專利名稱：用于分選帶有x或y染色體富集群的精子懸浮液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及分選精子細(xì)胞的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及制備精子細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性相對于體內(nèi)射精精子降低的懸浮液，更具體而言是運(yùn)動(dòng)性暫時(shí)降低；所述懸浮液可用于如將精子細(xì)胞分選為帶有X或Y染色體的富集精子細(xì)胞群的方法。
背景技術(shù)：
通過人工授精(AI)使動(dòng)物受精以及體外受精后的胚胎移植已經(jīng)是一項(xiàng)成熟的技術(shù)。在家畜產(chǎn)業(yè)中，能夠?qū)Ψ敝辰Y(jié)果施加影響而使其后代具有一種或多種所需特征，有明顯的優(yōu)勢。例如，乳制品產(chǎn)業(yè)中如能預(yù)先選擇后代有利于雌性而保證奶牛的產(chǎn)量，則會帶來經(jīng)濟(jì)效益。將精子分離為富集的帶有X和Y染色體的細(xì)胞群，即所謂的性別富集精液或性別富集精子，便是達(dá)到后代預(yù)選目的的方法之一。
為得到性別富集精液，必須將精子細(xì)胞以染料染色，然后分選為帶有X和Y染色體的細(xì)胞。染色和分選過程的每一步對于精子細(xì)胞而言都是應(yīng)激，會導(dǎo)致精子細(xì)胞的存活力或運(yùn)動(dòng)性，特別是前向性運(yùn)動(dòng)性降低。
Salisbury等人描述了將公牛射出的精液直接收集至稀釋液中的技術(shù)，所述稀釋液可抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性并防止其從周圍精漿中吸收糖。當(dāng)收集射出精液至稀釋液中，且通過充氣100％的CO2替換液體上方的氣相時(shí)，射出精液內(nèi)的細(xì)胞會喪失運(yùn)動(dòng)性。只要將細(xì)胞留存于該稀釋液中且排除空氣，就可以保證其在室溫下數(shù)小時(shí)不運(yùn)動(dòng)，而在5℃時(shí)可維持至少8天。
發(fā)明概述本發(fā)明的多方面之一涉及精子懸浮液，所述精子懸浮液可用于如將精子分選為帶X或Y染色體的富集精子群的方法。
因此簡言之，本發(fā)明涉及含有活精子以及下調(diào)精子糖攝取的組合物的精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為1×108精子/ml。
本發(fā)明還涉及含有不運(yùn)動(dòng)活精子的精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為1×108精子/ml。
本發(fā)明還涉及含有活精子的精子細(xì)胞懸浮液，所述精子相對于同一種系體內(nèi)射出的精子更具附睪中精子的運(yùn)動(dòng)性特點(diǎn)，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為1×108精子/ml。
本發(fā)明還涉及含有活精子、鉀、并任選地含有鈉的精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中的精子濃度至少為1×108精子/ml，而鉀與鈉的摩爾比大于各1∶1。
本發(fā)明還涉及含有活精子、下調(diào)精子糖攝取的組合物、以及DNA選擇性染料的精子細(xì)胞懸浮液。
本發(fā)明還涉及含有不運(yùn)動(dòng)活精子和DNA選擇性染料的精子細(xì)胞懸浮液。
本發(fā)明還涉及含有活精子和DNA選擇性染料的精子細(xì)胞懸浮液，所述精子相對于同一種系體內(nèi)射出的精子，其代謝率和運(yùn)動(dòng)性更具附睪中精子的特點(diǎn)。
本發(fā)明還涉及含有不運(yùn)動(dòng)活精子的精子細(xì)胞懸浮液，所述精子的DNA上結(jié)合有DNA選擇性染料。
本發(fā)明還涉及含有活精子的精子細(xì)胞懸浮液，相對于同一種系體內(nèi)射出的精子而言，所述精子代謝率和運(yùn)動(dòng)性更具附睪中精子的特點(diǎn)，且其DNA上還結(jié)合有DNA選擇性染料。
本發(fā)明還涉及對精子細(xì)胞染色的方法，所述方法包括形成這樣的染色混合物，其含有完整的活精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)抑制性量的鉀，以及DNA選擇性染料。
本發(fā)明還涉及形成用于流式細(xì)胞術(shù)方法的精子細(xì)胞懸浮液的方法，所述方法包括將精子細(xì)胞源與抑制精子細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的組合物混合，以形成精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中精子細(xì)胞濃度小于約1×106精子細(xì)胞/ml或至少為1×108精子細(xì)胞/ml。
本發(fā)明還涉及形成用于流式細(xì)胞術(shù)方法的精子細(xì)胞懸浮液的方法，所述方法包括將哺乳動(dòng)物射出精液收集至含有抑制性量的運(yùn)動(dòng)抑制劑的緩沖液中以形成精子懸浮液，所述懸浮液中含有精子濃度小于約1×106精子細(xì)胞/ml或至少為1×108精子細(xì)胞/ml。
本發(fā)明的其它方面和特征是顯而易見的，部分將于后文說明。
附圖簡述

圖1以圖表顯示了實(shí)施例1中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃含10mM丙酮酸鹽的TCA或二氧化碳?xì)鈱影暮?0mM丙酮酸鹽的TCA中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖2以圖表顯示了實(shí)施例1中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH7.3基于碳酸鹽的抑制劑中，用600μMHoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖3以圖表顯示了實(shí)施例1中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑中，用600μMHoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖4以圖表顯示了實(shí)施例2中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃含10mM丙酮酸鹽的TCA且隨后用含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用1000μM Hoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖5以圖表顯示了實(shí)施例2中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃(1)含有10mM丙酮酸鹽的TCA且用相同溶液1比3稀釋的情況下或(2)pH7.3基于碳酸鹽的緩沖液且用pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用1000μM Hoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖6以圖表顯示了實(shí)施例2中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑中，用1000μMHoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖7以圖表顯示了實(shí)施例3中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃含有10mM丙酮酸鹽的TCA且隨后用含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用300μM Hoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖8以圖表顯示了實(shí)施例3中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃(1)含有10mM丙酮酸鹽的TCA且用相同溶液1比3稀釋的情況下或(2)pH7.3基于碳酸鹽的緩沖液且用pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑1比3稀釋的情況下，用300μM Hoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖9以圖表顯示了實(shí)施例3中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃含有10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑中，用300μMHoechst 33342染料染色的精子細(xì)胞的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖10以圖表顯示了實(shí)施例4中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃TCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖11以圖表顯示了實(shí)施例5中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃TCA緩沖液或含有10μM維生素K的TCA緩沖液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖12以圖表顯示了實(shí)施例6中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃TCA緩沖液或含有100μM維生素K的TCA緩沖液中，用400μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖13以圖表顯示了實(shí)施例7中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于41℃TCA緩沖液或含1mM硫辛酸的TCA緩沖液中，用400μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖14以圖表顯示了實(shí)施例8中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用600μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖15以圖表顯示了實(shí)施例9中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液或含有100μM維生素K的TCA緩沖液中，用600μM Hoechst33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖16以圖表顯示了實(shí)施例10中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液或含1mM硫辛酸的TCA緩沖液中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖17以圖表顯示了實(shí)施例11中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液、含有2.5mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液、含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液、含有25mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液以及含有50mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用600μM Hoechst 33342染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖18以圖表顯示了實(shí)施例12中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用20μM SYBR-14染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖19以圖表顯示了實(shí)施例13中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用100μM BBC染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
圖20以圖表顯示了實(shí)施例14中進(jìn)行研究的結(jié)果，其中測量了于28℃TCA緩沖液或含有10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，用200μM BBC染料染色的精子的前向性運(yùn)動(dòng)百分比。
發(fā)明詳述令人驚訝的是，已經(jīng)確定相對于體內(nèi)射精精子(相同種系)運(yùn)動(dòng)性降低的精子，往往更能耐受多個(gè)與分選精子細(xì)胞為帶有X或Y染色體的精子富集群通常相關(guān)的步驟。因此在優(yōu)選實(shí)施方案中，可制備用于人工授精的性別富集精子群，所述精子群在染色后或分選后的組合物中活細(xì)胞數(shù)目增多或運(yùn)動(dòng)精子(特別是前向運(yùn)動(dòng)性精子)數(shù)目增多。
根據(jù)本發(fā)明的方法，形成含有精子和一種或多種抑制精子運(yùn)動(dòng)性的組合物的懸浮液，有時(shí)也稱其為分散體系；此種運(yùn)動(dòng)性受抑的狀態(tài)有時(shí)被稱之為不運(yùn)動(dòng)或精子靜止。一般而言，懸浮液中含有精子的密度為約1×103精子/ml至約5×1010精子/ml懸浮液。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，懸浮液中可含有“相對低”密度的精子，即精子密度少于約1×107精子/ml，優(yōu)選少于約1×106精子/ml，更優(yōu)選約1×103至約5×106精子/ml，更優(yōu)選約1×103至約1×106精子/ml，甚至更優(yōu)選1×104至約1×105精子/ml，最優(yōu)選約1×105精子/ml懸浮液。在可選的實(shí)施方案中，懸浮液中可含有“中間”密度的精子，即密度為約1×107至約1×108精子/ml懸浮液。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，懸浮液中可含有“相對高”密度的精子，即精子密度至少為約1×108精子/ml，優(yōu)選約1×108至約5×1010精子/ml，更優(yōu)選約1.5×108至約2×1010精子/ml，甚至更優(yōu)選1.5×108至約2×108精子/ml，更加優(yōu)選約1.5×108精子/ml懸浮液。因此例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，懸浮液中可含有至少約1.25×108、至少約1.5×108、至少約1.75×108、至少約2×108、至少約2.25×108、至少約2.5×108、至少約2.75×108，或甚至至少約3×108精子/ml懸浮液。在可選的實(shí)施方案中，懸浮液中可含有少于約9×105、少于約7×105、少于約5×105、少于約2×105、少于約1×105、少于約1×104，或甚至少于約1×103精子/ml懸浮液。
精子懸浮液中的精子密度取決于若干考慮，包括隨后將用于富集或分選精子細(xì)胞的方法。例如，可以利用如下文詳述的流式細(xì)胞術(shù)分選精子細(xì)胞。在這樣的情況下，緩沖精子懸浮液一般含“中間”或“相對高”密度的精子。其它分選或富集技術(shù)可能在精子密度較低時(shí)更利于使用，例如標(biāo)有標(biāo)記(如此處所述的染料和標(biāo)記)的“相對低”密度的精子。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明懸浮液中的精子在某些方面表現(xiàn)出附睪中精子的特征性行為；例如，精子的不運(yùn)動(dòng)性，和/或相對于洗滌或剛射出的精子而言，其內(nèi)呼吸速率更低而有氧糖酵解的速率更高。最好受抑精子在與抑制劑分離后，其運(yùn)動(dòng)性能夠表現(xiàn)出射出精子的特征性行為(而不具有附睪精子的特點(diǎn))；而在一個(gè)實(shí)施方案中，其運(yùn)動(dòng)性和呼吸都可具有如射出精子的特征性表現(xiàn)。
例如在一個(gè)實(shí)施方案中，通過HTM-IVOS精子分析(Hamilton-ThorneHTM-IVOS計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)，Hamilton-Thorne Research，Beverly MA)測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約50％。優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約60％。更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約70％。還更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約80％。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約90％。甚至更優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約95％。最優(yōu)選通過HTM-IVOS精子分析測量，運(yùn)動(dòng)抑制劑可使分散體系中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)相對于相同種系剛射出精液中精子細(xì)胞的路徑速度、前向性速度或兩者同時(shí)，降低至少約99％。
