇可交叉反應(yīng)的抗體。
另一方面，本發(fā)明提供一種針對由Mh、Ap或Pm感染導(dǎo)致的疾病對宿主進(jìn)行免疫接種的方法，該方法包括將免疫有效量的上述免疫原性組合物給予宿主。
以下保守性內(nèi)核LPS結(jié)構(gòu)已經(jīng)在Mh、Ap和Pm中識別。該結(jié)構(gòu)可用作對所有菌株有效的疫苗候選物。所有三個菌種都具有此相同的結(jié)構(gòu)單位這一意外發(fā)現(xiàn)，使得能夠基于該保守性結(jié)構(gòu)制備多菌種疫苗。
其中-R是H或者磷酸乙醇胺(PEtn)，P是磷酸，R’和R″是H或者寡糖鏈延伸，優(yōu)選不包括β-D-Galp-(1-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)，R是Ap中可變的O-抗原，Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸，脂質(zhì)A(Lipid A)是去毒的。
為了表征各菌種中這些保守性結(jié)構(gòu)而進(jìn)行的結(jié)構(gòu)分析在實(shí)施例1(Mh)、實(shí)施例2(Ap)和實(shí)施例3～5(Pm)中詳細(xì)敘述。實(shí)施例1描述了溶血性巴氏桿菌的血清型A1 LPS的結(jié)構(gòu)分析。實(shí)施例2描述了來自幾種Ap血清型的LPS的結(jié)構(gòu)分析，由此首先識別出Mh和Ap的內(nèi)核分子在結(jié)構(gòu)上的親緣關(guān)系。實(shí)施例3描述了來自Pm的基因組菌株的LPS的結(jié)構(gòu)分析，由此首先識別了所有三個菌種的內(nèi)核分子的結(jié)構(gòu)保守性。實(shí)施例4描述了Pm菌株VP161的LPS的結(jié)構(gòu)分析。實(shí)施例5描述了Pm菌株X73的核寡糖的結(jié)構(gòu)分析。實(shí)施例6描述了Pm的orfH基因、Hep III到Hep II庚糖轉(zhuǎn)移酶的識別。實(shí)施例7描述了顯示出獸類病原體特異性的保守的LPS結(jié)構(gòu)的、溶血性曼氏桿菌的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶突變型的產(chǎn)生，以及針對此LPS結(jié)構(gòu)的抗體的開發(fā)及其交叉反應(yīng)性。實(shí)施例8描述了利用該保守性內(nèi)核LPS分子作為糖部分的糖聯(lián)合疫苗的產(chǎn)生和研究。實(shí)施例9描述了使用內(nèi)核特異性單克隆抗體和多克隆血清獲得的殺菌實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)施例10描述了使用內(nèi)核特異性單克隆抗體獲得的被動保護(hù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)?？偟膩碚f，這些實(shí)施例表明，這些內(nèi)核脂多糖表位可作為疫苗候選物，用以預(yù)防由LPS分子中包含該內(nèi)核結(jié)構(gòu)的菌種引起的疾病。
由莢膜多糖構(gòu)成的疫苗可有效預(yù)防由同源的有莢膜細(xì)菌引起的人類疾病。由于缺少T細(xì)胞依賴性應(yīng)答，這些糖抗原在人體中的免疫原性通常較差。然而，通過將特異性多糖抗原與適當(dāng)?shù)牡鞍纵d體聯(lián)合，糖抗原的免疫原性相對于多糖本身可有極大提高?；赽型流感嗜血桿菌(Hib)和c型腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)的糖聯(lián)合疫苗(例如ProHiBit，MenC)已經(jīng)證實(shí)可成功控制侵入性Hib和腦膜炎球菌病。
通常的做法是將保守性內(nèi)核LPS分子以適當(dāng)?shù)姆绞脚c適當(dāng)?shù)妮d體分子聯(lián)合，以便在對宿主進(jìn)行免疫接種后誘發(fā)期望的免疫應(yīng)答。
免疫原性載體蛋白優(yōu)選地選自破傷風(fēng)毒素/類毒素、白喉毒素/類毒素(CRM197)、去毒的綠膿桿菌(P.aeruginosa)毒素A、霍亂毒素/類毒素、百日咳毒素/類毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)外毒素/類毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、輪狀病毒VP 7蛋白、呼吸道合胞體病毒F和G蛋白或者其他適當(dāng)?shù)妮d體。
佐劑優(yōu)選地選自弗氏佐劑、明礬和Ribi，或者其他任何制藥上可接受的佐劑。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了一種誘導(dǎo)或增強(qiáng)動物、魚類或鳥類針對細(xì)菌性病原體的免疫力的方法，包括給予保守性內(nèi)核LPS分子。在一些情況下，所述細(xì)菌性病原體為曼氏桿菌(Mannheimia)、放線桿菌(Actinobacillus)或者巴氏桿菌(Pasteurella)。在一些實(shí)例中，所述細(xì)菌性病原體為感興趣的獸醫(yī)中的生物體。給藥可通過任何適當(dāng)?shù)耐緩竭M(jìn)行，包括注射、施用于粘膜、經(jīng)皮施用、口服(優(yōu)選適當(dāng)?shù)匕?等等。在一些實(shí)例中，內(nèi)核LPS分子與適當(dāng)?shù)妮d體分子連接或結(jié)合。在一些實(shí)例中，還使用適當(dāng)?shù)淖魟?。在一些?shí)例中，內(nèi)核LPS與抗菌藥或其他免疫激發(fā)物共同給藥。在一些實(shí)例中，保守性內(nèi)核LPS分子是結(jié)構(gòu)I的內(nèi)核LPS。在一些實(shí)例中，保守性內(nèi)核LPS分子是結(jié)構(gòu)II的內(nèi)核LPS，但沒有本文所定義的一個或兩個R和R1。在一些實(shí)例中，保守性內(nèi)核LPS為至少下述一種Q P6 4a)Hep-(1-6)-β-Glc-(1-4)-L，D-α-Hep-1-5-α-Kdo3XQ6b)Hep-(1-6)-β-Glc-(1-4)-L，D-α-Hep3XQ P6 4c)Glc-(1-4)-L，D-α-Hep-1-5-α-Kdo3XQ6d)Glc-(1-4)-L，D-α-Hep3X
d)Hep-(1-6)-β-Glc-(1，4)-L，D-α-Hep3XP4f)Hep-(1-6)-β-Glc-(1，4)-L，D-α-Hep-1-5-α-Kdo3X其中Q是 X是 P是磷酸酯。
在一些實(shí)例中，保守性內(nèi)核LPS是上述的一個或多個分子a-f或者所公開的通常結(jié)構(gòu)(具有或者沒有R和R1)之一的變異體，其中一個或多個末端糖是以異構(gòu)體或者經(jīng)過修飾以維持其特定的異構(gòu)體的形式出現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了上述的抗原性LPS來源的寡糖，該寡糖沒有與其他寡糖連接的共價鍵。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了一種制備疫苗的方法，包括將保守性內(nèi)核LPS分子或者其部分和/或變異體與免疫原性載體蛋白相連。在一些實(shí)例中，可將佐劑與LPS分子-載體蛋白一起提供。