除抑制性緩沖液外或可替代之的是，也可單獨(dú)降低精子細(xì)胞的溫度或緊鄰精子細(xì)胞的環(huán)境溫度(即精子分散體系)以影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性。此種降溫一般會增加不運(yùn)動(dòng)性。此外，例如，精子細(xì)胞或精子分散體系溫度的降低會導(dǎo)致用于誘導(dǎo)不運(yùn)動(dòng)性的抑制劑的濃度降低。因此，精子分散體系可處于不超過5℃的溫度；優(yōu)選在約0℃至約5℃之間；更優(yōu)選為約3℃至約5℃之間；而最優(yōu)選為約5℃?；蛘呔臃稚Ⅲw系的溫度可介于約4℃至約50℃范圍內(nèi)；優(yōu)選為約7℃至約43℃；更優(yōu)選為約10℃至約39℃；還更優(yōu)選為約15℃至約30℃；甚至更優(yōu)選為約17℃至約25℃；而最優(yōu)選為約18℃。然而，優(yōu)選不將精子細(xì)胞暴露于會對細(xì)胞存活力造成實(shí)質(zhì)不良影響的溫度下。
抑制劑可以為一系列對精子運(yùn)動(dòng)性具有抑制作用的組合物中的任意一種。此類組合物包括如鈉/鉀ATP酶抑制劑，如烏本苷；含有鉀離子的組合物；以及含有鉀離子和鈉離子的組合物。例如，懸浮液中相對高濃度的鉀離子會抑制精子運(yùn)動(dòng)性。因此一般而言，優(yōu)選懸浮液中含有鉀離子源且懸浮液中的鉀濃度至少為約0.05mol/L。更優(yōu)選鉀濃度為至少約0.05mol/L至約0.5mol/L。還更優(yōu)選鉀濃度為至少約0.1mol/L至約0.3mol/L。最優(yōu)選鉀濃度為約0.173摩爾/升。此類懸浮液一般(但非必須)也含有鈉離子源。當(dāng)含有鈉離子時(shí)，鉀和鈉的摩爾比一般等于或大于各1∶1。優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.25∶1。更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.5∶1。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.75∶1。還更優(yōu)選鉀和鈉的摩爾比為至少約1.78∶1。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約2∶1。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約3∶1。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約4∶1。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約5∶1。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約6∶1。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約7∶1。又在另一個(gè)實(shí)施方案中，鉀和鈉的摩爾比為至少約8∶1。
精子懸浮液中還可額外含有能夠下調(diào)糖攝取的離子或二氧化碳源。在該實(shí)施方案中，二氧化碳的來源可以為如一種或多種碳酸鹽。在目前優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，精子懸浮液含有NaHCO3和KHCO3，由此提供鉀和鈉離子源以及二氧化碳分壓。例如，在目前優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，精子懸浮液含有NaHCO3和KHCO3的水性溶液，優(yōu)選NaHCO3、KHCO3和C6H8O7·H2O的水溶液；一般而言，分散體系中KHCO3的濃度可為至少約0.05mol/L。更優(yōu)選KHCO3的濃度為至少約0.05mol/L至約0.5mol/L。還更優(yōu)選KHCO3的濃度為至少約0.1mol/L至約0.3mol/L。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如Salisbury & Graves，J.Reprod.Fertil，6351-359(1963)中公開的那樣，利用含0.097mol/L NaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O水溶液的抑制性緩沖液形成懸浮液。只要精子細(xì)胞暴露于運(yùn)動(dòng)抑制劑，它們一般都會保持靜止。
當(dāng)分散體系中含有C6H8O7·H2O時(shí)，KHCO3與NaHCO3間的摩爾比可如上所述。KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比一般等于或大于各1∶1，但一般不會超過摩爾比8∶1。優(yōu)選KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.25∶1。還更優(yōu)選KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.5∶1。還更優(yōu)選KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.75∶1。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約1.78∶1。在另一具體實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約2∶1。而在另一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約3∶1。又在另一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約4∶1。又在另一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約5∶1。又在另一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約6∶1。又在另一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約7∶1。又在另一實(shí)施方案中，KHCO3與C6H8O7·H2O間的摩爾比為至少約8∶1。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，如Salisbury & Graves，J.Reprod.Fertil，6351-359(1963)中所公開的那樣，利用含0.097mol/L NaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液的抑制性緩沖液形成懸浮液。只要精子細(xì)胞暴露于運(yùn)動(dòng)抑制劑，它們一般都會保持靜止。
迄今為止的實(shí)驗(yàn)證據(jù)還提示，如果將精子細(xì)胞懸浮液保存在相對于空氣二氧化碳分壓增高的大氣下，可以改善精子細(xì)胞的整體健康和其它生命特征。在優(yōu)選實(shí)施方案中，懸浮液上方的大氣中二氧化碳分壓值為至少0.9；更優(yōu)選為至少約0.95。
可以將細(xì)胞與運(yùn)動(dòng)性抑制劑分離并將其暴露于空氣中，使靜止細(xì)胞還原為活性狀態(tài)。此外，還可以通過在生理鹽水中(Salisbury等人，1963)或諸如TCA緩沖液或PBS的緩沖液中稀釋細(xì)胞來起始活性狀態(tài)。一般而言，根據(jù)HTM-IVOS精子分析測量，至少約20％、優(yōu)選至少約50％、更優(yōu)選至少約60％、還更優(yōu)選至少約70％、甚至更優(yōu)選至少約80％、甚至更優(yōu)選至少約90％、還更優(yōu)選至少約95％、而最優(yōu)選至少約99％回復(fù)活性狀態(tài)的細(xì)胞(即再活化細(xì)胞)具有這樣的路徑速度、前向性速度或兩者兼具即分別為與運(yùn)動(dòng)性抑制劑混合前的精子細(xì)胞(即剛射出的精子細(xì)胞)的路徑速度、前向性速度或兩者的至少約50％，優(yōu)選至少約60％，更優(yōu)選至少約70％，還更優(yōu)選至少約80％，甚至更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選至少約95％，而最優(yōu)選至少約99％。
一般而言，細(xì)胞分選方法包括一系列分離步驟，即細(xì)胞樣本的收集、細(xì)胞染色、細(xì)胞分選、分選細(xì)胞的收集，并任選地包括分選細(xì)胞的冷凍伸展(cryoextension)。形成的精子懸浮液中最好包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑，或在一個(gè)或多個(gè)這些步驟中采用之。
細(xì)胞樣品的收集可以收集牛、豬、馬或其它哺乳動(dòng)物完整的活精子細(xì)胞并將之與運(yùn)動(dòng)性抑制劑接觸。已知眾多收集活精子的方法，例如，包括手握法、使用人工陰道以及電刺激射精。例如，可以將一般每毫升含有5億至100億精子細(xì)胞的牛精液樣品，直接由來源哺乳動(dòng)物收集于含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑的容器中，以形成精子懸浮液?？蛇x地，也可以將精子樣品收集于空容器中，隨后在收集的數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)將之與運(yùn)動(dòng)性抑制劑接觸以形成精子懸浮液。
除緩沖物外，精子懸浮液中也可含有一系列添加劑以增強(qiáng)精子存活力。例示性的添加劑包括蛋白質(zhì)源、抗生素以及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。
例示性的蛋白質(zhì)源包括卵黃、卵黃提取物、乳(包括熱勻漿和脫脂乳)、乳提取物、大豆蛋白、大豆蛋白提取物、血清白蛋白、牛血清白蛋白、人血清替代物增補(bǔ)劑以及它們的組合。白蛋白特別是牛血清白蛋白(BSA)，是優(yōu)選的蛋白質(zhì)源。例如，若含有BSA，則精子懸浮液中的BSA含量可少于約5.0％(w/v)，優(yōu)選少于約2％(w/v)，更優(yōu)選少于約1％(w/v)，而最優(yōu)選其量為約0.1％(w/v)。
單獨(dú)使用蛋白質(zhì)源(如BSA)，可能會起始懸浮液中百分之一精子細(xì)胞的獲能過程。該過程優(yōu)選發(fā)生于雌性生殖道內(nèi)。因此，為了抑制稀釋過程以及隨后的染色和分選期間獲能的起始，精子懸浮液中可含有備選的蛋白質(zhì)源或蛋白質(zhì)替代物。所述備選蛋白質(zhì)源或蛋白質(zhì)替代物除了能夠抑制精子懸浮液中更大百分比的細(xì)胞起始獲能，還具有典型蛋白質(zhì)源(如BSA)的優(yōu)點(diǎn)。備選白質(zhì)源的實(shí)例包括人血清替代物增補(bǔ)劑(SSS)(IrvineScientific，Santa Ana，CA)以及膽固醇強(qiáng)化的BSA，而蛋白質(zhì)替代物的實(shí)例包括聚乙烯醇，例如一般分子量為約30,000至約60,000的低至中粘度聚乙烯醇。一般而言，若含有這些組合物，其含量與上述BSA的量相同；緩沖物或緩沖溶液中總白蛋白含量一般不超過約5.0％(w/v)。
例如，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的例示性組合物包括丙酮酸鹽、維生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黃素、醌類、超氧化物歧化酶(SOD)以及SOD模擬物。若精子懸浮液中含有此類組合物，則其濃度足以產(chǎn)生保護(hù)性作用而不會對精子健康產(chǎn)生不良影響。例示性的濃度范圍包括從約10μM至約20mM，取決于諸如所用的具體組合物或懸浮液中的精子濃度等因素。例如，精子懸浮液中丙酮酸鹽的濃度可為約1mM至約20mM，優(yōu)選為約5mM至約15mM，更優(yōu)選為約10mM。精子懸浮液中維生素K的濃度可為約1μM至約100μM，優(yōu)選為約10μM至約100μM，更優(yōu)選為約100μM。精子懸浮液中硫辛酸的濃度可為約0.1mM至約1mM，優(yōu)選為約0.5mM至約1mM，而更優(yōu)選為約1mM。
精子懸浮液中可含有抗生素以抑制細(xì)菌的生長。例示性的抗生素包括例如泰樂菌素、慶大霉素、林可霉素、壯觀霉素、利高霉素Linco-Spectin(林可霉素羥氯化物-壯觀霉素)、青霉素、鏈霉素、替卡西林(ticarcillin)或其任意組合。若含有抗生素，則其濃度可為每ml精液中約50μg至約800μg(不論精液是純凈的、緩沖性的或含有其它物質(zhì)，例如此處提及的任一種添加劑)。Certified Semen Services(CSS)和美國國家動(dòng)物育種協(xié)會(NAAB)已經(jīng)頒布了有關(guān)抗生素在精子收集和使用中應(yīng)用的綱要。
可以向精子分散體系中加入生長因子，以協(xié)助維持精子細(xì)胞的存活力。例示性的生長因子包括如轉(zhuǎn)化生長因子(“TGF”)(例如TGF β-1和TGFβ-2)，以及胰島素樣生長因子(“IGF”)(例如IGF-1)。一般而言，精子分散體系中的TGF可以TGF β-1的形式出現(xiàn)，其濃度為約0.1ng/L至約10μg/L，或?yàn)門GFβ-2的形式，其濃度為約0.1ng/L至約200ng/L；而IGF在精子分散體系中可以為IGF-1形式，其濃度為約0.1ng/L至約50μg/L。此類生長因子的用途為本領(lǐng)域所公知，并公開于如美國專利申請公開號2003/0157473中，其內(nèi)容在此處引用作為參考。
一旦收集到細(xì)胞，可將其于室溫下靜止?fàn)顟B(tài)保存數(shù)小時(shí)、低溫下(如5℃)保存數(shù)周，或在下文所討論的冰凍伸展劑中保存數(shù)月。優(yōu)選細(xì)胞上方的大氣如上所述含有較高的二氧化碳分壓?；蛘撸占募?xì)胞還可在數(shù)小時(shí)內(nèi)用于如育種方法、染色方法或分選方法。
細(xì)胞染色運(yùn)動(dòng)性抑制劑可用于使細(xì)胞在細(xì)胞染色期間不運(yùn)動(dòng)。一般而言，精子細(xì)胞染色方法中可包括形成染色混合物(有時(shí)稱之為標(biāo)記混合物)，其中含有完整的活精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和染料(有時(shí)稱之為標(biāo)記)。在本發(fā)明的這一方面，可以將運(yùn)動(dòng)性抑制劑與精子細(xì)胞接觸以形成精子懸浮液，然后將精子懸浮液與DNA選擇性染料相接觸。在該實(shí)施方案中，精子來源可為純精子，或者為通過離心或使用其它手段分離精子級分而得到的含精子的精液衍生物。
在可選的實(shí)施方案中，染料可與運(yùn)動(dòng)性抑制劑相混合，從而形成染料溶液。因此，例如，純固體(包括可自由流動(dòng)的粉末)或液體組合物形式的染料可與抑制劑組合形成染料溶液，所述溶液可隨后與純精子、精子懸浮液或含精子的精液衍生物混合。
任何情況下，只要精子細(xì)胞保存在抑制劑中，一般都會保持靜止(Salisbury等人，1963)。然而，優(yōu)選將染色混合物保存在二氧化碳分壓相對于空氣而言增高的大氣中；例如，一般優(yōu)選染色混合物上方的大氣中含99％+的CO2。
可將染色混合物的pH保持在一定pH值范圍內(nèi)的任意一點(diǎn)；一般而言，該范圍為約5.0至約9.0。例如，可使染色混合物保持在“微酸性”pH下，即約5.0至約7.0。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選pH為約6.0至約7.0，更優(yōu)選為約6.0至約6.5，而最優(yōu)選為約6.2?；蛘?，還可使染色混合物保持在“微堿性”pH下，即約7.0至約9.0。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選pH為約7.0至約8.0，更優(yōu)選為約7.0至約7.5，而最優(yōu)選為約7.3。
如以前在美國專利號5,135,759和WO 02/41906中所述，可使用一種或多種可經(jīng)UV或可見光激發(fā)的DNA選擇性染料形成染色混合物。經(jīng)紫外光(UV)激發(fā)的選擇性染料的實(shí)例包括Hoechst 33342和Hoechst 33258，二者均可由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)購得。經(jīng)可見光激發(fā)的例示性選擇性染料包括可購于Molecμlar Probe，Inc.(Eugene，OR)的SYBR-14，以及WO02/41906中所描述的雙苯甲亞胺-BODIPY綴合物6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基)丙?；鵠氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-3’H-2，5’-雙苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙?；?氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。這些染料中的每一種都可以單獨(dú)使用或者聯(lián)合使用；或者，也可以將其它具有細(xì)胞滲透性的UV和可見光激發(fā)的染料單獨(dú)或與前述染料聯(lián)合使用，只要所述染料在可進(jìn)行別處所述分選的濃度下不會對精子細(xì)胞的存活力產(chǎn)生不可接受的不良影響。