圖1顯示來自溶血性曼氏桿菌血清型A1 LPS的核心寡糖組分在D2O(300 K，pH 3)中600MHz的質(zhì)子NMR光譜。HOD共振在4.756ppm。端基異構(gòu)體區(qū)4.4ppm以上的共振與Kdo亞甲基共振一起標(biāo)注。標(biāo)注為A1的確定的結(jié)構(gòu)以及殘基的命名也為公知。由于主鏈寡糖的部分截短而導(dǎo)致的異質(zhì)性在連接位點(diǎn)以虛箭頭標(biāo)出。在文字中，由于異質(zhì)性而導(dǎo)致的f的較小組分標(biāo)示以f’。HepI、HepII和HepIII是D-D-庚糖。其他殘基具有D-構(gòu)型。
圖2顯示A1的2D NMR實(shí)驗(yàn)，顯示端基異構(gòu)體區(qū)的HMQC光譜(a)，以及端基異構(gòu)體區(qū)和環(huán)區(qū)的COSY(b)和NOESY(c)光譜。箭頭指示觀察到的位于k5附近的b2共振的位置。
圖3顯示從A1的異核1H-13C 2D NMR光譜中選出的圖。(a)在環(huán)區(qū)的HMQC光譜中，在可能的地方標(biāo)出了一些歸屬。(b)在HMQC-TOSCY光譜中，標(biāo)出了C7-H7s-C6-H6、C4-H4-C5-H5 TOCSY的相關(guān)性以及b2的相關(guān)性。(c)在HMBC光譜中，顯示了端基異構(gòu)體質(zhì)子共振的H1-C1-01-Cx糖苷間相關(guān)性以及殘基內(nèi)相關(guān)性。
圖4顯示了識別A1中非庚糖殘基的1D選擇實(shí)驗(yàn)。(a)1D TOCSY(a1，180ms)；(b)1D TOCSY(h1，180ms)；(c)1D TOCSY(i1 k4，180ms)；(d)1D NOESY-TOCSY(i1 k4，400ms；k6 180ms)；(e)1D NOESY-TOCSY(del，400ms；g3 k7，180ms)；(f)1D TOCSY(c1，180ms)；(g)1D TOCSY j1，180ms)；(h)1D TOCSY-NOESY(j1，180ms；j4，400ms)。由于異質(zhì)性導(dǎo)致的f和h的微量組分分別表示為f’和h’?？捎脮r，第一選擇步驟的共振以下劃線標(biāo)出，第二選擇步驟的共振以雙下劃線標(biāo)出。所選的端基異構(gòu)體區(qū)的共振在光譜左側(cè)標(biāo)出。
圖5顯示檢測A1中偶極相互作用的1D選擇實(shí)驗(yàn)。(a)-(f)分別為b1、c1、de1、f1、g1和i1/k4的200ms混合時間的端基異構(gòu)體區(qū)共振的1D NOESY光譜，(g)為j1的1D ROESY(f1，500ms)。所選的端基異構(gòu)體區(qū)共振在光譜的左側(cè)標(biāo)出。
圖6顯示庚糖單糖的質(zhì)子光譜。D2O、300K條件下在600MHz的提高分辨率的D-L-庚糖光譜(a)，及其α(b)和β形式(c)的增強(qiáng)光譜。D2O、300K條件下在600MHz的提高分辨率的D-D-庚糖光譜(d)，及其α(e)和β形式(f)的自旋模擬光譜。端基異構(gòu)體和H5-β共振未知。注意到H-3、H-4共振的強(qiáng)耦合和H-5共振的虛擬耦合在(b)中可正確地重現(xiàn)。
圖7顯示識別A1中庚糖殘基的1D選擇實(shí)驗(yàn)。(a)1D TOCSY-TOCSY(b1，75ms；b2，75ms)以檢測b3、b4和b5；(b)1D TOCSY-NOESY(b2，150ms；b5，400ms)以檢測b5-b6和b5-b3 NOE。還要注意由于b(1-3)d鍵引起的強(qiáng)b5-d2 NOE；(c)1d TOCSY-TOCSY(de1，75ms；e2，75ms)以檢測e3、e4和e5；(d)1D TOCSY-TOCSY(de1，75ms；d2，75ms)以檢測d3、d4和d5；(e)1d TOCSY-TOCSY(g1，90ms；g2，150ms)以檢測g3到g5；(f)1DTOCSY-NOESY(g2，150ms；g5，400ms)顯示根據(jù)g(1-6)I鍵的g5-g6和g5-g3 NOE以及g5-i6 NOE；(g)1D NOESY-TOCSY(f1，400ms；g6，180ms)以檢測根據(jù)f(1-6)g鍵的來自f1-g6糖苷間NOE的g7共振；(h)1DTOCSY-TOCSY(f1，90ms；f2，150ms)以檢測直到H-6的f和f’共振。注意f5和f’5的清晰的多重峰圖譜；(i)1D TOCSY(f6，40ms)以檢測只是由于較短的自旋鎖定時間而導(dǎo)致的f7共振。可用時，第一選擇步驟的共振以下劃線標(biāo)出，第二選擇步驟的共振以雙下劃線標(biāo)出。所選的端基異構(gòu)體區(qū)共振在光譜左側(cè)標(biāo)出。
圖8顯示對A1的內(nèi)核庚糖進(jìn)行MMC計算所得的最小能量的構(gòu)象異構(gòu)體的分子模型。氧繪成較大的球，并且去掉了羥基質(zhì)子。有關(guān)的質(zhì)子被標(biāo)出。注意觀察到了e-b分支和g-i分支相緊鄰，以及殘基e的外環(huán)鏈和殘基b的端基異構(gòu)體質(zhì)子相緊鄰與遠(yuǎn)程N(yùn)OE相一致。同時注意到L-D-庚糖(殘基d、b、e)和D-D-庚糖(殘基g)之間外環(huán)鏈方向的不同。
圖9顯示通過對A1的內(nèi)核庚糖進(jìn)行MMC計算得出的質(zhì)子間距離與宏觀運(yùn)動(macro move)的變化，其中(a)-(g)分別對應(yīng)b1-e5、b1-e7、e1-i4、e1-g2、g1-b2、g1-b3。質(zhì)子間距離出現(xiàn)在2-4范圍內(nèi)與所觀察到的遠(yuǎn)程b-e、e-i和e-g NOE相一致。
圖10顯示使用脂質(zhì)A構(gòu)建的溶血性曼氏桿菌LPS的分子模型，其中所述脂質(zhì)A具有能報道流感嗜血桿菌LPS的脂肪酰取代型式。脂質(zhì)A部分和Kdo標(biāo)成灰色，庚糖標(biāo)成紅色或紫色，葡萄糖標(biāo)成綠色，半乳糖標(biāo)成藍(lán)色。PO4基因是黃色。已經(jīng)去掉了羥基質(zhì)子。
圖11.Ap血清型5a核心OS的陰離子電噴射質(zhì)譜圖。
圖12.Ap血清型a)5a；b)5b；c)2；d)1的核心OS的1H-NMR光譜的端基異構(gòu)體區(qū)。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖13.Ap血清型5殘基a)Hep I；b)Hep II；c)Hep III；d)HepIV；e)Hep V；f)Glc II；g)Glc I；h)Gal I的核心OS的選擇性1D-TOCSYNMR光譜的環(huán)區(qū)。字母代表的各殘基如實(shí)施例2的表2中所示。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄，庚糖殘基的混合時間是150ms，己糖殘基的混合時間是90ms。
圖14.Ap血清型5a殘基a)Hep III；b)Hep II；c)Glc I；d)GlcII；e)Hep IV；f)Hep V的核心OS的選擇性1D-NOESY NMR光譜的環(huán)區(qū)。字母代表的各殘基如實(shí)施例2的表2中所示。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄，混合時間是400ms。
圖15.確定Ap血清型5a的核心OS的O-鏈Gal I殘基的位置。a)GalI的端基異構(gòu)體1H-共振的1D-NOESY NMR光譜；b)NOESY步驟中Gal I殘基的端基異構(gòu)體1H-共振和TOCSY步驟中Hep III殘基的H-71H-共振的1D-NOESY-TOCSY光譜；c)TOCSY步驟中Hep III殘基的端基異構(gòu)體1H-共振和NOESY步驟中Hep III殘基的H-4/H-51H-共振的1D-TOCSY-NOESY光譜。d)13C-1H-HMBC NMR光譜的區(qū)域，顯示Gal I和Glc I的端基異構(gòu)體1H-共振的HMBC。e)13C-1H-HSQC NMR光譜的區(qū)域，顯示Hep III的H-71H-共振、Hep V的H-21H-共振和Hep II的H-31H-共振的13C交疊峰。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖16.Ap血清型1的核心OS的陽離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。產(chǎn)物離子譜來自m/z9302+。
圖17.識別Ap血清型1的核心OS的開鏈N-乙酰半乳糖胺殘基。a)Ap血清型1的核心OS的2D-13C-1H-HSQC NMR光譜的環(huán)區(qū)。b)Ap血清型1的核心OS的1H-NMR光譜的環(huán)區(qū)。c)GalNAc殘基的H-11H-共振的1-D NOESY光譜。d)GalNAc殘基的H-41H-共振的1-D NOESY光譜。e)GalNAc殘基的H-21H-共振的1-D NOESY光譜。f)HexNAc殘基的H-41H-共振的1-D NOESY光譜。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。識別的共振如標(biāo)注所示(i，GalNAc；j，Gal II)。
圖18.Ap血清型1、2、5a和5b的核心寡糖的一個實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)示意圖。對于血清型1；R是α-GaloNAc-(1-4，6)-β-Gal II-(1-3)-β-GalI，R’是H，其中o代表開鏈構(gòu)型。對于血清型2；R是β-Glc III，R’是D-α-D-Hep V。對于血清型5a和5b；R是H，R’是D-α-D-Hep V。
圖19.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心OS的陰離子電噴射質(zhì)譜圖。
圖20.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心OSm/z 1246.52+的MS/MS的陽離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。
圖21.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心OSm/z 316+的先驅(qū)離子掃描的陽離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。
圖22.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70的完全脫酰LPS的1H-NMR光譜的端基異構(gòu)體區(qū)。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。殘基如實(shí)施例3表2所示標(biāo)注。
圖23.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心OS的TOCSY光譜的端基異構(gòu)體區(qū)的一部分。該光譜在D2O中25℃下記錄。
圖24.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心OS的NOESY光譜的端基異構(gòu)體區(qū)的一部分。該光譜在D2O中25℃下記錄。
圖25.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心OS的1H-13C-HMBC NMR光譜的端基異構(gòu)體區(qū)。嵌入物(inset)是顯示N-乙酰-氨基糖的診斷信號的光譜區(qū)。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖26.多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70核心寡糖的結(jié)構(gòu)，顯示推測的糖基轉(zhuǎn)移酶。
圖27.Pm菌株VP161的LPS-OH的陰離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。a)m/z 9923-的產(chǎn)物離子光譜，b)m/z 9993-的產(chǎn)物離子光譜，c)m/z 10403-的產(chǎn)物離子光譜。
圖28.Pm菌株VP161的核心OS的陽離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。a)m/z 9032+的產(chǎn)物離子光譜，b)m/z 9842+的產(chǎn)物離子光譜，c)利用高口壓(oriffice voltage)的m/z 4242+的產(chǎn)物離子光譜。
圖29.Pm菌株VP161核心OS的2D-NOESY NMR光譜區(qū)域。字母代表的各殘基如實(shí)施例4的表2中所示。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄，混合時間為400ms。
圖30.Pm菌株VP161核心OS的2D-13C-1H-HMBC NMR光譜區(qū)域，顯示端基異構(gòu)體1H-共振(小寫字母)和環(huán)13C-共振(大寫字母)的相關(guān)性。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖31.Pm菌株VP161核心OS的2D-31P-1H-HSQC-TOCSY NMR光譜區(qū)域，顯示標(biāo)以g-1到g-4和h-1到h-4的半乳糖殘基和膽堿共振的31P-共振(X-軸)和1H-共振(Y-軸)的相關(guān)性。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖32.Pm菌株VP161的完全脫酰LPS的1H-NMR光譜。a)含一個Kdo殘基的糖型；b)含兩個Kdo殘基的糖型。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。字母代表的各殘基如實(shí)施例4表2所示。*Gal I(g)和Gal II(h)的H-4質(zhì)子共振的低區(qū)移位是由于KOH處理過程中PCho殘基的水解和遷移造成的。
圖33.Pm菌株X73核心OS的陽離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。a)m/z 11082+的產(chǎn)物離子光譜，b)利用高口壓的m/z 451.5+的產(chǎn)物離子光譜。
圖34.Pm菌株X73核心OS的2D-31p-1H-HMQC-TOCSY NMR光譜區(qū)域，顯示PEtn和半乳糖殘基之間31P-1H耦合當(dāng)混合時間優(yōu)化為10 Hz時31P-共振(X-軸)和1H-共振之間的相關(guān)性。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖35.Pm菌株X73核心OS的2D-13C-1H-HSQC-TOCSY NMR光譜區(qū)域，顯示13C-共振(Y-軸)和1H-共振之間的相關(guān)性，表明半乳糖殘基的C-5、C-6、H-5和H-6共振的相關(guān)性。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄。
圖36.通過對全細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE和銀染色，分析多殺性巴氏桿菌的LPS。(A)多殺性巴氏桿菌LPS圖樣的比較野生型VP161(泳道1)；庚糖基轉(zhuǎn)移酶突變體AL251(泳道2)；對照菌株AL438(含有載體質(zhì)粒pAL99的AL251)(泳道3)以及互補(bǔ)的突變株AL298(泳道4)。
(B)多殺性巴氏桿菌LPS圖樣的比較糖基轉(zhuǎn)移酶突變體AL251(泳道1)；野生型VP161(泳道2)以及從AL251接種的三只不同的雞中分離的多殺性巴氏桿菌野生型回復(fù)體(泳道3、4和5)。
圖37.多殺性巴氏桿菌核心OS的陰離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。(A)親株VP161核心OS的雙電荷區(qū)域；(B)突變株AL251核心OS的單電荷區(qū)域。
圖38.來自(A)多殺性巴氏桿菌親株VP161和(B)多殺性巴氏桿菌突變株AL251的LPS核心OS的1H-NMR光譜區(qū)域。該光譜在25℃下記錄，并以內(nèi)丙酮在2.225ppm下作為參考基準(zhǔn)。
圖39.多殺性巴氏桿菌VP 161核心OS的NOESY光譜區(qū)域。NOE連接性如圖所示。嵌入物；VP 161內(nèi)核OS結(jié)構(gòu)。該光譜在25℃下記錄，并以內(nèi)丙酮在2.225ppm下作為參考基準(zhǔn)。
圖40.來自(A)親株VP161和(B)突變株AL251的多殺性巴氏桿菌內(nèi)核LPS的推測的結(jié)構(gòu)，其中R是Glc上的寡糖鏈延伸。
圖41.a)溶血性曼氏桿菌菌株A1，b)胸膜肺炎放線桿菌血清型1的核心寡糖的結(jié)構(gòu)示意圖。表示出外核修飾的第一階段中起作用的糖基轉(zhuǎn)移酶。
圖42.a)溶血性曼氏桿菌突變株losB的O-脫酰LPS，和b)使用含losB基因的pNF 2176AAlosB反向互補(bǔ)的溶血性曼氏桿菌突變株losB的O-脫酰LPS的陰離子毛細(xì)管電泳-電噴射電離質(zhì)譜圖。
圖43.野生型溶血性曼氏桿菌菌株A1和突變株losB的完全脫酰LPS的2D-TOCSY NMR光譜區(qū)域。各殘基的表示如圖所示，并將losB突變株缺少的外核殘基圈出。該光譜在pH 7.0的D2O中25℃下記錄，混合時間為400ms。
圖44.小鼠#1-5的D42多克隆血清的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB(▲)和wt(■)的純化的LPS。小鼠標(biāo)號如圖所示。所有血清稀釋液如圖所示。
圖45.九種內(nèi)核LPS mAb的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株MhlosB和wt，App血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS，以及Mh和Pm菌株的LPS-OH。mAb標(biāo)號和稀釋液如圖所示。
圖46.小鼠#1、小鼠#2+3、小鼠#4和小鼠#5的D42多克隆血清的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、App血清型1和5a以及Pm菌株VP 161和X73的LPS。小鼠標(biāo)號如圖所示。所有血清以1∶50的稀釋度使用。
圖47.小鼠#5的D152多克隆血清的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、App血清型1和5a以及Pm菌株VP 161和X73的LPS。稀釋度如圖所示。
圖48.兩種代表性內(nèi)核LPS mAb的廢上清液(spent supernatant)的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP 161和X73的LPS。MAb標(biāo)號和稀釋度如圖所示。
圖49.使用Mh losBKOH處理的LPS的陰離子毛細(xì)管電泳-電噴射質(zhì)譜圖。
圖50.MhlosB-HAS結(jié)合物的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。在12.5％SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，并用稀釋度為1∶106的糖特異性mAb G8進(jìn)行印跡和篩選。
圖51.對a)HSA；b)HSA-MhlosB糖結(jié)合物的CE-ES-MS分析。
圖52.已接種小鼠#V1-V5和對照小鼠C6、C8和C9的D23多克隆血清的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB的LPS，該實(shí)驗(yàn)用來篩選IgG應(yīng)答(▲)和IgM應(yīng)答(■)。小鼠標(biāo)號如圖所示。所有血清的稀釋度如圖所示。
圖53.已接種小鼠#V1-V5和對照小鼠C6、C8和C9的D45多克隆血清的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB的LPS，該實(shí)驗(yàn)用來篩選IgG應(yīng)答(▲)和IgM應(yīng)答(■)。小鼠標(biāo)號如圖所示。所有血清的稀釋度如圖所示。
圖54.多克隆血清V2(1∶25 diln)的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS。
圖55.多克隆血清V2(1∶25 diln)的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的全細(xì)胞。
圖56.多克隆血清Mh#1(1∶100 diln)的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的全細(xì)胞。
圖57.多克隆血清Mh#1(1∶100 diln)的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt、Ap血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS。
圖58.來自a)mAb G3和b)mAb G8的腹水的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt的LPS。
圖59.來自a)mAb G3和b)mAb G8的腹水的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh losB和wt；Ap血清型1和5a；Pm菌株VP161、X73和Pm70的全細(xì)胞。
圖60.來自a)mAb 3-5和b)mAb 3-16的腹水的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh wt和Pm菌株VP161的LPS。
圖61.來自a)mAb 3-5和b)mAb 3-16的腹水的ELISA(OD405)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)針對菌株Mh wt和losB；Ap血清型1和Pm菌株VP161和X73以及腦膜炎雙球菌菌株L2 galE的全細(xì)胞。
圖62.使用來自mAb G3和相應(yīng)的補(bǔ)體缺陷對照的免疫血清稀釋液進(jìn)行的血清殺菌試驗(yàn)；其中存活百分率＝[試驗(yàn)的平均#CFU T30/只有Mh的平均#CFU T30]×100％。
圖63.使用來自mAb G8和相應(yīng)的補(bǔ)體缺陷對照的免疫血清稀釋液進(jìn)行的血清殺菌試驗(yàn)；其中存活百分率＝[試驗(yàn)的平均#CFU T30/只有Mh的平均#CFU T30]×100％。
圖64.使用來自Mh losB全細(xì)胞免疫的小鼠(Mh#1 D140)和相應(yīng)的補(bǔ)體缺陷對照的多克隆血清稀釋液進(jìn)行的血清殺菌試驗(yàn)；其中存活百分率＝[試驗(yàn)的平均#CFU T30/只有Mh的平均#CFU T30]×100％。
圖65.對a)mAb G3和b)mAbG8腹水進(jìn)行蛋白A柱純化，對上柱前后的腹水針對Mh wt菌株的LPS進(jìn)行ELISA(OD405)檢測。
圖66.接種后3天(dpi 3)殺死的B組小鼠的肺，顯示在中等大小的支氣管管腔中存在中等數(shù)量的嗜中性粒細(xì)胞。
圖67.接種后3天殺死的C組小鼠的肺，顯示可分辨出支氣管肺炎，并在某些區(qū)域存在少量的淋巴樣細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本實(shí)施例形成了Can.J.Chem.80，1715(2002)中出版物的基礎(chǔ)。研究溶血性曼氏桿菌血清型A1。對溶血性曼氏桿菌血清型A1的LPS的分析表明了Hex3Hep5Kdo為主要的核心寡糖組分。這是通過以下方法測定的對LPS樣品進(jìn)行弱酸水解(1％HOAc，100℃，3h)，對獲得的寡糖組分進(jìn)行1D 1H NMR和FAB-MS分析。對核心寡糖的糖醇乙酸酯和2-丁基苷衍生物進(jìn)行GLC-MS分析表明，在核心寡糖的主要成分中含有D-葡萄糖、D-半乳糖、L-D-庚糖和DD-庚糖，其摩爾比為2∶1∶3∶2。從甲基化分析中發(fā)現(xiàn)D-Gal殘基為末端非還原性部分，并且在具有Hex2Hep5Kdo組成的核心寡糖組分的少數(shù)成分中缺失。通過比色分析確定了Kdo存在于LPS中。
溶血性曼氏桿菌LPS先使用無水肼再使用強(qiáng)堿處理，可生成水溶性脫酰LPS寡糖。脫酰LPS樣品代表包含核心和脂質(zhì)A寡糖部分的天然材料的完整的主鏈寡糖。這通過電噴射電離ESI-MS證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)給出與Hex3Hep5Kdo1HexN2(H2PO3)3對應(yīng)的分子離子作為主要的寡糖組分(見實(shí)驗(yàn)部分)。
在質(zhì)子光譜(圖1)以及HMQC和COSY光譜(圖2)中，觀察到10個端基異構(gòu)體1H NMR共振和亞甲基質(zhì)子共振。對端基異構(gòu)體共振，按其1H NMR化學(xué)位移的降序標(biāo)以a-j，Kdo的亞甲基質(zhì)子標(biāo)以k3eq和k3ax。b1和de1和j1端基異構(gòu)體峰的積分比其他端基異構(gòu)體共振峰的積分少40％，證實(shí)了在該樣品中的異質(zhì)性。在h1附近4.91ppm處出現(xiàn)了低磁場雙峰(downfielddoublet)，說明在h1也有一些異質(zhì)性。
進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的同核和異核2D-NMR分析。從圖2的COSY光譜中可確定H-2共振的位置。認(rèn)識到對于殘基b、d、e、f和g來說，J1，2很小，具有甘露-庚糖的特點(diǎn)，2D-TOCSY不可能用于從H-1經(jīng)H-2轉(zhuǎn)移磁化。從圖3的HMQC光譜中看出，庚糖殘基的H-2與其他共振重疊，使得2D-TOCSY難以對這些殘基進(jìn)行分析。2D-NOESY光譜還顯示NOE數(shù)異常高，特別是對于b1、de1共振。在端基異構(gòu)體區(qū)也有幾個共振相互重疊。因此，由于光譜的復(fù)雜性和該樣品的異質(zhì)性，使用1D選擇方法來提取光譜參數(shù)，該光譜參數(shù)無法使用標(biāo)準(zhǔn)的2D方法獲取，從而能夠?qū)Y(jié)構(gòu)和構(gòu)象分析進(jìn)行解析。HMQCTOCSY和HMBC實(shí)驗(yàn)對于進(jìn)行完全識別，特別是庚糖單元的完全識別也非常重要。使用該方法，就可能對較大的主鏈寡糖(A1)的1H和13C NMR化學(xué)位移進(jìn)行完全識別(實(shí)施例1，表1)。
從以前的研究中已經(jīng)知道了Kdo-GlcNII-GlcNI序列和部分識別，并與此處所做的識別相一致。對殘基a和h進(jìn)行1D-TOCSY使得能夠識別共振，測量質(zhì)子耦合常數(shù)(圖4a，4b)。磷酸酯基的位置通過以前做的31P HMQC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。然后從HMQC、HMQC-TOCSY和HMBC光譜中識別13C NMR化學(xué)位移。該信息使得可將殘基a和h確定為脂質(zhì)A部分的α-D-GlcN和β-D-GlcN吡喃糖基單元。多數(shù)質(zhì)子、31P和13C NMR化學(xué)位移與先前在相似的結(jié)構(gòu)元件中報道的類似。在h1的1D-TOCSY中，3.62ppm處的h’5峰是由于Kdo-(2-6)-β-D-GlcNII糖苷鍵的水解導(dǎo)致的。在溶液中幾個月后，該鍵完全水解，分別在3.82和3.92ppm處出現(xiàn)h’6和h’6。還發(fā)現(xiàn)3.91ppm處清晰的端基異構(gòu)體信號是由該二糖的h’1導(dǎo)致的。
對于Kdo，H-4和H-5共振從選擇激發(fā)H-3eq或H-3ax的1D-TOCSY實(shí)驗(yàn)中識別。由于在C-4處有一個磷酸酯基，H-4共振向低磁場區(qū)位移，這通過31P HMQC驗(yàn)證。較小的J5，6＜1Hz阻止了TOCSY經(jīng)H-5轉(zhuǎn)移(圖4c)。然而，在圖2c的k4和k6之間觀察到強(qiáng)NOE，這與Kdo的X射線結(jié)構(gòu)一致。使用1D NOESY-TOCSY(k4，k6)完成識別(圖4d)。如后所示，對于HepI-(1-5)-Kdo鍵，還觀察到d1-k7 NOE，這是Kdo在C-5處被取代的特點(diǎn)。使用該NOE，從1D-NOESY-TOCSY(de1，k7)中檢測到的Kdo共振(圖4e)具有與前面實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的相同的化學(xué)位移和相似的多重峰圖樣，因而證實(shí)了Kdo1H NMR識別。然后從HMQC光譜中得到Kdo的13C NMR識別，并從HMQC-TOCSY光譜中驗(yàn)證。
殘基i確定為6-取代的β-D-葡萄糖，記為GlcI。殘基i的端基異構(gòu)體共振與Kdo的H-4共振重疊。在這兩個重疊共振的1D-TOCSY中可以區(qū)分出殘基i的共振，因?yàn)镵do的J5，6耦合常數(shù)很小(圖4c)。可以檢測高達(dá)H-6的所有共振，并且可以測量這些多重峰的耦合常數(shù)。由于其β-D構(gòu)型，i1-i3和i1-i5 NOE也在NOESY光譜中被觀察到(圖2和圖5f)。然后從HMQC光譜中獲得了GlcI的13C NMR識別，并使用HMQC-TOCSY光譜驗(yàn)證。通過與末端葡萄糖的化學(xué)位移相比，對于C-6共振觀察到3.7ppm的苷化低磁場區(qū)位移，表明它在該位置被取代。對于C-5也觀察到-2.2ppm的明顯位移。關(guān)于C-5-C-6鍵的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體分布可從圖5f中i1-i5 NOE中所觀察到的H-5多重峰確定。很明顯，J5，6和J5，6’.都有＜2Hz的較小的值，因?yàn)镠-5多重峰似乎是由10Hz的較大的J4，5耦合主導(dǎo)的雙峰。這表明H-6和H-6.’都與H-5鄰位交叉，06-C6-C5-05＝-60°的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體優(yōu)選在溶液中。
殘基c確定為末端α-D-葡萄糖，記為GlcII。從c1的1D-TOCSY(圖4f)中，可檢測到高達(dá)H-5的共振，基于測量的質(zhì)子耦合常數(shù)，表明殘基c為α-葡萄糖。從HMQC光譜以及與末端葡萄糖模型化合物的化學(xué)位移相比，可完成所有的1H和13C NMR識別。
從j1的1D-TOCSY中分辨出末端半乳糖，殘基j，記為Gal，并且觀察到高達(dá)H-4的共振(圖4j)。為了通過較小的J4，5耦合常數(shù)并且分辨出H-5，進(jìn)行了1D-TOCSY-NOESY(j1，j4)(圖4h)。從HMQC光譜以及與末端半乳糖模型化合物的化學(xué)位移相比，可完成所有的1H和13C NMR識別。
為了歸屬庚糖殘基，合成了模型化合物以獲得準(zhǔn)確的1H和13C NMR化學(xué)位移和JH，H值。這些對于通過化學(xué)位移比較而歸屬末端庚糖單元來說非常重要。而且，一旦苷化，取代碳的13C NMR共振會有顯著的低磁場苷化位移。D-D-庚糖和D-L-庚糖的質(zhì)子光譜示于圖6。在溶液中，每種化合物都存在α和β形式。使用1D-TOCSY實(shí)驗(yàn)識別它們的1H NMR光譜。為獲得準(zhǔn)確的耦合常數(shù)和化學(xué)位移，進(jìn)行了質(zhì)子光譜的自旋模擬。模擬的光譜示于圖6。模擬的光譜精確再現(xiàn)了所觀察到的光譜，特別是D-α-L-庚糖中H-3-H-的強(qiáng)耦合(圖6b)。使用HMQC識別13C NMR化學(xué)位移。庚糖單糖的NMR數(shù)據(jù)在實(shí)施例1，表2中給出。L-D-庚糖的化學(xué)位移與D-L-庚糖相同，因?yàn)樗鼈兓閷τ钞悩?gòu)體。
在TOCSY實(shí)驗(yàn)中，從A1中殘基b、d、e、f和g的較窄的端基異構(gòu)體共振中可將它們識別為庚糖，這是由于J1，2耦合較小，并且缺乏磁化從H-1向H-2的轉(zhuǎn)移。A1中所有的庚糖具有α-D構(gòu)型，因?yàn)槲ㄒ坏膩碜訦-1的殘基內(nèi)NOE是到H-2的(圖2)。使用1D-TOCSY-TOCSY(H-1，H-2)來識別所有的庚糖殘基。由于1.8Hz的較小的J1，2值，因而阻礙了磁化從H-1轉(zhuǎn)移至H-2并進(jìn)一步轉(zhuǎn)移的第一個TOCSY步驟。然而，由于3Hz的較大的j2，3值，在H-2上的第二步可將磁化進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至更高的自旋上。然而，對于L-D-庚糖，磁化轉(zhuǎn)移停留在H-5，這是由于1.6Hz的較小的J5，6值。對于D-D-庚糖，磁化轉(zhuǎn)移阻礙較小，這是由于3.2Hz的較大的J5，6值。然而，松弛效應(yīng)也可阻礙磁化轉(zhuǎn)移，不能使用缺少H-5上的轉(zhuǎn)移作為L-D-庚糖識別的證據(jù)。
殘基b確定為2-取代的L-α-D-庚糖，記為HepII。1D-TOCSY-TOCSY(b1，b2)辨別出3.64ppm和3.9ppm處的共振(圖7a)。3.64ppm處的多重峰圖樣是H-5共振的指示，而在3.9ppm處的多重峰圖樣與單糖中觀察到的強(qiáng)耦合的H-3和H-4共振相似(圖6b)。為了辨別H-6，進(jìn)行了1D-TOCSYNOESY(b2，b5)(圖7b)。在b2的第一個TOCSY步驟中，a6共振也被照射，但第二步只選擇b5共振。b2的NOE在b3和b6上，以及在d2上的殘基間NOE中也被觀察到。一旦b6位置確定后，使用C-7-H-7s-C-6-H-6的HMQC-TOCSY來識別H-7和H-7.’共振(圖3b)。然后從HMQC光譜中獲得其他共振的識別，并從HMQC-TOCSY和HMBC光譜驗(yàn)證(圖3)。將化學(xué)位移與L-α-D-庚糖的化學(xué)位移相比，表明C-2有9ppm的低磁場位移，C-3有-0.8ppm的高磁場位移，表明在C-2處有取代。C-4到C-7的化學(xué)位移在單糖化學(xué)位移的0.6ppm之內(nèi)。
殘基e確定為末端L-α-D-庚糖，記為HepIII。雖然d1和e1共振重疊，但是由于它們的H-2共振不重疊，所以沒有關(guān)系。1D-TOCSY-TOCSY(de1，e2)辨別出e3、e4和e5自旋(圖7c)。在圖5a中的b1 NOE中，還觀察到e5共振。1D選擇實(shí)驗(yàn)的高數(shù)字分辨率使得能夠由觀察到它們的多重峰圖樣而將不同實(shí)驗(yàn)中的共振準(zhǔn)確匹配。圖5a中還觀察到b1-e7和b1-e7.’NOE。如后文所示，這些NOE是由b1質(zhì)子與e5以及e7和e7’質(zhì)子緊鄰所導(dǎo)致。在C-7-H-7s-C-6-H-6的HMQC-TOCSY中可確定H-6共振的位置。1H和13C NMR識別可使用HMQC和HMQCTOCSY完成。殘基e的1H和13C NMR化學(xué)位移與L-α-D-庚糖相似。
殘基d確定為3，4，6-三取代的L-α-D-庚糖，記為HepI。
1D-TOCSY-TOCSY(de1，d2)在4.17ppm處辨別出窄多重峰，在4.01ppm處辨別出較寬的多重峰(圖7d)。4.01ppm和4.17ppm處的多重峰(d2)在b1的1D-NOESY中也被觀察到(圖5a)。4.17ppm處的共振在i1的1D-NOESY中也被觀察到(圖5f)。在HMQC光譜中，在(δc，δh)(74.9，4.17)，(72.5，4.17)處辨別出兩個窄交叉峰，在(75.3，4.01)處辨別出一個寬交叉峰。HMQC-TOCSY相關(guān)性在這些交叉峰之間也可觀察到。將13C NMR化學(xué)位移與實(shí)施例1，表2中的α-D-庚糖吡喃糖的化學(xué)位移相比，可明顯看出(74.9，4.17)和(75.3，4.01)處的交叉峰經(jīng)歷了13C NMR低磁場苷化位移。由于這三個交叉峰來自d3、d4或d5，只有d5交叉峰不會經(jīng)歷大的苷化位移，因?yàn)楦巧系娜〈粫l(fā)生在C-5處。因此，(72.5，4.17)處的交叉峰被識別為(C-5，H-5)?；贖MBC(d3，d1)和(d3，b1)的相關(guān)性，(75.3，4.01)處的交叉峰被識別為(C-3，H-3)。因此(74.9，4.01)處的交叉峰被識別為(d4，d1)，與所觀察到的HMBC(d4，i1)相關(guān)性和(i1，d4)NOE相一致(圖3和圖5f)。從i1的1D-NOESY可識別d6共振，這是因?yàn)橹挥袣埢鵧是L-D-庚糖時，對于GlcI-(1-4)-HepI鍵，也可以預(yù)期觀察到對H-6的強(qiáng)NOE。d6共振在c1的1D-NOESY中也可觀察到(圖5b)。從HMQCTOCSY(C-7，H-6)交叉峰(圖3)和1DNOESY-TOCSY(i1，d6)(未顯示)，確定H-7和H-7.’共振的位置。將化學(xué)位移與L-α-D-庚糖的化學(xué)位移相比，表明C-3、C-4和C-6分別有3.9、7.9和11.6ppm的低磁場苷化位移。
如下所示，由于分支庚糖的異質(zhì)性(圖1)，應(yīng)該存在4，6-二取代的L-α-D-庚糖(d’)。從端基異構(gòu)體區(qū)的HMQC和COSY光譜中，由于與其他共振重疊，不能觀察到H-1或H-2的單獨(dú)的信號。據(jù)推測，d’1的質(zhì)子化學(xué)位移與d1的相同，d’2的化學(xué)位移與e2的相似。
殘基g確定為6-取代的D-α-D-庚糖，記為HepIV。1D-TOCSY-TOCSY(g1，g2)識別出g3、g4和g5自旋(圖7e)。3.94處的多重峰圖樣是H-5共振的標(biāo)志。為了辨別H-6，獲得了1D-TOCSY-NOESY(g2，g5)(圖7f)。來自g2的NOE在g3和g6上，以及在i6上推測的殘基間NOE上被觀察到。一旦確定g6的位置，就可使用C-7-H-7s-C-6-H-6的HMQC-TOCSY(圖3b)和1D-NOESY-TOCSY(f1，g6)(圖7g)來識別H-7和H-7.’共振。然后，對其他共振的識別可從HMQC光譜獲得，并使用HMQC-TOCSY光譜驗(yàn)證(圖3)。在1D-NOESY(f1)中，觀察到g6和g5共振(圖5d)。從分子模型研究中可得，只有當(dāng)殘基g是D-D-庚糖時NOE f1-g5 NOE才有可能(見下文)。將化學(xué)位移與D-α-D-庚糖的化學(xué)位移相比，表明C-6具有4.3ppm的低磁場位移。
殘基f確定為7-取代的D-α-D-庚糖，記為HepV。1D-TOCSY-TOCSY(f1，f2)識別出高達(dá)f6的自旋，表明殘基f為D-D-庚糖。f5多重峰圖樣相當(dāng)清晰。從f6開始的1D-TOCSY中辨別出f7和f7’共振。然后，從HMQC光譜中獲得了13C NMR識別，并使用HMQCTOCSY光譜驗(yàn)證。將化學(xué)位移與α-D-D-庚糖的化學(xué)位移相比，表明C-7具有8.8ppm的低磁場位移。只檢測到末端D-α-D-庚糖(記為f’)，這是由于在該鍵位置的異質(zhì)性所導(dǎo)致的。如在1D-TOCSY-TOCSY(f1，f2)中所示，可檢測到f’5和f’6共振，以及HMQC和HMQC-TOCSY光譜中的交叉峰，該交叉峰對應(yīng)于末端D-α-D-庚糖的交叉峰，后者又與實(shí)施例1，表2中的D-α-D-庚糖的交叉峰相似。
從圖5所示的端基異構(gòu)體共振的1D-NOESY光譜以及端基異構(gòu)體質(zhì)子共振的HMBC光譜(圖3c)，可建立核心寡糖的序列。殘基間NOE也在圖7b和7f所示的1D-TOCSY-NOESY實(shí)驗(yàn)中觀察到。結(jié)果列于實(shí)施例1，表3中，結(jié)構(gòu)顯示于圖1中。從端基異構(gòu)體共振的整合和新共振隨時間的出現(xiàn)，可確定存在異質(zhì)性的鍵位置。k(2-6)h和b(1-3)d鍵在pH為3的溶液中經(jīng)歷數(shù)月可水解，而j(1-7)f鍵是穩(wěn)定的。
觀察到異常多的遠(yuǎn)程N(yùn)OE，跨越多達(dá)五個連續(xù)的殘基。對于α-D糖，預(yù)期H-1-H-2殘基內(nèi)NOE。對于β-D-糖，預(yù)期H-1-H-3和H-1-H-5殘基內(nèi)NOE。對于(1-x)鍵，預(yù)期H-1-C-1-O-1-C-x-H-x糖苷間NOE。還可出現(xiàn)在H-x±1和H-x±2上的兩個鍵接的糖之間的殘基間端基異構(gòu)體NOE。其他不靠近糖苷鍵的殘基間NOE被認(rèn)為是遠(yuǎn)程N(yùn)OE，如實(shí)施例1，表3所列。
為了解釋大量的遠(yuǎn)程N(yùn)OE，使用Metropolis Monte Carlo(MMC)方法進(jìn)行構(gòu)象分析，以改變糖苷鍵角度，對分子的多重構(gòu)象進(jìn)行取樣。使用該方法，對于在還原性末端具有Kdo的內(nèi)核寡糖來說，發(fā)現(xiàn)所有觀察到的遠(yuǎn)程N(yùn)OE可解釋為e-b分支與g-i分支的緊鄰。這些遠(yuǎn)程N(yùn)OE可能是由于HepI上三個分支點(diǎn)帶來的內(nèi)核殘基的限制導(dǎo)致的。
通過計算獲得的最小能量構(gòu)象異構(gòu)體示于圖8。從這些坐標(biāo)測得的各種質(zhì)子間距離在實(shí)施例1，表3中給出。如所觀察到的那樣，多數(shù)NOE的存在可解釋為較短的質(zhì)子間距離。g1-b2和g1-b3的遠(yuǎn)程N(yùn)OE與圖8所繪分子模型中獲得的距離不一致。盡管有(3，4，6)-HepI取代模式的限制，但是糖苷鍵也有柔性，這一點(diǎn)必須考慮。如圖9所示，對于g1-b2和g1-b3距離，選取了與觀察到的NOE相一致的具有短質(zhì)子間距離的多種構(gòu)象。相同的情況可應(yīng)用于所有其他遠(yuǎn)程和殘基間NOE。g1-b2和g1-b3和e1-i4的遠(yuǎn)程N(yùn)OE跨越四個殘基，具有約三個糖苷(φ，ψ)角總共6df的移動性。e1-g2和e1-g3之間跨越五個殘基(e-b-d-i-g)的遠(yuǎn)程N(yùn)OE變化程度更大，這是由于具有8df的糖苷角，還沒有考慮g(1-6)i鍵中的C-5-C-6鍵可能的柔性。b1-e5、b1-e7和b1-e7.’取決于e(1-2)b糖苷鍵的移動性和殘基e的C-6-C-7的旋轉(zhuǎn)。在所有情況下，具有短質(zhì)子間距離的多重構(gòu)象的出現(xiàn)與所觀察到的殘基間和遠(yuǎn)程N(yùn)OE是一致的。
本研究中已經(jīng)證實(shí)，溶血性曼氏桿菌A1 LPS分子的脂質(zhì)A區(qū)含有雙-4，4’-磷酸化β-1，6連接的D-葡糖胺二糖部分。與該二糖相連的脂肪?；男再|(zhì)和取代型式未見報道。完全?；腖PS分子組成了細(xì)菌膜外層的多數(shù)小葉，在保持膜完整性方面起重要作用。該分子的單糖部分通常向外延伸，離開細(xì)菌膜所確定的平面。LPS寡糖部分在毒力方面起重要作用，并參與誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答。為了獲得該LPS分子的核心寡糖和膜錨定的脂質(zhì)A區(qū)的相對大小和方向的直觀印象，使用在相關(guān)生物即流感嗜血桿菌中發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)A脂肪酸取代型式構(gòu)建了分子模型。該模型示于圖10中。據(jù)報道，流感嗜血桿菌脂質(zhì)A具有六個脂肪?；?，其中還原性葡糖胺殘基的酰胺基(C-2)和C-3羥基被3-羥基十四烷酸?；?，而非還原性殘基的C-2.’酰胺和C-3.’羥基被3-十四酰氧十四烷酸酰化。如圖10所示，由于內(nèi)核提供了相當(dāng)剛性的結(jié)構(gòu)，單糖部分從確定細(xì)菌膜平面的脂質(zhì)A部分伸出。末端殘基特別是末端Gal殘基可觀察到更大的移動性。在圖2的NOESY光譜中，沒有觀察到與該殘基的移動性增加相一致的端基異構(gòu)體共振NOE。
已發(fā)現(xiàn)幾種LPS的核心結(jié)構(gòu)為高度分支的，這可以導(dǎo)致該內(nèi)核的清晰的構(gòu)象。在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)卡他莫拉菌(Moraxella catharrhalis)的LPS采用了異常的構(gòu)象，其中可觀察到非常罕見的反構(gòu)象異構(gòu)體(anticonformer)。對于該LPS分子中高度分支的3，4，6-三取代的D-葡萄糖殘基，檢測到β-D-Glcp-(1-4)-DGlcp與分支的葡萄糖單元鍵接的雙面角(C-1’-O-1’-C-4-H-4)接近180°。
本研究結(jié)果提供了溶血性曼氏桿菌血清型A1的LPS核心寡糖區(qū)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)圖示。我們在前面已經(jīng)說明，溶血性曼氏桿菌LPS的寡糖區(qū)在小鼠、綿羊和牛中均有免疫原性，并且12種溶血性曼氏桿菌血清型中的8種(即血清型A1、A5、A6、A7、A8、A12、A14和A16)具有相同的核心寡糖決定簇。血清型A1和A8的核心寡糖顯示幾乎相同的1H NMR光譜，證明存在共有的基本結(jié)構(gòu)。從本研究結(jié)果可明顯看出，由溶血性曼氏桿菌血清型A8產(chǎn)生的O-鏈缺陷型LPS在核心寡糖中缺少末端Gal單元，該殘基可能為O-鏈附著提供位點(diǎn)。對溶血性曼氏桿菌血清型之間LPS結(jié)構(gòu)差異的理解可提供針對溶血性曼氏桿菌牛巴氏桿菌病(pasturellosis)的疫苗的基礎(chǔ)。血清型A1是導(dǎo)致該病的主要微生物，占全球牲畜總死亡數(shù)的30％。在疫苗制劑中使用毒力弱的血清型或其抗原可提供有效的疾病治療手段。
實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)從溶血性曼氏桿菌制備LPS從Veterinary Infectious Diseases Organization(VIDO)，Saskatoon，SK，Canada獲得溶血性巴氏桿菌(溶血性曼氏桿菌)血清型A1(NRCC 4212)。從發(fā)酵罐培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物中通過熱酚溶液法(Severn etal.Carbohydr.Res.240，277(1993))提取和純化LPS。
LPS脫酰產(chǎn)生主鏈寡糖如先前在Severn et al.J.Bacteriol.178，1731(1996)中所述，通過修改Holst et al的脫酰方法，制備主鏈寡糖。在環(huán)境溫度下使用無水肼處理(20mL，37℃，30min)樣品(400mg)，從LSP的脂質(zhì)A除去酯結(jié)合的脂肪酸。向冷卻的反應(yīng)混合物(0℃)中加入丙酮(三倍體積)破壞多余的肼。離心(5000rpm，10min)分離沉淀的O-脫酰LPS產(chǎn)物，用丙酮洗滌，并凍干水分。在KOH水溶液(4M，10mL)中加熱O-脫酰樣品(200mg)，100℃持續(xù)20h，除去N-?；?。將反應(yīng)混合物冷卻(0℃)，使用4MHCl中和，離心(12000×g，30min)除去沉淀的脂肪酸。上清液在具有500分子量截留膜的Amicon濃縮室(concentration cell)(Amicon；YC05)中過濾，并使用去離子水洗滌，直到洗脫液中不含氯離子(使用AgNO3溶液測量)。將透析材料凍干，得到脫酰LPS(約80mg)。在DEAE A-25上通過陰離子交換色譜純化寡糖。主鏈寡糖組分(約50mg)在陽離子ESI-MS中顯示為m/z 1124.8的雙電荷離子，并作為與Hex3Hep5Kdo HexN2(H2PO3)3(M，2246.9)組合物相對應(yīng)的主要離子。雙電荷離子的MS-MS在m/z500(HexN2(H2PO3)2)和801(KdoHexN2(H2PO3)2)處產(chǎn)生特征性片段，它們分別對應(yīng)于脫酰脂質(zhì)A和Kdo-P取代單元。
D-甘油-L-甘露-庚糖在堿性乙醇(alkaline methanol)中使用硝基甲烷縮合D-半乳糖，制備庚糖。將從去離子產(chǎn)物(mp 158℃，產(chǎn)率21％)的水溶液中獲得的結(jié)晶1-脫氧-1-硝基-D-甘油-L-甘露-庚醇轉(zhuǎn)化為其鈉鹽。該溶液使用稀硫酸(35℃)處理后，再使用Rexyn 101(H+)和Amberlite A4(OH-)離子交換樹脂去離子化，然后凍干生成糖漿形式的庚糖(產(chǎn)率80％)。通過纖維素柱色譜分級產(chǎn)物，以丁-1-醇-水(1∶10 v/v)作為洗脫劑。含庚糖的組分減壓濃縮干燥。具有[α]D-14°(c 0.2，水)的D-甘油-L-甘露-庚糖通過紙色譜法純化，其在GLC上的還原(NaBH4)和乙?；a(chǎn)物具有單峰，保留時間與真正的庚-O-?；?D-甘油-L-甘露-庚醇相對應(yīng)，由此確定其純度。
D-甘油-D-甘露-庚糖從D-阿卓糖制備庚糖，使用硝基甲烷縮合，生成1-脫氧-1-硝基-D-甘油-D甘露-庚醇(mp 109℃，[α]D-7.0°(c 1.1，EtOH)，產(chǎn)率27％)，其鈉鹽水溶液緩慢滴加至保持在0℃并不斷攪拌的20％(v/v)硫酸中，轉(zhuǎn)化為D-甘油-D-甘露-庚糖。反應(yīng)混合物使用飽和Ba(OH)2中和，過濾，經(jīng)過Rexyn 101(H+)和Duolite A4(OH-)樹脂除去殘留的離子物質(zhì)，濃縮成糖漿(產(chǎn)率92％)。紙色譜顯示，庚糖產(chǎn)物中混有阿卓糖和未變化的1-脫氧-1-硝基-D-甘油-D-甘露-庚醇(約2到3％)。該產(chǎn)物通過纖維素柱層析純化，使用丁-1-醇-水(1∶10 v/v)作為流動相。D-甘油-D-甘露甘露糖具有[α]D+22°(c 2，MeOH)。在GLC上還原(NaBH4)和乙?；臉悠樊a(chǎn)生單峰，對于于真正的庚-O-?；?D-甘油-D-甘露-D庚醇，表明了合成庚糖的身份和純度。
電噴射質(zhì)譜在裝有電噴射離子源的VG Quattro三級四極質(zhì)譜計(Micromass，Manchester，U.K.)上分析樣品。主鏈寡糖溶于含0.5％乙酸的乙腈-水(約1∶2 v/v)中。注入體積為10μL，流速設(shè)置為4mL min-1。電噴射的觸點(diǎn)電壓(tip voltage)通常為2.7kV，質(zhì)譜計從m/z 50到2500進(jìn)行掃描，掃描時間為10s。對于MS-MS實(shí)驗(yàn)，使用第一級四極選擇先驅(qū)離子，在只有RF的四極室中使用氬碰撞活化的碎片離子通過掃描第三級四極進(jìn)行質(zhì)譜分析。碰撞能量通常為60ev(參考實(shí)驗(yàn)框架)。
核磁共振使用標(biāo)準(zhǔn)軟件，在Bruker AMX 600、AMX 500或者Varian Inova 600光譜儀上生成NMR光譜。所有的測量均在300K和pH 3下進(jìn)行，包括10mg樣品，溶于0.6mL D2O中。測量在pH 3下進(jìn)行是為了提高質(zhì)子光譜的分辨率，如先前的做法(Cox，1996)。
丙酮在2.225ppm用作1H光譜、在31.07ppm用作13C光譜的內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)。標(biāo)準(zhǔn)的同核和異核相關(guān)的2D技術(shù)被用于核心寡糖的常規(guī)識別COSY、TOCSY、NOESY、三級量子同核相關(guān)實(shí)驗(yàn)、HMQC、HMQC-TOCSY以及HMBC和31P HMQC。使用標(biāo)準(zhǔn)的Varian軟件進(jìn)行庚糖單糖的自旋模擬。從用于進(jìn)行自旋模擬的參數(shù)而不是從光譜的峰值列表中獲得準(zhǔn)確的化學(xué)位移和耦合常數(shù)。
進(jìn)行選擇性1D-TOCSY、1D-NOESY、1D-TOCSY-TOCSY、1D-TOCSY-NOESY和1D-NOESY-TOCSY實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行完全的殘基識別以及確定f殘基間1H-1H核Overhauser增強(qiáng)。用于描述1D選擇序列的應(yīng)用的術(shù)語是1D EXP(自旋，混合時間)和1D EXP1-EPX2(自旋1，混合時間；自旋2，混合時間)，其中EXP、EXP1和EXP2代表TOCSY或NOESY。另外，在圖中，所選共振用下劃線標(biāo)出。標(biāo)有雙下劃線的共振表示該共振被選為第二選擇步驟。如圖1所示，所有的殘基標(biāo)以字母，自旋標(biāo)以原子數(shù)，所以a1是指殘基a的H-1共振。
在AMX光譜儀上，通過半高斯脈沖實(shí)現(xiàn)選擇激發(fā)。用于TOCSY的混合時間取決于自旋系統(tǒng)。通常30到180ms范圍的混合時間(自旋鎖定時間)可用于識別該自旋系統(tǒng)。1D-NOESY的混合時間取決于糖苷鍵的分子和內(nèi)部運(yùn)動的相關(guān)時間。NOESY混合時間在150到400ms范圍內(nèi)。為檢測末端Gal殘基的殘基間NOE，以500ms的混合時間進(jìn)行1D-ROESY實(shí)驗(yàn)。對于雙重選擇實(shí)驗(yàn)，選擇脈沖要盡可能短，以避免由于松弛效應(yīng)而導(dǎo)致的信號強(qiáng)度損失。每部分一次優(yōu)化一個。1D-TOCSY可進(jìn)行幾分鐘左右。1D-NOESY花費(fèi)幾分鐘到幾小時，這取決于NOE的大小。某些雙重選擇實(shí)驗(yàn)要花費(fèi)高達(dá)12h。1D-TOCSYTOCSY和1D-TOCSY-NOESY最有效。由于樣品隨時間而降解，有些實(shí)驗(yàn)還在Inova 600光譜儀上進(jìn)行以利用脈沖場梯度。
分子模型使用先前所述的Metropolis Monte Carlo方法(Peters et al.Carbohydr.Res.238，49(1993))進(jìn)行構(gòu)象分析。使用PFOS電勢。使用來自量子化學(xué)程序性交換(Quantum Chemistry Program Exchange，QCPE)的MM3獲得單糖的最小化坐標(biāo)。使用每種二糖的最小能量構(gòu)象作為起始構(gòu)象。從還原端的Kdo開始，對各種寡糖進(jìn)行計算，一直到完整的結(jié)構(gòu)。對于內(nèi)核辛糖，使用5×104的宏運(yùn)動(macro move)，糖苷鍵的步長為5，溫度為1×103K，導(dǎo)致接收比為0.36。使用最小能量構(gòu)象異構(gòu)體生成內(nèi)核辛糖的分子模型。從每一種宏運(yùn)動所保存的坐標(biāo)中提取距離。使用脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)和Kdo鍵的最小能量構(gòu)象異構(gòu)體生成帶有脂質(zhì)A的完整LPS。使用E.Keeler，University of Freiburg，Germany的Schaka197來完成分子圖。
表1.溶血性曼氏桿菌(溶血性巴氏桿菌)血清型A1 LPS的核心寡糖組分的NMR化學(xué)位移(ppm)