或者，還可利用熒光聚酰胺形成染色混合物，更具體而言是利用綴合有熒光標(biāo)記或報(bào)告子的聚酰胺。此類標(biāo)記在結(jié)合于核酸時(shí)會發(fā)出熒光。連接有熒光標(biāo)記或報(bào)告子的聚酰胺實(shí)例包括，如Best等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100(21)12063-12068(2003)；Gygi等人，Nucleic Acids Res.，30(13)2790-2799(2002)；美國專利號5,998,140；美國專利號6,143,901以及美國專利號6,090,947中所公開的那些，其中每一篇內(nèi)容均在此處引用作為參考。
熒光核苷酸序列也可用于標(biāo)記精子細(xì)胞。此類核苷酸序列在與含有靶序列或互補(bǔ)序列的核酸雜交時(shí)會發(fā)出熒光，但在非雜交狀態(tài)時(shí)則不會發(fā)出熒光。此類核苷酸公開見于如美國專利申請公開號2003/0113765(此處引用作為參考)。
性別特異性抗體也可用于標(biāo)記染色混合物中的精子細(xì)胞。例如，在該實(shí)施方案中，性別特異性抗體可綴合于熒光部分(或等價(jià)報(bào)告分子)。由于抗體結(jié)合的抗原只存在于帶有X染色體或Y染色體的細(xì)胞上，根據(jù)其熒光(相對于無熒光的未標(biāo)記細(xì)胞)能夠選擇性地鑒定此類細(xì)胞。此外，可以同時(shí)使用分別與不同熒光部分相連的一種以上的性別特異性抗體。從而能根據(jù)帶有X染色體或Y染色體的細(xì)胞間的不同熒光，對之進(jìn)行區(qū)分。
也可使用發(fā)光的色彩選擇性納米晶體標(biāo)記染色混合物中的精子細(xì)胞。這些顆粒也稱為量子點(diǎn)，正如美國專利號6,322,901和美國專利號6,576,291所述為本領(lǐng)域所公知(均在此處引用作為參考)。這些納米晶體已被綴合于多種生物學(xué)材料，包括如肽、抗體、核酸、鏈霉親和素及多糖(見如美國專利號6,207,392、6,423,551、5,990,479和6,326,144，均在此處引用作為參考)，且已用于檢測生物學(xué)靶標(biāo)(見如美國專利號6,207,392和6,247,323，兩者均在此處引用作為參考)。
染色混合物中DNA選擇性染料或任何其它類型染料的濃度優(yōu)選為一系列變量的函數(shù)，所述變量包括細(xì)胞對于所選染料的滲透性、染色混合物的溫度、完成染色所需要的時(shí)間量、以及在隨后的分選步驟中所期望的富集程度。一般而言，優(yōu)選的染料濃度足以在適度短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到所期望的染色程度，而不會對精子存活力產(chǎn)生實(shí)質(zhì)的不良影響。例如，Hoechst33342、Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的濃度一般在約0.1μM至約1.0M之間，優(yōu)選為約0.1μM至約700μM，更優(yōu)選為約100μM至約200μM。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，Hoechst 33342、Hoechst33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的濃度一般在約400μM至約500μM，最優(yōu)選為約450μM。因此，在一種染色條件設(shè)置下，Hoechst 33342的濃度優(yōu)選為約100μM。在另一種染色條件設(shè)置下Hoechst 33342的濃度為約150μM。又在另一種染色條件設(shè)置下，濃度優(yōu)選為約200μM。而在另一種染色條件設(shè)置下，Hoechst 33342的濃度最優(yōu)選為約450μM。
又例如，熒光聚酰胺的濃度(例如美國申請公開號2001/0002314中所述的那些)，一般為約0.1μM至約1mM，優(yōu)選約1μM至約1mM，更優(yōu)選約5μM至約100μM，甚至更優(yōu)選約10μM。
染色混合物中也可任選地包含可增強(qiáng)精子存活力的添加劑。例示性的添加劑包括如上文“細(xì)胞樣品的收集”中已經(jīng)討論過的抗生素、生長因子或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物?？蓳?jù)此向收集液中添加此類添加劑。
染色混合物一旦形成，可以在一系列溫度范圍中的任意溫度下保存；一般而言，溫度范圍為約4℃至約50℃。例如，可以將染色混合物保存于“相對低”的溫度下，即溫度為約4℃至約30℃；在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選為約20℃至約30℃，更優(yōu)選為約25℃至約30℃，最優(yōu)選為約28℃?；蛘咭部蓪⑷旧旌衔锉４嬗凇爸虚g”溫度范圍內(nèi)，即溫度為約30℃至約39℃；在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選為約34℃至約39℃，更優(yōu)選為約37℃。此外，還可將染色混合物保存于“相對高”的溫度范圍內(nèi)，即溫度為約40℃至約50℃；在該實(shí)施方案中，溫度優(yōu)選為約40℃至約45℃，更優(yōu)選為約40℃至約43℃，最優(yōu)選為約41℃。對于優(yōu)選溫度的選擇一般取決于一系列變量，包括如細(xì)胞對所用染料的滲透性、染色混合物中染料的濃度、細(xì)胞在染色混合物中留存的時(shí)間、以及在分選步驟中所期望的富集程度。
精子細(xì)胞攝取染色混合物中的染料可以持續(xù)足夠長的一段時(shí)間，以達(dá)到所期望程度的DNA染色。所述時(shí)間一般足以使染料結(jié)合于精子細(xì)胞的DNA，從而能根據(jù)帶有X和Y染色體的精子細(xì)胞間不同的且可測量的熒光強(qiáng)度，將兩者分選開來。一般而言，這一時(shí)間不會超過約160分鐘，優(yōu)選不超過約90分鐘，還更優(yōu)選不超過約60分鐘，而最優(yōu)選為約5分鐘至約40分鐘。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度為約100μM至約200μM的染料的染色混合物，且將該染色混合物于約41℃的溫度保持一段時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O0.090mol/L的水溶液)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度為約400μM至約500μM的染料的染色混合物，且將該染色混合物于約41℃的溫度保持一段時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，染料濃度為450μM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O 0.090mol/L的水溶液)。
又在另一個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度為約100μM至約200μM的染料的染色混合物，且將該染色混合物于約28℃的溫度保持一段時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O0.090mol/L的水溶液)。
而在另一個(gè)實(shí)施方案中，形成含有精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)性抑制劑和濃度為約400μM至約500μM的染料的染色混合物，且將該染色混合物于約28℃的溫度下保持一段時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，染料濃度為450μM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)性抑制劑于每25ml純水中含有0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3和0.473g C6H8O7·H2O(NaHCO30.097mol/L、KHCO30.173mol/L、C6H8O7·H2O 0.090mol/L的水溶液)。
分選運(yùn)動(dòng)性抑制劑也可用于在分選精子細(xì)胞期間使細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)。一般而言，一旦根據(jù)本發(fā)明將精子染色，可以根據(jù)任何已知的可依據(jù)熒光分離的方法分選之。常用且公知的方法包括流式細(xì)胞術(shù)體系，如美國專利號5,135,759、5,985,216、6,071,689、6,149,867及6,263,745；國際專利公開號WO99/33956和WO01/37655；美國專利申請系列號10/812,351及其相應(yīng)的國際專利公開號WO 2004/088283中所例示和描述的那些，此處引用其內(nèi)容作為參考)。當(dāng)根據(jù)這些方法分選時(shí)，將精子作為樣品液引入流式細(xì)胞儀的管口中。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品液可包含有染色精子細(xì)胞和運(yùn)動(dòng)性抑制劑。
與之類似，用于在穿行細(xì)胞儀時(shí)包裹樣品液流的鞘液中也可含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑。一般而言，利用加壓空氣或注射泵將鞘液引入流式細(xì)胞儀的管口。優(yōu)選的加壓空氣為二氧化碳或氮?dú)?，更?yōu)選氮?dú)狻；蛘?，加壓空氣也可為二氧化碳，但在這種情況下，必須注意盡量減少氣泡。
樣品液或鞘液中也可任選地含有添加劑，如上文“細(xì)胞樣品的收集”中討論過的抗生素、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物或生長因子?？蓳?jù)此將這些添加劑中的每一種加入任一種液體中。
分選細(xì)胞的收集一旦完成分選，將分選細(xì)胞收集于含有收集液的容器內(nèi)。一般而言，(采用)收集液的目的包括緩沖收集容器對精子細(xì)胞的影響，或?yàn)榧?xì)胞提供液體支持。
在一個(gè)實(shí)施方案中，收集液中可含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑和蛋白質(zhì)源。若含有蛋白質(zhì)源，則其可為任何不會干擾精子細(xì)胞存活力并與所用的運(yùn)動(dòng)性抑制劑相容的蛋白質(zhì)源。常用蛋白質(zhì)源的實(shí)例包括乳(包括熱勻漿和脫脂乳)、乳提取物、卵黃、卵黃提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此類蛋白質(zhì)的使用濃度可為約1％(v/v)至約30％(v/v)，優(yōu)選約10％(v/v)至約20％(v/v)，更優(yōu)選約10％(v/v)。
收集液中也可任選地含有添加劑，如上文“細(xì)胞樣品的收集”中討論過的抗生素、生長因子或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物。可據(jù)此將這些添加劑中的每一種加入收集液中。
因此，在某一實(shí)施方案中，收集液為含有0.097mol/L NaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O以及10％(v/v)卵黃的水溶液，pH為約6.2，更優(yōu)選pH為約7.0，甚至更優(yōu)選為約6.5。優(yōu)選將收集液保存在二氧化碳分壓高于空氣的大氣中；例如，大氣中二氧化碳分壓可大于0.9，更優(yōu)選0.95，還更優(yōu)選0.99。
可將分選細(xì)胞收集至含有或包被有冰凍伸展劑的容器中，以代替常規(guī)收集液的使用。因此，在具體的實(shí)施方案中，分選細(xì)胞收集于含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑的冰凍伸展劑中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分選細(xì)胞收集于這樣的冰凍伸展劑中，其含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyl(Minitube，Verona，WI，含有甘油、tris、檸檬酸、果糖、泰樂菌素5mg/100ml、慶大霉素25mg/100ml、壯觀霉素30mg/100ml及林可霉素15mg/100ml)、卵黃以及丙酮酸鹽。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，收集液為這樣的冰凍伸展劑，其含有0.097mol/LNaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液，且每75ml水中含25g Triladyl、25g卵黃和10mM丙酮酸鹽。
分選細(xì)胞的冰凍伸展一旦完成精子的分選并收集其至收集容器內(nèi)，這些精子即可用于對雌性哺乳動(dòng)物授精。這幾乎不需要對精子進(jìn)行其它處理就可以立即進(jìn)行。同樣，也可以將精子冷卻或冰凍以備后用。在這種情況下，加入冰凍伸展劑以最大程度地降低冷卻或冰凍對存活力或解凍后運(yùn)動(dòng)性的影響，對精子大有益處。
運(yùn)動(dòng)性抑制劑可用于使冰凍伸展劑中的細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)。一般而言，冰凍伸展劑含有運(yùn)動(dòng)性抑制劑、蛋白質(zhì)源和冰凍保護(hù)劑。若含有，也可加入例如蛋白質(zhì)源以提供細(xì)胞支持、緩沖細(xì)胞與收集容器的接觸。蛋白質(zhì)源可為任何不會干擾精子細(xì)胞存活力并與具體所用運(yùn)動(dòng)性抑制劑相容的蛋白質(zhì)源。常用蛋白質(zhì)源的實(shí)例包括乳(包括熱勻漿和脫脂乳)、乳提取物、卵黃、卵黃提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此類蛋白質(zhì)的使用濃度可為約10％(v/v)至約30％(v/v)，優(yōu)選約10％(v/v)至約20％(v/v)，更優(yōu)選約20％(v/v)。
冰凍伸展劑中優(yōu)選含有冰凍保護(hù)劑，以減輕或避免冷凍休克或以保持精子的生育力。本領(lǐng)域已知眾多冰凍保護(hù)劑。適于與給定伸展劑共同使用的冰凍保護(hù)劑可有多種選擇，取決于待冰凍的精子來源于哪一種系。適宜的冰凍保護(hù)劑的實(shí)例包括如，甘油、二甲基亞砜、乙二醇、丙二醇、海藻糖、Triladyl以及它們的組合。若含有冰凍保護(hù)劑，則其在冰凍伸展劑中的量一般為約1％(v/v)至約15％(v/v)，優(yōu)選其量為約5％(v/v)至約10％(v/v)，更優(yōu)選其量為約7％(v/v)，最優(yōu)選量為約6％(v/v)。
在具體實(shí)施方案中，冰凍伸展劑包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyl、卵黃和丙酮酸鹽。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，冰凍伸展劑為含0.097mol/LNaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液，且每75ml水中含25g Triladyl、25g卵黃和10mM丙酮酸鹽。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，冰凍伸展劑包含運(yùn)動(dòng)性抑制劑、水、Triladyl和卵黃。而在另一個(gè)實(shí)施方案中，冰凍伸展劑為含0.097mol/LNaHCO3、0.173mol/L KHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的水溶液，且每75ml水中含25g Triladyl、25g卵黃。
冰凍伸展劑中也可任選地含有如上文“細(xì)胞樣品的收集”中討論過的抗生素、生長因子或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外氧化/還原反應(yīng)的組合物?？蓳?jù)此將這些添加劑中的每一種加入收集液中。
上文已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明，顯而易見的是，在不脫離所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍時(shí)可以對之進(jìn)行修飾和改變。
實(shí)施例提供以下非限制性實(shí)施例以進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品在25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，將精液懸浮于TCA緩沖物或基于碳酸鹽的抑制劑中，制備數(shù)管含150×106精子/ml的懸浮液。下表I顯示了所用的組合物和染色條件。