說明在25℃、pH 3和D20中，在600MHz(1H)從HMQC和HMBC數(shù)據(jù)測量，其中外部丙酮的CH3信號對于1H NMR設(shè)置為2.225ppm，對于13C NMR設(shè)置為31.07ppm。δC平均誤差為±0.2ppm，δH平均誤差為±0.02ppm。由于異質(zhì)性而導(dǎo)致的f的較小組分標(biāo)為f’。CH2自旋系統(tǒng)(H，H’)按化學(xué)位移的降序排列。對于Kdo，H-3和H-3’歸屬為H-3eq和H-3ax。
表2.D-L-庚糖和D-D庚糖單糖的NMR數(shù)據(jù)

說明在25℃的D2O中，在600MHz(1H)從1H自旋模擬和13C光譜(150MHz)測量，其中丙酮的CH3信號對于1H NMR設(shè)置為2.225ppm，對于13C NMR設(shè)置為31.07ppm。δC和δH的單位是ppm，δC平均誤差為±0.005ppm，δH平均誤差為±0.003ppm。JH，H值單位是Hz，平均誤差為±0.2Hz。H-7和H-7’按化學(xué)位移的降序排列。
aJC1，H1＝171±1HzbJC1，H1＝160±1Hz，從未去耦合的13C NMR光譜測量。
表3.A1的HMBC和NOE數(shù)據(jù)，以及與圖8所示的核心庚糖的最小能量構(gòu)象異構(gòu)體的距離

a對于Gal-(1-7)-HepV-(1-6)-Hep IV序列(j-f-g)中的j和f殘基，給出從MMC計算得到的平均距離。
實(shí)施例2本實(shí)施例形成了Carbohydr.Res.3391973(2004)中出版物的基礎(chǔ)。研究胸膜肺炎放線桿菌血清型5a、b、2和1。
對柱分級的LPS進(jìn)行糖分析表明，葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)、D-甘油-D-甘露-庚糖(DD-Hep)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)各自的比例大約為2∶1.5∶1∶2∶3。如在材料和方法中所述，將酸水解產(chǎn)物進(jìn)行凝膠過濾色譜分離來純化核心OS，獲得富含核心OS和相對不含O-抗原的組分，并進(jìn)行糖分析，該分析顯示；Glc、Gal、DD-Hep和LD-Hep各自比例為2∶1∶2∶3。由于血清型5b的莢膜多糖含有N-乙酰-D-葡糖胺和酮糖殘基，我們懷疑LPS有一些莢膜(CPS)摻雜，之所以分級的核心OS樣品中沒有CPS，是因?yàn)镃PS中的酮糖鍵(ketosidic bond)對為獲得核心OS而采用的酸水解條件敏感。另外，較少量的半乳糖(唯一的O-抗原殘基)表明所檢測的組分主要是核心OS，沒有明顯的O-抗原延伸。
制備LPS-OH并通過凝膠過濾色譜分級。對與含有低比例O-抗原相一致的體積時洗脫的組分，通過CE-ES-MS進(jìn)行分析(實(shí)施例2，表1)。觀察到一種簡單的質(zhì)譜，該質(zhì)譜對應(yīng)于與組成2Hex、5Hep、Kdo、P、脂質(zhì)A-OH相一致的2537amu的分子。對雙電荷離子m/z 1268進(jìn)行CE-MS/MS分析(數(shù)據(jù)未給出)在m/z 951和1584產(chǎn)生兩個單電荷峰，證實(shí)了O-脫酰脂質(zhì)A的大小為952amu，核心OS的大小為1584。O-脫酰脂質(zhì)A種類(952amu)由N-乙?；?3-OH C 14:0)葡糖胺殘基的二糖組成，每個殘基被磷酸分子取代。對分級的OS樣品的ES-MS和CE-ES-MS分析顯示其質(zhì)量為1505 Da，與組成2Hex、5Hep、Kdo一致(實(shí)施例2，表1)(圖11)。更晚洗脫的核心OS組分的CE-ES-MS光譜具有1562的質(zhì)量，比主要糖型高57amu(實(shí)施例2，表1)。該質(zhì)量對應(yīng)于氨基酸甘氨酸，這最近已經(jīng)在腦膜炎雙球菌和流感嗜血桿菌的LPS中觀察到。CE-ES-MS/MS分析將該甘氨酸殘基定位于Kdo分子的第二個庚糖殘基(Hep II)上(數(shù)據(jù)未給出)。
在核心OS上進(jìn)行甲基化分析，以確定該分子的連接型式。僅對對應(yīng)于核心OS的組分進(jìn)行分析表明，存在大約等摩爾量的末端Glc、6-取代的Glc、末端DD-Hep、末端LD-Hep、6-取代的DD-Hep、2-取代的LD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep。對主要含有O-抗原的更早的OS組分進(jìn)行分析表明，存在6-取代的Gal(O-抗原組分)，證實(shí)了O-抗原的連接型式。
為了闡明OS的準(zhǔn)確位置和連接型式，對不含O-抗原的收集OS組分進(jìn)行NMR研究(圖12a)。通過COSY和TOCSY實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)對OS的1H共振的識別。圖13顯示從OS中每個殘基的端基異構(gòu)體1H共振的一系列選擇性1D-TOCSY實(shí)驗(yàn)。在NMR分析的過程中，很明顯Ap 5a OS在結(jié)構(gòu)上與溶血性曼氏桿菌核心OS的結(jié)構(gòu)相關(guān)，Ap 5a OS光譜的識別可參考該1H NMR數(shù)據(jù)來幫助進(jìn)行(實(shí)施例2，表2)。
在Ap 5a OS的選擇光譜中，從庚糖殘基(Hep I，(圖13a)，Hep II，(圖13b)，Hep III，(圖13c)，Hep IV(圖13d)和Hep V，(圖13e))產(chǎn)生的自旋系統(tǒng)很容易從5.11(HepI)、5.70(Hep II)、5.17(Hep III)、4.96(Hep IV)和5.03(Hep V)ppm處的端基異構(gòu)體1H共振辨別，所述共振與指向甘露-吡喃糖基環(huán)系統(tǒng)的自旋系統(tǒng)的形態(tài)相耦合。Hep I和Hep II的端基異構(gòu)體質(zhì)子中觀察到的異質(zhì)性(圖12a)是由于Kdo殘基在酸水解時重排造成的。基于自旋系統(tǒng)的形態(tài)(圖13f)，5.21ppm(Glc II)處的α-端基異構(gòu)體區(qū)中的其他殘基確定為吡喃型葡萄糖。該光譜低磁場區(qū)(4.45-6.00ppm)的其余端基異構(gòu)體共振都可歸因于β-連接的殘基，這是由于它們的端基異構(gòu)體1H共振以及，在殘基已經(jīng)解析的情形下，它們較高的J1.2(約8Hz)耦合常數(shù)。從自旋系統(tǒng)的形態(tài)(圖13g)，在4.66ppm(Glc I)處的一個共振被識別為葡糖-構(gòu)型。從TOCSY實(shí)驗(yàn)中的H-4共振的特征性自旋系統(tǒng)的形態(tài)(圖13h)，將低磁場區(qū)中的4.49(Gal I)ppm處的剩余共振識別為半乳糖-吡喃糖基殘基。該實(shí)驗(yàn)還涉及Kdo自旋系統(tǒng)，因?yàn)?.48ppm處的Kdo H-61H共振也被照射，并顯示在4.10和4.21ppm分別有H-4和H-51H共振。然而，Kdo自旋系統(tǒng)難以完全確定，這是因?yàn)镵do殘基在核心水解時重排，以及可能由于氘交換而導(dǎo)致的亞甲基H-3質(zhì)子的強(qiáng)度水平極低。然而，在另一個1-D TOCSY實(shí)驗(yàn)中，從1.92ppm的H-3中軸進(jìn)一步識別該自旋系統(tǒng)，顯示2.08ppm處的赤道質(zhì)子和4.10ppm處的H-4質(zhì)子的1H共振(數(shù)據(jù)未給出)。
鄰近的糖基殘基上的端基異構(gòu)體和苷元質(zhì)子之間的殘基間1H-1H NOE測量可確定OS中糖基殘基的序列，并證實(shí)和擴(kuò)展甲基化分析數(shù)據(jù)。用這種方法確定了Ap 5a OS的連接型式(圖14)(實(shí)施例2，表2)。因此質(zhì)子對Hep III H-1和Hep II H-2(圖14a)以及Hep II H-1和Hep I H-3(圖14b)之間強(qiáng)烈的跨糖苷NOE連接性的出現(xiàn)，確立了三個LD-庚糖殘基的序列和附著點(diǎn)。這種連接型式在溶血性曼氏桿菌和流感嗜血桿菌的內(nèi)核OS中經(jīng)常遇到。而且，端基異構(gòu)體質(zhì)子Hep III H-1和Hep II H-1之間的殘基間NOE驗(yàn)證了1，2-鍵接。從Glc I的H-1檢查NOE的連接性表明，該葡萄糖殘基與4-位的Hep I連接，這是根據(jù)Hep I H-4和Hep I H-6的殘基間NOE(圖14c)得出的。H-6的殘基間NOE的形態(tài)對于4-取代的庚糖殘基來說經(jīng)常出現(xiàn)。Glc I的H-1和Glc II的H-1之間出現(xiàn)遠(yuǎn)程N(yùn)OE連接性表明，α-構(gòu)型的葡萄糖殘基(Glc II)在6-位取代Hep I，這在溶血性曼氏桿菌OS中已經(jīng)觀察到。檢查Glc II的H-1的NOE連接性證實(shí)，該葡萄糖殘基在6-位與Hep I連接，這是根據(jù)Hep I H-6的殘基間NOE(圖14d)得出的。類似地，對于Glc I，在Glc I和Glc II的端基異構(gòu)體1H共振之間觀察到遠(yuǎn)程N(yùn)OE連接性。其他庚糖殘基(Hep IV和Hep V)的連接位置按如下方法導(dǎo)出。檢查Hep IV的H-1的NOE連接性表明，該庚糖殘基在6-位與Glc I連接，這是根據(jù)Glc I H-6和H-6’的殘基間NOE(圖14e)得出的。最后，確定Hep V在6-位取代了Hep IV，這是根據(jù)從Hep V H-1到Hep IVH-6的NOE連接性(圖14f)得出的。另外，對血清型5a的OS進(jìn)行NMR分析使得能夠辨別O-鏈半乳糖殘基的附著點(diǎn)。只含有一種半乳糖殘基的組分用于該目的。端基異構(gòu)體1H共振的NOE連接性包括3.68和3.93ppm處的H-3和H-5的內(nèi)部連接性，以及3.93ppm處的之間連接性(圖15a)。然后將選擇性1-D實(shí)驗(yàn)用于辨別3.93ppm處的質(zhì)子共振的自旋系統(tǒng)。在NOESY步驟中，進(jìn)行Gal的H-1質(zhì)子的1D NOESY-TOCSY實(shí)驗(yàn)，然后在TOCSY步驟中，在3.93ppm處進(jìn)行共振的選擇激發(fā)，證實(shí)了3.93ppm處的共振和4.06ppm處的共振的連接性(圖15b)。使用150ms的混合時間，在5.16ppm進(jìn)行Hep III殘基的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振的1-D TOCSY實(shí)驗(yàn)顯示了在3.82ppm處該自旋系統(tǒng)的H-4和H-5質(zhì)子共振(圖13c)。然后在NOESY步驟中該共振被選擇性照射，顯示出4.06ppm處的Hep III H-6共振，從而證實(shí)了Hep III殘基的7-位是O-鏈的附著點(diǎn)(圖15c)。從13C-1H HMBC實(shí)驗(yàn)獲得驗(yàn)證性數(shù)據(jù)，該實(shí)驗(yàn)辨別出4.48ppm處的O-鏈半乳糖殘基的端基異構(gòu)體1H共振的交叉峰，該交叉峰與70.3ppm處的13C共振相關(guān)(圖15d)，在13C-1HHSQC實(shí)驗(yàn)中該交叉峰被發(fā)現(xiàn)與3.93ppm處的質(zhì)子共振相關(guān)(圖15e)，在13C-1H HSQC光譜中該交叉峰顯示為具有-CH2-基特征的正峰，證實(shí)了庚糖殘基的7-位是O-鏈的附著點(diǎn)。該結(jié)論通過在只含有一種半乳糖殘基的組分上進(jìn)行甲基化分析來證實(shí)，表明存在7-取代的LD-Hep殘基；在對沒有O-鏈的核心OS組分進(jìn)行甲基化分析時沒有觀察到這種過甲基化醛醇醋酸酯衍生物。
研究胸膜肺炎放線桿菌血清型5b對血清型5b的LPS、LPS-OH和OS所做的所有分析都與前面在血清型5a中描述的分析相同或極其相似(實(shí)施例2，表1和2；圖12b)。
研究胸膜肺炎放線桿菌血清型2對完整LPS的糖分析表明存在Glc、DD-Hep、LD-Hep、Rha、Gal、GlcNAc和GalNAc，其比例大約為8∶2∶2∶1∶2∶1∶2，與該材料中存在O-抗原和莢膜多糖相一致。對分級的酸水解產(chǎn)物進(jìn)行糖分析，表明在較早的洗滌組分中存在Glc、Rha、Gal和GalNAc，其比例大約為2∶1∶1∶1，與富含O-抗原的組分一致。缺少O-抗原的較晚的組分顯示只存在Glc、DD-Hep和LD-Hep，其比例大約為3∶2∶3，與該核心OS組分中缺少O-抗原一致。
制備LPS-OH并通過凝膠過濾色譜分級。對與含有低比例O-抗原相一致的體積時洗脫的組分，通過CE-ES-MS以陰離子模式進(jìn)行分析(實(shí)施例2，表1)。觀察到一種簡單的質(zhì)譜，該質(zhì)譜對應(yīng)的分子是2700amu，與組成3Hex、5Hep、Kdo、P、脂質(zhì)A-OH相一致，還有少量質(zhì)量小于80amu的第二種分子，其與缺失磷酸酯基相吻合。對三電荷離子m/z 899進(jìn)行CE-MS/MS分析(數(shù)據(jù)未給出)在m/z 951產(chǎn)生一個單電荷峰，證實(shí)了O-脫酰脂質(zhì)A的大小為952amu，較大分子的質(zhì)量為2700amu。對缺少O-抗原的分級的核心OS樣品的CE-ES-MS分析顯示其質(zhì)量為1667 Da，與組成3Hex、5Hep、Kdo一致(實(shí)施例2，表1)。因而質(zhì)譜分析表明，血清型2的核心OS與血清型5a和5b的OS相比，多包含一個葡萄糖殘基。
對缺少O-抗原的核心OS組分進(jìn)行甲基化分析，表明存在末端Glc、6-取代的Glc、末端DD-Hep、末端LD-Hep、2-取代的DD-Hep、2-取代的LD-Hep、4，6-二取代的DD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep，其比例大約為6∶3∶3∶2∶1∶2∶3∶2。血清型2和5b OS的甲基化數(shù)據(jù)之間的主要差異在于單-6-取代的DD-Hep被4，6-二取代的DD-Hep替換，實(shí)驗(yàn)性地證實(shí)了內(nèi)部DD-Hep殘基的4-位是附加的葡萄糖殘基的附著點(diǎn)。通過甲基化分析辨別的血清型2和5b之間的末端葡萄糖殘基的比例，也與在血清型2核心OS中存在附加的末端葡萄糖殘基這一結(jié)論一致。
1H-NMR數(shù)據(jù)(實(shí)施例2，表2(圖12c))確證了質(zhì)譜和甲基化分析數(shù)據(jù)，證實(shí)了血清型2的核心OS與血清型5b的相同，但是多辨別出一個末端α-構(gòu)型的葡萄糖殘基(Glc III)。NOE數(shù)據(jù)可確定Glc III的附著點(diǎn)在Hep IV的4-位，這是根據(jù)從4.53ppm處的Glc III的端基異構(gòu)體質(zhì)子的1H共振到3.96ppm處的Hep IV的4位的1H共振的之間NOE連接性(數(shù)據(jù)未給出)得出的。對Hep IV的6-位也觀察到NOE連接性，這先前在4-取代的庚糖殘基中也已經(jīng)觀察到。
研究胸膜肺炎放線桿菌血清型1對柱分級的LPS進(jìn)行糖分析顯示存在Rha、Glc、Gal、GlcNAc、DD-Hep和LD-Hep，比例大約為1∶3∶1∶0.5∶1∶3。辨別出Rha和GlcNAc表明在該組分中仍然存在一些O-抗原組分。對缺少O-抗原的核心OS組分進(jìn)行糖分析表明，Glc、Gal、DD-Hep和LD-Hep的比例為2∶1.5∶1∶3。對含有全長O-抗原的較早的組分進(jìn)行糖分析顯示Rha、Glc和GlcNAc的比例大約為2∶1∶1，與已經(jīng)公開的該血清型O-抗原的結(jié)構(gòu)一致。
制備LPS-OH并通過凝膠過濾色譜分級。對與含有低比例O-抗原相一致的體積時洗脫的組分，通過ES-MS和CE-ES-MS以陰離子模式進(jìn)行分析(實(shí)施例2，表1)。觀察到一種簡單的質(zhì)譜，該質(zhì)譜對應(yīng)的分子是2874amu，其與組成4Hex、HexNAc、4Hep、Kdo、P、脂質(zhì)A-OH相一致，還有少量質(zhì)量大于123amu的第二種分子(與另外存在的磷酸乙醇胺殘基一致)和質(zhì)量小于80amu的第三種分子(與缺失磷酸殘基相吻合)。對三電荷離子m/z 957進(jìn)行CE-MS/MS分析(數(shù)據(jù)未給出)在m/z 951產(chǎn)生一個單電荷峰，證實(shí)了O-脫酰脂質(zhì)A的大小為952amu，較大分子的質(zhì)量為2874amu，并且在m/z 959產(chǎn)生一個雙電荷峰，對應(yīng)于核心OS。對缺少O-抗原的幾種核心OS組分的ES-MS和CE-ES-MS分析顯示其質(zhì)量為1840 Da，與組成4Hex、HexNAc、4Hep、Kdo一致(實(shí)施例2，表1)。對m/z 930的雙電荷離子以陽離子模式進(jìn)行CE-MS/MS分析顯示出單電荷離子，這與血清型1核心OS中存在下列殘基一致，包括HexNAc m/z 204、Hex-Hex-HexNAc m/z 528、Hep-Hex-Hex-HexNAc m/z 720(圖16)。因此，質(zhì)譜分析表明血清型1核心OS比血清型5a和5b核心OS少含有一個DD-Hep殘基，但是多含有兩個Hex和一個HexNAc殘基。然而，在對缺少O-抗原的核心OS進(jìn)行糖分析中，缺少HexNAc的證據(jù)開始讓人費(fèi)解。
對缺少O-抗原的核心OS組分進(jìn)行甲基化分析顯示存在大約等摩爾量的末端Glc、6-取代的Glc、3-取代的Gal、末端LD-Hep、4，6-二取代的Gal、4-取代的DD-Hep、2-取代的LD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep。缺少HexNAc的任何證據(jù)仍然讓人困惑。
因此，質(zhì)譜、糖和甲基化分析數(shù)據(jù)與血清型2、5a和5b中所觀察到的內(nèi)核結(jié)構(gòu)一致，1H NMR數(shù)據(jù)確證了這些推斷(圖12d)(實(shí)施例2，表2)。1H NMR數(shù)據(jù)還使得能夠辨別在血清型2、5a和5b的核心OS中不存在的其他的核心OS殘基。根據(jù)在TOCSY實(shí)驗(yàn)中H-41H共振的特征性自旋系統(tǒng)，在5.18ppm處識別了α-構(gòu)型半乳糖殘基(Gal II)。根據(jù)其端基異構(gòu)體質(zhì)子的1H共振和其特征性自旋系統(tǒng)的形態(tài)，在4.55ppm處識別了β-構(gòu)型半乳糖殘基(Gal I)。根據(jù)4.34ppm處H-2質(zhì)子的1H共振(與13C-1H HSQC實(shí)驗(yàn)中52.6ppm的13C化學(xué)位移相關(guān)(圖17a))，在4.88ppm處識別了α-構(gòu)型N-乙酰己糖胺殘基(HexNAc)。13C化學(xué)位移與氮取代的碳原子一致。然而，很難接近H-2質(zhì)子上該HexNAc殘基的自旋系統(tǒng)，H-2質(zhì)子的化學(xué)位移似乎位于相當(dāng)?shù)偷拇艌?。殘基間NOE連接性建立了4.55ppm處Gal I殘基的端基異構(gòu)體質(zhì)子和3.94ppm處Hep IV的4位的連接型式。類似地，5.18ppm處的Gal II端基異構(gòu)體質(zhì)子和3.79ppm處的Gal I殘基的3位的NOE連接性建立了該連接。然而，4.88ppm處的HexNAc殘基的端基異構(gòu)體質(zhì)子和4.25ppm處的Gal II殘基的4位，以及4.12和4.01ppm處的該殘基的6位之間的殘基間NOE連接性表明了HexNAc殘基在4位和6位取代了Gal II殘基，這與甲基化分析數(shù)據(jù)一致，但仍然令人困惑(圖17c)。甲基化OS的FAB-MS使得對OS的該部分的糖序列有了進(jìn)一步的了解。所觀察到的A型主要糖基氧鎓離子和次要離子(缺少甲醇)如下464→432(Hex，HexNAc)+，668→636(Hex2，HexNAc)+，916→884(Hex2，HexNAc，Hep)+，1120→1088(Hex3，HexNAc，Hep)+，1368(Hex3，HexNAc，Hep2)+，1572→1540(Hex4，HexNAc，Hep2)+，以及1865→1833(Hex3，HexNAc，Hep4)+。該FAB數(shù)據(jù)與NOE和陽離子CE-ES-MS/MS數(shù)據(jù)一致，但缺少末端HexNAc殘基的證據(jù)讓人困惑，但是與糖分析和甲基化分析數(shù)據(jù)一致。缺少HexNAc殘基的確切數(shù)據(jù)使得我們進(jìn)行更加復(fù)雜的NMR研究，以試圖辨明推測的HexNAc殘基的本質(zhì)，確定血清型1的核心OS的該區(qū)域的連接型式。
由4.88ppm處、混合時間的范圍從30到150ms的HexNAc殘基的H-11H-共振的一系列選擇性1D實(shí)驗(yàn)顯示出4.34ppm處的H-21H-共振和識別為4.13ppm處H-3和3.36ppm處H-4的弱信號。為了驗(yàn)證這些推論，完成該HexNAc殘基的識別，進(jìn)行了其他的選擇實(shí)驗(yàn)。從3.36ppm處的H-41H-共振獲得1-D TOCSY實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了H-2和H-3識別，分別在3.93、3.66和3.64ppm處分辨出H-5和H-6、6’共振(圖17d)。從4.34ppm處的H-21H-共振獲得1-D TOCSY實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了H-3和H-4識別(圖17e)。從3.36ppm處的H-41H-共振獲得1-D NOESY實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了H-2、H-3、H-5和H-6、6’識別(圖17f)。從這些實(shí)驗(yàn)測定耦合常數(shù)，得到j(luò)1，24.8Hz，j2，31.0Hz，J3，49.7Hz，J4，51.4Hz，J5，66.5Hz，J5，6’6.5Hz，K6，6’-12Hz。進(jìn)行了2D-13C-1H-HSQC NMR光譜(圖17e)，辨別出HexNAc分子的C-1到C-6位的13C-化學(xué)位移分別為101.1ppm，52.6ppm，68.5ppm，70.0ppm，70.7ppm和64.1ppm。該數(shù)據(jù)最初令人困惑，然而對本實(shí)驗(yàn)室的糖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的檢索發(fā)現(xiàn)了變形菌(Proteus)菌種的核心OS中的開鏈N-乙酰半乳糖胺殘基的一組類似數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)開鏈殘基盡管出人意料，卻與糖、甲基化和FAB分析數(shù)據(jù)一致，這是因?yàn)榇藲埢鶎μ呛图谆治鲋兴捎玫乃鈼l件敏感，在FAB分析中該末端殘基的糖基氧鎓離子的形成會被該殘基的開鏈構(gòu)型所阻礙。
因此，血清型1、2、5a和5b的核心OS的結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)完成，在所有菌株中辨別出保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)，在該保守性結(jié)構(gòu)上具有不同的修飾，如圖18所示。
對血清型1、2、5a和5b的核心寡糖(代表核心類型I、II、II和II)的結(jié)構(gòu)分析顯示出相對保守的結(jié)構(gòu)。每條鏈的內(nèi)核OS均相同，由與Kdo殘基連接的三糖L-甘油-D-甘露-庚糖殘基組成。每種血清型中，鄰近的庚糖殘基(Hep I)在3位被L-甘油-D-甘露-庚糖三糖的第二個L-甘油-D-甘露-庚糖殘基(Hep II)取代，在4位被β-葡萄糖殘基(Glc I)取代，在6位被α-葡萄糖殘基(Glc II)取代。在每條鏈中Glc I殘基的6位都發(fā)現(xiàn)有一個D-甘油-D-甘露-庚糖殘基(Hep IV)。在血清型2、5a和5b中，第二個D-甘油-D-甘露-庚糖殘基(Hep V)取代了6位的Hep IV。血清型2和5a、5b之間的唯一區(qū)別是，在血清型2中，在Hep IV殘基的4位多連接有一個葡萄糖殘基。在這些OS結(jié)構(gòu)和前面發(fā)現(xiàn)的溶血性曼氏桿菌血清型A1的OS結(jié)構(gòu)之間存在著驚人的相似性。5b、5a OS結(jié)構(gòu)和溶血性曼氏桿菌血清型A1核心OS之間唯一的區(qū)別是，在溶血性曼氏桿菌A1 OS的Hep V中缺少另外的末端半乳糖殘基。在血清型1中沒有Hep V殘基，Hep IV在4位被三糖α-GaloNAc-(1-4，6)-α-Gal-(1-3)-β-Gal-取代，其中，HexNAc殘基為罕見的開鏈構(gòu)型。在血清型1中，被識別為從Hep I的最初的三糖延伸的結(jié)構(gòu)排布與先前在杜克雷嗜血桿菌菌株2665 LPS中發(fā)現(xiàn)的相同，然而與在杜克雷嗜血桿菌中發(fā)現(xiàn)的DD-Hep間斷的乳糖-N-新四糖結(jié)構(gòu)相比，血清型1 LPS在Gal I殘基上有不同的延伸。
因而，對于在SDS-PAGE中觀察到的Ap LPS的兩種核心類型，獲得了結(jié)構(gòu)上的解釋。核心類型II的血清型2、5a和5b具有非常相似的LPS結(jié)構(gòu)，區(qū)別僅在于血清型2中多有一個葡萄糖殘基。然而核心類型I的血清型1缺少DD-Hep殘基，但是有兩個己糖和一個新的開鏈HexNAc殘基。為了研究該新的開鏈HexNAc殘基是否在其他的核心類型I血清型中存在，檢查了來自血清型6、9和11的LPS。開鏈HexNAc的證據(jù)在血清型9和11中的MS和NMR實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未給出)中均被發(fā)現(xiàn)，但在血清型6中沒有發(fā)現(xiàn)。對用于對核心類型進(jìn)行分類的SDS-PAGE圖樣進(jìn)一步研究顯示，血清型6具有兩種核心類型的LPS遷移模式，因此有可能我們檢查的血清型6菌株只有核心類型II圖樣。
在Ap的LPS生物合成的遺傳控制中可用的數(shù)據(jù)很少。最近Galarneau等人的一篇論文辨別了轉(zhuǎn)座子誘變的三個基因，似乎涉及Ap血清型1 LPS的核心OS區(qū)的生物合成?；谂c其他糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性，這些基因被暫時辨別為糖基轉(zhuǎn)移酶。據(jù)推測，這三個基因?yàn)閘bgB，α-1，6-DD-庚糖基轉(zhuǎn)移酶，lbgA，β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，以及己糖或N-乙酰-己糖胺轉(zhuǎn)移酶。前兩個基因，lbgAB，與本文在血清型1核心OS中辨別的結(jié)構(gòu)一致，具有與杜克雷嗜血桿菌LPS相同的基因座排布。Rioux等人的另一篇論文辨別了基因galU，UTP-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)基因。從血清型1 Ap galU突變株分離的LPS的SDS-PAGE具有不同的核心-脂質(zhì)A區(qū)的遷移模式，該突變株對豬氣管細(xì)胞的粘附性較弱，對豬的毒力較弱，說明核心OS區(qū)本質(zhì)或呈現(xiàn)的改變對該動物病原體的毒力有影響。
辨別出新的開鏈HexNAc殘基很令人感興趣。該結(jié)構(gòu)以前只在兩種變形菌菌種、最近在沙雷菌(Shewanella oneidensis)中辨別出來，其意義還不清楚。如同現(xiàn)有文獻(xiàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的那樣，本文中辨別的開鏈殘基被發(fā)現(xiàn)同時在4和6位雙取代相鄰的殘基，所以這可能是此類殘基共有的排布方式。
前面，在幾種菌株包括溶血性曼氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌和非典型性流感嗜血桿菌中，已經(jīng)觀察到從Hep I的寡糖延伸中的DD-Hep殘基的辨別。在溶血性曼氏桿菌中，觀察到兩個DD-Hep殘基，而在杜克雷嗜血桿菌和流感嗜血桿菌中，只發(fā)現(xiàn)一個DD-Hep殘基。在Ap中存在兩種情況在從HepI的寡糖延伸中血清型2和5a、5b具有兩個DD-Hep殘基，血清型1只有一個DD-Hep殘基。前面在溶血性曼氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌和流感嗜血桿菌中還觀察到三-LD-庚糖基內(nèi)核基團(tuán)。這里在所有研究過的App菌株中發(fā)現(xiàn)的3，4，6-三取代的Hep I殘基以前在溶血性曼氏桿菌LPS中都已經(jīng)觀察到，然而杜克雷嗜血桿菌LPS只具有與在流感嗜血桿菌中發(fā)現(xiàn)的相同的3，4-二取代的Hep I殘基。
辨別出Hep III殘基的7位為血清型5a的O-抗原半乳糖殘基的附著點(diǎn)是令人非常感興趣的，并與所觀察到的血清型1的三種不同截短型的核心寡糖突變體中仍然具有O-抗原這一現(xiàn)象相一致，這是由于這三種截短型基因產(chǎn)物的預(yù)期功能不會干擾內(nèi)核LD-庚糖基三糖單元的生物合成，從而O-抗原附著的受體仍然在突變型LPS核心寡糖中存在。
該研究從結(jié)構(gòu)上表征了幾種Ap菌株(代表兩種核心類型)的核心寡糖區(qū)域，辨別出保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)和新的外核組成。已知該區(qū)域涉及Ap的粘附性，從而涉及到毒力。因此，該研究能夠促進(jìn)對Ap LPS的核心寡糖區(qū)域的結(jié)構(gòu)和該生物潛在毒力的相關(guān)性的進(jìn)一步研究。
材料和方法-實(shí)施例2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件將Ap血清型1(菌株4074)、2(菌株4226)、5a(菌株K17)和5b(菌株L20)首先在巧克力瓊脂平板上37℃下培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)物用于接種1 L腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基添加有終濃度為5ug/ml的βNAD(SigmaN-7004)、終濃度為5ug/ml的氯化血紅素(haemin，Sigma H-2250)以及1％葡萄糖glucose(10g)。然后將培養(yǎng)物在37℃下以200rpm溫育6小時，并用于接種在28 L NBS發(fā)酵罐中的23 L BHI培養(yǎng)基(添加成分同上)。然后將該培養(yǎng)物在37℃、24 lmin-1通氣200rpm攪拌下培養(yǎng)18小時。殺死細(xì)胞(2％苯酚w/v，4小時)，使用Sharples連續(xù)離心機(jī)收獲(約40g濕重)。
分離和純化脂多糖通過下述方法從血清型5a和5b的干細(xì)胞群中分離脂多糖(LPS)在用有機(jī)溶劑洗滌干細(xì)胞群后，再使用熱水/酚法。將水相使用水透析，凍干，若為血清型2，LPS從充分透析的酚相中分離。將干燥的樣品溶于水中，生成1-2％的溶液(w/v)，使用脫氧核糖核酸酶I(DNase)(0.01mg/ml)和核糖核酸酶(RNase)(0.01mg/ml)在37℃下處理3小時，然后使用蛋白酶K(0.01mg/ml)處理3小時。將透析、干燥的樣品溶于水中，生成1％的溶液，超速離心(5小時，100,000g)。將LPS沉淀重新溶于水中，凍干，在Bio-Gel P-2(1cm×100cm)柱上通過凝膠過濾純化，以水作為洗脫液，收集含有糖的組分，凍干。使用無水肼在37℃、攪拌下處理純化的LPS一小時，制備O-脫酰LPS(LPS-OH)。將反應(yīng)在冰浴上冷卻，緩慢加入冷丙酮(-70 C，5倍體積)，以破壞過量的肼，沉淀的LPS-OH通過離心分離。然后將樣品如上所述過Bio-Gel P-2柱純化。核心寡糖(OS)通過下述方法分離使用1％乙酸處理(10mgml-1，100℃，1.5小時)純化的LPS，然后通過離心(5000g)去除不溶性脂質(zhì)A。凍干的OS以凍干的各組分通過Bio-GelP-2柱進(jìn)一步純化。
分析方法糖以其糖醇乙酸酯衍生物的形式通過GLC-MS測定。將樣品使用4 M三氟乙酸在100℃下水解4小時。將水解產(chǎn)物在H2O中還原(NaBD4)過夜，以殘留的乙酸鈉作為催化劑，使用乙酸酐在100℃乙?；?小時。在GLC-MS上裝上30 M DB-17毛細(xì)管柱(180℃到260℃，3.5℃/min)，Varian SaturnII質(zhì)譜儀上以電子碰撞模式進(jìn)行MS。甲基化分析通過NaOH/DMSO/甲基碘方法進(jìn)行，并通過如上的GLC-MS分析。
質(zhì)譜測定在VG Quattro質(zhì)譜儀(Micromass，Manchester，U.K.)上以陰離子模式進(jìn)行ESI-MS，直接將樣品注入含0.5％乙酸的25％乙腈水溶液中。在crystal Model 310(CE)設(shè)備(AYI Unicam)上進(jìn)行毛細(xì)管電泳(CE)-ESI-MS，該設(shè)備通過微型離子噴射接口與API 3000質(zhì)譜儀(Perkin-Elmer/Sciex)連接。將保護(hù)液(sheath solution)(異丙醇-甲醇，2∶1)以1 L/min的流速輸給較低的死體積三通管(tee)(250μm i.d.，ChromatographicSpecialties)。所有的水溶液在使用前通過0.45-μm濾器(Millipore)過濾。將電噴射不銹鋼針(27號)與較低的死體積三通管對接，以使保護(hù)液能夠流到毛細(xì)管柱的端頭。使用10mM乙酸銨/氫氧化銨的去離子水溶液(pH9.0，含5％甲醇)，在約90cm長的裸熔融石英毛細(xì)管上獲得分離物。注射時一般應(yīng)用20kV的電壓。使用激光鉗(Sutter Instruments)將毛細(xì)管的出口拉細(xì)至大約15μm i.d.。以采樣時間3.0ms、每步1m/z單位、全質(zhì)量掃描方式獲得質(zhì)譜。以采樣時間1.0ms、每步1m/z單位獲得MS/MS數(shù)據(jù)。在只有RF的四極碰撞室中，由氮與所選先驅(qū)離子碰撞活化所形成的片段離子，通過掃描第三級四極來進(jìn)行質(zhì)譜分析。
核磁共振使用5mm或3mm三重共振(1H，13C，31P)探針，在Varian Inova 400、500和600 MHz光譜儀上進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)。將凍干的糖樣品溶于600 L(5mm)或140 L(3mm)99％的D2O中。該實(shí)驗(yàn)在25℃下進(jìn)行，同時HOD(氘化H2O)在4.78ppm處的信號受到抑制。丙酮的甲基共振用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，2.225ppm對應(yīng)1H光譜，31.07ppm對應(yīng)13C光譜。將來自Varian、COSY、TOCSY、NOESY、13C-1H HSQC、13C-1H HSQC-TOCSY和13C-1H HMBC的與標(biāo)準(zhǔn)的同核和異核有關(guān)的2D脈沖序列用于常規(guī)識別。進(jìn)行帶有Z濾光片和選擇性1D-TOCSY和1D-NOESY實(shí)驗(yàn)，以及3-D NOESY-TOCSY和TOCSY-NOESY實(shí)驗(yàn)的1-D類似實(shí)驗(yàn)來完成殘基識別，并確定1H-1H核的Overhauser增強(qiáng)。選擇性脈沖的脈沖寬度為30-80Hz。將30-150ms的混合時間用于1D-TOCSY實(shí)驗(yàn)。將400-800ms的混合時間用于1D-NOESY實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2，表1胸膜肺炎放線桿菌血清型1、2、5a和5b的O-脫酰LPS和核心寡糖的陰離子ES-MS和CE-ES-MS數(shù)據(jù)以及推測的組成。平均質(zhì)量單位用于計算基于如下推測的組成的分子量Hex，162.15；HexNAc，203.19；Hep，192.17；Kdo，220.18；P，79.98；PEtn，123.05；Gly，57.05.O-脫酰脂質(zhì)A(脂質(zhì)A-OH)為952.00。