表I
向精子懸浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使?jié)舛葹?00μMHoechst。染色期間將精子懸浮液留置于28℃水浴中(約1小時(shí))。從染色分精子懸浮液中移取50μl小份，加入200μl 25℃含10mM丙酮酸鹽的TCA(pH7.3)以起始靜止逆轉(zhuǎn)，至少5分鐘的平衡時(shí)間后，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS前向性運(yùn)動(dòng)百分比的比較結(jié)果見圖1-3。
實(shí)施例2利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品在25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，將精液懸浮于TCA緩沖物或基于碳酸鹽的抑制劑中，制備數(shù)管含450×106精子/ml的懸浮液。下表II顯示了所用的組合物和染色條件。
表II
向精子懸浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使?jié)舛葹?000μMHoechst。將精子懸浮液留置于28℃水浴中1小時(shí)，然后按照各圖中具體的說明，用含10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑將之稀釋為150×106精子/ml的典型分選濃度。在各圖指定的時(shí)間內(nèi)從染色并稀釋的精子懸浮液中移取50μl小份，并加入200μl 25℃含10mM丙酮酸鹽的TCA(pH7.3)以起始靜止逆轉(zhuǎn)，至少5分鐘的平衡時(shí)間后，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS前向性運(yùn)動(dòng)百分比的比較結(jié)果見圖4-6。
實(shí)施例3利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品在25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，將精液懸浮于TCA緩沖物或基于碳酸鹽的抑制劑中，制備數(shù)管含450×106精子/ml的懸浮液。下表II顯示了所用的組合物和染色條件。
表III
向精子懸浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使?jié)舛葹?00μMHoechst。將精子懸浮液留置于41℃水浴中30分鐘，然后按照各圖中具體的說明，用含10mM丙酮酸鹽的TCA或pH6.2基于碳酸鹽的抑制劑將之稀釋為150×106精子/ml的典型分選濃度。在各圖指定的時(shí)間內(nèi)從染色并稀釋的精子懸浮液中移取50μl小份，并加入200μl 25℃含10mM丙酮酸鹽的TCA(pH7.3)以起始靜止逆轉(zhuǎn)，至少5分鐘的平衡時(shí)間后，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS前向性運(yùn)動(dòng)百分比的比較結(jié)果見圖7-9。
實(shí)施例4利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品以2份的碳酸鹽緩沖液稀釋、于25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，移取小份碳酸鹽精子懸浮液、將其在500×g離心5分鐘、除去上清液并將沉淀重懸于41℃pH7.3的TCA緩沖液中，制備1mL 150×106精子/ml的懸浮液。再通過將小份精液懸浮于41℃含10mM丙酮酸鹽、pH7.3的TCA緩沖液內(nèi)，制備另外1mL 150×106精子/ml懸浮液。向精子懸浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使染料濃度為400μM Hoechst。染色期間將精子懸浮液留置于41℃水浴中。從染色的精子懸浮液中移取50μl小份，加入200μl相同溫度的相同緩沖物，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖10。
實(shí)施例5除以下不同外，按照實(shí)施例4的相同方法獲取和制備精子樣品用于懸浮精子以進(jìn)行染色和IVOS分析的緩沖物為TCA和含10μM維生素K的TCA。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖11。
實(shí)施例6除以下不同外，按照實(shí)施例4的相同方法獲取和制備精子樣品用于懸浮精子以進(jìn)行染色和IVOS分析的緩沖物為TCA和含100μM維生素K的TCA。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖12。
實(shí)施例7除以下不同外，按照實(shí)施例4的相同方法獲取和制備精子樣品用于懸浮精子以進(jìn)行染色和IVOS分析的緩沖物為TCA和含1mM硫辛酸的TCA。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖13。
實(shí)施例8利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品以2份的碳酸鹽緩沖液稀釋、于25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，將精子懸浮液在500×g離心5分鐘、除去上清液并將沉淀重懸于28℃pH7.3的TCA緩沖液中，制備1mL含150×106精子/ml的懸浮液。再通過將小份精液懸浮于28℃含10mM丙酮酸鹽、pH7.3的TCA緩沖液內(nèi)，制備另外1mL 150×106精子/ml懸浮液。向精子懸浮液中加入等份10mM Hoechst水溶液以使染料濃度為600μMHoechst。染色期間將精子懸浮液留置于28℃水浴中。
從染色精子懸浮液中移取50μl小份，加入200μl相同溫度的相同緩沖物，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖14。
實(shí)施例9除以下不同外，按照實(shí)施例8的相同方法獲取和制備精子樣品用于懸浮精子以進(jìn)行染色和IVOS分析的緩沖物為TCA和含100μM維生素K的TCA。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖15。
實(shí)施例10除以下不同外，按照實(shí)施例8的相同方法獲取和制備精子樣品用于懸浮精子以進(jìn)行染色和IVOS分析的緩沖物為TCA和含1mM硫辛酸的TCA。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖16。
實(shí)施例11利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品以2份的碳酸鹽緩沖液稀釋、于25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，移取小份碳酸鹽精子懸浮液、將其在500×g離心5分鐘、除去上清液并將沉淀重懸于1ml TCA緩沖液或1ml含2.5mM、10mM、25mM或50mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，制備1mL含150×106精子/ml的懸浮液。向樣品中加入MON33342溶液以使染料終濃度為600μM。于28℃水浴中孵育懸浮液。從染色精子懸浮液中移取50μl小份，加入200μl相同溫度的相同緩沖物，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS分析前向性運(yùn)動(dòng)％的結(jié)果如圖17所示。
實(shí)施例12利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品以2份的碳酸鹽緩沖液稀釋、于25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，移取小份碳酸鹽精子懸浮液、將其在500×g離心5分鐘、除去上清液并將沉淀重懸于1ml TCA緩沖液中，制備1mL含150×106精子/ml的TCA緩沖液。移取一份碳酸鹽精子懸浮液、將其在500×g中離心5分鐘、除去上清液并將沉淀重懸于1ml含10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，制備1mL含150×106精子/ml的10mM丙酮酸鹽TCA緩沖液。向樣品中加入SYBR14染料溶液以使染料終濃度為20μM。于28℃水浴中孵育懸浮液。從染色精子懸浮液中移取50μl小份，加入200μl相同溫度的相同緩沖物，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS分析前向性運(yùn)動(dòng)％的結(jié)果如圖18所示。
實(shí)施例13利用人工陰道從性成熟公牛中收集公牛精液，并將樣品以2份的碳酸鹽緩沖液稀釋、以于25℃溫控容器內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至染色設(shè)施。精液一經(jīng)接收，便根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和公知的方法(Farrell等人Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))，利用Hamilton-Thorn運(yùn)動(dòng)性分析儀(IVOS)分析其濃度、運(yùn)動(dòng)性和前向運(yùn)動(dòng)性。根據(jù)精液濃度，移取小份碳酸鹽精子懸浮液、將其在500×g離心5分鐘、除去上清液并將沉淀重懸于1ml TCA緩沖液中，制備1mL含150×106精子/ml的TCA緩沖液。移取一份碳酸鹽精子懸浮液、將其在500×g中離心5分鐘、除去上清液并重懸浮沉淀于1ml含10mM丙酮酸鹽的TCA緩沖液中，制備1mL含150×106精子/ml的10mM丙酮酸鹽TCA緩沖液。向樣品中加入BBC溶液以使染料終濃度為100μM。于28℃水浴中孵育懸浮液。從染色精子懸浮液中移取50μl小份，加入200μl相同溫度的相同緩沖物，通過IVOS分析測量前向性運(yùn)動(dòng)百分比(前向性運(yùn)動(dòng)％)進(jìn)行分析。IVOS分析前向性運(yùn)動(dòng)％的結(jié)果如圖19所示。
實(shí)施例14除以下不同外，按照實(shí)施例4的相同方法獲取和制備精子樣品染色濃度為200μM BBC。IVOS分析的結(jié)果總結(jié)于圖20。
權(quán)利要求
1.含有活精子以及下調(diào)精子糖攝取的組合物的精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為約1×108精子/ml。
2.含有不運(yùn)動(dòng)活精子的精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為約1×108精子/ml。
3.含有活精子的精子細(xì)胞懸浮液，該精子相對于同一種系體內(nèi)射出的精子更具附睪中精子的運(yùn)動(dòng)性特點(diǎn)，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為約1×108精子/ml。
4.含有活精子、鉀、并任選地含有鈉的精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中的精子濃度小于約1×106精子/ml或至少為約1×108精子/ml，而鉀與鈉的摩爾比大于各1∶1。
5.權(quán)利要求4的懸浮液，其中鉀與鈉的摩爾比大于各1.25∶1。
6.權(quán)利要求4的懸浮液，其中鉀與鈉的摩爾比大于各1.5∶1。
7.權(quán)利要求4的懸浮液，其中鉀與鈉的摩爾比大于各1.75∶1。
8.權(quán)利要求4的懸浮液，其中鉀與鈉的摩爾比大于各2∶1。
9.含有活精子、下調(diào)精子糖攝取的組合物、以及DNA選擇性染料的精子細(xì)胞懸浮液。
10.含有不運(yùn)動(dòng)活精子和DNA選擇性染料的精子細(xì)胞懸浮液。
11.含有活精子和DNA選擇性染料的精子細(xì)胞懸浮液，所述精子相對于同一種系體內(nèi)射出的精子，其代謝率和運(yùn)動(dòng)性更具附睪中精子的特點(diǎn)。
12.含有不運(yùn)動(dòng)活精子的精子細(xì)胞懸浮液，所述精子的DNA上結(jié)合有DNA選擇性染料。
13.含有活精子的精子細(xì)胞懸浮液，相對于同一種系體內(nèi)射出的精子而言，所述精子代謝率和運(yùn)動(dòng)性更具附睪中精子的特點(diǎn)，且其DNA上還結(jié)合有DNA選擇性染料。
14.權(quán)利要求10的懸浮液，其中染料為DNA選擇性熒光染料。
15.權(quán)利要求10的懸浮液，其中染料為UV激發(fā)或可見光激發(fā)的染料。
16.權(quán)利要求10的懸浮液，其中染料從由Hoechst 33342、Hoechst33258、SYBR-14、以及雙苯甲亞胺-BODIPY綴合物6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2H-吡咯-5-基)丙?；鵠氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-雙苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙?；?氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺組成的組中選擇。
17.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中含有碳酸鹽源。
18.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中含有NaHCO3、KHCO3和C6H8O7·H2O。
19.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液制備自含0.097mol/LNaHCO3、0.173mol/LKHCO3、0.090mol/L C6H8O7·H2O的緩沖水溶液。
20.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為至少1.25×108精子/ml。
21.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為至少1.5×108精子/ml。
22.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為至少1.75×108精子/ml。
23.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為小于約9.0×105精子/ml。
24.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為小于約7×105精子/ml。
25.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為小于約5×105精子/ml。
26.權(quán)利要求2的精子懸浮液，所述懸浮液中精子的濃度為小于約2×105精子/ml。
27.權(quán)利要求2的精子懸浮液，其中所述懸浮液中精子的濃度為小于約1×105精子/ml。
28.對精子細(xì)胞染色的方法，所述方法包括形成這樣的染色混合物，其含有完整的活精子細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)抑制性量的鉀，以及DNA選擇性染料。
29.權(quán)利要求28的方法，其中染色混合物處于CO2分壓相對于空氣增加的大氣中。
30.形成用于細(xì)胞分選的精子細(xì)胞懸浮液的方法，所述方法包括將精子細(xì)胞源與抑制精子細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性的組合物混合，以形成精子細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液中精子細(xì)胞濃度小于約1×106精子細(xì)胞/ml或至少為1×108精子細(xì)胞/ml。
31.形成用于流式細(xì)胞術(shù)方法的精子細(xì)胞懸浮液的方法，所述方法包括將哺乳動(dòng)物射出精液收集至含有抑制性量的運(yùn)動(dòng)抑制劑的緩沖液中，以形成精子懸浮液，所述懸浮液中含有小于約1×106精子細(xì)胞/ml或至少為1×108精子細(xì)胞/ml。
32.權(quán)利要求30的方法，其中細(xì)胞懸浮液中含有DNA選擇性染料。
33.權(quán)利要求18的懸浮液，還含有DNA選擇性染料。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含運(yùn)動(dòng)抑制劑的精子細(xì)胞懸浮液。此類懸浮液中含有的細(xì)胞更能耐受與將精子細(xì)胞分選為性別富集群過程一般相關(guān)的多個(gè)步驟，從而使分選后的組合物中活精子或運(yùn)動(dòng)性的精子數(shù)目增多。本發(fā)明也公開了形成此類細(xì)胞懸浮液的方法以及對精子細(xì)胞染色的方法。
文檔編號G01N1/30GK101014700SQ200580017370
公開日2007年8月8日 申請日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者C·L·路德維格, K·S·克勞利, C·N·格拉維斯 申請人:孟山都技術(shù)公司