a數(shù)離子對應(yīng)于分子離子-18(失去H2O)。
實(shí)施例2，表2胸膜肺炎放線桿菌血清型1、2、5a和5b的核心OS的1H-和13C-NMR化學(xué)位移。





a；內(nèi)核數(shù)據(jù)來源于血清型5a；殘基的字母標(biāo)號如括號中所示。來自其他血清型內(nèi)核殘基的化學(xué)位移實(shí)質(zhì)上相同b；血清型5a和5b的取代的Hep III殘基的數(shù)據(jù)c；血清型1和2的末端Hep III殘基的數(shù)據(jù)d；對于血清型1的1H-共振，Glc I H-6a和H-6b分別為4.15和3.74ppm。
實(shí)施例3本實(shí)施例形成了Glycobiology 15323(2005)中一篇出版物的基礎(chǔ)。研究多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70對純化的LPS進(jìn)行糖分析表明葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)的各自的比例大約為4∶2∶3。還識別到少量的N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAc)和N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)，并且，與最近所研究的其他獸類的病原體相比，沒有識別到D-甘油-D-甘露-庚糖(DD-Hep)(Brisson，et al，2002；St.Michael et al，2004)。核心寡糖(OS)衍生的丁基-糖苷的GLC分析表明，Glc、Gal和GalNAc殘基以它們的D-異構(gòu)體形式存在。
制備O-脫酰LPS(LPS-OH)，并用凝膠過濾色譜分級，以及用CE-MS分析(實(shí)施例3，表1)。在CE-MS分析中，觀察到簡單質(zhì)譜，主峰為m/z1173.8的三電荷離子，該峰對應(yīng)于與組成HexNAc2，Hep4，Hex6，PEtn，Kdo，P，Lipid A-OH相一致的3525amu的分子，還有少量由m/z1132.93-和1215.23-表征的從主要碎片中失去或者得到一個PEtn殘基的離子峰。對三電荷離子m/z 1173.8的CE-MS分析(未顯示數(shù)據(jù))得到一個m/z951的單電荷峰和一個m/z 1236.5的雙電荷離子，從而確定O-脫酰脂質(zhì)A的大小為952amu，核心OS的大小為2475amu。O-脫酰脂質(zhì)A的主要種類(952amu)由N-酰(3-OH C 14∶0)葡糖胺殘基二糖組成，每一殘基由一個磷酸分子取代。有趣的是，對應(yīng)于缺少己糖和磷酸分子，同時增加Kdo分子的少量糖型，由m/z 1125.73-和1166.73-表征，這暗示分子的Kdo區(qū)域存在兩種截然不同的排布(實(shí)施例3，表1)，即Kdo-P或Kdo-Kdo排布。在KOH處理的LPS的CE-MS光譜中觀察到含有一個和兩個Kdo殘基糖型的一種類似混合(實(shí)施例3，表1)。ES-MS和CE-MS分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)分級的核心OS樣品具有2492Da，這與HexNAc2，Hep4，Hex6，PEtn，Kdo的組成一致(實(shí)施例3，表1)(圖19)。對核心OS用陽離子模式進(jìn)行CE-MS/MS分析，以獲得OS分子中的一些官能團(tuán)的定位信息。對m/z 1246.52+的雙電荷離子的MS/MS分析表明了幾種產(chǎn)物離子(圖20)。一種與203.5+的HexNAc殘基和兩種407.5+的HexNAc殘基對應(yīng)的單電荷離子占優(yōu)勢。還識別出對應(yīng)圖20中所示組成的其他產(chǎn)物離子。在對m/z 316(對應(yīng)Hep-PEtn基團(tuán))的先驅(qū)離子的掃描中，根據(jù)對m/z 817.52+(Hex3，Hep4，Kdo，PEtn)、898.52+(Hex4，Hep4，Kdo，PEtn)、979.52+(Hex5，Hep4，Kdo，PEtn)、1059.52+(Hex6，Hep4，Kdo，PEtn)和1263.52+(HexNAc2，Hex6，Hep4，Kdo，PEtn)(圖21)的水合雙電荷離子的識別，將核心OS的PEtn區(qū)定位于內(nèi)核的一個庚糖殘基(Hep)。通過對m/z 893+(對應(yīng)HexNAc-HexNA基團(tuán))的先驅(qū)離子的掃描，揭示了893+的單電荷離子，該單電荷離子對應(yīng)于Hex3，HexNAc2(未顯示數(shù)據(jù))組成。因此，這兩種先驅(qū)離子掃描實(shí)驗(yàn)表明了內(nèi)核組成Hex3、Hep4、Kdo和PEtn，并帶有一3Hex和2HexNAc殘基的外核延伸。
為確定分子的連接模式而對核心OS進(jìn)行的甲基化分析顯示末端Glc，6-取代的Glc，4-取代的Glc，4-取代的Gal，3-取代的Gal和末端LD-Hep以摩爾比約為2∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比率存在，并觀察到有較少的末端Gal，2-取代的LD-Hep，3，4-二取代的LD-Hep和3，4，6-三-取代的LD-Hep。另外，通過比較來自胸膜肺炎放線桿菌(Ap)血清型2的過甲基化糖醇乙酸酯，將4，6二-取代的LD-Hep殘基的保留時間與4，6二-取代DD-Hep殘基區(qū)分開來，確定了其歸屬，并且與Pm LPS中無DD-Hep一致。
為了闡明OS的確切位置及連接模式，對OS組分以及完全脫酰(KOH處理)的樣品(圖22)進(jìn)行了NMR研究，其中對OS組分提供了最清楚，最均一的譜圖。通過COSY和TOCSY(圖5a)實(shí)驗(yàn)識別了OS和KOH處理的LPS的1H共振，同時參照了溶血性曼氏桿菌(Mh)和Ap的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的核心OS(Brisson，et al，2002；St.Michael et al，2004)(實(shí)施例3，表2)。
在Pm70 OS和KOH處理的LPS的1H-NMR譜圖中，從庚糖殘基(Hep I(E)，Hep II(F)，Hep III(G)和Hep IV(J))在5.10OS(OS樣品)/5.19KOH(KOH處理樣品)(Hep I，E)，5.87os/5.74KOH(Hep II，F(xiàn))，5.23os&KOH(Hep III，G)和5.12os&KOH(Hep IV，J)ppm的端基異構(gòu)體1H共振中識別到源于上述庚糖殘基的自旋系統(tǒng)，結(jié)合這些自旋系統(tǒng)的形態(tài)，將上述自旋系統(tǒng)確定為甘露-吡喃糖基環(huán)系統(tǒng)。由于相鄰Kdo分子在酸水解后的多種重排產(chǎn)物的存在，觀察到在OS樣品中有Hep I端基異構(gòu)體質(zhì)子的異質(zhì)性(詳述OS樣品中較多Hep I信號的識別)。僅從殘基內(nèi)NOE’s在H1和H2共振之間的出現(xiàn)，能顯而易見的確定庚糖殘基的α-構(gòu)型。5.22os&KOHppm(Glc II，H)和5.09os/5.53KOHppm(GalNAc II/GAlN II，P)的α-端基異構(gòu)體區(qū)的兩個殘基，根據(jù)其自旋系統(tǒng)的形態(tài)分別被確定為葡萄糖-吡喃糖和半乳糖-吡喃糖。半乳糖-構(gòu)型殘基在5.09os/5.53KOHppm下被確定為氨基糖，這是根據(jù)其在4.24os/3.65KOHppm下的H-2質(zhì)子的1H共振而確定的，在13C-1H HSQC實(shí)驗(yàn)中，其與50.4os/51.5KOHppm的13C化學(xué)位移有關(guān)。該13C化學(xué)位移與氮取代的碳原子一致。在TOCSY實(shí)驗(yàn)中，在4.95os/4.99KOHppm(Gal II，N)下，根據(jù)其特征性自旋系統(tǒng)出現(xiàn)在H-4共振，將α-端基異構(gòu)體區(qū)剩余殘基確定為半乳糖-吡喃糖(圖23)。在光譜的低磁場區(qū)(4.45-6.00ppm)的剩余的端基異構(gòu)體共振，根據(jù)他們的異頭1H共振的化學(xué)位移和在該殘基已經(jīng)解析情況下的高J1，2(～8Hz)耦合常數(shù)，歸因于β-連接殘基。在4.65os&KOHppm(GlcI，I)，4.70os&KOHppm(Glc III，K)和4.69os&KOHppm(Glc IV，L)下的共振，根據(jù)他們的自旋系統(tǒng)的形態(tài)，將其確定為葡萄糖-構(gòu)型。在TOCSY實(shí)驗(yàn)中，在低磁場區(qū)4.53os&KOHppm(Gal I，M)和4.73os/5.01KOHppm(GalNAc I/GalNI，O)下，根據(jù)H-4共振的特征性自旋系統(tǒng)出現(xiàn)在，將剩余共振確定為半乳糖-吡喃糖殘基。在4.73os/5.01KOHppm下，根據(jù)半乳糖-構(gòu)型殘基在4.12/3.53ppm下，H-2質(zhì)子的1H共振，將其確定為一個氨基糖，其與在13C-1H HSQC實(shí)驗(yàn)中、51.9os/53.1KOHppm的13C化學(xué)位移有關(guān)。該13C化學(xué)位移與氮取代的碳原子一致。在3.27和4.16ppm下的OS樣品中，觀察到PEtn部分的CH2質(zhì)子信號，其分別與13C-1H HSQC實(shí)驗(yàn)中、在40.1和62.2ppm下的特征性13C化學(xué)位移相關(guān)。另外，在2.06和2.04ppm下的OS樣品中，觀察到氨基糖的乙?；卣餍孕盘?，其分別與13C-1H HSQC實(shí)驗(yàn)中、在22.4和22.1ppm下的13C化學(xué)位移相關(guān)。
通過殘基間1H-1H NOE測定法，將OS中糖基殘基的順序確定在相鄰的糖基殘基的端基異構(gòu)體質(zhì)子和苷元質(zhì)子之間，并且確定和擴(kuò)充了甲基化作用的分析數(shù)據(jù)。使用這種方式確定了Pm70脫酰寡糖的連接模式(圖24)(實(shí)施例3，表2)。這樣，就如同常觀察到的三-庚糖基部分一樣，在質(zhì)子對Hep III(G)H-1和Hep II(F)H-2，Hep II(F)H-1和Hep I(E)H-3和Hep I(E)H-1和Kdo(C)H-5之間出現(xiàn)與糖苷強(qiáng)的NOE連接關(guān)系，建立起這三種LD-庚糖殘基的順序和附著點(diǎn)，這種連接模式經(jīng)常在流感嗜血桿菌(Hi)和Mh的內(nèi)核OS中遇到(Cox et al，2001 a；Brisson et al，2002)。而且，在Hep III(G)H-1和Hep II(F)H-1之間的端基異構(gòu)體質(zhì)子的殘基間NOE’s為1，2-連接鍵提供了確認(rèn)(Romanowska et al，1988)。對Glc I(I)H-1的NOE連接性考察，通過Hep I(E)H-4和Hep I(E)H-6的殘基間NOE，說明該葡萄糖殘基與Hep I(E)在4-位連接。一個H-6的殘基間NOE對4-取代庚糖殘基來說經(jīng)常發(fā)生(Backman et al，1988)。如在前面Mh和Ap的OS中所觀察到的，在Glc I(I)H-1和Glc II(H)H-1之間的遠(yuǎn)程N(yùn)OE連接性的出現(xiàn)表明α-構(gòu)型葡萄糖殘基(Glc II(H))在6-位取代Hep I(Brisson，et al，2002；St.Michael et al，2004)。對Glc II(H)H-1的NOE連接性考察，通過Hep I(E)H-4的殘基間NOE，確定這個葡萄糖殘基與Hep I(E)在6-位連接。類似Glc I(I)，在GlcI(I)和Glc II(H)端基異構(gòu)體1H共振之間觀察到一個遠(yuǎn)程N(yùn)OE連接性。通過Glc I(I)H-6a和H-6b的殘基間NOE，對Hep IV(J)H-1的NOE連接性進(jìn)行考察，揭示出這個庚糖殘基與Glc I(I)在6-位連接。在之前的Mh和Ap中觀察到內(nèi)核單糖結(jié)構(gòu)Hep IV殘基(J)是D-甘油-D-甘露構(gòu)型，而這里的Hep IV殘基(J)是L-甘油-D-甘露構(gòu)型，這是因?yàn)樵谔欠治鲋凶R別到的庚糖殘基的唯一構(gòu)型。根據(jù)NOE連接性和13C-1H-HMBC證據(jù)，以及甲基化作用分析數(shù)據(jù)推斷出外核殘基的連接模式。兩個葡糖構(gòu)型殘基(K&L)，它們的端基異構(gòu)體質(zhì)子在4.70OS&KOH/4.69OS&KOHppm下的共振表明在4.15OS&KOH和4.31OS&KOHppm下Hep IV殘基(J)H-4和H-6質(zhì)子共振的NOE連接性，與甲基化分析中觀察到的4，6-二取代LD-庚糖殘基一致，并且與前面在Ap血清型2中觀察到的DD-HepIV排布相似(St.Michael et al，2004)。通過1H-13C HMBC實(shí)驗(yàn)(圖25)可以確定，Glc III(K)在4位上連接于HepIV(J)，Glc IV(L)在6位上連接于HepIV(J)。從Gal I(M)在4.53OS&KOHppm下的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振到Glc IV(L)的H-4質(zhì)子共振NOE間的連接性顯示，Gal I(M)在4-位上取代Glc IV(L)。從Gal II(N)的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振到Gal I(M)的H-4質(zhì)子共振NOE間的連接性顯示，Gal II(N)在4-位上取代Gal I(M)，與甲基化分析數(shù)據(jù)所確定的兩個4-連接己糖殘基，即一個4-連接葡萄糖和一個4-連接半乳糖殘基相一致。從GalNAc I/GAlN I(O)的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振到Glc II(N)的H-3質(zhì)子共振NOE間的連接性顯示，GalNAc I/GAlN I(O)在3-位上取代GlcII(N)，又通過甲基化分析確認(rèn)到一個3-連接己糖殘基而確定。最后，從GalNAc II/GalN II(P)的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振到GalNAc I/GalN I(O)的H-3質(zhì)子共振NOE間的連接性顯示，GalNAc II/GalN II(P)在3-位上取代GalNAc I/GalN I(O)，與MS/MS確認(rèn)的一個HexNAc-HexNAc二糖相一致。通過以O(shè)S樣品的31P-1H-HSQC和31P-1H-HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)確認(rèn)Hep II(F)的3-位為PEtn的取代位置。HSQC實(shí)驗(yàn)識別到一個從磷信號到4.41ppm處的質(zhì)子共振的交叉峰，該交叉峰歸屬于Hep II殘基(F)的3位，這在HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)中被進(jìn)一步確認(rèn)和擴(kuò)充，該HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)顯示Hep II(F)的H-2和H-1質(zhì)子共振分別位于4.31和5.87ppm(未顯示數(shù)據(jù))。
通過對經(jīng)KOH處理的LPS的分析確定了Hep I-Kdo-脂質(zhì)A區(qū)(E-C-B-A)的連接為L-α-D-Hep I-(1-5)-α-Kdo4P-(2-6)-β-GlcN4P-(1-6)-α-GlcN1P(實(shí)施例3，表2)。通過色譜分離和MS識別得到含有兩種Kdo的組分，但其量不足以用于NMR分析。
Pm70菌株基因組序列的利用(May et al，200)連同對OS結(jié)構(gòu)的全面的認(rèn)知，加上糖基轉(zhuǎn)移酶信息，使幾種用于Pm70 OS生物合成的候選糖基轉(zhuǎn)移酶被確認(rèn)(圖26)，所述糖基轉(zhuǎn)移酶將在結(jié)構(gòu)上和分類學(xué)上相關(guān)的種類聯(lián)系起來，。在Pm70基因組序列中確認(rèn)了幾種推測的庚糖轉(zhuǎn)移酶，包括一個Hep III Tase PM1294，一個Hep II Tase PM1844，兩個Hep I TasesPM1302和PM1843以及一個Hep IV Tase PM1144。在實(shí)施例3，表3中詳細(xì)描述了這些基因中的每一個在數(shù)據(jù)庫中的最佳同源物，這種高度同源性顯示候選PM基因會有所示的功能。前面我們小組和合作者曾表明，PM1294在另一Pm菌株VP161中是Hep III Tase(Harper et al，2004)。將α-葡萄糖(H)加到Hep I(E)的6-位的基因不是公知的，但對β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(其在4-位取代Hep I(E))，有一個很好的同源物PM1306。由于Kdo轉(zhuǎn)移酶有廣泛數(shù)目的極好的同源物，因而其已很容易地被識別是PM1305，然而，在Pm基因組中只識別到一個Kdo轉(zhuǎn)移酶同源物。有趣的是，幾個與Kdo(C)，Hep I(E)，Glc I(I)的生物合成相關(guān)的基因成簇地存在于在該條染色體的這個區(qū)域。外核區(qū)推測的糖基轉(zhuǎn)移酶似乎也成簇出現(xiàn)在從PM1138到PM1144的染色體的某一區(qū)域。在這種菌屬中并不總是能觀察到這種糖基轉(zhuǎn)移酶基因簇，實(shí)際上，Hi OS的糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛地分散于整個基因組。在Pm(從PM0506到PM0512)基因組的另一區(qū)域，可以找到另一個推測的糖基轉(zhuǎn)移酶基因座。在Hi和杜克雷嗜血桿菌(Hd)中，這種基因座都與所謂的lsg基因座很好地排布在一起。這種未被指定任何具體作用的基因座在HiOS生物合成中的作用是文獻(xiàn)(Phillips et al，1996，2000；Cox et al，2001b)中的一個討論問題。但在這個Pm70基因座中間是一個唾液酸轉(zhuǎn)移酶同源物(PM0508)，該同源物是Pm70(也是PM0188和PM1174)基因組中三個唾液酸轉(zhuǎn)移酶同源物之一，并且在我們實(shí)驗(yàn)室，結(jié)構(gòu)研究仍在進(jìn)行以考察在適當(dāng)?shù)纳L條件下，Pm70是否可能唾液酸化。在實(shí)施例3，表3中，還詳述了被激活的核苷酸糖供體候選基因。
討論對Pm菌株的Pm70基因組的寡糖結(jié)構(gòu)分析顯示出一種結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)類似于之前所確定的相關(guān)菌種Mh(Brisson et al，2000)，Ap(St.Michaelet al，2004)，Hd(Schweda et al，1994)和Hi(Cox et al，2001a)的LPS核心寡糖結(jié)構(gòu)。在每種情況下，核心OS包含連接在Kdo殘基上的一個等同連接的三-庚糖基單元。有趣的是，在多數(shù)情況下，在Pm中3-位的HepII殘基被PEtn殘基替代，而Ap，Hd和Mh不包含PEtn殘基，Hi在HepII的6-位有一個PEtn殘基。Pm的Hep I殘基的取代模式與在獸類病原體Ap和Mh中發(fā)現(xiàn)的相同，在4-位和6-位有兩個葡萄糖殘基，而在Hi和Hd的Hep I殘基中，只有4-位被取代。另外，在三種獸類病原體、Hd以及Hi的一些菌種中，在Hep I 4-位的葡萄糖殘基總是被一個庚糖殘基在6-位取代。然而，與在Ap、Hd、Mh和一些Hi菌株中的D-甘油-D-甘露構(gòu)型的庚糖殘基相比，在Pm(和一些Hi菌株)中取代葡萄糖殘基的庚糖殘基是L-甘油-D-甘露構(gòu)型。在這些菌株中，庚糖殘基的取代模式多種多樣，在OS結(jié)構(gòu)的這一方面，在多種菌株之間保守內(nèi)核結(jié)構(gòu)相似性終止。在Pm中庚糖殘基在4-和6-位被兩個葡萄糖殘基二-取代，與在Ap血清型2中庚糖殘基在相同位置被二-取代相似，但在4-位是被另一庚糖殘基而不是被葡萄糖殘基取代。Mh在4-位也有另一個D，D-庚糖殘基，而在Ap血清型1、Hd和Hi中也有來自于第四個庚糖殘基進(jìn)一步的己糖延伸，但是在這里沒有觀察到在新的GalNAc-GalNAc二糖單元終止的延伸。
在Pm70基因組中，基于Pm70 OS結(jié)構(gòu)識別到有相似特異性的關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶的同源物Pm?？紤]到依賴于一或兩個Kdo殘基的存在的兩個LPS成員的新發(fā)現(xiàn)，會有趣地注意到在Pm基因組中只識別到一個關(guān)于Kdo殘基轉(zhuǎn)移酶的同源物。這并不令人驚訝，因?yàn)镵do轉(zhuǎn)移酶的多效性本質(zhì)已被充分證明，例如相同的Kdo轉(zhuǎn)移酶能夠轉(zhuǎn)移一個Kdo殘基到脂質(zhì)A而將第二個Kdo殘基轉(zhuǎn)移到初始的Kdo殘基。Pm LPS的新特征雖然是有一和兩個已被公開的Kdo殘基的成員，但就我們所知，在之前沒有被識別到過。但是，在Pm70基因組中觀察到兩個很好的Hep I(E)到Kdo(C)(α-1，5庚糖轉(zhuǎn)移酶)的轉(zhuǎn)移酶的同源物。一個轉(zhuǎn)移酶對Hi的HI 0261(OpsX)有最高同源性，其中LPS結(jié)構(gòu)中包含一個Kdo殘基；第二個轉(zhuǎn)移酶對來自大腸桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌的WaaC具有最高同源性，所述大腸桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌中LPS結(jié)構(gòu)中有兩個Kdo殘基。因此，兩個Hep I轉(zhuǎn)移酶的識別與Pm70 LPS的Kdo區(qū)域中兩種結(jié)構(gòu)排布的出現(xiàn)相符，并且理解這種生物體Kdo轉(zhuǎn)移酶的規(guī)律是非常有趣的。
這項(xiàng)研究從結(jié)構(gòu)上表征了Pm基因組菌株的核心OS區(qū)域，確認(rèn)出用于核心OS的完全生物合成的推定的糖基轉(zhuǎn)移酶。
材料、方法培養(yǎng)基和生長條件Pm菌株P(guān)m70(NRCC#6232)先在巧克力瓊脂平板上于37℃培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)物接種到1L腦-心浸液(BHI)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基添加有，終濃度為5ug/ml的β NAD(Sigma N-7004)，終濃度5ug/ml的氯化血紅素(SigmaH-2250)，和1％葡萄糖(10g)。然后將培養(yǎng)物在37℃，200rpm下培養(yǎng)6小時，接種到一個28L NBS發(fā)酵罐中的24L BHI培養(yǎng)基(添加同上)。再將培養(yǎng)物于37℃，每分鐘通氣24次，轉(zhuǎn)速在200rpm，20％O2飽和下培養(yǎng)18小時。接著用透明質(zhì)酸酶(1g，Sigma，)處理，殺死細(xì)胞(2％苯酚w/v，4小時)，用Sharples連續(xù)式離心機(jī)收集(～240g濕重)。
脂多糖的分離純化接下來用有機(jī)溶劑洗滌凍干細(xì)胞塊(～70g)得到～50g，從用熱水、苯酚方法清洗的10g凍干細(xì)胞塊中分離出脂多糖(LPS)(Westphal and Jann，1965)。將水相除水透析并凍干。將干樣品溶于水中得到1-2％的溶液(w/v)，用脫氧核糖酸梅I(DNase)(0.01mg/ml)和核糖核酸酶(RNase)(0.01mg/ml)于37℃處理3小時，然后用蛋白酶K(0.01mg/ml)消化3小時。將透析、干燥樣品溶解于水中制得1％的溶液，于8K低速離心去除不溶物質(zhì)(124g)后于45K超速離心。45K離心而得的LPS沉淀用水再溶解并凍干(180g)。純化的LPS(75g)用無水肼于37℃搖動處理1小時以制備O-脫酰LPS(LPS-OH)。反應(yīng)于冰浴中冷卻，并逐漸加入低溫丙酮(-70℃，5倍體積)以破壞剩余的肼，離心分離出沉淀的LPS-OH(60mg)。如上面所述，將該樣品通過Bio-Gel P-2柱純化。通過用1％乙酸(10mg/ml-1，100℃，1.5小時)處理純化的LPS(100mg)，隨后離心(5000g)除去不溶的脂質(zhì)A以分離出核心寡糖。用凍干的各組分通過Bio-Gel P-2柱進(jìn)一步純化凍干的OS(50mg)。將LPS-OH(20mg)用4N KOH在125℃處理16小時，中和后用前面所述的陰離子交換液相色譜分級，分離出完全脫酰的LPS(Vinogradov，E and Bock，K.1999)。
分析方法通過GLC-MS糖被確認(rèn)為是其糖醇乙酸酯衍生物(Sawardeker et al，1965)。將樣品用4M三氟乙酸于100℃水解4小時，然后在水中還原(NaBD4)過夜，并以殘留乙酸鈉為催化劑用醋酸酐于100℃乙?；?小時。GLC-MS配備有一個30 M DB毛細(xì)管柱(180℃到260℃，以3.5℃/min)，MS在VarianSaturn II型質(zhì)譜儀上以電子碰撞模式進(jìn)行。通過NaOH/DMSO/甲基碘方法(Ciucanu and Kerek，1994)進(jìn)行甲基化分析，并通過上述的GLC-MS進(jìn)行分析。絕對構(gòu)型由丁基糖苷衍生物的GLC分析決定(St.Michael et al，2004)。
質(zhì)譜法ESI-MS用VG Quattro質(zhì)譜儀(Micromass，Manchester，U.K.)以陰離子模式進(jìn)行，直接注入含0.5％乙酸的25％乙腈水溶液中的樣品。毛細(xì)管電泳(CE)-MS在Prince CE系統(tǒng)(Prince Technologies，TheNetherlands)上進(jìn)行，該系統(tǒng)經(jīng)由一個微型噴霧接口結(jié)合API 3000質(zhì)譜儀(Applied Biosystem/Sciex，Concord，Canada)。以1pL/min的流速遞送保護(hù)液(異丙醇-甲醇，2∶1)到具有低死體積的三通管(250μm i.d.，Chromatographic Specialties)中。所有水溶液在使用之前用0.45μm濾膜(Millipore)過濾。用一個電噴射不銹鋼針(27號)鄰接低死體積的三通管以使保護(hù)液的遞送到毛細(xì)管柱的末端。用10mM乙酸銨/氫氧化銨、pH9.0、含有5％甲醇的去離子水溶液在約90cm長的空融硅毛細(xì)管上完成分離。在注射部位一般施用20kV的電壓。使用一個激光鉗(SutterInstruments)使毛細(xì)管的出口漸縮為約15μm i.d。在全質(zhì)量掃描模式下，每1m/z單元步驟的駐留時間為3.0ms，即可獲得質(zhì)譜光譜。每1m/z單元駐留時間為1.0ms，得到MS/MS數(shù)據(jù)。在只有RF的四極碰撞室中，所選擇的先驅(qū)離子與氮?dú)馀鲎不罨纬伤槠x子，通過掃描第三級四極對碎片離子進(jìn)行質(zhì)譜分析。
核磁共振NMR實(shí)驗(yàn)使用5mm或3mm三重共振(1H，13C，31P)探針，在Varian Inova400，500和600MHz光譜儀上完成。將凍干糖樣品溶解于600μL(5mm)或140μL(3mm)的99％的D2O中。上述實(shí)驗(yàn)在25℃下進(jìn)行，以抑制4.78ppmHOD(氘化水)信號。丙酮的甲基共振作為在2.225ppm的1H光譜和31.07ppm的13C光譜的內(nèi)部參數(shù)。來自Varian，COSY，TOCSY，NOESY，13C-1H HSQC，13C-1H HSQC-TOCSY和13C-1H HMBC的與標(biāo)準(zhǔn)同核和異核相關(guān)的2D脈沖序列被用于一般性歸屬。2D1H-31P HSQC實(shí)驗(yàn)在Varian Inova 400光譜儀上進(jìn)行6小時完成。通過系列1D-HSQC實(shí)驗(yàn)在12Hz優(yōu)化耦合常數(shù)。F2(1H)維的掃描寬度為6.0ppm，F(xiàn)1(31P)維的掃描寬度為16.2ppm。在松弛延遲期，水預(yù)飽和延遲是1.5s，t2的取數(shù)時間是0.21s，在每隔180(HMQC)掃描的模式下，可獲得32格。2D1H-31p HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)與HSQC實(shí)驗(yàn)采用相同的參數(shù)在Varian Inova 400光譜儀上進(jìn)行8小時，TOCSY混合時間為80ms。
實(shí)施例3，表1來自于多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70的核心OS、O-脫酰和KOH處理的LPS的陰離子CE-MS和推測的組成。平均質(zhì)量單位根據(jù)如下推測組成用于計算分子量Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；HexNAc，203.19；HexN，161.15；PEtn，123.05。

實(shí)施例3，表2對于來自于多殺性巴氏桿菌Pm70的完全脫酰(KOH處理的)LPSa和核心OSb的1H-和13C-NMR化學(xué)位移。




a來自KOH處理的LPS數(shù)據(jù)；b來自核心OS樣品的數(shù)據(jù)；ab來自KOH處理的LPS和OS樣品的數(shù)據(jù)，歸屬一致；除了來自KOH處理的LPS的殘基I的cH-1化學(xué)位移是4.60ppm和來自KOH處理的LPS的殘基J的dH-2化學(xué)位移是4.11ppm。
實(shí)施例3，表3.在多殺性巴氏桿菌基因組菌株P(guān)m70中，LPS核生物合成的椎定糖基轉(zhuǎn)移酶。


實(shí)施例4本實(shí)施例形成了在“Carbohydrate Research340，59(2005)”中一篇文獻(xiàn)的基礎(chǔ)。多殺性巴氏桿菌菌株VP161的脂多糖結(jié)構(gòu)分析。
本實(shí)施例闡明了來源于多殺性巴氏桿菌菌株VP161的脂多糖結(jié)構(gòu)。該脂多糖易于受到多種降解過程的影響。通過單糖和甲基化分析、NMR光譜及質(zhì)譜建立起純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。如下的脂多糖結(jié)構(gòu)是在這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)合數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上確定的， 其中，根據(jù)NMR數(shù)據(jù)，所有的糖都以吡喃糖環(huán)形式存在，Kdo代表2-酮-3-脫氧-辛酮糖酸，L-α-D-Hep代表L-甘油-D-甘露-庚糖，PPEtn代表焦磷酸乙醇胺，PCHo代表磷酸膽堿。有趣的是，當(dāng)檢測O-完全脫乙?；腖PS時，很明顯，在該分子的Kdo區(qū)域的排布中存在變化性。發(fā)現(xiàn)帶有一個Kdo-P部分的糖型，以及具有Kdo-Kdo基團(tuán)的糖型。此外，當(dāng)存在兩個Kdo殘基時，Glc II殘基沒有連接到Hep I上，但是當(dāng)Kdo-P排布很復(fù)雜時，Glc II殘基則是連接到Hep I上的，這揭示出一種生化合成的不相容性，這種不相容性歸結(jié)于空間位阻作用或者不合適的受體構(gòu)象。在包括基因組株P(guān)m70在內(nèi)的，其他被研究的多殺性巴氏桿菌菌株中LPS的Kdo區(qū)也發(fā)現(xiàn)了這種變化。
多殺性巴氏桿菌(Pm)是革蘭氏陰性菌，也是多個物種的病原體，會在可食用動物和人類中產(chǎn)生很嚴(yán)重的疾病。Pm菌是雞或火雞的禽霍亂，牛的出血敗血癥，豬的萎縮性鼻炎以及人的貓狗咬傷傳染病的致病媒介。之前就已經(jīng)識別出了一些Pm毒性因子，這些毒性因子包括血清組A和B的莢膜及LPS。然而，關(guān)于從Pm分離出來的LPS的內(nèi)毒素性質(zhì)，存在有互相矛盾的報告。從血清組B2株分離出的被證明是內(nèi)毒性的LPS，靜脈注入LPS能在美洲野牛中產(chǎn)生出血性敗血癥的臨床癥狀。但是，發(fā)現(xiàn)火雞幼禽能相對抵抗從Pm血清組A株中分離的LPS的致死作用，盡管其炎癥反應(yīng)和顯微鏡觀測的肝損傷與在哺乳動物宿主中所觀察到的相似。與之相反的，發(fā)現(xiàn)雞胚胎和小鼠對于Pm LPS的毒性作用高度敏感。
基于對LPS的抗體應(yīng)答，Pm菌株可歸類于Heddleston血清型，同時，針對熱滅活Pm疫苗而產(chǎn)生的抗體主要用于抵抗LPS，并保護(hù)宿主抵抗具有相同血清型的菌株。早期研究表明，采用熱酚/水方法純化并被注射到小鼠和兔子體的LPS產(chǎn)生很弱的抗體應(yīng)答，并且不產(chǎn)生抵抗Pm感染的保護(hù)作用，然而，相同的LPS注射到雞體內(nèi)，則誘導(dǎo)出很好的抗體應(yīng)答，這種抗體應(yīng)答能被動地保護(hù)接種者抵抗疾病。由血清型A菌株的LPS產(chǎn)生的單克隆抗體顯示出具有殺菌性，并能夠完全保護(hù)小鼠抵抗同源攻擊。此外，抗Pm血清型B菌株LPS的調(diào)理性單克隆抗體，表現(xiàn)出能夠部分保護(hù)小鼠抵抗Pm感染。
經(jīng)過修飾的LPS結(jié)構(gòu)無疑會影響Pm在生物體內(nèi)的生存力。最近，辨別出了三株被大幅度減毒的Pm菌株VP161的突變體，每一個突變體在基因pm1294(命名為waaQpm)處都有一個單轉(zhuǎn)座子插入。該基因pm1294隨后被證明用于編碼庚糖基轉(zhuǎn)移酶，該基因的突變產(chǎn)生高度截短的LPS結(jié)構(gòu)。此外，Pm galE突變體之前就已經(jīng)被構(gòu)建出來，并在小鼠體內(nèi)減毒，但沒有其LPS結(jié)構(gòu)分析被報導(dǎo)過。采用被莢膜抗原敏化的紅血球進(jìn)行的被動血球凝集試驗(yàn)，根據(jù)Pm莢膜抗原，將其分離株按血清型分組為5種血清型組A、B、D-F。血清組A(透明質(zhì)酸)，D(肝素)和F(軟骨素)的莢膜的結(jié)構(gòu)信息是可獲得的，所述透明質(zhì)酸、肝磷脂和軟骨素中的每一種都是已經(jīng)被充分研究的粘多糖。體細(xì)胞(LPS)類型也可以用來鑒定細(xì)胞株，這里有兩種主要報道過的系統(tǒng)。Namioka系統(tǒng)基于試管凝集實(shí)驗(yàn)，能夠識別11種血清型；而Heddleston體系應(yīng)用凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)，能夠識別16種血清型，是目前的優(yōu)選方法。
1981年，開始推薦使用一種鑒定多殺性巴氏桿菌血清型的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用字母A、D、E和F辨別Carter莢膜類型，同時利用數(shù)字辨別Heddleston體細(xì)胞類型。Pm表達(dá)不具有多聚體O-抗原的LPS分子，即所謂的粗糙型LPS。近來，我們分析了基因組菌株P(guān)m70的LPS結(jié)構(gòu)，該LPS結(jié)構(gòu)展示出粗糙型LPS結(jié)構(gòu)。該項(xiàng)研究也在另一種Pm菌株，即VP161(一種高毒性的血清型A1菌株)上進(jìn)行，以獲得對PmLPS結(jié)構(gòu)的啟示，以及研究在菌株中的Kdo區(qū)域是否存在變異。之前，我們已經(jīng)表征出VP161的庚糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的核心OS，這里我們報道LPS的完整結(jié)構(gòu)，包括在LPS分子的Kdo區(qū)域的新型排布。
實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件多殺性巴氏桿菌VP161在巧克力瓊脂平板上于37℃初始生長16h，然后將培養(yǎng)物接種到1L腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基，該腦心浸液(BHI)培養(yǎng)基添加有終濃度為5ug/ml的β-NAD(Sigma N-7400)，終濃度為5ug/ml的氯化血紅素(Sigma H-2250)和1％葡萄糖(10g)。然后，將培養(yǎng)物在37℃、200rpm溫育6h后，接種到發(fā)酵罐。然后，多殺性巴氏桿菌VP161在28L發(fā)酵罐內(nèi)，在24L BHI肉湯中，在37℃、20％DO值條件下培養(yǎng)18h。加入苯酚到2％來殺死細(xì)胞，加入苯酚3h后加入1g透明質(zhì)酸酶(RocheChemicals)并攪拌1h；之后，使用Sharples連續(xù)離心機(jī)(～210g)收獲細(xì)胞。
脂多糖的分離、純化和降解將多殺性巴氏桿菌細(xì)胞(濕重約210g)凍干，得到約56g凍干細(xì)胞。為了提高LPS萃取效率，將凍干細(xì)胞用有機(jī)溶劑洗滌(1倍乙醇，2倍丙酮，2倍輕石油醚)去除脂質(zhì)和其他親脂性成分。洗滌后的細(xì)胞(從約42g得到10g)采用熱酚/水方法進(jìn)行萃取，水相合并并相對流水透析48h。將滲余物凍干，得到約1.6g，配制為2％水溶液，用DNA酶和RNA酶在37℃處理4h，接下來用蛋白酶K在37℃處理4h。透析除去小肽。凍干后，將透析物(約0.2g)配制為2％水溶液，8000g下離心15分鐘(得約85mg的8K沉淀)，接著將上清液在100,000g下進(jìn)一步離心5h。將含有純化的LPS的沉淀重新溶解、凍干(得約17mg)。為了制備O-脫乙酰基LPS(LPS-OH)，將8K沉淀材料(約40mg)以無水肼在37℃攪拌處理1h。上述反應(yīng)冰浴冷卻，然后，逐步地，加入冷丙酮(-70℃，5倍體積)破壞過量的肼，通過將重新溶解的沉淀(約35mg)離心、凍干分離得到沉淀的LPS-OH。然后，樣品以凍干的各組分通過Bio-Gel P-2柱進(jìn)行純化。以1％冰醋酸(10mg/ml，100℃，1.5h)分別處理8K沉淀材料(約45mg)和LPS(約17mg)，隨后通過離心(5,000g)去除不溶的脂質(zhì)A，分離得到核心寡糖(OS)。接著，采用與上述相同的過程，將來自8K沉淀的凍干OS樣品通過Bio-Gel P-2柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。以4N KOH在125℃處理LPS-OH(約12mg)16h，可將完全脫酰的LPS分離出來；隨后的中和產(chǎn)物可通過陰離子交換液相色譜分離。
分析方法可通過GLC-MS以其糖醇乙酸酯衍生物的形式測定糖。在100℃用4M三氟乙酸水解樣品4h，水解產(chǎn)物在水中用NaBD4還原16h；然后，以殘留的乙酸鈉為催化劑，用乙酸酐在100℃乙?；?h。GLC-MS儀裝備有30MDB-17毛細(xì)管柱(以3.5℃/min的速度從180℃升溫到260℃)，MS在VarianSaturn II質(zhì)譜儀的電子撞擊模式下進(jìn)行。通過NaOH/DMSO/甲基碘方法進(jìn)行甲基化分析，并應(yīng)用GLC-MS進(jìn)行分析。絕對構(gòu)象可通過丁基糖苷衍生物的GLC分析來確定。
質(zhì)譜分析直接將樣品分散到含有0.5％乙酸的25％乙腈水溶液中，在VGQuattro質(zhì)譜分析儀(Micromass，Manchester，U.K.)的陰離子模式下進(jìn)行ESIMS分析。毛細(xì)管電泳(CE)-MS在Prince CE系統(tǒng)(PrinceTechnolgies，The Netherlands)中進(jìn)行，該P(yáng)rince CE系統(tǒng)通過一微噴霧接口與API 3000質(zhì)譜分析儀(Applied Biosysten/Sciex，Concord，Canada)連接。保護(hù)液(異丙醇-甲醇，2∶1)以1μL/min的速度輸送到一個具有低死體積的三通管(250μm i.d.，ChromatographicSpecialties)中。所有的水溶液在使用前經(jīng)過0.45-μm濾膜(Millipore)過濾。一個不銹鋼電子噴射針頭(27號)鄰接該低死體積的三通管，使保護(hù)液能夠輸送到毛細(xì)管柱的末端。使用pH9.0，含有5％甲醇的10mM乙酸銨/氫氧化銨的去離子水溶液作為洗脫液，在長約90cm的空融硅毛細(xì)管中完成分離。在注射部位一般使用20kY電壓。使用激光鉗(SutterInstruments)將毛細(xì)管的出口漸縮為15μm i.d。在全質(zhì)量掃描模式下，每1m/z單元步驟的駐留時間設(shè)置為3.0ms，即可獲得質(zhì)譜光譜。每1m/z單元駐留時間設(shè)置為1.0ms，得到MS/MS數(shù)據(jù)。在只有RF的四極碰撞室中，所選擇的先驅(qū)離子與氮?dú)馀鲎不罨纬伤槠x子，通過掃描第三級四極對碎片離子進(jìn)行質(zhì)譜分析。
核磁共振NMR實(shí)驗(yàn)在使用一個5mm或3mm三重共振(1H，13C，31P)探針，在VarianInova 400，500和600MHz光譜儀上進(jìn)行。凍干的糖樣品溶解于600μL(5mm)或者140μL(3mm)的99％D20中。該NMR實(shí)驗(yàn)在25℃下進(jìn)行，以抑制在4.78ppm處的HOD(氘化H2O)信號。丙酮在2.225ppm的1H光譜和31.07ppm的13C光譜的甲基共振作為內(nèi)部基準(zhǔn)。來自Varian，COSY，TOCSY，NOESY，13C-1H HSQC，13C-1H HSOC-TOCSY和13C-1H HMBC，與標(biāo)準(zhǔn)同核和異核的相關(guān)的2D脈沖序列被用于一般性歸屬。1D13P實(shí)驗(yàn)在一臺掃描寬度為40ppm，20000transient，采集時間1.6s的Varian Inova 200光譜儀中進(jìn)行。2D1H-31P HSQC實(shí)驗(yàn)在Varian Inova 400光譜儀上進(jìn)行6h。在10Hz通過進(jìn)行一系列1D-HSQC實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化耦合常數(shù)。F2(1H)維的掃描寬度為6.0ppm，F(xiàn)1(31P)維的掃描寬度為16.2ppm。松弛延遲期的水預(yù)飽和時間為1.5s，t2采集時間為0.21s，在每格180(HMQC)掃描的模式下，可獲得32格。采用與HSQC實(shí)驗(yàn)相同的參數(shù)，2D1H-31P HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)在Varian Inova 400光譜儀下進(jìn)行8h，其中TOCSY混合時間為150ms。
結(jié)果與分析多殺性巴氏桿菌菌株VP161的研究純化的LPS和8K沉淀材料的糖分析結(jié)果顯示，葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)的比例分別約為2∶1∶4。同時，也鑒定出到少量N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)。丁基-糖苷衍生的核心寡糖的GLC分析結(jié)果表明Glc和Gal均是D-型異構(gòu)體。
LPS-OH可由發(fā)酵罐培養(yǎng)細(xì)胞的LPS制備得到，然后應(yīng)用CE-MS對其進(jìn)行分析(實(shí)施例4表1)。在m/Z為992.0，999.0和1040.0處觀察到三價離子，對最小分子來說，這些三價離子對應(yīng)于2PCho，4Hep，3Hex，2Kdo和羥基脂質(zhì)A的組成。如下面所顯示的那樣，較大的糖型對應(yīng)于這樣的分子，該分子中磷酸分子替代第二個Kdo殘基，在核寡糖上有多于一個的己糖殘基；對于最大的糖型(m/z 1040.0)，則對應(yīng)于在Kdo-P處有附加的PEtn殘基。經(jīng)巧克力瓊脂平板培養(yǎng)之后，另外的糖型可通過m/z為1033.0和1081.0的三價離子顯示出來(實(shí)施例4表1)。MS/MS分析結(jié)果顯示，在糖型混合物中，發(fā)現(xiàn)了兩種不同的羥基脂質(zhì)A-OH類型，其是分子質(zhì)量為952amu的基礎(chǔ)類型，可根據(jù)MS/MS的m/z為475.5和951.5的二價和一價離子顯示出來；另一種含有附加PEtn殘基的類型，根據(jù)MS/MS的m/z為536.5的二價離子而被顯示出來(圖27C)。O-脫酰脂質(zhì)A的基礎(chǔ)類型(952amu)包括N-乙酰(3-OH C 14:0)葡糖胺殘基的二糖，每一個殘基都用一個磷酸分子取代。由于m/z為1033.0，1040.0和1081.0的三價離子的存在，較大的脂質(zhì)A類型只有在平板生長細(xì)胞中才能觀察得到。此外，根據(jù)糖型的MS/MS找到了存在一部分P-PEtn的證據(jù)，此與借助單價離子(m/z為219.5)的三價離子m/z1040.0和1081.0的相對應(yīng)(圖27c)。根據(jù)m/z為992.0，999.0和1033.0的三價離子的MS/MS沒有發(fā)現(xiàn)這個離子。進(jìn)一步的MS/MS試驗(yàn)顯示了核心OS分子的大小。對于m/z為992.0的三價離子，如m/z為1012.5的二價離子所表明的那樣，核心OS為2027amu(圖27a)。這對應(yīng)于2Kdo、2PCho、4Hep和3Hex的組成。對于m/z為999.0的三價離子，如m/z為1023.5的二價離子所表明的那樣，核心OS為2049amu(圖27b)。這對應(yīng)于Kdo，P，2PCho，4Hep，3Hex的組合。對于m/z為1040.0的三價離子，如m/z為1084.5的二價離子所表明的那樣，發(fā)現(xiàn)核心OS為2172amu，或者，如m/z為536.5的二價離子所表明的那樣，推測核心OS為2049amu，其對應(yīng)于帶有附加PEtn殘基的基礎(chǔ)脂質(zhì)A類型(圖27C)。因此，如那兩個用于識別m/z為475.5和536.5的兩種脂質(zhì)A類型的特征二價離子所證實(shí)的那樣，m/z為1040.0的離子對應(yīng)于異構(gòu)糖型，該異構(gòu)糖型在Kdo上具有部分P-PEtn或在脂質(zhì)A上具有附加PEtn。在MS/MS分析中也觀察到了從Kdo失去CO2的證據(jù)，通常情況下均如此。
對核心寡糖(來源于LPS和8K沉淀材料，產(chǎn)生相同的光譜)單獨(dú)進(jìn)行的MS分析，顯示出來源于m/z 903.0和984.0的二價正離子的不同碎片形式，這些二價正離子對應(yīng)于實(shí)施例4表1中在m/z為902.0和983.0的二價負(fù)離子，這與最接近Kdo的庚糖殘基(Hep I)上己糖殘基的存在與缺失相一致。m/z 903的二價離子(圖28a)的MS/MS顯示了與在Hep I上缺失Hex殘基相一致的碎片形式。m/z 984的二價離子(圖28b)的MS/MS顯示，與前者相比，較大的OS有附加己糖殘基，該己糖殘基位于Hep I殘基上，這一點(diǎn)可通過m/z682.0的二價離子的存在，并且根據(jù)m/z 903.0的二價離子的MS/MS的該信號的消失但m/z 697.0的二價離子的出現(xiàn)來確定(圖28a)。這些數(shù)據(jù)綜合起來表明VP161 LPS產(chǎn)生了一組新糖型，一些糖型包含一個帶有磷酸或者連接有焦磷酸乙醇胺部分的一種Kdo類型，以及包含兩個Kdo分子的另一種。在包含兩個Kdo分子的種類中，在核心OS最接近的庚糖殘基上不存在己糖殘基，這表明這種排布的生物合成是不可能的。PCho殘基的位置也可通過這些在正離子模式下的MS/MS試驗(yàn)來確定。m/z為424.5的二價離子發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于2PCho、2Hex和Hep的組成，該二價離子的后繼MS/MS/MS顯示出分別與PCho-Hex和PCho-Hex-Hep相對應(yīng)的m/z為328.5和520.5的一價離子，這表明兩個PCho-Hex部分連接于Hep殘基(圖28c)。
為了確定分子的連接方式，對O-脫酰LPS(LPS-OH)進(jìn)行了甲基化分析，結(jié)果顯示末端Glc，6-取代的Glc，末端LD-Hep，2-取代的LD-Hep和4，6-二取代的LD-Hep以摩爾比約為1∶1∶1∶1的比例存在，同時，也發(fā)現(xiàn)了極少量的末端Gal，3，4-二取代的LD-Hep和3，4，6-三取代的LD-Hep。在為除去磷酸殘基的HF處理過程之后(這些磷酸殘基會在水解過程中阻礙磷酸化糖的最優(yōu)釋放)，重復(fù)進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果顯示，除t-Gal殘基之外，相同的糖以相同的比例存在，該t-Gal殘基現(xiàn)在兩倍于其他成分的量，這表明PCho殘基取代了Gal糖基。
為了闡明OS的確切位置和連接方式，對那些能發(fā)出最具決定的和均一的光譜的OS部分進(jìn)行了NMR研究。以那些結(jié)構(gòu)相關(guān)的核心OS作為參考，所述核心OS來源于多殺性巴氏桿菌株P(guān)m70以及相關(guān)的菌種(溶血性曼氏桿菌和胸膜肺炎放線桿菌)，通過COSY和TOCSY實(shí)驗(yàn)獲得了OS樣品的1H共振信號的歸屬(實(shí)施例4表2)。從最近公開的多殺性巴氏桿菌株P(guān)m70來看，內(nèi)核殘基(Hep IV(f/f’))絲毫不差地連接于內(nèi)核上，實(shí)施例4表2所列出的歸屬也與之相一致。然而，在VP161核心OS的HepII(b)的3-位沒有PEtn殘基。對于核心OS樣品來說，有趣的是，在HepI(a)上GlcII殘基(e)的存在與缺失會對余下的內(nèi)核殘基導(dǎo)致兩組信號的辨別(圖29)。如上所述，在4.64(d)和4.51(d’)ppm的兩個Glc I信號可通過連接到HepI(a)的4-位和6-位的NOE識別出來，然而，當(dāng)Glc II缺失時，在GlcII(e)和在4.51ppm處GlcI殘基(d’)的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振之間的NOE連接的消失鑒定出該GlcI(d’)殘基的自旋系統(tǒng)。反之，當(dāng)GlcII存在時，GlcII(e)和在4.64ppm處GlcI殘基(d)的端基異構(gòu)體質(zhì)子共振的NOE間連接的存在，則表征出該GlcI(d)殘基的自旋系統(tǒng)(圖29)，先前就已經(jīng)在Pm70和相關(guān)物種溶血性曼氏桿菌和胸膜肺炎放線桿菌的LPS中觀察到了這種端基異構(gòu)體NOE間的連接。采用這種方式，基于GlcII(e)的存在與缺失，歸屬余下的內(nèi)核殘基就成為了可能。在Hep IV(f/f’)上的己糖殘基的位置與鑒定仍然還需要闡明。MS分析顯示，兩個己糖殘基都取代有PCho殘基，并且都取代到HepIV(f/f’)上。在HF處理之后進(jìn)行的甲基分析中所確定的t-Gal量的增加證實(shí)了這一點(diǎn)，這表明支撐PCho的己糖殘基都是Gal糖基。兩個β構(gòu)型的Gal殘基(Gal I和GalII)，依靠它們的耦合常數(shù)以及H-4的特定旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)，分別在4.70(g)和4.66(h)ppm處的核心OS樣品中被識別出來。Gal I(g)和Gal II(h)在Hep IV(f/f’)上的連接位置可以通過NOESY實(shí)驗(yàn)推測出來，該NOESY實(shí)驗(yàn)顯示GalI殘基(g)連接在Hep IV(f)的4-位，Gal II殘基連接到Hep IV(f/f’)的6-位(圖29)。這種推測可以通過13C-1H-HMBC實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)，該13C-1H-HMBC實(shí)驗(yàn)同時也證實(shí)在核心OS上的其他連接關(guān)系(圖30)。為了確定兩個PCho殘基的位置，進(jìn)行了31P-1H-HSQC和31P-1H-HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)，結(jié)果確認(rèn)事先歸屬的每一Gal殘基的3-位是每一PCho殘基的連接位置(圖31)。這可以通過13C-1H-HMQC實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)確認(rèn)每一在低磁場區(qū)(約78ppm)Gal殘基的C-3原子的化學(xué)位移與磷酸化相一致。
為了進(jìn)一步探索在分子的Kdo區(qū)域的新排布，對經(jīng)KOH處理之后的脫乙?；鶚悠愤M(jìn)行了測試。將含有一個和兩個Kdo殘基的完全脫乙?；腖PS部分分離出來，這是能夠做到的(圖32a和b)。圖32清楚無誤地顯現(xiàn)存在有包含糖型的一個和兩個Kdo殘基，與在圖32b中兩組橫軸和縱軸質(zhì)子信號(z3e，z3a、z’3e和z’3a)相比，對于圖32a中Kdo的H-3質(zhì)子只有一組橫軸和縱軸信號是可見的。對于包含樣品的一個Kdo殘基來說，完整的歸屬是可能的，但是，由于只能獲得極少量的這種糖基，導(dǎo)致很微弱的光譜信號，對于包含樣品的兩個Kdo殘基來說，僅僅部分歸屬是可能的。然而，這兩個光譜信號端基異構(gòu)體區(qū)域的基礎(chǔ)研究(rudimentary examination)明白無誤地顯示，在圖32a中，存在Glc II殘基(e)信號(這里，僅存在一個Kdo殘基)；在圖32b中，不存在Glc II殘基(e)的信號(這里，存在兩個Kdo殘基)。正如核心OS數(shù)據(jù)所顯示的那樣，Glc II殘基的存在或缺失會影響幾個其他端基異構(gòu)體質(zhì)子共振的化學(xué)位移，特別是，Hep I(a)，Hep II(b)和Glc I(d)信號的化學(xué)位移，這與對內(nèi)核分子構(gòu)象的影響相吻合。包含糖型的一個Kdo殘基的歸屬列于實(shí)施例4表2，這確認(rèn)了基于核心OS樣品的歸屬，并且可以將其擴(kuò)展到包括含有一個Kdo殘基的糖型的Kdo-脂質(zhì)A區(qū)域在內(nèi)的歸屬。
多殺性巴氏桿菌(Pm)VP161株寡糖的結(jié)構(gòu)分析顯示了一種與之前已確定的LPS核心寡糖結(jié)構(gòu)具有相似性和差異性的結(jié)構(gòu)，這些核心寡糖結(jié)構(gòu)是針對Pm的基因組菌株P(guān)m70和其他相關(guān)物種溶血性曼氏桿菌(Mh)，胸膜肺炎放線桿菌(Ap)的。在每種情況下，核心OS包含一個連接到Kdo殘基上的等同連接的三庚糖單元。有趣的是，在Pm70中，Hep II殘基的3-位多數(shù)情況都被PEtn殘基所取代，而在VP161菌株和其他相關(guān)物種App和Mh中，則沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)核PEtn殘基。排除以PEtn取代HepII這點(diǎn)變化，Pm菌株與相關(guān)的家畜物種Mh和App享有一個相對保守的內(nèi)核結(jié)構(gòu)。Pm內(nèi)核結(jié)構(gòu)的僅有的其他區(qū)別是，與在App和Mh中所遇到的D-甘油-D-甘露構(gòu)型的庚糖殘基相比，L-甘油-D-甘露構(gòu)型的庚糖殘基位于HepI的GlcI殘基的延伸，以及Pm內(nèi)核GlcII殘基的存在是可變的，很顯然這是由分子Kdo區(qū)域的變化性造成的Pm。在App和Mh的內(nèi)核LPS中化學(xué)定量地發(fā)現(xiàn)了該GlcII殘基。在VP161菌株中發(fā)現(xiàn)了在該保守內(nèi)核區(qū)域的不同延伸，由此，HepIV殘基被在4-位和6-位的PCho-Gal的部分雙取代。據(jù)我們所知，以前還沒有觀察到這種結(jié)構(gòu)排布。在同一LPS分子中碰到兩個PCho殘基，這是很少見的；非典型Hi攜帶菌株11和16是這種排布的僅有的文獻(xiàn)記載例子。PCho殘基的存在可能關(guān)系到Pm生物體的毒性，文獻(xiàn)已經(jīng)報道了PCho在呼吸道中的附著和集群作用。同時也發(fā)現(xiàn)，菌株VP161的突變體在小鼠模型和雞中都被減毒，該突變體呈現(xiàn)出缺失兩個PCho殘基的被截短的LPS結(jié)構(gòu)。其他作者的早期研究也發(fā)現(xiàn)了在Pm血清型D菌株的galE突變體毒性上的降低，可能由于LPS結(jié)構(gòu)的改變所造成的。然而，VP161 LPS結(jié)構(gòu)最吸引人的地方就是所發(fā)現(xiàn)的Kdo區(qū)域變異，在該Kdo區(qū)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)到了包含一個Kdo和兩個Kdo的糖型。此外，由Kdo區(qū)域排布變化所導(dǎo)致的對內(nèi)核結(jié)構(gòu)的影響，即HepI上Glc II的存在或者缺失，是令人感興趣的。負(fù)責(zé)GlcII向Hep I殘基轉(zhuǎn)移的α-1，6葡糖基轉(zhuǎn)移酶目前并不為人所知。需要指出的是，在Pm基因組菌株P(guān)m70中僅識別出Kdo轉(zhuǎn)移酶的唯一同源物，該P(yáng)m菌株的LPS同樣包含帶有一個和兩個Kdo的種類的群組。有趣的是，通過比較來源于Pm、App和Mh的Kdo轉(zhuǎn)移酶的基因序列，以探究任何序列上的差異以及探究其它的調(diào)控因子涉及所述的變異，上述序列上的差異可歸因于Pm轉(zhuǎn)移酶的雙官能特性PmPmMh。本研究確定了第二種Pm菌株的LPS結(jié)構(gòu)，這兩種菌株具有相似的內(nèi)核結(jié)構(gòu)以及可變的外核修飾，并且都在分子的Kdo區(qū)域展示出有趣的變異，這種變異的重要性需要進(jìn)一步研究。
實(shí)施例4，表1來自多殺性巴氏桿菌菌株VP161的O-脫酰LPS(LPS-OH)和核心OS的陰離子CE-MS數(shù)據(jù)和推測組成。平均質(zhì)量單位根據(jù)如下推測組成用于計算分子量Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；PEtn，123.05；Lipid A-OH，952.00。

實(shí)施例4，表2對于來自于多殺性巴氏桿菌VP161的核心OS和完全脫酰(KOH處理的)LPS的1H-和13C-NMR化學(xué)位移。aKOH處理的LPS數(shù)據(jù)是來自包含Kdo殘基的糖型；b核心OS樣品的數(shù)據(jù)；abKOH處理的LPS和OS樣品的數(shù)據(jù)，歸屬一致。由于Pcho殘基的水解和遷移引入的相當(dāng)大的異源性，因而不包括來自GaI-I和GaI-II的KOH處理的LPS的數(shù)據(jù)。





實(shí)施例5本實(shí)施例形成了Carbohydrate Research340，1253(2005)中一篇文獻(xiàn)的基礎(chǔ)。來自多殺性巴氏桿菌菌株X73的核心寡糖的結(jié)構(gòu)分析。
本實(shí)施例中，闡明了來自多殺性巴氏桿菌菌株X73的脂多糖的核心寡糖的結(jié)構(gòu)。該脂多糖經(jīng)過多種降解過程。通過單糖和甲基化分析，NMR譜和質(zhì)譜，可建立起純化后的寡糖的結(jié)構(gòu)。下述結(jié)構(gòu)顯示與最近從另一個多殺性巴氏桿菌菌株VP161中識別到的寡糖相似的結(jié)構(gòu)，但是它有另外的磷酸乙醇胺部分對末端半乳糖殘基的對稱性取代， 其中，根據(jù)NMR數(shù)據(jù)，所有的糖都被發(fā)現(xiàn)是吡喃糖環(huán)形式，Kdo是2-酮-3-脫氧-辛酮糖酸，L，D-α-Hep是L-甘油-D-甘露-庚糖，PEtn是磷酸乙醇胺和PCho是膽堿磷酸。
多殺性巴氏桿菌(Pm)是革蘭氏陰性菌，也是多個物種的病原體，會在可食用動物和人類中產(chǎn)生很嚴(yán)重的疾病。對基因組菌株P(guān)m70和一種毒性血清型A1菌株VP161中的脂多糖(LPS)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，顯示出一個帶有變化的外核OS結(jié)構(gòu)的保守內(nèi)核寡糖(OS)結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)研究在另外的一種毒性血清型A菌株X73上進(jìn)行，純化的LPS產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析，顯示出一個與菌株VP161相似的OS結(jié)構(gòu)，但在外核OS上帶有額外的對稱磷酸化型式。菌株X73中的純化的LPS和8k沉淀材料的糖分析，顯示出與菌株VP161有相似的組成，該菌株中含有的糖，即葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和L-甘油-D-甘露庚糖(LD-Hep)各自近似比例為2∶1∶4。O-脫酰LPS(LPS-OH)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)胞中制得，并經(jīng)CE-MS分析(實(shí)施例5表1)。觀察到與在菌株VP161中觀察到的相似的質(zhì)譜圖樣，但其主要成分為m/z1081.0的三價離子，與來自VP161 LPS-OH的多數(shù)種類(m/z 999.0)相比，它對應(yīng)于另外兩個PEtn殘基。MS/MS分析顯示出所有脂質(zhì)A分子是基礎(chǔ)種類，包括一個N-?；?3-OH C 14:0)葡萄糖胺殘基的二糖，每一個殘基被磷酸分子所取代，通過m/z 475.5和951.5的二價和一價離子確定該磷酸分子的分子量為952amu。所以該MS/MS分析表明了菌株X73的額外PEtn殘基位于LPS分子的核心OS區(qū)域中，核心OS分子的推測的質(zhì)譜表示在實(shí)施例5的表1。
對核心寡糖單獨(dú)進(jìn)行MS分析，顯示了一系列的離子與從LPS-OH數(shù)據(jù)推測得到的組成相一致，在與菌株VP161比較時顯示存在額外的PEtn殘基。采用陽離子模式從MS/MS實(shí)驗(yàn)可確定PEtn殘基的位置。與最大糖型相應(yīng)的二價離子m/z 1108的破碎產(chǎn)生的離子，包括m/z 183.5+(Pcho)，450.5+(PCho-Hex-PEtn)，547.52+(2Pcho，2PEtn，2Hex，Hep)和916.52+(M-Kdo-Hex)。在m/z547.52+處的二價離子在與菌株VP161中m/z 4242+二價離子作比較時有特別之處，因?yàn)樗@示出一個具有較高質(zhì)量246amu的糖型，與兩個PEtn殘基的存在一致。對m/z 916.52+二價離子進(jìn)行MS/MS/MS分析，顯示產(chǎn)物離子光譜示于圖33a。圖33a中的破碎模式PEtn殘基定位于HepIV殘基上的末端HEX-Pcho部分，后續(xù)的破碎m/z 450.5離子的MS/MS/MS實(shí)驗(yàn)中(圖33b)，證實(shí)該離子與最初推斷的PCho-Hex-PEtn部分相一致。
為了證實(shí)和擴(kuò)展這些推測，對分級的核心OS樣品進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)，該樣品包含有兩種PEtn殘基(由未顯示的MS數(shù)據(jù)確定)。除了兩個末端半乳糖殘基外，所有歸屬與在菌株VP161的核心OS獲得的相同。觀察到VP161樣品的半乳糖殘基的H-1和H-2共振的化學(xué)位移，但是H-3和H-4共振向低場區(qū)輕微漂移，分別從4.17和4.12漂移到4.21和4.17ppm。之前觀察到從半乳糖殘基的NOE間連接，盡管現(xiàn)在在3.94ppm處觀察到至H-5殘基的NOE內(nèi)連接(與菌株VP161的3.80和3.76ppm相反)(實(shí)施例5表2)。為了證實(shí)這兩個PEtn殘基的位置，可通過一個31P-1H-HSQC實(shí)驗(yàn)來完成，證實(shí)在4.07ppm處有一共振作為每一PEtn殘基的附著點(diǎn)，后續(xù)的31P-1H-HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)證實(shí)在3.94ppm處半乳糖殘基的H-5共振(圖34)。4.07ppm歸屬半乳糖殘基H-6共振是通過13C-1H-HMQC實(shí)驗(yàn)被確認(rèn)，這表明作為a-CH2部分的一個特征正峰，在低區(qū)值(～65ppm)的每個Gal殘基的C-6原子的低磁場化學(xué)位移與磷酸化一致。最后，31P-1H-HSQC-TOCSY實(shí)驗(yàn)證實(shí)在C-6和H-5共振(也可以說是H-5和C-6共振)的交叉峰，證實(shí)兩個半乳糖殘基的6位作為在菌株X73核心OS發(fā)現(xiàn)的額外兩個PEtn部分的附著點(diǎn)(圖35)。
所以這項(xiàng)研究證實(shí)了來自又一個血清型A菌株的LPS中的相似核心OS結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步研究將擴(kuò)展LPS結(jié)構(gòu)分析到另外的血清型，來檢驗(yàn)這異常的終端結(jié)構(gòu)是否存在與其它血清型中。在六碳糖的6位上PEtn的證實(shí)多少不尋常。PEtn通常在腦膜炎雙球菌和流感桿菌的庚糖殘基6位上發(fā)現(xiàn)。我們實(shí)驗(yàn)室最近的研究已經(jīng)證實(shí)PEtn在許多流感桿菌菌株的終端GalNAc殘基的6位處，新近的報道也發(fā)現(xiàn)在檸檬酸細(xì)菌屬樣品的3-連接位的半乳糖分子的6位上的PEtn殘基。在這里觀察到帶有相似化學(xué)位移的PCM1443(血清型039)。
1、實(shí)驗(yàn)1.1細(xì)菌的培養(yǎng)，LPS的分離和分級多殺性巴氏桿菌菌株X73(NRCC#6235)培養(yǎng)并分離。簡言之，將多殺性巴氏桿菌細(xì)胞(～210g濕重)凍干，得到～65g。凍干細(xì)胞用有機(jī)溶劑(1×乙醇，2×丙酮，2×輕石油醚)清洗以除去類脂和其它親脂成分，增強(qiáng)LPS提取效率。洗過的細(xì)胞(從～42g中取10g)通過熱酚/水方法提取，并將水相合并，相對流水透析48小時。滲余物凍干得到～0.57g，制成約2％的水溶液，在37℃用DNA酶和RNA酶處理4小時，接著用蛋白酶K在37℃處理4小時。小肽經(jīng)透析除掉。凍干后，滲余物(～0.42g)制成約2％的水溶液，在8000g離心15分鐘(得到一種約～265mg的“8K沉淀”)，接著對上清進(jìn)一步在100,000g離心5h。包含有純化過的LPS的沉淀重新溶解和凍干(得到～3mg)。分離和分級出LPS-OH和核心OS。簡言之，8K沉淀原料(～15mg)和LPS(～3mg)在37℃攪拌下用無水肼處理1h，制備LPS-OH，從8K制備物中得到～10mg，從LPS中為～1mg。用1％乙酸(10mg/ml，100℃，1.5h)處理8K沉淀原料(～115mg)，后經(jīng)離心(5,000x g)去除不溶類脂A，分離出核心OS。隨后將凍干的上清液以各凍干組分用Bio-Gel P-2柱進(jìn)一步純化，得到～40mg。
1.2分析方法糖以其糖醇乙酸酯衍生物的形式通過GLC-MS測定。甲基化分析通過NaOH/DMSO/甲基碘方法進(jìn)行，并用GLC-MS來分析。
1.3質(zhì)譜和NMR光譜學(xué)所有質(zhì)譜和NMR實(shí)驗(yàn)按上面的描述完成。
實(shí)施例5，表1來自多殺性巴氏桿菌菌株X73的O-脫酰LPS(LPS-OH)和核心OS的陰離子CE-MS數(shù)據(jù)和推測的組成。平均質(zhì)量單位根據(jù)如下推測組成用于計算分子量Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；PEtn，123.05；Pcho，165.05；脂質(zhì)A-OH，952.00。相對強(qiáng)度表示為相對于LPS-OH分子光譜中最大的三價離子的強(qiáng)度。


實(shí)施例5，表2來自多殺性巴氏桿菌菌株X73的核心OS的末端區(qū)域的1H-和13C-NMR化學(xué)位移所有其他殘基具有與菌株VP161相同的化學(xué)位移。


實(shí)施例6本實(shí)施例形成了Infect.Immun.723436(2004)中一篇文獻(xiàn)的基礎(chǔ)。一種多殺性巴氏桿菌的庚糖轉(zhuǎn)移酶突變株產(chǎn)生一個截短的脂多糖(LPS)結(jié)構(gòu)，并且其毒性減弱。
對多殺性巴氏桿菌VP161的野生型LPS分析表明一個“粗糙型”LPS，與從流感桿菌、杜克雷嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌以及N.Gonorrhoeae等革蘭氏陰性粘膜性病原體分離出的LPS或脂寡糖相似，只有一個短的非重復(fù)多糖單元與脂質(zhì)A相連。多殺性巴氏桿菌LPS的內(nèi)核結(jié)構(gòu)與流感桿菌、溶血性曼氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌相似，并具有一個經(jīng)由一個KDO殘基與脂質(zhì)A相連的三庚糖單元(圖30)。在AL251突變株中，waaQpm的失活導(dǎo)致LPS表達(dá)為在內(nèi)核區(qū)缺乏第三庚糖分子(Hep III)的高度截短的LPS。突變株中含量最高的LPS糖型同樣缺少第一個庚糖遠(yuǎn)側(cè)的所有糖，表明waaQPM的失活阻止了糖的進(jìn)一步添加。因此很可能由于第三庚糖的缺失導(dǎo)致的LPS中間體的構(gòu)像改變大大阻礙了后續(xù)轉(zhuǎn)移酶的活性。
材料和方法菌株，質(zhì)粒，培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。本研究中使用的菌株與質(zhì)粒見實(shí)施例6，表1。大腸桿菌(Escherichia coli)采用常規(guī)Luria-Bertani培養(yǎng)基培養(yǎng)。多殺性巴氏桿菌菌株采用腦心浸液(BHI)或營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(加入3％酵母抽提物)(Oxoid，Basingstoke，United Kingdom)的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。添加1.5％瓊脂制備固體培養(yǎng)基。需要時，向培養(yǎng)基中加入2.5μg/ml濃度的四環(huán)素。在結(jié)構(gòu)研究中，多殺性巴氏桿菌菌株VP161和AL251培養(yǎng)于28升發(fā)酵罐中24L的BHI培養(yǎng)基中，37℃下，20％的DO飽和度下培養(yǎng)18h。添加苯酚到2％以殺滅細(xì)胞，維持3h后加入1克透明質(zhì)酸酶(Roche Chemicals)，攪拌1h，然后采用Sharples連續(xù)流離心機(jī)收獲細(xì)胞。
轉(zhuǎn)座子穩(wěn)定性研究。多殺性巴氏桿菌菌株AL251于培養(yǎng)10ml NB中，37℃震蕩。在培養(yǎng)大約10，34，58代后，取出培養(yǎng)樣品，適當(dāng)稀釋，接種于NB瓊脂上。溫育過夜后，100個克隆轉(zhuǎn)接于含四環(huán)素的NB上，37℃溫育過夜。轉(zhuǎn)座子丟失由四環(huán)素敏感克隆的百分比來表示。
SDS-PAGE與銀染。LPS的分析采用Bio-Rad小型蛋白凝膠裝置，按照在Laemmli，Nature227，680(1970)文中描述的SDS-PAGE進(jìn)行。通過銀染后可見LPS。
DNA操作。限制性消化，連接和聚合酶反應(yīng)按照廠商N(yùn)EB(Beverley，MA)或Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，Germany)提供的酶操作者手冊進(jìn)行。質(zhì)粒DNA采用堿解法制備，使用Qiagen柱(QIAGEN GmbH，Germany)或PEG沉淀法(Ausubel，1995)進(jìn)行純化?；蚪MDNA采用CTAB方法制備。DNA的PCR擴(kuò)增使用Taq DNA聚合酶或Expand High Fidelity PCR系統(tǒng)(Roche Diagnostics)，使用Qiagen PCR純化試劑盒純化。研究中使用的寡核苷酸列于實(shí)施例6，表1。DNA序列采用373 A型DNA測序儀(Applied Biosystems)測定，使用Sequencher Version 3.1.1(GenCodes，Ann Arbor，MI)軟件分析。
waaQpM的反向互補(bǔ)。從多殺性巴氏桿菌VP161的基因組DNA中使用寡核苷酸片段BAP2146和BAP2147(實(shí)施例6，表1)擴(kuò)增完整的waaQpM基因。擴(kuò)增后的1.1kb的DNA片段連接Sail和BamHI-消化的質(zhì)粒載體pAL99(實(shí)施例6，表1)，所以轉(zhuǎn)錄可被多殺性巴氏桿菌tpiA啟動子驅(qū)動，篩選出存在正確質(zhì)粒的E.Coli轉(zhuǎn)化株，同時，指定的pAL170質(zhì)粒被用于轉(zhuǎn)化多殺性巴氏桿菌AL251菌株，產(chǎn)生菌株AL298。pAL99質(zhì)粒載體被單獨(dú)轉(zhuǎn)化AL251產(chǎn)生菌株AL438用作對照(實(shí)施例6，表1)。
競爭性生長分析。競爭性生長分析按照Harper(2003)描述的方法進(jìn)行并定量多殺性巴氏桿菌LPS突變株AL251和互補(bǔ)突變株AL298的相對生長速率。從輸出培養(yǎng)(output culture)獲得的(在體外或在體內(nèi))四環(huán)素抗性克隆百分比除以從輸入培養(yǎng)(input culture)獲得的四環(huán)素克隆百分比確定競爭因子(CI)。衡量體內(nèi)生長與體外生長差異的相對競爭因子(rCI)，由體內(nèi)CI除以體外CI確定。通過使用單邊z-test(one sidedz-test)(p＜0.05)統(tǒng)計分析，如果rCI值顯著小于1.0，則突變株被確定為減毒突變株。
毒性試驗(yàn)。一組十只12周齡的購得的Leghorn-cross雞使用多殺性巴氏桿菌VP161或AL251，以兩個不同劑量胸肌注射100μl進(jìn)行感染。在感染AL251后的不同時間點(diǎn)取血樣，并依照動物倫理道德要求對被認(rèn)為不能存活的雞實(shí)施安樂死。血樣用含肝素的BHI稀釋兩倍并涂布BHI平板。從血中分離的多殺性巴氏桿菌克隆涂布于NB瓊脂平板和含四環(huán)素的NB瓊脂平板。
血清敏感性分析。多殺性巴氏桿菌和E.coli對新鮮雞血清的敏感性采用Chung et al于Infect.Immun.69，2487(2001)中所述的方法測定。.
LPS的純化。多殺性巴氏桿菌細(xì)胞(210g，VP161；254g of AL251)凍干，得56g的VP161和52g的AL251。用有機(jī)溶劑洗滌凍干菌體細(xì)胞除去脂類或其他親脂類成分以提高LPS的抽提效率。洗滌后的細(xì)胞(42g，VP161；50g，AL251)用熱酚/水法抽提并相對流水透析48h。滲余物凍干，配成2％水溶液后，用DNA酶和RNA酶在37℃條件下處理4小時后，加入蛋白酶K并在37℃下處理4小時。透析除去小肽。凍干后，滲余物配成2％水溶液，8000g離心15分鐘后，取上清，100,00g離心5小時。含純化LPS的沉淀，重溶并凍干。用1％乙酸(10mg/ml，100℃，1.5h)處理純化的LPS，然后5000g離心除去不溶的脂質(zhì)A分離得到核心寡糖(OS)。
分析方法。糖通過它們的糖醇乙酸酯衍生物的GLC-MS被確定。LPS用4M三氟乙酸在100℃水解4小時，用NaBD4水溶液還原過夜，然后用乙酸酐在殘余的乙酸鈉催化下100℃乙?；?小時。GLC-MS采用30 M DB-17毛細(xì)管柱(以3.5℃/min，180℃到260℃)，質(zhì)譜使用Varian Saturn II質(zhì)譜儀電子撞擊模式。甲基化分析采用NaOH/DMSO/甲基碘方法，并用上述的GLC-MS分析。
MS分析。毛細(xì)管電泳-電噴射離子MS(CE-ESI-MS)采用晶體Model 310毛細(xì)管電泳(CE)設(shè)備(AYI Unicam)進(jìn)行，該設(shè)備經(jīng)由一個微噴霧接口偶聯(lián)到API 3000質(zhì)譜儀(Perkin-Ehner/Sciex)。保護(hù)液(異丙醇-甲醇，2∶1)，以1L/min流速加入到一低死體積三通管(250μm i.d.，Chromatographic Specialties)。所有水溶液用前經(jīng)0.45-μm(Millipore)過濾器過濾。
核磁共振。使用3mm三重共振(1H，13C，31P)探針，在Varian Inova500MHz光譜儀上獲得NMR譜。親脂性的糖樣品溶解在140μL(3mm)99％D2O中。實(shí)驗(yàn)在25℃下進(jìn)行，以抑制在4.78ppm處的HOD(氘化H2O)信號。丙酮的甲基共振作為在2.225ppm的1H光譜和31.07ppm的13C光譜的內(nèi)部或外部基準(zhǔn)。來自Varian、COSY、TOCSY、NOESY、13C-1H HSQC、13C-1HHSQC-TOCSY和13C-1H HMBC的、與標(biāo)準(zhǔn)的同核和異核相關(guān)的2D脈沖序列，用于一般性歸屬。
結(jié)果減毒的多殺性巴氏桿菌STM突變株產(chǎn)生截短的LPS，該LPS通過與功能性waaQpM基因互補(bǔ)可恢復(fù)產(chǎn)生全長的LPS。標(biāo)記標(biāo)簽的突變株(STM)被用于鑒定減毒突變株，以便用于在小鼠和雞中培養(yǎng)。在前述的分析中一個突變株被鑒定(命名為AL251)，它在雞和小鼠中都表現(xiàn)為弱毒性。突變株的序列分析表明單個轉(zhuǎn)座子插入在waaQpM基因中，該waaQpM基因被預(yù)言負(fù)責(zé)編碼所推測的庚糖基轉(zhuǎn)移酶和一種負(fù)責(zé)添加庚糖到LPS上的糖基轉(zhuǎn)移酶。
我們使用聚丙烯酰胺凝膠電泳然后銀染的方法比較了來自菌株AL251、AL251的野生型親本VP161以及互補(bǔ)突變株AL298的LPS結(jié)構(gòu)。來自AL251的LPS在凝膠中相對于野生型LPS遷移更遠(yuǎn)，這表明由突變株產(chǎn)生的LPS被顯著縮短(圖36a)。而且，來自互補(bǔ)突變株AL298的LPS，與野生型LPS遷移速度相同表明突變株AL251與一個完整的waaQPM基因互補(bǔ)能恢復(fù)野生型LPS的合成(圖36a)。
與waaQpM互補(bǔ)的AL251菌株的體內(nèi)生長恢復(fù)到野生型水平。由于waaQpM基因的互補(bǔ)，AL251菌株恢復(fù)產(chǎn)生野生型LPS，因此我們想確定是否互補(bǔ)失活的waaQPM也能在體內(nèi)恢復(fù)AL251突變株的到野生型生長水平。關(guān)于互補(bǔ)突變株AL298的前期研究表明，一旦去除對該互補(bǔ)質(zhì)粒pAL170的抗生素選擇，該質(zhì)粒就會顯著減少(6小時后剩余44％)。因此，選擇小鼠代替雞進(jìn)行競爭性生長分析，如之前研究所闡述的，從所需感染時間到收獲菌體只要6小時而雞感染則要超過12小時。三只小鼠被注射等量的VP161與互補(bǔ)株AL298的混合物。作為對照，兩只小鼠被注射等量的野生菌株VP161與對照菌株AL438(AL251帶有載體質(zhì)粒pAL99)的混合物?；パa(bǔ)突變株AL298的平均rCI為1.0，能與野生型菌株VP161平等競爭，而對照菌株AL438的平均rCI值為0.57(p＝0.03)，與前面報道的AL251在小鼠中的rCI值相似。這些結(jié)果表明waaQpm不僅為產(chǎn)生全長的LPS而且為感染過程中的正常生長所必需。
多殺性巴氏桿菌的waaQpm突變株不會在雞中致病。菌株AL251在雞中顯示了一個極度減緩的生長速率。希望確定它在這些宿主中是否仍然能夠致病。雞被兩種不同劑量的VP161或AL251測試(實(shí)施例6，表2)。所有注射了野生型VP161的雞都在20小時內(nèi)死亡。與此相反，大部分用AL251測試的雞在開始20小時內(nèi)保持健康，但在4天內(nèi)，不論何種劑量接種了AL251的雞，都病死于禽霍亂感染。從疾病的后期或末期的AL251-感染雞的血液中分離出多殺性巴氏桿菌，發(fā)現(xiàn)所有分離得到的多殺性巴氏桿菌克隆都具有四環(huán)素敏感性，這表明轉(zhuǎn)座子已經(jīng)不再在細(xì)菌中存在?；謴?fù)克隆的waaQPM基因的序列分析表明在所有克隆中轉(zhuǎn)座子已被敲除，因此重建了一個功能性waaQPM基因。有趣的是，除了一個分離體外，序列分析也表明在轉(zhuǎn)座子敲除點(diǎn)的核苷酸替代導(dǎo)致在waaQPM中的兩個氨基酸改變(aminoacids 88，89；Ser to Leu，and Asp to Cys)。這些氨基酸改變不影響waaQPM的功能，因?yàn)橛肁L251測試的雞得到的多殺性巴氏桿菌的分離株中LPS的結(jié)構(gòu)都與野生型菌株相同(圖36b)。綜上所述，這些結(jié)論表明接種AL251的雞中觀察到禽霍亂的晚期攻擊完全是由于AL251的野生型回復(fù)突變，因而具有一個失活的waaQPM基因的菌株不能致病。
waaQpM突變株對雞的毒性減弱不是由于增加了對雞血清的敏感性。為了確定野生型多殺性巴氏桿菌菌株VP161和LPS突變株AL251對補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷的相對敏感性，用每個菌株和對照菌株E.coli DH5α的對數(shù)生長期細(xì)胞，在常規(guī)或熱處理的雞血清中培育3小時。野生型多殺性巴氏桿菌菌株VP161，在加熱的或是未加熱的血清中，以相同速率生長，表明它是完全血清抗性的，這與以前報導(dǎo)的其它多殺性巴氏桿菌血清型A菌株相似。雞血清的細(xì)菌活性用E.coli對照菌株證實(shí)，在熱處理的血清中增殖19倍而在未處理的血清中細(xì)菌活性則減少大約9倍。有趣的是，對于AL251突變株，在熱處理的血清與普通血清中的生長并無差異，都大約有160倍的增殖。這些結(jié)果表明在雞的LPS突變株中觀察到的毒性減弱不是由于對補(bǔ)體增加了的敏感性所致。
來自多殺性巴氏桿菌VP161和AL251的LPS的結(jié)構(gòu)分析。來自親株VP161的糖結(jié)構(gòu)分析表明有葡萄糖(Glc)，半乳糖(Gal)，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)，L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)，其各自的比例為2∶1∶1∶3。相反，來自突變株VP251的LPS分析表明僅有葡萄糖(Glc)，L-甘油-D-甘露糖-庚糖(LD-Hep)，其各自的比例為1∶3，以及痕量的半乳糖(Gal)，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。GlcNAc的存在可能取決于除了每個LPS分子的脂質(zhì)A區(qū)域中預(yù)期的兩個殘基外，已知的本血清組透明質(zhì)酸莢膜的殘基數(shù)量。來自親本VP161 LPS的核心OS樣品的CE-ES-MS分析顯示了一個簡單質(zhì)譜(圖37a)，其與分子量1805與1967 Da的糖型相符，其中較小的糖型與2PCho，3Hex，4Hep，Kdo的組成一致，Kdo是獨(dú)有的LPS糖2-酮-3-脫氧-辛酮糖酸，PCho是磷酸酯部分磷酸膽堿。其中較大的糖型含有一個額外的庚糖種類(實(shí)施例6，表3，圖37a)。與突變株AL251LPS的SDS-PAGE分析一致，其核心OS樣品的CE-ES-MS分析顯示出一個高度截短的分子量605Da的分子的簡單質(zhì)譜(實(shí)施例6，表3，圖37b)。這一分子量符合2Hep，1Kdo的組成。觀察到一個的更大些的糖型，該糖型符合一個附加的庚糖殘基(767 Da)。觀察到痕量的一個多延伸的分子量1448Da(PCho，3Hep，3Hex，Kdo)的糖型，但在被觀察到的糖型中沒有含有全部親本的4庚糖殘基互補(bǔ)物(實(shí)施例6，表3)。為了完整表征突變株在核心OS截短的特性，進(jìn)行了親本與突變株核心寡糖的1H-NMR實(shí)驗(yàn)。由于質(zhì)譜數(shù)據(jù)表明在突變株中的OS中丟失一個庚糖殘基，并且氨基酸同源性對照表明WaaQpm是一個庚糖基轉(zhuǎn)移酶，高度關(guān)注分子中庚糖殘基的共振。1H-NMR光譜表明最鄰近Kdo殘基的Hep殘基的變異性(常在核心寡聚糖中觀察到)是由于在獲得核心OS的酸水解條件下Kdo殘基重排引起(圖38)。對來自于親本菌株的核心OS，在～5.7ppm識別到HepII的端基異構(gòu)體質(zhì)子的化學(xué)位移，與2-位取代這一殘基符合(圖38a)。然而，在AL251突變株的OS1H-NMR光譜(圖38b)中，Hep II的端基異構(gòu)體共振的化學(xué)位移向高場偏移為大約0.5ppm，與殘基不再在2-位被取代相一致。如同以前在H.somnus菌株中觀察到的，HepII殘基成為末端部分，并且H-4共振的化學(xué)位移與這種排布相符。通過2D NOESY實(shí)驗(yàn)獲得突變株結(jié)構(gòu)特征的確定性證據(jù)(圖39)。觀察到VP161核心OS在HepIII和HepII端基異構(gòu)體質(zhì)子間的特征性NOE，表明在HepIII和HepII殘基之間是α-1-2連接的(圖39)。AL251突變株的核心OS的NOESY光譜證實(shí)HepII殘基缺少2-位取代，如上所述的特征性NOE缺失，證實(shí)在突變株的OS中不存在HepIII殘基。關(guān)于親本OS的HepII和HepIII殘基的化學(xué)位移和NOE光譜數(shù)據(jù)以及關(guān)于突變株OS的HepII殘基的化學(xué)位移和NOE光譜數(shù)據(jù)總結(jié)于實(shí)施例6，表4。結(jié)構(gòu)技術(shù)表明突變基因waaQPM在LPS結(jié)構(gòu)上的效應(yīng)是阻止HepIII添加到Hep II(圖40)，這種作用與所編碼的蛋白和已知的庚糖基轉(zhuǎn)移酶的高度相似性一致。
討論使用STM首次在小鼠和雞中識別到的多殺性巴氏桿菌LPS突變株AL251，顯示有一個轉(zhuǎn)座子插入在預(yù)測的庚糖轉(zhuǎn)移酶基因waaQPM中，并且在雞和小鼠中致病毒性顯著下降。野生型VP161和AL251的細(xì)胞溶解物的銀染聚丙烯酰胺凝膠顯示來自突變株的LPS顯著縮短(圖36A)，這與waaQPM編碼一個負(fù)責(zé)將一個庚糖分子添加在LPS結(jié)構(gòu)的核心區(qū)的庚糖基轉(zhuǎn)移酶相符。
對多殺性巴氏桿菌的Pm70基因組的分析表明，基因waaQPM可能獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，因此產(chǎn)生縮短的LPS結(jié)構(gòu)直接由于waaQPM基因的失活而不是下游基因的偶極作用減緩多殺性巴氏桿菌在雞和小鼠的體內(nèi)生長。這一點(diǎn)通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)導(dǎo)入一個反向野生型waaQPM基因不僅恢復(fù)LPS的結(jié)構(gòu)(圖36A)，而且在小鼠中的生長恢復(fù)到野生型水平。
使用LPS突變株AL251在雞中的毒性試驗(yàn)導(dǎo)致的禽霍亂癥狀(實(shí)施例6，表2)的推遲出現(xiàn)以及具有疾病癥狀的雞中分離的多殺性巴氏桿菌對四環(huán)素敏感，說明不再帶有轉(zhuǎn)座子。對從感染的雞中分離的多殺性巴氏桿菌DNA的核酸序列數(shù)據(jù)證實(shí)waaQPM基因是完整的，并在多數(shù)情況下在原來插入轉(zhuǎn)座子處存在堿基改變，導(dǎo)致兩個氨基酸改變。從AL251感染的雞中獲得的分離株的LPS顯示其為野生型的LPS，證實(shí)盡管氨基酸變化，但waaQPM基因是有功能的(圖36B)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明在接種AL251的雞中觀察到的感染僅是因?yàn)榛貜?fù)突變株丟失轉(zhuǎn)座子插入所致。野生型多殺性巴氏桿菌菌株VP161是一種極高毒性微生物，在雞中少于50個細(xì)菌就可導(dǎo)致禽霍亂。我們的研究檢測到從AL251細(xì)胞中轉(zhuǎn)座子的消除速率，在最初的十代后為1％，(體外過夜生長)上升到58代后的4％(未顯示數(shù)據(jù))，這一消除速率導(dǎo)致在雞中野生型回復(fù)突變體的傳代與選擇，是以一個在試驗(yàn)過程中足以產(chǎn)生致死禽霍亂感染的速率。因此，一個穩(wěn)定失活的waaQPM將導(dǎo)致多殺性巴氏桿菌菌株不能產(chǎn)生禽霍亂。然而，構(gòu)建限定的多殺性巴氏桿菌的突變株的可靠方法還未建立。
多殺性巴氏桿菌菌株野生型LPS分析顯示一個“粗糙型”LPS，與從革蘭氏陰性粘膜病原體，如流感桿菌、H.ducreyi、腦膜炎奈瑟菌以及N.gonorrhoeae等分離出的LPS或脂寡糖(LOS)相似，只有一個短的非重復(fù)多糖單元與核心相連。多殺性巴氏桿菌LPS的內(nèi)核結(jié)構(gòu)與在流感桿菌、溶血性曼氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌描述的LPS結(jié)構(gòu)相似，帶有一個三庚糖單元，該單元經(jīng)由一個Kdo殘基與脂A相連(圖39)。在AL251突變株中，waaQPM的失活導(dǎo)致表達(dá)出在內(nèi)核區(qū)域缺乏第三庚糖分子(Hep III)的高度截短的LPS。突變株中含量最高的LPS糖型同樣缺少連接在第一個庚糖的所有糖殘基，表明waaQPM的失活阻止了糖的進(jìn)一步添加(實(shí)施例6，表3)。因此很可能由于在大部分第三庚糖的缺失導(dǎo)致的LPS中間體的構(gòu)像改變大大阻礙了后續(xù)轉(zhuǎn)移酶的活性。
全長LPS分子的缺失明顯影響突變株AL251在小鼠中的生長能力和在雞中的致病能力。這一毒性減弱的具體原因還不清楚。然而，在野生型多殺性巴氏桿菌VP161 LPS中，識別到兩個PCho基團(tuán)而突變株AL251 LPS中僅在一種非常稀少的糖型中含有一個PCho基團(tuán)(實(shí)施例6，表3)。在VP161 LPS中存在一個以上的PCho殘基是不同尋常的；具有PCho-修飾的LPS的細(xì)菌通常只有一個相連的殘基，盡管連接到LPS結(jié)構(gòu)上的位置多種多樣。僅有一種不同細(xì)菌，一種非典型流感嗜血桿菌菌株，已知有兩個PCho殘基連接到LPS。有趣的是，在血清型A火雞分離出PM70的LPS上沒有PCho基團(tuán)，該菌株對雞類也是無毒的。
PCho基團(tuán)經(jīng)常連接到粘膜病原體表面上的多種細(xì)菌結(jié)構(gòu)中，所述病原體如流感嗜血桿菌、伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、肺炎鏈球菌(Strep tococcus pneumoniae)和奈瑟菌屬種(Neisseria spp.)，通過與血小板活化受體(PAF)連接，在黏附和入侵上皮和內(nèi)皮宿主細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。具有LPS的PCho陽性糖型的非典型性流感嗜血桿菌經(jīng)由一系列信號活動可以黏附并侵入人支氣管上皮細(xì)胞。然而，在流感嗜血桿菌和奈瑟菌屬種中，盡管在LPS上的PCho表達(dá)在黏附和侵入人的上皮細(xì)胞中是必要的，它的存在減少在某些宿主生態(tài)中的存活，因?yàn)楸磉_(dá)Pcho的菌株具有更強(qiáng)的血清敏感性，通過Pcho連接到C-活性蛋白和補(bǔ)體系統(tǒng)的后續(xù)激活來調(diào)解。有趣的是，現(xiàn)有研究表明LPS突變株AL251仍對雞血清補(bǔ)體的細(xì)菌活性有高度抗性，說明一個完整的野生型的LPS結(jié)構(gòu)并非細(xì)菌具有全血清抗性所必需。毫不奇怪，因?yàn)槎鄽⑿园褪蠗U菌血清型A菌株的莢膜賦予血清抗性。
總之，一個多殺性巴氏桿菌的waaQPM突變株表達(dá)一個極度截短的LPS。野生型多殺性巴氏桿菌的LPS分子和waaQPM突變分子的內(nèi)核結(jié)構(gòu)被確定，這表明一個有功能的waaQPM基因?yàn)樘砑拥谌菤埢絃PS的內(nèi)核所必需。因此，waaQPM被鑒定為一個庚糖基轉(zhuǎn)移酶III并通過毒性試驗(yàn)表明其活性在多殺性巴氏桿菌對自然宿主雞的細(xì)菌毒性中是必須的。waaQPM的失活導(dǎo)致在內(nèi)核中第三庚糖基的完全缺失，即產(chǎn)生完全野生形糖型。從突變株LPS中識別到的多數(shù)糖型缺乏PCho殘基，在其他革蘭氏陰性粘膜病原體的LPS中，該殘基在細(xì)菌毒性中起關(guān)鍵作用。
實(shí)施例6，表1.用于本研究的細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和寡核苷酸(oligo)。

實(shí)施例6，表2.VP161和AL251在幾組雞(每組10只)中的毒性。
CFU＝菌落形成單位，h＝小時，N.D＝未檢測到。

實(shí)施例6，表3.從多殺性巴氏桿菌菌株VP161(親本)和AL251(突變株)的核心OS的陰離子CE-MS數(shù)據(jù)和的推測組成。根據(jù)如下的推測組成，平均質(zhì)量單位被用于分子量計算Hex，162.15；Hep，192.17；Kdo，220.18；Pcho，165.05。相對強(qiáng)度表示為二價或-價離子的相對高度。

aPCho，磷酸膽堿；Hep，庚糖；Hex，己糖；Kdo，2-酮-3-脫氧辛酮糖酸baKdo指脫水-Kdo衍生物實(shí)施例6，表4.來自多殺性巴氏桿菌菌株VP161(親本)和AL251(突變株)的核心OS的Hep II和Hep III殘基的1H-NMR化學(xué)位移。在D20中于25℃記錄。未確定在2.225ppm.nd參照內(nèi)部丙酮的化學(xué)位移。由于核水解后Kdo分子的異質(zhì)性，對應(yīng)每-殘基觀察到兩個共振。


實(shí)施例7表現(xiàn)出一種獸類病原體特定的保守LPS結(jié)構(gòu)的溶血性曼氏桿菌的D-甘油-D-甘露-庚糖基轉(zhuǎn)移酶突變株的制備，以及對這種LPS結(jié)構(gòu)的抗體的產(chǎn)生和交叉反應(yīng)。
對來自獸類病原體溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌的脂多糖的以前的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)識別出一種保守內(nèi)核寡糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)存在于被研究的所有菌株中。為了考察這種內(nèi)核結(jié)構(gòu)作為疫苗的潛能，采用一種誘變策略來干擾溶血性曼氏桿菌的D-甘油-D-甘露庚糖轉(zhuǎn)移酶基因(losB)。這種基因編碼的酶負(fù)責(zé)增加D-甘油-D-甘露庚糖殘基，該殘基是保守內(nèi)核外的第一殘基，而且它的失活使保守內(nèi)核結(jié)構(gòu)暴露作為突變體LPS分子上的末端單元。隨后的分析確定突變株LPS的結(jié)構(gòu)如下，且與losB的反向互補(bǔ)確定了losB基因編碼一種α-1，6-D-甘油-D-甘露庚糖基轉(zhuǎn)移酶。
在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生這種LPS結(jié)構(gòu)的多克隆和單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)這些抗體可識別溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌三種菌株的LPS和全細(xì)胞。
菌苗或者簡單修飾的活菌株是實(shí)踐中的傳統(tǒng)疫苗，然而，現(xiàn)場試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)性研究已經(jīng)反復(fù)證實(shí)菌苗無效，實(shí)際上經(jīng)常引起負(fù)作用。本工作探索滿足有效、準(zhǔn)確要求的亞單位疫苗候選物?？梢钥紤]作為疫苗候選物的抗原幾乎確定必須處在自然狀態(tài)下的細(xì)菌的表面上，以獲得隨后靶向活的有機(jī)體的疫苗抗原的免疫應(yīng)答。
在此背景下，包含表面暴露的糖部分的獸類病原體可用作疫苗候選物。該糖部分是脂多糖(LPS)和莢膜多糖。莢膜多糖是直接連接于細(xì)菌表面的幾個糖殘基的重復(fù)單元，而LPS由三個區(qū)域組成，一個經(jīng)由脂肪酸殘基將LPS分子連接于細(xì)菌表面的脂質(zhì)A區(qū)，一個將脂質(zhì)A區(qū)連接于第三區(qū)的相對保守的核心寡糖區(qū)，以及可變多糖抗原(O-抗原)。莢膜和O-抗原多糖的菌株異質(zhì)性將這些結(jié)構(gòu)排除作為經(jīng)濟(jì)可行的疫苗候選物，因?yàn)樗麄兊哪芰χ荒芨采w同源菌株或產(chǎn)生相同結(jié)構(gòu)的菌株。另一種情況，如果能識別出一個保守核心LPS結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)也許可以利用作為一種對所有菌株提供廣泛覆蓋的疫苗候選物。
在我們實(shí)驗(yàn)室中，之前和現(xiàn)在的對三個菌株，App，Pm和Mh的LPS結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)分析識別出一個存在于所有考察的菌株(App，Pm和Mh)中的保守內(nèi)核LPS結(jié)構(gòu)。為了考察保守內(nèi)核單元的潛能，必須將該結(jié)構(gòu)暴露成為末端殘基，為此采用誘變策略，將編碼負(fù)責(zé)外核生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶基因破壞。這種誘變的結(jié)果從而使得保守內(nèi)核結(jié)構(gòu)被暴露。
本研究描述了來自溶血性曼氏桿菌的庚糖基轉(zhuǎn)移酶基因的識別、克隆和誘變，該庚糖基轉(zhuǎn)移酶在外核修飾中負(fù)責(zé)第一生物合成步驟。來自突變株的LPS結(jié)構(gòu)分析確定，LPS被適當(dāng)截短了。然后，將突變菌株用于產(chǎn)生對抗保守LPS結(jié)構(gòu)的抗體，并且那些抗體檢測三個靶向菌株間的交叉反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件Mh菌株A1 Sh1217(S.Highlander，Baylor College of Medicine，Houston Texas)和A1菌株01A ADRI(Perry Fleming，IBS)于37℃在BHI平板或BHI肉湯上進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。E.coli DH10B(Invitrogen，Carlsbad California)用于重組質(zhì)粒的克隆和制備，并在加有適量抗生素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)(氨比西林100μg/ml，氯霉素25μg/ml)。需要時，溶血性曼氏桿菌菌株在加有氨比西林(50μg/ml)和氯霉素(5μg/ml)的BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
包括插入到losB基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
將來自菌株01A的染色體DNA的losB基因使用側(cè)翼引物通過PCR擴(kuò)增。所使用的引物是losB-kpn 5’ATATGGTACCTATCAGCGGTAGAGATTC TAAC和losB-xba 5’TGCTC TAGACCGAACCTGCACCAAAAAGATTTAACGC。這些引物擴(kuò)增出一個2Kb的片斷，用Kpn/Xba限制性內(nèi)切酶消化后將該片斷克隆到pBluescript，接著電穿孔到E.coli DH10B。使用如下對應(yīng)losB結(jié)構(gòu)基因的引物5’CCGCTGCGAGAGATAAGTGGATACTTTATC-3’和5’GACATTGGGATCTTTATTTAGATTTCAAACCGAC-3’進(jìn)行以該質(zhì)粒為模板的反向PCR，從瓊脂糖凝膠上切取產(chǎn)物并用Qiagen凝膠提取試劑盒純化。來自pNFplpcat的經(jīng)修飾的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)盒(plpCat)通過PCR擴(kuò)增，將粘性末端產(chǎn)物連接到上述PCR產(chǎn)物制成pSK losB::at。限制性酶切圖和重組質(zhì)粒序列確定Cat盒被以與losB基因相同方向插入到losB結(jié)構(gòu)基因。
losB菌株的篩選質(zhì)粒pSKlosB::cat通過電穿孔轉(zhuǎn)化到Mh細(xì)胞中。簡言之，電穿孔后將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移到1ml的預(yù)熱的BHI肉湯，于37℃培養(yǎng)1.5h。平板接種到含有5mg/ml氯霉素的BHI瓊脂上以篩選轉(zhuǎn)化株。為確定該轉(zhuǎn)化株不再帶有pSKlosB::cat質(zhì)?？寺?，將其拷貝平板接種到BHI/Amp平板上，氨比西林敏感克隆通過PCR檢測。倍增重組后losB基因的插入失活用PCR確認(rèn)。在初始克隆實(shí)驗(yàn)中所使用的針對losB-Kpn和losB-Xba的上游和下游序列的引物，確定Cat cassette插入到losB基因的染色體拷貝中。
losB突變株與losB反向基因的互補(bǔ)通過使用Xba和Kpn的限制性內(nèi)切酶消化從pSK losB(見上)上切取losB基因的野生型拷貝，克隆到穿梭質(zhì)粒pNF2176中以產(chǎn)生pNF2176AalosB。然后將該質(zhì)粒電穿孔到Mh losB突變株和在Amp/Cat上篩選的轉(zhuǎn)化株中。
突變株LPS特征描述使用常規(guī)技術(shù)從滅活細(xì)胞中分離出。如之前所述，準(zhǔn)備糖分析和部分甲基化的糖醇乙酸酯。純化核心OS和O-脫酰LPS(LPS-OH)。純化完全脫酰LPS。使用質(zhì)譜檢測法和核磁共振光譜檢測法。
抗體制備用福爾馬林滅活、PBS洗滌的Mh losb 0.5ml，其中有108細(xì)胞，在天數(shù)(D)0，14和35時對5只雌性BALB/c小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射(ip)免疫。在D42進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取血，從每只小鼠的面靜脈抽取少量血，將分離出的血清通過ELISA檢測與Mh losB和Mh wt LPS的交叉反應(yīng)性。在D54，每只小鼠接受重復(fù)ip免疫接種，并且小鼠#2也接受一次靜脈(iv)注射0.2ml，其中有4×107細(xì)胞。在D57，從這些小鼠上切下脾并與一種骨髓瘤細(xì)胞系融合。該融合體的初始篩選的抗原是來自Mh losB和Mh wt的純化LPS。小鼠#3和小鼠#5在D90用Mh losB全細(xì)胞(～108)ip。小鼠#3在D131用Mh losB細(xì)胞ip和iv加強(qiáng)免疫，為D134的脾細(xì)胞融合作準(zhǔn)備；小鼠#5在D152用來自Pm菌株VP161經(jīng)福爾馬林滅活的全細(xì)胞ip和iv注射加強(qiáng)免疫，在D155將其脾細(xì)胞融合。針對小鼠#3和小鼠#5融合體的初始篩選的抗原是來自App血清型5a和Pm菌株VP161的純化LPS。制備含有單克隆抗體的腹水。
LPS ELISA純化的并充分表征的野生型和突變株LPS被用于固相間接ELISA以確定mAb的結(jié)合專一性。
全細(xì)胞ELISA使用酚滅活細(xì)胞結(jié)果候選糖基轉(zhuǎn)移酶的識別。
來自3種所感興趣的菌株(Mh，App和Pm)的LPS表現(xiàn)有相同的內(nèi)核結(jié)構(gòu)(實(shí)施例7，表1)。為考察這種保守內(nèi)核結(jié)構(gòu)作為一種有用的疫苗候選物的潛能，必須去除這個區(qū)域外的外核修飾。為幫助完成此事，采取方法以識別和改變在外核修飾中負(fù)責(zé)第一個單糖加入的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。由于相對于App，Mh中的O-抗原的數(shù)量低，不會干擾隨后的免疫研究，因而選擇Mh進(jìn)行誘變研究。Pm菌株P(guān)m70[24]的基因組序列測定完成，Pm(菌株P(guān)-3480)、App(血清型1和5b)和Mh(A1菌株)的正在進(jìn)行。在App血清型1和Mh菌株A1中都識別到如圖41所示的候選糖基轉(zhuǎn)移酶。Galameau等人鑒別出App中的lbgA基因定位于兩個基因中間，所述兩個基因通過mini-Tn10轉(zhuǎn)座子誘變發(fā)現(xiàn)與核寡糖生物合成相關(guān)。相鄰基因lbgB顯示與杜克雷嗜血桿菌的一個D-甘油-D-甘露庚糖基轉(zhuǎn)移酶有相當(dāng)高的同源性。使用App的lbgB基因序列對Mh基因組序列(Baylor College，Houston)進(jìn)行Blast分析，揭示出在Mh基因組序列中有兩個相鄰的D-甘油-D-甘露-庚糖基轉(zhuǎn)移酶的同源物。所識別的最佳lbgB同源物據(jù)推測為負(fù)責(zé)在第一個L-甘油-D-甘露-庚糖殘基的延伸上添加第一個D-甘油-D-甘露-庚糖殘基的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶，因此我們推測，第二個同源物(我們稱為losB)是負(fù)責(zé)添加第二個D-甘油-D-甘露-庚糖殘基的D-甘油-D-甘露-庚糖轉(zhuǎn)移酶。
Mh中l(wèi)osB的誘變在Mh中質(zhì)粒pSKlosB::cat不能復(fù)制，因此在功能上作為一種自殺性質(zhì)粒。隨后電穿孔(5μg質(zhì)粒DNA)進(jìn)入Mh中，獲得136個catR轉(zhuǎn)化體，其中104個是amps。隨機(jī)選擇其中的兩個作進(jìn)一步研究。通過用包含插入位點(diǎn)的引物的PCR確認(rèn)兩個突變株都曾有過雙交換作用(未顯示數(shù)據(jù))。為確定對LPS結(jié)構(gòu)(見下文)的影響是由losB基因的失活造成的，我們在穿梭質(zhì)粒pNF2176上用losB基因的野生型拷貝反向互補(bǔ)突變菌株。
losB突變株的LPS的表征常規(guī)方法分離LPS。純化的LPS的糖分析揭示，葡萄糖(Glc)、D-甘油-D-甘露-庚糖(DD-Hep)和L-甘油-D-甘露-庚糖(LD-Hep)各自的比例大約為2∶1∶3，還可觀察到痕量的N-乙酰-葡糖胺(GlcNAc)。這種糖組成與突變株LPS的預(yù)期結(jié)構(gòu)一致，并且暗示突變的losB基因，如同源性數(shù)據(jù)所預(yù)示的，是特異性的庚糖轉(zhuǎn)移酶基因，而不是與庚糖生物合成有關(guān)的基因，因?yàn)樗膫€其他庚糖殘基保留在突變株的LPS中。常規(guī)方法制備O-脫酰LPS(LPS-OH)，并用CE-MS分析(實(shí)施例7，表2)。觀察到一個有二價(1172.32)，三價(781.33-)和四價(585.4-)離子的簡單質(zhì)譜(圖42a)，所觀察到的離子與預(yù)期的Hex2，Hep4，Kdo-P，脂質(zhì)A-OH組成一致。還觀察到少量帶電離子；二價(1065.32-)，三價(709.83-)和四價(532.34-)，與多存在一個Kdo殘基、同時缺少己糖、庚糖和磷酸部分相對應(yīng)。以前在相關(guān)獸類病原體多殺性巴氏桿菌中觀察到這種情況。純化核寡糖(OS)并用CE-MS相似地檢測(實(shí)施例7，表2)，給出一個一價(1312-)和二價(655.62-)離子的質(zhì)譜，與預(yù)期的Hex4，Hep2，Kdo組成相一致。為了證明突變株LPS的連接模式?jīng)]有因誘變而改變，在核心OS上進(jìn)行了甲基化分析，顯示末端Glc，6-取代的Glc，末端LD-Hep，末端DD-Hep，2-取代的LD-Hep和3，4，6-三取代LD-Hep以大約相等的比例存在，這又與預(yù)期的突變株LPS結(jié)構(gòu)相一致。在完全脫酰的LPS上的NMR實(shí)驗(yàn)獲得了突變株LPS的核心OS結(jié)構(gòu)的最后確認(rèn)，并與野生型LPS光譜(圖43)比較發(fā)現(xiàn)，在突變株LPS中很明顯沒有末端Gal-Hep二糖。化學(xué)位移的排布揭示(實(shí)施例7，表3)，保守核心OS的所有連接與野生型LPS的相同，因此已獲得想要的結(jié)構(gòu)。從互補(bǔ)突變株獲得LPS-OH，CE-ES-MS分析確認(rèn)出帶有少量的具有附加Kdo殘基的糖型的wt LPS表形(實(shí)施例7，表2，圖42b)。
抗體制備經(jīng)初始和加強(qiáng)免疫后，檢測5只小鼠的血清識別Mh losB和Mh wt LPS的能力(圖44)。由于小鼠#2對wt菌株有最高的IgG滴定率，選擇這種小鼠進(jìn)行第一次融合實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)生mAb。產(chǎn)生九個識別Mh losB的穩(wěn)定的雜交瘤，并檢測他們與Mh，App和Pm的wt LPS的交叉反應(yīng)的能力(圖45)。然而，沒有mAb能識別App和PmLPS，并且只有四個mAb能識別Mh wt LPS。D42多克隆血清的檢測揭示，存在能識別純化的App血清型5a、Pm菌株VP161和X73 LPS而不能識別App血清型1的LPS的抗體(圖46)。因此，在小鼠#3上制得融合物，但是沒有鑒別到能識別App血清型5a和Pm菌株VP161的純化LPS的雜交瘤。最后，因?yàn)樵贒152時多克隆血清檢測顯示出與Mh losB和wt，App血清型1和5a以及Pm菌株VP161和X73的LPS的交叉反應(yīng)，所以在小鼠#5用Pm菌株VP161的滅活完整細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫后，制得融合物(圖47)。獲得十四個雜交瘤，十一個只能能識別Pm菌株VP161的純化LPS，三個能識別App血清型5a和Pm菌株VP161的純化LPS。隨后發(fā)現(xiàn)這三個交叉反應(yīng)雜交瘤能識別App血清型1、Pm菌株X73以及Mh losB和wt的純化LPS，而上述十一個識別Pm VP161的雜交瘤，也是只能識別相關(guān)的Pm菌株X73(圖48，實(shí)施例7，表4)。
目前沒有有效的疫苗來對抗由獸類病原體Mh，Pm和App引起的疾病。對抗由Mh引起的疾病的疫苗方法仍然主要是基于菌苗和活減毒株。最近的活疫苗中引入了分泌或者提取的Mh抗原，如神經(jīng)氨酸酶、白細(xì)胞毒素、唾液糖蛋白酶、外膜以及未識別的蛋白。白細(xì)胞毒素在常規(guī)上一直是主要的亞單位疫苗候選物，但使用表達(dá)非毒性白細(xì)胞毒素的突變株進(jìn)行免疫接種在小牛攻擊模型中仍然部分有毒，并且白細(xì)胞毒素與莢膜多糖聯(lián)合使用時不能產(chǎn)生防護(hù)性免疫應(yīng)答。相比而言，LPS已顯示出可穩(wěn)定的白細(xì)胞溶解活性，所以基于LPS和去毒白細(xì)胞毒素的聯(lián)合疫苗可帶來希望。
目前對抗由App引起的疾病的疫苗方法是基于活減毒株，它們中含有高度不穩(wěn)定的Apx毒素，該毒素可誘導(dǎo)防護(hù)所需的中和抗體。這些Apx毒素形成了針對App的主要亞單位疫苗的基礎(chǔ)，但似乎只能誘導(dǎo)部分臨床防護(hù)。有人提出將粘附素(包括LPS的核心OS)作為改善的疫苗候選物。
目前預(yù)防豬Pm病的疫苗由類毒素和體細(xì)胞抗原如莢膜和外膜蛋白組成。巴斯德(Pasteur)首先表明Pm可引起雞的禽霍亂，目前對該病的防護(hù)手段是利用Pm減毒株。然而一般來說，由于該免疫應(yīng)答仍然是血清型限制的，不能提供對其他血清型的交叉保護(hù)，所以這種手段受到極大限制。然而已經(jīng)表明Pm的LPS在感染的免疫中起部分作用。
最近已經(jīng)積累了相當(dāng)?shù)淖C據(jù)表明來自這些生物中每一種的LPS都可能是亞單位疫苗設(shè)計的良好候選物。已經(jīng)顯示LPS是Mh表面上可見的和主要的抗原決定簇，由A1 LPS誘導(dǎo)的mAb有助于吞噬作用而無助于補(bǔ)體介導(dǎo)的體外殺傷。
對于pm，核糖體-LPS疫苗保護(hù)雞類免受由同源Pm菌株引起的禽霍亂感染。另外，使用LPS-蛋白復(fù)合物對小鼠進(jìn)行免疫接種，當(dāng)使用同源菌株攻擊小鼠時該免疫接種可提供100％的保護(hù)，然而當(dāng)分開使用時，該復(fù)合物的單一組分無法提供保護(hù)。來自Pm的LPS誘導(dǎo)的MAb在小鼠模型中只能提供部分保護(hù)，盡管它們具有調(diào)理吞噬作用，但在補(bǔ)體存在下不具有殺菌作用。然而在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，針對PmLPS的mAb可完全保護(hù)小鼠免受同源攻擊，并且具有殺菌作用。一種模擬來自A型的LPS的抗獨(dú)特型疫苗在小鼠模型中當(dāng)其受到同源生物攻擊時可起到保護(hù)作用。
在App中，LPS，更具體地說是LPS的核區(qū)與該細(xì)菌的粘附能力有關(guān)。BSA與App血清型1 LPS連接的聯(lián)合疫苗可在同源攻擊而不能在異源攻擊后保護(hù)小鼠，來自血清型5和1的光滑型和粗糙型App LPS的聯(lián)合疫苗表明App細(xì)胞壁的糖部分在豬免疫應(yīng)答中起重要作用。
因而，我們從事這個研究以制造出一個保守的截短的核心LPS，該LPS是所有三種有機(jī)體中都有的。已顯示LPS在對這些獸類病原體的每一種的免疫力中都起作用，如果能識別到一種保守LPS抗原，那么對同源菌株的保護(hù)應(yīng)答或許能延伸到異源菌株甚至菌種。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)表明，所有這些獸類病原體都有一個共同的保守性內(nèi)核心OS結(jié)構(gòu)。因此決定探索基于LPS的疫苗的可能性。該過程的第一步是構(gòu)建突變株，該突變株只表達(dá)保守性內(nèi)核心OS表位作為末端暴露結(jié)構(gòu)。
該研究已經(jīng)從Mh菌株A1獲得α-1，6-D-甘油-D-甘露-庚糖基轉(zhuǎn)移酶基因的突變體，以便以末端暴露部分的形式呈現(xiàn)保守性內(nèi)核表位。在Mh中，誘變策略決不是簡單的。以前有限數(shù)量的研究制備出aroA基因、lpp基因座、莢膜nmaAB基因座以及白細(xì)胞毒素lktCABD基因簇的突變株。盡管電穿孔是將外源DNA導(dǎo)入Mh細(xì)胞的一種有效方法，但是通過同源重組將外源DNA插入到染色體中是很難的，并且出現(xiàn)頻率低，而單交換事件頻繁發(fā)生，導(dǎo)致靶基因的突變株和功能性拷貝的存在。在Mh中不穩(wěn)定的質(zhì)粒(自殺型質(zhì)粒)已被幾個人用于此方法，在當(dāng)前研究中被成功使用。突變株的LPS的結(jié)構(gòu)分析證實(shí)了預(yù)期的LPS表型，互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)所觀察到的結(jié)果確實(shí)是由于這種基因的失活造成的。重新反向?qū)雔osB基因的完整拷貝使LPS結(jié)構(gòu)回復(fù)為野生型證實(shí)，losB基因是α-1，6-D-甘油-D-甘露-庚糖基轉(zhuǎn)移酶。誘導(dǎo)針對此截短的LPS結(jié)構(gòu)的mAb和pAb，以檢驗(yàn)在這些獸類病原體的一定范圍的菌株中此結(jié)構(gòu)的保守性和可達(dá)性的程度。獲得了三種mAb，它們能夠與Ap、Pm和Mh的所有研究過的菌株的LPS發(fā)生交叉反應(yīng)，因而建立了這三種重要的獸類病原體之間共有的保守性交叉反應(yīng)性LPS表位的可能性。
實(shí)施例7，表1來自獸類病原體溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌的LPS的核心寡糖的保守和多變區(qū)的結(jié)構(gòu)。



對于多殺性巴氏桿菌，庚糖殘基Hep IV是L-□-D構(gòu)型，在少數(shù)糖型中沒有葡萄糖殘基□-Glc II。
實(shí)施例7，表2來自溶血性曼氏桿菌losB突變株和互補(bǔ)突變株的O-脫酰LPS和核心寡糖的陰離子CE-ESI-MS數(shù)據(jù)和推測組成。平均質(zhì)量單位根據(jù)如下推測組成用于計算分子量Hex，162.15Hep，192.17；Kdo，220.18；P，79.98.O-脫酰脂質(zhì)A(脂質(zhì)A-OH)是952.00。

實(shí)施例7，表3來自溶血性曼氏桿菌losB突變株KOH處理的LPS的1H-和13C-NMR化學(xué)位移。


實(shí)施例7，表4.由小鼠#5融合體制備的mAb的摘要信息

*，~；mAb 3-3和3-4以及mAb 3-15和3-16隨后顯示來自相同的克隆。
實(shí)施例8用于預(yù)防由獸類病原體溶血性曼氏桿菌，胸膜肺炎放線桿菌與多殺性巴氏桿菌所產(chǎn)生疾病的、基于LPS的糖結(jié)合物的篩選結(jié)合化學(xué)以及小鼠免疫之后的免疫反應(yīng)研究為了制備糖結(jié)合物，LPS按下述過程進(jìn)行衍生化。將來源于Mh losB突變株的LPS(145mg)和8K沉淀材料溶解于4N KOH(10mg/ml)并在125℃攪拌30h以脫除乙酰基，該Mh losB突變株具有目標(biāo)結(jié)構(gòu)。溶液冷卻到室溫，并以乙酸酐進(jìn)行中和，這里乙酸酐用于重新N-乙酰化由該過程所產(chǎn)生的氨基。離心(9K，15分鐘)除去沉淀鹽，上清液上Sephadex G-25柱，以水為洗脫劑進(jìn)行洗脫。收集糖陽性的組分，凍干，得到20-25％產(chǎn)率的KOH’d LPS(25mg 8K沉淀，33.3mg LPS)。產(chǎn)物在0.1M NaOH(10mg/ml)中室溫處理2h以脫-O-乙?；谒幸許ephadexG-25柱純化，然后，凍干，獲得約20％產(chǎn)率的KOH’d LPS。
通過1H-NMR和ES-MS分析來進(jìn)行質(zhì)量控制。MS分析顯示在KOH處理過的LPS材料中有一些異質(zhì)性，所述異質(zhì)性與末端庚糖殘基和葡糖殘基的可變?nèi)笔嘁恢隆?br> 去磷酸化作用合并源自LPS或8K沉淀材料的產(chǎn)物，溶解(約10mg/ml)于含有重組堿性磷酸酶(Roche)(-140units/mg units alk.P/mg KOH’d LPS)的pH8.0的0.1M NH4HCO3緩沖液中，并于37℃攪拌4h進(jìn)行去磷酸化作用。上述溶液加熱到100℃保持5min，冷卻，14K離心10min。上清凍干。
產(chǎn)物在水中以SephadexG-25柱脫鹽，凍干，獲得20％產(chǎn)率(48mg)的KOH’d alk.P’d LPS。通過1H-NMR和CE-ES-MS分析來進(jìn)行質(zhì)量控制，這些分析證實(shí)了KOH處理的LPS的去磷酸化作用。
胺化作用通過在600μl DMSO中溶解干燥的糖(48mg)，加入4800μl 2M NH4OAc甲醇溶液和120mg溶解于1200μl MeOH的NaCNBH3，在pH8.3、50℃下反應(yīng)72h，對目標(biāo)aldehydo功能基團(tuán)進(jìn)行胺化。在N2保護(hù)下蒸發(fā)MeOH，凍干產(chǎn)物并在水中以SephadexG-25柱純化，凍干，獲得約10％產(chǎn)率(32mg)的KOH’d alk.P’d胺化的LPS。通過1H-NMR分析來進(jìn)行質(zhì)量控制，該1H-NMR分析證實(shí)了KOH處理的LPS的胺化作用。
接頭分子的附著通過溶解干燥糖(32mg)于4000μl H2O中，加入4000μl MeOH，100μl squarate，在pH8.2(以三乙胺(4μl)調(diào)節(jié))、室溫下反應(yīng)2h，每間隔15分鐘檢測pH，使接頭分子(squarate)聯(lián)接到產(chǎn)物氨基上。在N2保護(hù)下蒸發(fā)MeOH，凍干產(chǎn)物并在水中以SephadexG-25柱純化，凍干，獲得約12％產(chǎn)率(30mg)的KOH’d alk.P’d胺化的squarated LPS。通過1H-NMR、13C-1H-NMR和CE-ES-MS分析進(jìn)行質(zhì)量控制，這些分析證實(shí)了squarate接頭的聯(lián)接。然而，MS分析顯示只有50％材料帶有squarate接頭。
結(jié)合到蛋白載體上通過在pH9.2室溫下攪拌24h，將約20mg HSA連接到25倍摩爾過量的溶解于1ml 0.02M硼酸鈉緩沖液中的squarate連接糖上，糖在反應(yīng)開始時和反應(yīng)6h后加入。24h后，取出一份，并通過MALDI-MS和SDS-PAGE檢測，以糖特異性單克隆抗體G8進(jìn)行Western印跡(圖50)。最終反應(yīng)混合物使用PBS(50mM磷酸鈉，100mM NaCl，10mM檸檬酸鈉，pH7.5)過Sepharose 6B柱純化，以分離沒有結(jié)合糖的分離物。與產(chǎn)物峰相對應(yīng)的組分在Amicon ultra-15 10K cutoff spin柱中進(jìn)行濃縮。對結(jié)合物的最終體系進(jìn)行定量，通過BCA分析定量蛋白含量，通過PhOH/H2SO4方法確定糖含量，得出糖與蛋白的摩爾比為4.5∶1。同時，通過在1％乙酸中的納米-電子-散射質(zhì)譜分析對最終結(jié)合物和載體蛋白HAS進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示了對應(yīng)于HAS的預(yù)期分子量(圖51a)以及與載體蛋白各種糖基化相一致的一系列峰(圖51b)。
連接方案步驟1KOH處理Mh losB LPS
步驟2alkP處理Mh losB KOH’d LPS 步驟3alkP處理的Mh losB KOH’d LPS的胺化反應(yīng)
步驟4KOH’d alkP’d胺化的Mh losB LPS的squarate反應(yīng) 步驟5KOH’d alkP’d胺化的squarated Mh losB LPS的結(jié)合反應(yīng) 結(jié)合物制備 -Mh losB-HSA(約4CHO/CRM)，至小鼠免疫過程以結(jié)合物對6只6-8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，作為對照，3只雌性6-8周齡的BALB/c小鼠以混合的糖和HAS進(jìn)行免疫。所有疫苗均溶解于無菌PBS溶液，在Ribi佐劑中每0.1ml sc注射劑加有10μg糖。
小鼠按照如下時間表進(jìn)行免疫0天 預(yù)抽血及初始注射14天 第一次加強(qiáng)免疫23天 試驗(yàn)性抽血35天 第二次加強(qiáng)免疫45天 小鼠抽血在23天的試驗(yàn)性抽血以及在45天的最終抽血顯示，#V2號小鼠表現(xiàn)出對糖抗原的IgG反應(yīng)，如抗Mh losBLPS的LPS ELISA所揭示的那樣(圖52和53)。對來源于進(jìn)行了三種免疫過程的#V2號小鼠的多克隆血清，對其與三種目標(biāo)物交叉反應(yīng)能力進(jìn)行了檢測。Ap、Mh與Pm的LPS和全細(xì)胞都能被該多克隆血清所識別(圖54與55)。然而，來源于Neisseriameningitides株L3galE和L2galE的LPS和全細(xì)胞也能夠分別在LPS和全細(xì)胞ELISA中所識別。這一現(xiàn)象歸功于在KOH處理制備結(jié)合物的過程中糖抗原的部分降解，這會產(chǎn)生末端庚糖殘基和己糖殘基的各種形式缺失(見圖49)。這將導(dǎo)致在最終結(jié)合物中有一部分這種糖抗原含有抗原決定簇，該抗原決定簇會模擬腦膜炎菌LPS區(qū)(用于測試多克隆血清V2)，進(jìn)而導(dǎo)致這種已觀察到的交叉反應(yīng)活性。不過，用這種結(jié)合物血清進(jìn)行免疫的小鼠培養(yǎng)到的血清能夠識別來源于獸類病原體Ap、Pm和Mh的LPS和全細(xì)胞。
實(shí)施例9用對保守內(nèi)核脂多糖特異性的單克隆抗體的殺菌實(shí)驗(yàn)在D140時小鼠#1的多克隆血清識別Mh的完整細(xì)胞(圖56)，并包含對Mh的內(nèi)核LPS的特異性抗體(圖57)，在殺菌實(shí)驗(yàn)中mAb G3，G8，3-5和3-16(圖58-61)腹水連同對照腹水L2-16被用作殺菌實(shí)驗(yàn)的血清來源。該實(shí)驗(yàn)根據(jù)Sutherland A.D.1988.Vet.Microbiol.16263-271的方法進(jìn)行。簡言之，在100ml BHI肉湯中，培養(yǎng)Mh細(xì)胞到～5×103cfu/ml的生長水平。使用10ml的培養(yǎng)物，將其中的細(xì)胞在5000×g，4℃制成小球，并用D-PBS(含有Ca和Mg[Gibco # 14040-133])洗滌兩次。最終的細(xì)胞小球再懸浮于10ml的D-PBS中。實(shí)驗(yàn)血清和腹水樣品在56℃熱滅活30min，以破壞內(nèi)源補(bǔ)體。實(shí)驗(yàn)建立在96-孔，組織培養(yǎng)級，平底微量滴定板(NUNC)上，重復(fù)三次。每孔加入在D-PBS中適度稀釋的抗血清20ul，接著加入細(xì)菌懸浮液(100ul)，將平板在RT培養(yǎng)15min。每孔加入補(bǔ)體(80ul，幼兔，#CL3441-S，Cedarlane)，將平板在37℃培養(yǎng)30min。將平板放置在冰上終止反應(yīng)，每孔三分樣品(50ul)涂板在BHI瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。每組實(shí)驗(yàn)中還包括只含有細(xì)菌懸浮液、有補(bǔ)體的細(xì)菌懸浮液和有適量稀釋的抗體的細(xì)菌懸浮液的對照孔。
計數(shù)細(xì)菌的生長，計算相對于對照的致死百分?jǐn)?shù)。
如下表和圖62-64中所見，mAb G3和G8以及多克隆血清都促進(jìn)MhA1 wt細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)溶解作用。mAb 3-5和3-16的腹水的失效是由于這些血清的十分低的滴定度(操作稀釋度1∶50相對于1∶106)。
mAb G3和G8以及多克隆血清顯示的殺菌活性闡明，Mh中對保守內(nèi)核LPS表位特異性的抗體能夠識別Mh全細(xì)胞，并且在功能上對Mh全細(xì)胞也是有活性的。
實(shí)施例9，表1.mAb G3和G8對Mh A1細(xì)胞的殺菌活性

SE＝SD/√n 其中n＝樣品容量實(shí)施例9，表2.D140時多克隆血清Mh#1對Mh A1細(xì)胞的殺菌活性

SE＝SD/√n其中n＝樣品容量實(shí)施例10使用對保守內(nèi)核脂多糖特異性的單克隆抗體的被動保護(hù)實(shí)驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)根據(jù)Lopez et al.1982.Can，J.Comp.Med.46314-316的方法使用如下所述的方法和改進(jìn)進(jìn)行。
小鼠和試劑在蛋白A柱上純化mAb腹水的IgG，無菌過濾(圖65)以用于被動保護(hù)實(shí)驗(yàn)。
試驗(yàn)的mAb G3和G8G8，IgG2b，3.8mg/ml；G3，IgG2a，4.7mg/ml。
對照mAbL2-16，IgG2b，1.9mg/ml。
Balb/c小鼠40只雌性，6-8周齡，CRL.5只小鼠/組.
溶血性曼氏桿菌A17.5×107cfu/小鼠.
實(shí)驗(yàn)計劃和分組




i所有小鼠表現(xiàn)出不同程度的臨床癥兆，如粗糙的皮毛、脫水和不愿在DPI2上移動。然而，C和D組小鼠總體上是健康的，F(xiàn)和G組小鼠盡管有粗糙的皮毛，但是保持活躍。在DPI 3上，A和B組小鼠嚴(yán)重脫水，并體重降低，G組小鼠也有輕微的病狀。
ii所有小鼠表現(xiàn)出不同程度的肺粘連(lung consolidarion)，并未采取嘗試以確定涉及的面積大小。
iii在各組之間的主要區(qū)別是，A、B和E組全部小鼠顯示在他們的肺中比其他組的小鼠有更多的嗜中性粒細(xì)胞。然而，所有的小鼠，無論如何處理，都顯示有某種程度的肺炎。
iv++++粗糙皮毛，中度到重度的體重降低，不愿移動；+++粗糙皮毛，輕度到中度的體重降低和脫水，但保持活躍；++粗糙皮毛并輕度的體重降低；+輕度粗糙皮毛。
v+++中量面積的粘連；++小面積的粘連。
vi+++中度的支氣管肺炎伴隨中量到大量的嗜中性粒細(xì)胞的出現(xiàn)和血管周圍及支氣管周圍區(qū)域的淋巴細(xì)胞的顯著滲入；++微度到中度的支氣管肺炎伴隨少量的嗜中性粒細(xì)胞的出現(xiàn)和血管周圍及支氣管周圍區(qū)域的淋巴細(xì)胞的滲入；+微度的支氣管肺炎伴隨少量的嗜中性粒細(xì)胞的偶爾出現(xiàn)和血管周圍及支氣管周圍區(qū)域的淋巴細(xì)胞的微度滲入。
vii表現(xiàn)臨床癥狀的小鼠數(shù)量基于這個試驗(yàn)性的實(shí)驗(yàn)顯示，mAb處理，特別是用溶血性曼氏桿菌的體外預(yù)溫育，對臨床癥候和被感染小鼠的組織病理學(xué)上顯示出中度影響。
圖66顯示對照小鼠B的中等大小的支氣管腔中，中量的嗜中性粒細(xì)胞的出現(xiàn)，與發(fā)病機(jī)理相符，但是圖67顯示與圖66同時殺死的C組小鼠的肺的一些區(qū)域中，顯示出由于少量的淋巴樣細(xì)胞的存在而引起的肺炎的消退，與通過體外預(yù)混合的mAb G3和Mh細(xì)胞提供的某種程度的保護(hù)一致。
生物保藏溶血性曼氏桿菌菌株A1 losB于2005年5月4日在IDAC進(jìn)行保藏。保藏編號為IDAC 040505-01。
序列表<110>加拿大國家研究委員會(National Research Council of Canada)<120>作為多物種疫苗候選物的保守性內(nèi)核脂多糖表位<130>PAT 2817W-90<150>CA 2,467,329<151>2004-05-14<150>US 60/571,489<151>2004-05-17<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>waaQPM擴(kuò)增的正向引物；具有BamHI位點(diǎn)用于克隆<400>1gagtaggatc ctgaaacatg ttccc 25<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>waaQPM擴(kuò)增的反向引物，具有SalI位點(diǎn)用于克隆<400>2ggttgggtcg accaagccac attactg27<210>3<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>losB-kpn引物<400>3atatggtacc tatcagcggt agagattcta ac32<210>4<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>losB-xba引物<400>4tgctctagac cgaacctgca ccaaaaagat ttaacgc 37<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>與losB結(jié)構(gòu)基因內(nèi)的序列相對應(yīng)的引物<400>5ccgctgcgag agataagtgg atactttatc 30<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>與losB結(jié)構(gòu)基因內(nèi)的序列相對應(yīng)的引物<400>6gacattggga tctttattta gatttcaaac cgac 3權(quán)利要求
1.一種分離的脂多糖部分，基本上由不含可變的外核寡糖鏈延伸的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成。
2.一種分離的脂多糖部分，基本上由通式I的葡糖基-庚糖基內(nèi)核部分組成 其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；R是H或者磷酸乙醇胺；R’″是H或者胸膜肺炎放線桿菌中的O-抗原；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；Q1是H或者α-Glc；Q2是H、Kdo或者-P-R，其中P是磷酸酯，R是H或者磷酸乙醇胺；Q3是H或者去毒的脂質(zhì)A；Q4是H或者 其中，R’和R″各自是H或者寡糖延伸，條件是如果R’″是H，且Q2是-P-R，其中R是H或者磷酸乙醇胺，那么Q1是α-Glc。
3.一種分離的脂多糖部分，基本上由通式Ia的葡糖基-庚糖基內(nèi)核部分組成； 其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放線桿菌中的O-抗原；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；Q1是H或者α-Glc；Q2是H、Kdo或者-P-R，其中P是磷酸酯，R是H或者磷酸乙醇胺；脂質(zhì)A是去毒的，條件是如果R’″是H，且Q2是-P-R，其中R是H或者磷酸乙醇胺，那么Q1是α-Glc。
4.一種分離的脂多糖部分，基本上由具有結(jié)構(gòu)I的二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成 結(jié)構(gòu)I其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放線桿菌中的O-抗原；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂質(zhì)A是去毒的。
5.一種分離的脂多糖部分，基本上由具有結(jié)構(gòu)II的葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成 結(jié)構(gòu)II其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R是H或者胸膜肺炎放線桿菌中的O-抗原；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂質(zhì)A是去毒的。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的脂多糖部分，其中在內(nèi)核部分中O-連接的基團(tuán)在任意位置被取代。
7.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的脂多糖部分，以及制藥上可接受的載體。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中制藥上可接受的載體具有免疫原性。
9.一種功能性抗體，所述抗體針對溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌以及多殺性巴氏桿菌可發(fā)生交叉反應(yīng)，并且所述抗體可結(jié)合權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的脂多糖部分中的表位。
10.一種制備和獲得針對溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌以及多殺性巴氏桿菌的功能性交叉反應(yīng)抗體的方法，該方法包括(a)產(chǎn)生針對權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的脂多糖部分的抗體；(b)將從步驟(a)獲得的抗體針對溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌以及多殺性巴氏桿菌的多種菌株進(jìn)行測試；(c)選擇與溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌以及多殺性巴氏桿菌的所有菌株都發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體。
11.權(quán)利要求7或8的組合物在制備治療由巴斯德菌科的細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述細(xì)菌具有該保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)。
12.權(quán)利要求7或8的組合物在制備治療由曼氏桿菌、放線桿菌或巴氏桿菌屬的細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述細(xì)菌具有該保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求7或8的組合物在制備治療由溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌或多殺性巴氏桿菌菌種的細(xì)菌感染所導(dǎo)致的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述細(xì)菌具有該保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病選自豬纖維蛋白出血性壞死性胸膜肺炎、禽霍亂、牛出血性敗血病、豬萎縮性鼻炎、羊和牛肺炎巴斯德氏菌病(船運(yùn)熱)和羊敗血病。
15.溶血性曼氏桿菌菌株A1 losB(IDAC 040505-01)。
16.一種減毒疫苗，包括巴斯德菌科的細(xì)菌菌株，所述細(xì)菌菌株缺少致病能力，并呈現(xiàn)來自保守性內(nèi)核結(jié)構(gòu)的脂多糖表位。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的減毒菌株，其中所述細(xì)菌菌株選自曼氏桿菌、放線桿菌或巴氏桿菌屬。
18.一種減毒疫苗，其包括在白細(xì)胞毒素基因上有突變的溶血性曼氏桿菌菌株A1 losB。
19.一種制備脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有結(jié)構(gòu)I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成 結(jié)構(gòu)I其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放線桿菌中的O-抗原；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂質(zhì)A是去毒的；所述方法包括(a)從溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌或多殺性巴氏桿菌菌種中分離糖基轉(zhuǎn)移酶基因失活的突變株，以使脂多糖部分以末端單元的形式呈現(xiàn)；(b)在適于表達(dá)脂多糖部分的條件下，培養(yǎng)從步驟(a)中獲得的溶血性曼氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌或多殺性巴氏桿菌的突變菌株；(c)分離和鑒定得到的脂多糖部分；和(d)使脂多糖部分的脂質(zhì)A部分去毒。
20.一種制備脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有結(jié)構(gòu)I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成 結(jié)構(gòu)I其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂質(zhì)A是去毒的；所述方法包括(a)從溶血性曼氏桿菌菌種中分離losB基因失活的突變株；(b)在適于表達(dá)脂多糖部分的條件下，培養(yǎng)從步驟(a)中獲得的溶血性曼氏桿菌突變菌株；(c)分離和鑒定得到的脂多糖部分；(d)使脂多糖部分的脂質(zhì)A部分去毒。
21.一種制備脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有結(jié)構(gòu)I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成 結(jié)構(gòu)I其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H或者胸膜肺炎放線桿菌中的O-抗原；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂質(zhì)A是去毒的；所述方法包括(a)從胸膜肺炎放線桿菌血清型1菌株中分離lbgA或rfbP基因失活的突變株；(b)在適于表達(dá)脂多糖部分的條件下，培養(yǎng)從步驟(a)中獲得的胸膜肺炎放線桿菌突變菌株；(c)分離和鑒定得到的脂多糖部分；(d)使脂多糖部分的脂質(zhì)A部分去毒。
22.一種制備脂多糖部分的方法，所述脂多糖部分基本上由具有結(jié)構(gòu)I的保守性二-葡糖基-四-庚糖基內(nèi)核部分組成 結(jié)構(gòu)I其中，Glc是葡萄糖；Hep是庚糖；P是磷酸酯；R是H或者磷酸乙醇胺；R’和R″各自是H或者寡糖延伸；R’″是H；Kdo是3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸；脂質(zhì)A是去毒的；所述方法包括(a)從多殺性巴氏桿菌菌株P(guān)m70中分離PM0223或PM1143基因失活的突變株；(b)在適于表達(dá)脂多糖部分的條件下，培養(yǎng)從步驟(a)中獲得的多殺性巴氏桿菌突變菌株；(c)分離和鑒定得到的脂多糖部分；(d)使脂多糖部分的脂質(zhì)A部分去毒。
23.一種單克隆抗體，其可與權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所定義的脂多糖部分中的表位相結(jié)合。
24.權(quán)利要求19至22任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所述脂多糖部分與所述內(nèi)核脂多糖部分中包含的表位的特異性單克隆抗體接觸，來識別該脂多糖部分。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述單克隆抗體如權(quán)利要求23所定義。
26.一種糖結(jié)合物，其包括與免疫原性載體相連接的、權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所定義的脂多糖部分。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的糖結(jié)合物，其中脂多糖部分與免疫原性載體通過接頭分子相連接。
28.權(quán)利要求26或27的糖結(jié)合物，其中所述接頭分子選自squarate、胱胺、己二酸二酰肼、ε-氨基己酸、氯己醇二甲基縮醛、D-葡糖醛酸內(nèi)酯和對硝基苯胺。
29.權(quán)利要求26至28任一項(xiàng)的糖結(jié)合物，其中所述的載體選自去毒綠膿桿菌毒素A、霍亂毒素/類毒素、百日咳毒素/類毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素/類毒素、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原、輪狀病毒VP7蛋白、呼吸道合胞體病毒F和G蛋白、白喉類毒素CRM197、破傷風(fēng)類毒素TT、人血清白蛋白(HSA)、溶血性曼氏桿菌白細(xì)胞毒素類毒素、溶血性曼氏桿菌PlpE脂蛋白、胸膜肺炎放線桿菌OmlA、溶血性曼氏桿菌或者胸膜肺炎放線桿菌TbpA和B(轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合蛋白)、溶血性曼氏桿菌唾液酸糖蛋白酶、胸膜肺炎放線桿菌選自Apx I到IV的Apx外類毒素、胸膜肺炎放線桿菌或者多殺性巴氏桿菌Plp-40脂蛋白、多殺性巴氏桿菌Omp28主要外膜蛋白、多殺性巴氏桿菌39kDa莢膜蛋白以及多殺性巴氏桿菌PlpB(39kDa交叉防護(hù)脂蛋白)。
30.一種疫苗組合物，其包括權(quán)利要求26至29任一項(xiàng)的糖結(jié)合物以及佐劑。
31.權(quán)利要求30的疫苗組合物，其中所述疫苗制成脂質(zhì)體、古生菌體(archaeosome)或者來自古生菌脂質(zhì)(archaeolipid)。
32.權(quán)利要求30或31的疫苗組合物，所述組合物在對哺乳動物進(jìn)行免疫接種后，可誘導(dǎo)能與巴斯德菌科的細(xì)菌的全細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)的抗血清。
33.一種多價疫苗組合物，其包括權(quán)利要求26至29任一項(xiàng)所定義的糖結(jié)合物以及佐劑的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了在一定范圍的致病性病原菌分離株的脂多糖(LPS)上表達(dá)的保守性內(nèi)核寡糖表位，所述分離株包括胸膜肺炎放線桿菌(Ap)、溶血性曼氏桿菌(Mh)和多殺性巴氏桿菌(Pm)。構(gòu)建了只以末端暴露結(jié)構(gòu)的形式表達(dá)保守性內(nèi)核OS表位的突變菌株，這使得能夠識別、制備和分離這三種生物共有的內(nèi)核LPS。進(jìn)一步提供了相關(guān)的疫苗、針對該保守性LPS內(nèi)核產(chǎn)生的抗體以及糖結(jié)合物，所述糖結(jié)合物包括與免疫原性載體連接的LPS內(nèi)核。
文檔編號G01N33/569GK101014698SQ200580023509
公開日2007年8月8日 申請日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月14日
發(fā)明者安德魯·考克斯, 詹姆斯·C.·理查茲 申請人:加拿大國家研究委員會